PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO

Tiến sĩ Hà Minh Hiển
MỞ ĐẦU
Định tính, định lƣợng dƣợc chất
trong thuốc đa thành phần

Paracetamol 325 mg
Thiamin nitrat 10 mg
Clorpheniramin maleat 2 mg
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự
phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn,
trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa
trong cột.

• Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ,
phân bố khối lƣợng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước
hoặc tương tác hóa học lập thể.
• Sắc ký phân bố ứng dụng nhiều nhất trong ngành Dược.
 Sắc ký phân bố : pha thuận & pha đảo

 Pha thuận (Normal phase chromatography)

 Pha tĩnh: phân cực, thí dụ: silica
 Pha động: KHÔNG phân cực, thí dụ: 2-hexan, ethyl
acetat
 Chất kém phân cực NHẤT sẽ ra trước
 Sắc ký phân bố : pha thuận & pha đảo
 Pha đảo (Reversed phase chromatography)
 Pha tĩnh: KHÔNG phân cực, thí dụ: C8, C18
 Pha động: phân cực, thí dụ: nước, acetonitril, methanol
 Chất phân cực NHẤT sẽ ra trước
 Quaù trình saéc kyù

1. Ñöa hoãn hôïp leân pha tónh

2. Cho pha ñoäng qua pha tónh
3. Phaùt hieän caùc chaát ñöôïc taùch
 TÁCH 2 CHẤT A VÀ C TRONG 2 PHA
KHÔNG TRỘN LẪN
Hƣớng dòng chảy

Pha động (m)

Pha tĩnh (s)

Quá trình tách hỗn hợp 2
thành phần A và B bằng
phương pháp sắc ký lỏng

A: Hỗn hợp chất cần tách lúc mới nạp vào cột (pha tĩnh)
: Tập trung ưu tiên ở pha động (B)
: Tập trung ưu tiên ở pha tĩnh (B)
C: Cân bằng được thiết lập
D: Lặp lại quá trình, 2 chất tách ra sau một thời gian
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Thiết bị
• Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm
mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể
được sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ
thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một
máy ghi đồ thị). Pha động được cung cấp từ một
hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường
với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector.
SƠ ĐỒ THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Hệ thống bơm
• Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một
lưu lượng không đổi. Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ cho
dung môi chạy qua một thiết bị giảm xung. Ống dẫn và hệ thống nối phải là
loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Các bơm có thể được lắp
với thiết bị loại bỏ bọt khí.

• Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hoặc
hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa
giải gradient) theo một chương trình xác định. Trong trường hợp rửa giải
gradient, hệ thống bơm lấy các dung môi từ một vài bình chứa và các dung
môi có thể được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp suất cao.
Thiết bị giảm xung

Thiết bị loại bỏ bọt khí

Hệ thống bơm cao áp 1 piston
Pha động ra khỏi bơm vào cột
Pha động vào bơm
 Đầu bơm có 2 van điều
tiết, mỗi van có một lỗ
nhỏ chứa 1 viên bi
 Thân bơm có 1 piston
chuyển động đi lại
 Piston di chuyển , các
viên bi lần lượt đóng, mở
 Pha động từ bình chứa
vào thân bơm rồi đi vào
cột sắc ký
 Hệ thống bơm cao áp 2 piston
Pha động ra khỏi bơm vào cột

 Một piston đẩy pha động

vào cột

Piston 1 đẩy  Một piston khác hút pha

động vào thân bơm
 Áp suất cột sẽ không đổi
Piston 2 hút  Lưu lượng không đổi
Pha động vào bơm
 Lưu lượng điều chỉnh
bằng motor
Bơm đẳng dòng Chỉ lấy pha động từ 1 bình, KHÔNG pha trộn từ
nhiều bình
 Không tăng tốc độ dòng đột
ngột
 Theo dõi áp suất bơm trong quá
trình phân tích
 Định kỳ rửa lọc dung môi đầu
vào
 Nạp đầy hệ thống bơm bằng
dung môi (methanol, acetonitril)
khi không chạy để tránh nấm
mốc phát triển
 Giá thành rẻ nhất
Bơm nhị phân Có thể lấy pha động từ 2 bình,
chạy đƣợc chƣơng trình dung môi
(rửa giải gradient)
Bơm tứ phân
Có thể lấy pha động từ 4 bình, chạy đƣợc
chƣơng trình dung môi (rửa giải gradient)

 Phối hợp dung môi hợp lý để

tránh kết tủa
 Dùng dung môi trung gian
hợp lý
 Rửa kỹ đường ống chứa đệm
 Áp suất hoạt động tối đa
5000-6000 psi
 Cột
Đầu dò
Bộ tiêm
Bơm mẫu Buồng cột

