TỔNG CỤC MÔI TRƯƠNG

TR
TRUNG TÂM QUAN TRẮC MÔI TRƯỜNG
TR
CEM LABORATORY

XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG

CỦA PHƯƠNG
PH PHÁP
(Method Validation)

Người trình bày: Đoàn Văn Oán

Hà Nội, 30/8/2013
CEM LABORATORY Nội dung
1. Xác nhận giá trị sử dụng (MV)
 MV là gì?
 Tại sao thực hiện MV là cần thiết?
 Khi nào thì cần thực hiện MV?
2. Thông số đặc trưng khi thực hiện MV
 Độ chụm (Precision)
 Độ chọn lọc (Selectivity)
 Độ chệch (Bias)
 Độ nhạy (Sensitivity)
 Độ tuyến tính & Khoảng làm việc (Linearity & Working Rang
 Giới hạn phát hiện (Detection Limit)
 Giới hạn định lượng (Quantitation Limit)
 Yếu tố ảnh hưởng (Ruggedness and Robustness)
3. Ước lượng độ không đảm bảo đo
Principles of Method Validation – Part 1 Page 2
CEM LABORATORY MV là gì?
Khẳng định bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan
rằng các yêu cầu xác định cho việc sử dụng phương pháp là
phù hợp với mục đích và điều kiện phân tích cụ thể đã được
thực hiện.

 Độ chụm
 Độ chọn lọc
 Độ chệch
 Độ nhạy
 Độ tuyến tính & Khoảng làm việc
 Giới hạn phát hiện
 Giới hạn định lượng
 Các yếu tố ảnh hưởng

Principles of Method Validation – Part 1 Page 3

CEM LABORATORY Tại sao cần thiết phải thực hiện MV?

 Tính khoa học: Nguyên lý khoa học; tích chính xác; tính ổn
định
 Tính thực tiễn: Phạm vi của phương pháp; nguồn lực thực
hiện; sự an toàn; nhu cầu của khách hàng/chấp nhận của pháp
lý; khả năng so sánh và phổ biến; thời gian và giá thành…
 Cung cấp các kết quả tin cậy để đảm bảo rằng bất kỳ một
quyết định nào đưa ra dựa trên kết quả đó là đáng tin cậy
 Đáp ứng yêu cầu của ISO/IEC 17025

Principles of Method Validation – Part 1 Page 4

CEM LABORATORY Khi nào cần thực hiện MV?
MV

 Phương pháp mới đối với một vấn đề cụ thể

 Chỉnh sửa phương pháp đã có
- Cải tiến
- Mởi rộng phạm vị
 Khi QC chỉ ra rằng phương pháp đã thay đổi theo thời gian
 Khi phương pháp thiết lập được đưa vào sử dụng
- Trong một PTN khác
- Với người phân tích khác.
- Thiết bị khác
 Để chứng tỏ sự tương đương
đươ giữa 2 phương pháp

Principles of Method Validation – Part 1 Page 5

CEM LABORATORY Tiến trình thực hiện

Xác định các yêu cầu phân tích

Lựa chọn phương

ph pháp áp dụng

Giải pháp thực hiện MV

1. Thẩm định lại phương pháp đã MV trước đó
2. Đánh giá lại phương pháp khi có bất kỳ một sự thay đổi nào
3. Xác nhận giá trị sử dụng khi thay đổi từ phương pháp này
sang phương pháp khác
4. MV một phương pháp mới

Kế hoạch thực hiện MV

Principles of Method Validation – Part 1 Page 6

CEM LABORATORY Tiến trình thực hiện (tiếp)

Tiến hành thực hiện MV

1. Đánh giá thông tin phê duyệt (so sánh các số liệu tạo ra v
các yêu cầu)
2. Nếu cần thiết, cải tiến phương phấp để đáp ứng yêu cầu
3. Khi các yêu cầu được đáp ứng cần phải văn bản ho
phương pháp và kết quả phê duyệt phương pháp

Xác định thủ tục kiểm soát chất lượng

l
Sử dụng phương pháp tin cậy, cùng với các quy trình kiểm soá
chất lượng phù hợp và tham gia thử nghiệm thành thạo đ
cung cấp bằng chứng tin cậy liên tục.

