NỘI DUNG

Quá trình tách trong HPLC

Thiết bị HPLC

Ứng dụng
Quá trình tách trong HPLC

Tổng quan về sắc ký

Nguyên lý hoạt động

Video minh họa

2
 Quá trình tách chất phân tích trong thiết bị HPLC

Tổng quan
về sắc ký Sắc ký là một phương pháp phân tách mà trong đó các thành
phần cần tách sẽ được phân bố giữa hai pha. Một trong hai pha
này được gọi là pha tĩnh và pha còn lại là pha động, chuyển
động trên pha tĩnh theo hướng xác định. Thành phần hỗn hợp
tự phân bố lại giữa hai pha bằng việc thông qua quá trình có thể
là hấp thụ, phân vùng hay trao đổi ion hoặc loại trừ, kích thước.
Pha tĩnh ở đây có thể là chất rắn hay chất lỏng, còn pha động
có thể là chất lỏng, khí hay chất lỏng siêu tới hạn
 Nguyên lý hoạt động thiết bị HPLC
Tách hỗn hợp thành các thành phần trên
cơ sở cấu trúc phân tử và thành phần
phân
:
tử.
Điều này liên quan đến pha tĩnh (chất rắn
hoặc chất lỏng được hỗ trợ trên chất rắn)
và pha động (chất lỏng hoặc chất khí).
+ Pha động chảy qua pha tĩnh và tách các
thành phần trong hỗn hợp mẫu.
+ Các thành phần mẫu có ái lực khác nhau
với pha tĩnh. Thành phần nào tương tác
mạnh với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn
qua cột so với các thành phần có ái lực yếu
hơn.
Thiết bị HPLC
Sơ đồ cấu tạo HPLC

Vai trò của thiết bị

Video minh họa

6
 Sơ đồ thiết bị
HPLC HPLC

Bơm

Bình đựng dung môi Bộ phận đuổi bọt khí

Máy tính
 Vai trò của thiết bị
A Eluent E Column
Vai trò làm bình chứa dung môi pha động. Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống
sắc ký lỏng hiệu năng cao.
B Degasser
F Column oven
Vai trò lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi
Ổn định nhiệt độ cột
pha động.

C Pump G  Detector (đầu dò)

Vai trò là để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và
chia tách sắc ký. cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính
Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút. và định lượng.

H Máy tính
D Sample Injection Unit (bộ tiêm mẫu)
Ghi nhận tính hiệu từ đầu dò.
Vai trò là đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích
bơm có thể thay đồi: tiêm thủ công và tiêm tự động. I Bình thải
Đựng chất thải
Ứng dụng HPLC: Xác định hàm lượng Vitamin B1 và
B6 có trong mẫu nấm.

Hóa chất

Thiết bị và dụng cụ

Quy trình phân tích

Kết quả phân tích

10
Methanol
Hóa chất
Axit
1-heptansulfunic HCl 1M

Iso butanol

Axit glyocylic

Axit axetic

Chất chuẩn B1 và B6
 Vai trò hóa chất
HÓA CHẤT VAI TRÒ

Thiamine hyđrochloride Chất chuẩn B1

Pyridoxamin đihyđrochlorua Chất chuẩn B6

CH3COONa.3H2O Dung dịch đệm

Metanol Dung môi pha động

Iso butanol Dung môi pha động
HCl 1N; HCl 0,1M Tạo môi trường pH = 1

NaBH4 Khử Pyridoxal về Pyridoxine

KH2PO4; H3PO4; axit 1- heptane sulfonic Dung môi pha động

 Các dụng cụ và thiết bị

Thiết bị HPLC Máy li Thiết bị lọc dung môi Giấy Lọc

Cân phân
tâm
tích

Bình định mức Beacher

Nồi cách thủy 6 chỗ Máy nghiền mẫu
Máy rung siêu Máy lắc
âm

13
Ứng Dụng: Chuẩn bị mẫu nấm phân tích

cắt phần mũ
nấm thành từng
miếng (không
phơi khô tự lấy phần cuống
nhiên nấm) cỡ 3-5cm.

cân 30g

nghiền mịn
trộn đồng
làm lạnh sơ bộ nhất

phân tích
ngay
 Xử lý mẫu nấm xác định vitamin B1
Cân 2g mẫu 100ml HCl 1N
pH=1

Thủy phân nồi Để nguội chỉnh

cách thủy 1 giờ pH= 3,75- 4,75
bằng
2,5N
Bơm vào
HPLC Thêm isobutanol 3ml NaOH 15%
đến vạch

Lắc trong 1 phút

Giấy lọc
 Xử lý mẫu nấm xác định vitamin B6
Tiến hành xử lý các mẫu nấm lớn xác định vitamin B6 theo 2 quy trình:
Quy trình 1: Theo TCVN 9513: 2012 [3].