Pha động Wash

Bình thải

Sơ đồ hệ thống HPLC rửa giải đẳng dòng

 Máy tính

Giao diện
Detector
Cóng đo
L M
Đuổi khí Bộ tiêm
P Bơm I Cột
mẫu
G X
Buồng cột
4 Bơm A.S

A B C D
Bình
Pha động
thải
Sơ đồ hệ thống HPLC rửa giải gradient
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Bộ phận tiêm mẫu
• Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động
hoặc vào vị trí gần đầu hoặc đầu cột nhờ một bộ
phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất
cao. Có thể dùng vòng chứa mẫu thử, có thể tích cố
định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vận
hành bằng tay hoặc tự động. Khi tiêm mẫu bằng tay
có thể gây ra sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa
mẫu không đủ.
Sơ đồ bộ phận tiêm mẫu bằng tay
Sơ đồ bộ phận tiêm mẫu tự động
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Pha tĩnh
Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc
ký lỏng, phổ biến dùng trong kiểm nghiệm là:
• Silica (silic dioxyd), nhôm oxyd hoặc than hoạt tính
dạng xốp thường được dùng trong sắc ký pha thuận
mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về
khả năng hấp phụ hoặc (và) phân bố khối lượng
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel
hoặc than graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự
chia tách về nguyên tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất
giữa pha động và pha tĩnh.

• Pha tĩnh loại biến đổi hoá học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của cellulose hoặc
amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin vv... dùng để tách các đồng
phân đối quang (sắc ký đối quang).

Chất nhồi cột

 Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica
biến đổi hoá học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm
pha động. Bề mặt của chất mang, ví dụ như các nhóm silanol
của silica được phản ứng với các thuốc thử silan khác nhau tạo
thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che phủ một số
lượng khác nhau các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang.
Bản chất của các pha liên kết là tham số quan trọng để xác định
các tính chất tách của hệ sắc ký.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Các pha liên kết dùng phổ biến là:

• Octyl = Si –(CH2)7–CH3 C8
• Octadecyl = Si –(CH2)17–CH3 C18
• Phenyl = Si–(CH2)n– (C6H5) C6 H 5

• Cyanopropyl = Si–(CH2)3–CN CN
• Aminopropyl = Si– (CH2)3–NH2 NH2
• Diol = Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường
các cột sắc ký pha đảo dựa trên silaca được coi là ổn định đối
với pha động có pH từ 2,0 tới 8,0.

• Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica
không bị biến đổi, than graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa
học làm cho phân cực (ví dụ cyanopropyl hoặc diol) và pha
động không phân cực được sử dụng trong một số trường.
hợp.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh phổ biến
nhất từ 3 µm tới 10 µm. Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình dạng nhất
định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu. Những tham số này cấu
thành biểu hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể. Trong trường hợp pha đảo, các
yếu tố bổ sung như bản chất của pha tĩnh, mức độ liên kết, ví dụ như độ dài mạch
carbon liên kết, hoặc các nhóm hoạt động bề mặt của pha tĩnh có được che phủ
hết hay không.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên
luận riêng, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau được sử dụng
cho phân tích sắc ký. Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường
được coi là vi cột. Nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ ổn định
trong suốt thời gian phân tích. Phần lớn quá trình tách được thực hiện ở
nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả
cao hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60 oC vì
khả năng phân huỷ của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha
động có thể xảy ra.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Pha động
• Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực. Sự có
mặt của nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ
nhằm thu được kết quả tái lặp lại. Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng
pha động chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ.

• Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu
phân lớn hơn 0,45 µm. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị
bằng cách đong các thể tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng)
của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó trộn lẫn với nhau. Ngoài ra,
dung môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng
các van chia tỷ lệ thuận, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn.
Dung môi thường được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí heli,
lắc siêu âm hoặc sử dụng hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến
nhằm tránh sự tạo bọt khí trong cốc đo của detector.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường
không được chứa các chất làm ổn định và phải
trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước
sóng phát hiện, nếu như sử dụng detector tử
ngoại. Dung môi và những thành phần khác được
dùng phải có chất lượng phù hợp. Khi cần điều
chỉnh pH chỉ thực hiện với thành phần nước của
pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp. Nếu
sử dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ thống
bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ (5% tt/tt)
nhằm ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi kết thúc
quá trình sắc ký.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ một
ion trái dấu trong sắc ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc
đối quang trong trường hợp sắc ký sử dụng pha tĩnh không
chọn lọc đối quang.
(a): Pha liên kết
(b): Pha tĩnh
(c): Tác nhân tạo cặp ion trong pha động
(d): Tác nhân tạo cặp ion hấp phụ vào pha
tĩnh
(e): Ion mẫu tự do trong pha động
(f): Mẫu lưu giữ trên cột bởi cơ chế ion cặp
 PHA ĐỘNG
Lọc và đuổi khí pha động