Principles of Method Validation – Part 1 Page 7

 Thông số đặc trưng thực hiện MV đối với các
phép phân tích
CEM LABORATORY

Principles of Method Validation – Part 1 Page 8

CEM LABORATORY Mẫu thử nghiệm
Mẫu thực hiện MV phải đáp ứng các yêu cầu sau:
 Có lượng mẫu phù hợp
 Được dán nhãn phù hợp
 Đại diện cho loại mẫu đang được thử nghiệm
 Được vận chuyển và lưu giữ dưới các điều kiện có thể duy trì tính
nguyên vẹn của mẫu
 Được phân tích trong khoảng thời gian phù hợp tính từ
 thời điểm lấy mẫu
 Vật liệu/Hóa chất được thêm vào để ổn định mẫu cần phải đượ
nhận diện đầy đủ
 Vật liệu được sử dụng cho thiết bị lấy mẫu cần phải được quy định
 Người phân tích cần có một số hiểu biết, nhận thức về độ không
đảm đo liên quan trong quá trình lấy mẫu vì nó ảnh hưởng đến sự
biến đổi có thể có trong quá trình phân tích

Principles of Method Validation – Part 1 Page 9

CEM LABORATORY Độ chụm (Precision)

Mức độ gần nhau giữa các kết quả thử nghiệm độc lập thu
được trong cùng điều
iều kiện quy định
Độ chụm thường được biểu diễn bởi các thuật ngữ sau
 Độ lệch chuẩn (s)

 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hoặc hệ số biến thiên (CV)

 Độ lệch chuẩn trung bình (SDM) của các thí nghiệm lặp được
biết như sai số chuẩn của các giá trị trung bình

Principles of Method Validation – Part 1 Page 10

CEM LABORATORY Độ chụm/Độ lặp lại (Repeatability)

Độ lặp là phép đo sự biến đổi của các kết quả đo trong thời
gian ngắn
Độ
Độ lặp lại là độ chụm của các kết quả được đo dưới điều
kiện:
- Cùng phương pháp
- Cùng vật liệu thử nghiệm
- Cùng phòng thí nghiệm
- Cùng người thực hiện
- Trong khoảng thời gian ngắn

Principles of Method Validation – Part 1 Page 11

CEM LABORATORY Độ chụm/Độ tái lập (Reproducibility)

Độ tái lập là phép đo sự biến đổi của các kết quả đo trong
thời gian dài
Độ
Độ tái lập là độ chụm của các kết quả được đo dưới điều
kiện:
- Cùng phương pháp
- Cùng vật liệu thử nghiệm
- Khác phòng thí nghiệm
- Khác người thực hiện
- Khác thiết bị đo
- Trong thời gian dài

Principles of Method Validation – Part 1 Page 12

CEM LABORATORY Độ chụm/Độ chụm trung gian (Intermediate)

Độ chụm trung gian là phép đo sự biến đổi của các kết quả đo
trong thời gian dài trong một phòng thí nghiệm
Độ
Độ chụm trung gian là độ chụm của các kết quả được đo dướ
điều kiện:
- Cùng một PTN
- Cùng phương pháp
- Cùng vật liệu thử nghiệm
- Có sự thay đổi lớn về điều
đ kiện đo
• Khác người thực hiện
• Khác ngày thực hiện
• Khác thiêt bị đo…
- Trong khoảng thời gian dài (1-3
(1 tháng)

Principles of Method Validation – Part 1 Page 13

CEM LABORATORY Độ chụm - Ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau

Principles of Method Validation – Part 1 Page 14

CEM LABORATORY Ước tính độ chụm

 Số lượng các phép phân tích lớn, độ tin cậy ước tính độ chụm
càng lớn

 7 - 15 phép phân tích độc lập cần được xác định

 Yêu cầu tối thiểu trong phân tích nước
n là 10 bậc tự do (n-1)
 Độ chụm phụ thuộc vào nền mẫu và nồng độ phân tính, ước
tính trên toàn dải nồng độ làm việc.