Lọc
Quy trình 2: Với các ký hiệu 3 dạng tồn tại có thể chuyển hóa cho nhau
của B6 là: PN(Pyridoxine); PL(Pyridoxal); PM(Pyridoxamine).
Nguyên tắc quá trình xử lý các mẫu nấm như sau:
Bước 1: PM thực hiện phản ứng với axit glyoxylic tạo PL.
Bước 2: PL bị khử quay trở lại PN bằng trong dung dịch axit yếu.
 a) Quy trình xây dựng đường chuẩn B1
Bảng số liệu:

STT 1 2 3 4 5
Bình định mức 100ml

Vml 0,2(mg/L) 40 20 10 5 4

Thêm 20ml dung dịch chuẩn gốc thiamin hydroclorua

Thêm 20ml dung dịch HCl 1N

Định mức 100ml

Kết quả đo vitamin B1:

(mg/L) vitamin B1
0,5 1 2 4 5

S 823112 1500612 2855612 5565612 6920612

8000000

6000000 f(x) = 1355266.66666667 x + 144545.333333333

R² = 0.999999922568457
4000000

2000000

00 1 2 3 4 5 6
Đường chuẩn xác định vitamin B1
 b) Quy trình xây dựng đường chuẩn vitamin B6
Bảng số liệu:

STT Bình định mức 100ml 1 2 3 4

Vml 0,2 (mg/L) 20 10 5 4

Thêm 20 ml dung dịch chuẩn gốc pyidoxamin đihiđroclorua

Thêm 20ml nước cất

Định mức 100ml

Kết quả đo vitamin B6:

/L) vitamin B6 1 2 4 5

S 1090555 2067676 4021918 4999039

ĐƯỜNG CHUẨN XÁC ĐỊNH VITAMIN B6

6000000
5000000 f(x) = 977121 x + 113434
R² = 1

4000000
3000000
2000000
1000000
0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5
c. Phân tích mẫu thực Bảng hàm lượng vitamin B1, B6 trong các mẫu nấm thực
Sắc ký đồ của một số mẫu chuẩn và mẫu nấm lớn
 Bàn luận kết quả

Kết quả phân tích thu được cho thấy trong khi hàm
lượng B1 trong tất cả 10 mẫu nấm lớn đều lớn, dao
động từ 0,8144 mg/kg đến 3,4954 mg/kg thì hàm
lượng B6 trong 10 mẫu nấm lớn đều nằm dưới
ngưỡng phát hiện của phương pháp.
 1.Xác định hàm lượng vitamin B1
 
Hàm lượng vitamin B1(mg/kg) trong mẫu đo là:
  Cx= (mg/kg)
 
Hàm lượng vitamin B1(mg/kg) trong mẫu định mức lần 2 là:
 
C đm2= Cx.F= . (mg/kg)
 
Hàm lượng vitamin B1(mg/kg) có trong mẫu nấm hút là:
 
C hút= C đm2=. (mg/kg)
 
Hàm lượng vitamin B1 (mg/kg) có trong mẫu nấm ban đầu là:
 
m= C hút . F = . . = = 3,69 (mg/kg)
Nhận xét: Với hàm lượng vitamin B1 mẫu nấm ban đầu là 3,69(mg/kg), so với điều kiện phân tích và với độ lệch
chuẩn của phương trình đường chuẩn là R2=1 Kết quả phân tích đạt
 2. Xác định hàm lượng vitamin B6
 
Hàm lượng vitamin B6 (mg/kg) có trong mẫu nấm đem đo là:
  Cx= (mg/kg)

Hàm lượng vitamin B6 (mg/kg) có trong mẫu nấm đem đi định mức là:
 
Cđm= C x . F = (mg/kg)

Hàm lượng vitamin B6(mg/kg) có trong mẫu nấm ban đầu là:
 
m= Cđm . F = = = 0,8144(mg/kg)
 
Nhận xét: Với hàm lượng vitamin B6 trong mẫu nấm ban đầu là 0,8144 (mg/kg), so với điều kiện phân tích
và với độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn là R 2=1 Kết quả phân tích đạt.
 Nhóm 5

GAME ÔN TẬP KAHOOT

Cảm ơn Thầy và Các

bạn đã lắng nghe bài
thuyết trình