Bình chứa pha động  Màng lọc thích hợp

 Kích thước 0,45 m
 Chai thủy tinh trung tính
 Có nắp đậy kín
Dụng cụ lọc pha động Lọc mẫu với màng lọc
và màng lọc dùng một lần

Màng lọc mẫu dùng một lần

ĐUỔI KHÍ CHO PHA ĐỘNG

Siêu âm

Sục khí heli

Đuổi khí on-line

 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Detector
• Detector hấp thụ tử ngoại/khả kiến gồm cả detector chuỗi diod là được
sử dụng phổ biến nhất. Detector huỳnh quang, detector khúc xạ vi sai,
detector điện hoá, detector khối phổ, detector tán xạ ánh sáng bay hơi,
detector phóng xạ hoặc các loại detector đặc biệt khác cũng có thể được
sử dụng.
Sơ đồ khối detector UV-Vis
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Phƣơng pháp tiến hành
• Làm cân bằng cột với pha động và tốc độ dòng theo qui định,
ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ qui định trong chuyên luận
riêng, cho đến khi đường nền ổn định. Chuẩn bị các dung
dich chuẩn và dung dịch thử theo yêu cầu. Các dung dịch
phải không được có các tiểu phân rắn.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Phƣơng pháp tiến hành
• Thành phần và tốc độ dòng của pha động được qui định trong
chuyên luận riêng. Pha động là hỗn hợp dung môi được đuổi khí
bằng bơm chân không hoặc bằng một thiết bị đuổi khí khác phù
hợp nhưng không ảnh hưởng đến thành phần của hỗn hợp.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Cột sắc ký thường được làm bằng thép không gỉ có kích
thước (chiều dài x đường kính trong) được qui định trong
chuyên luận riêng. Nếu không có chỉ dẫn khác trong chuyên
luận riêng, quá trình sắc ký được tiến hành ở điều kiện nhiệt
độ không đổi trong môi trường phòng thí nghiệm.
 PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Trừ khi có các chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng,
hệ thống detector gồm một detector đo quang gắn với
một cốc đo có thể tích nhỏ (khoảng 10 l là phù hợp).
Phải đặt bước sóng theo chỉ dẫn trong chuyên luận
riêng.
 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
TRONG KIỂM NGHIỆM
Định tính
Dựa vào sự trùng khớp về thời gian lưu. Thí dụ:
 Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ thu
được của dung dịch thử phải tương ứng với thời
gian lưu của pic artemether trong sắc ký đồ thu
được của dung dịch chuẩn.

 Trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2) ở phần định

lượng phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng
với pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu
roxithromycin(1).
ĐỊNH TÍNH
1. Dựa vào sự trùng khớp thời gian lưu
Thuốc gì
đây?