Principles of Method Validation – Part 1 Page 15

CEM LABORATORY Độ chụm Vs Nồng độ chất phân tích

30
RSD (Reproducibility) %
20

10

-10

-20

-30
100 ppb

100 ppm
1 ppm

10 ppm
10 ppb

10 %
1%
0.1 %

100 %
Nồng độ chất phân tích
Principles of Method Validation – Part 1 Page 16
CEM LABORATORY Độ chệch (Bias)

Mức độ sai khác giữa kỳ vọng của các kết quả thử nghiệm và
giá trị qui chiếu được chấp nhận
 Nghiên cứu độ chệch là nghiên cứu tổng sai số hệ thống. Sự
sai khác hệ thống so với giá trị quy chiếu được chấp nhận
càng lớn thì độ chệch càng lớn
 Độ chệch gồm:
Độ chệch phòng thí nghiệm
Độ chệch phương pháp

 Độ chệch có thể âm hoặc dương

Principles of Method Validation – Part 1 Page 17

CEM LABORATORY Độ chệch (tiếp)
Nguyên nhân sai số
 Mẫu phân tích
 Phương pháp
 Thiết bị đo
 Độ thu hồi không hoàn toàn
 Phòng thí nghiệm hoặc người
ng phân tích…
Sai số tổng thể được xác định từ
 Phân tích các chất chuẩn đã biết trước nồng độ (CRM) có
nền phù hợp
 Thử nghiệm xác định độ thu hồi mẫu thêm chuẩn
 So sánh liên phòng
 Phương pháp đối chứng độc lập

Principles of Method Validation – Part 1 Page 18

CEM LABORATORY Ước lượng sai số từ việc thêm chuẩn

R2-R1

(R4)

R4 lượng chất thêm chuẩn

Sai số = R3 - R4
Ví dụ: Xác định Atrazine trong nước
Sai số = (45.9 ng/L – 32.4 ng/L) – 15.0 ng/L
Sai số = 13.5 ng/L – 15.0 ng/L
Sai số = -1.5 ng/L

Principles of Method Validation – Part 1 Page 19

CEM LABORATORY Xử lý với các sai số

Khi có một sai số lớn mà không thể loại bỏ

 Người sử dụng số liệu phân tích cần phải được cảnh báo sự
tồn tại của chúng
 Hiệu chỉnh phép đo o hàng ngày
 Báo cáo giá trị đo
o và sai số riêng rẽ
 Độ không đảm bảo đo o (MU) kết hợp với hiệu chỉnh sai số
có thể sẽ được tính đến

Principles of Method Validation – Part 1 Page 20

CEM LABORATORY Độ đúng (Độ chệch) Vs Độ chụm

Inaccurate &
Không Đúng và
imprecise
Không Chụm

Inaccurate but Accurate but

Chụm và Không Đúng và Không
precise imprecise
Đúng Chụm Đúng và Chụm

Principles of Method Validation – Part 1 Page 21

CEM LABORATORY Độ chọn lọc (Selectivity)

Đặc trưng của một phương pháp: Mức độ mà nó có thể

phát hiện và xác định rõ ràng một chất phân tích nhất định
trong một hỗn hợp, mà không có sự ảnh hưởng từ các
thành phần khác

Phổ hấp thụ nguyên tử, Phổ phát xạ nguyên tử, Phổ huỳnh quang,
Phổ khối…

vs.

time time

Principles of Method Validation – Part 1 Page 22

 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc
(Linearity and Working range)
CEM LABORATORY

 Khoảng tuyến tính: khoảng nồng độ của chất phân tích mà

phương pháp phân tích cho kết quả phân tích tỷ lệ thuận với
nồng độ chất phân tích.
 Khoảng làm việc: khoảng nồng độ của chất phân tích mà
thiết bị cho tín hiệu đáp ứng tốt.
Tính toán độ tuyến tính và khoảng làm việc
 Phân tích các mẫu chuẩn đã biết nồng độ
 Tối thiểu phân tích tại 6 cấp nồng độ
 Vẽ đồ thị từ các kết quả thu được
- Đánh giá độ tuyến tính bằng hệ số hồi quy r2 > 0,99
- Xác định khoảng tuyến tính tương đối, cận trên và cận
dưới của khoảng làm việc.