2. Phương pháp thêm chất chuẩn

ĐỊNH LƢỢNG Dựa vào diện tích pic
 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
TRONG KIỂM NGHIỆM
Xác định tạp chất liên quan trong dƣợc chất azithromycin
• Pha động: Dung dịch có chứa dikali hydrophosphat 3,484% đã được điều chỉnh pH
đến 6,5 bằng acid phosphoric - acetonitril - nước (10 : 35 : 55).
• Dung môi pha mẫu: Acetonitril - nước (4 : 6).
• Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,100 g chế phẩm trong dung môi pha mẫu và pha
loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi.
• Dung dịch thử (2): Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử (1) thành 20,0 ml với dung môi
pha mẫu.
• Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 50,0 mg azithromycin chuẩn (ĐC) trong dung
môi pha mẫu và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi.
• Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử (1) thành 100,0 ml với
dung môi pha mẫu.
• Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 5,0 mg azithromycin chuẩn (ĐC) và 5,0 mg tạp
chất chuẩn A của azithromycin (ĐC) trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 50
ml với cùng dung môi.
• Dung dịch đối chiếu (4): Hòa tan 2 mg tạp chất chuẩn B của azithromycin (ĐC)
trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch
này dùng để xác định thời gian lưu của pic tạp chất B.
 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
TRONG KIỂM NGHIỆM
Điều kiện sắc ký:
• Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh là end-capped polar-
embedded octadecylsilyl amorphous organosilica polymer (5 m). Duy trì nhiệt độ
cột ở 70 oC.
• Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm.
• Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
• Thể tích tiêm: 100 l.
• Cách tiến hành: Tiêm lần lượt các dung dịch thử (1), dung dịch đối chiếu (2), (3)
và (4), tiến hành sắc ký dung dịch thử với thời gian rửa giải bằng 4,5 lần thời gian
lưu của azithromycin.
• Thời gian lưu tương đối của các tạp chất so với azithromycin (thời gian lưu khoảng
26 phút): tạp chất D khoảng 0,37; tạp chất J khoảng 0,39; tạp chất A khoảng 0,42;
tạp chất I khoảng 0,5; tạp chất C khoảng 0,65; tạp chất K khoảng 0,9; tạp chất F
khoảng 1,6; tạp chất B khoảng 1,7 và tạp chất G khoảng 2,8.
• Độ thích hợp hệ thống: Trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (3), độ phân giải giữa
pic của tạp chất A và pic của azithromycin ít nhất phải bằng 7,0.
• Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử (1), diện tích pic tạp chất B không được
lớn hơn 2 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2) (2,0%). Diện
tích pic của các tạp chất khác không được lớn hơn diện tích pic chính của dung dịch
đối chiếu (2) (1,0%). Tổng diện tích của tất cả các pic tạp chất không được lớn hơn
5 lần diện tích pic chính của dung dịch đối chiếu (2) (5,0%).
• Bỏ qua các pic phụ có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích pic chính của dung dịch đối chiếu (2) (0,1%).
 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
TRONG KIỂM NGHIỆM
Định lƣợng azithromycin trong viên nang
• Pha động: Hỗn hợp methanol - nước - amoniac đậm đặc
(80 : 19,9 : 0,1).
• Dung dịch chuẩn: Hoà tan một lượng azithromycin chuẩn
trong pha động để thu được dung dịch có nồng độ
azithromycin khoảng 1,0 mg trong 1 ml. Lọc qua màng
lọc 0,45 m.
• Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương
ứng với khoảng 50 mg azithromycin vào bình định mức
50 ml, thêm 30 ml pha động và lắc siêu âm 15 phút. Pha
loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua
giấy lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu, lọc lại dịch lọc qua màng
lọc 0,45 m.
 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
TRONG KIỂM NGHIỆM
Điều kiện sắc ký:
• Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B
(5 m)
• Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm.
• Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
• Thể tích tiêm: 20 l.
Cách tiến hành:
• Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung
dịch thử.
• Tính hàm lượng azithromycin, C38H72N2O12, có trong một
đơn vị chế phẩm dựa vào diện tích pic của azithromycin thu
được từ sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và
hàm lượng C38H72N2O12 trong azithromycin chuẩn.
 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
TRONG KIỂM NGHIỆM
• Định lƣợng viên nén paracetamol và codein phosphat
• Dung dịch đệm: Hòa tan 2,04 g kali dihydrophosphat (TT) trong khoảng 950 ml
nước. Thêm 2 ml triethylamin (TT), điều chỉnh về pH 2,35 bằng acid phosphoric
(TT) pha loãng với nước thành 1000 ml và trộn đều.
• Pha động: Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch đệm - methanol (TT) (92 : 8). Lọc và
đuổi khí. Điều chỉnh tỉ lệ nếu cần.
• Dung dịch chuẩn codein phosphat gốc: Chuẩn bị dung dịch codein phosphat
trong pha động có nồng độ khoảng 0,3 mg/ml.
• Dung dịch chuẩn: Chuyển 30 mg paracetamol chuẩn và 100J ml dung dịch
chuẩn codein phosphat gốc, J là tỷ lệ lượng ghi trên nhãn (mg) của codein
phosphat hemihydrat và lượng ghi trên nhãn của paracetamol (mg) trong một
viên vào bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng pha động đến định mức.
• Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 300 mg
paracetamol vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 75 ml pha động, siêu âm
trong 10 phút. Pha loãng bằng pha động đến vạch và trộn đều. Lấy chính xác 5
ml dung dịch này cho vào bình định mức 50 ml. Pha loãng bằng pha động đến
vạch và trộn đều. Lọc qua màng lọc 0,45 m.
 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
TRONG KIỂM NGHIỆM
Điều kiện sắc ký:
• Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 m).
• Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 214 nm.
• Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
• Thể tích tiêm: 30 l.
Cách tiến hành:
• Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Độ
phân giải giữa pic tương ứng với paracetamol và codein phosphat không được nhỏ
hơn 2,0. Độ lệch chuẩn tương đối của các diện tích đáp ứng từ các lần tiêm lặp lại
không được lớn hơn 2,0% đối với pic paracetamol và 3,0% đối với pic codein
phosphat.
• Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
• Tính hàm lượng paracetamol C8H9NO2 và hàm lượng codein phosphat hemihydrat
C18H21NO3.H3PO4. ½ H2O có trong viên dựa vào diện tích pic thu được từ dung dịch
thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C8H9NO2 của paracetamol chuẩn, hàm lượng
C18H21NO3.H3PO4. ½ H2O của codein phosphat chuẩn.