Principles of Method Validation – Part 1 Page 23

CEM LABORATORY Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc

Principles of Method Validation – Part 1 Page 24

CEM LABORATORY Giới hạn phát hiện (LoD) và Giới hạn định lượng (LoQ)

 Giới hạn phát hiện (LoD) là nồng độ chất phân tích nhỏ nh
có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết xác định hà
lượng trong điều kiện thí nghiệm.
 Giới hạn định lượng (LoQ
LoQ) là nồng độ thấp nhất của chất ph
tích trong mẫu có thể định lượng được với độ chụm và đ
đúng chấp nhận được trong điều kiện tiến hành phân tích
 Giới hạn phát hiện (LoD):
(LoD Giới hạn phát hiện của thiết
(IDL) và Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL)
 Giới hạn định lượng (LoQ
LoQ): Giới hạn định lượng của thiết
(IQL) và Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL)

Principles of Method Validation – Part 1 Page 25

CEM LABORATORY Giới hạn phát hiện (LoD) và Giới hạn định lượng (LoQ)

LoD = 3 x S/N LoQ = 3 LoD = 9 S/N

(Dựa vào độ lệch chuẩn của nhiễu)

Độ lệch chuẩn của

nhiễu SD

Principles of Method Validation – Part 1 Page 26

CEM LABORATORY Tính toán giới hạn phát hiện của phương pháp (MD
EPA 40 CFR Part 136.. APPENDEX B, revision 1.11
1. Dự đoán MDL của chất phân tích
2. Chuẩn bị 2 mẫu thêm chuẩn (Spike) có nồng độ bằng 5 lần giá t
MDL dự đoán
3. Phân tích 2 mẫu này theo quy trình phân tích và ghi nhận kết quả phâ
tích
4. Nếu hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu, chuyển sang bước tiếp theo. Nế
không đạt yêu cầu, quay trở lại bước (1) và chọn MDL cao hơn.
5. Chuẩn bị ít nhất 7 mẫu thêm chuẩn có nồng độ như bước (2) và phâ
tích theo quy trình phân tích
6. Ghi nhận kết quả và tính toán MDL
Kiểm tra lại giá trị MDL thu được
1. MDL < Spike < 10xMDL
2. S/N có nằm trong khoảng yêu cầu không? 2,5 – 10?
3. Hiệu suất thu hồi có nằm trong khoảng yêu cầu không? 70 – 110?

Principles of Method Validation – Part 1 Page 27

CEM LABORATORY Ví dụ tính toán MDL

• Phân tích Toluen trong nước Kết quả

Mẫu H%
bằng GC/MS ug/L
Mẫu 1 0,23 110
• MDL ước tính là 0,040 ug/L
Mẫu 2 0,21 100
• Nồng độ Spike 0,21 ng/L vào Mẫu 3 0,24 114
nền nước cất 2 lần Mẫu 4 0,19 90
Mẫu 5 0,18 86
Mẫu 6 0,22 105
Mẫu 7 0,17 81
• MDL < Spike < 10x MDL Mẫu 8 0,16 76
0,084 < 0,21 < 0,84 Mẫu 9 0,23 110
AVE 0,20 96,9
• S/N = 0,20/0,029 = 7,0
SD 0,029
• AVE H = 96,9% MDL 0,084
S/N 7,0

Principles of Method Validation – Part 1 Page 28

CEM LABORATORY Yếu tố ảnh hưởng (Robustness and Ruggedness)

 Xem xét độ nhạy của các thông số đặc trưng của phương
pháp đối với những thay nhỏ của môi trường và điều kiện
phân tích mà không hoặc ít ảnh hưởng đến kết quả phân
tích.
 Chỉ ra mức độ ổn định của phương pháp trong quá trình sử
dụng

Principles of Method Validation – Part 1 Page 29

CEM LABORATORY Tài liệu tham khảo

EURACHEM Guide 1998

The Fitness for Purpose of Analytical Methods

IUPAC Technical Report 2002

Harmonized Guideline for Single Laboratory Validation of
Methods, Pure Appl. Chem.
Chem 2002, 74, 835-855

Principles of Method Validation – Part 1 Page 30

CEM LABORATORY

XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN!

Principles of Method Validation – Part 1 Page 31