Thẩm định phương pháp

(Validation)
Thẩm định phương pháp là gì?

Thẩm định phương pháp là sự xác nhận thông qua việc (FDA, US)
kiểm tra và cung cấp các bằng chứng khách quan cho thấy
các đặc điểm kỹ thuật cụ thể của một hoạt động có chủ
đích đã được thỏa mãn
Là quá trình cung cấp bằng chứng đã được ghi nhận http://www.fw
chứng minh một phương pháp thực hiện được đúng theo s.gov/aah
dự kiến. Để đảm bảo rằng phương pháp phân tích đó:
– Chính xác
– Đặc hiệu
– Lặp lại được
Là quá trình xác định sự phù hợp của một phương pháp J. Guerra
nhất định đối với việc cung cấp các thông số phân tích hữu
ích
 Tại sao chúng ta cần
Thẩm định phương pháp?
• Kết quả phân tích biến đổi:
– Do độ lệch không tránh khỏi khi thực hiện phép đo
– Do sự không đồng nhất giữa các mẫu đo
– Do các yếu tố nhiễu
– Do các thông số cần đo khác nhau
• Sự biến thiên luôn tồn tại, nhưng câu hỏi
chính là: độ biến thiên ở mức nào thì được coi
là chấp nhận được khi sử dụng phương pháp
đó?
Phù hợp với mục đích (Fit-For-Purpose)
• Các phương pháp phân tích được dùng để đo lường sự vật với độ
chính xác và độ đúng đủ để đi đến kết luận.
• Một số phương pháp có thể đơn giản, một số khác thì phức tạp.
Nhưng tất cả đều cần phải tin tưởng được.
• Các phương pháp phân tích được phát triển theo mục đích định sẵn.
Chúng được thiết kế để trả lời một câu hỏi khoa học cụ thể
• Không có một phương pháp nào hoàn hảo hay có thể áp dụng chung;
tất cả đều có hạn chế.
• Một phần của việc phát triển phương pháp là phát hiện các hạn chế
đó và xác định phạm vị áp dụng của phương pháp.
• Sau khi đã phát triển, điều quan trọng là chứng tỏ được phương pháp
có thể đạt được mục đích đã đặt ra.
• Do đó, thẩm định phương pháp là một cách để đảm bảo rằng khi sử
dụng đúng mục đích, phương pháp đó có thể đưa ra các kết quả
chính xác một cách nhất quán.
• Nói cách khác, thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp đó
“phù hợp với mục đích”.
“Phù hợp với mục đích” có nghĩa là gì?
• Phù hợp – nghĩa là phương pháp thích hợp và chính
xác để dùng trả lời câu hỏi khoa học cụ thể đó.
• Mục đích – Quyết định, Sàng lọc, Điều trị, Nghiên cứu.
• Phù hợp với mục đích
• Việc thực hiện các thử nghiệm nghiêm ngặt đã chứng
tỏ rằng phương pháp “phù hợp” để đưa ra các kết quả
chính xác và lặp lại được, đúng như “mục đích” đã đề
ra (khi sử dụng trong các giới hạn xác định bởi
phương pháp đó).
• Nếu một phương pháp chưa được thẩm định cho một
mục đích nhất định, không thể biết được số liệu tạo ra
có chính xác hay không.
 Phù hợp với mục đích
• Bạn có dùng nhiệt kế đo miệng để đo nhiệt
độ tủ sấy khô không?
• Bạn có tin tưởng kết quả xét nghiệm từ que
thử thai dùng mẫu nước bọt không?
• Bạn có tin tưởng kết quả glucose khi phương
pháp xét nghiệm được thiết lập cho muc
đích định lượng glucose không?
• Bạn có chấp nhận đi từ Kisumu đến Mombasa
(cách nhau 825km) bằng xe tuk-tuk ko?
 Phù hợp với mục đích
• Nhà khoa học tốt sẽ đảm bảo rằng họ đang sử dụng
đúng phương pháp cho đúng mục đích.
– Phương pháp có được sử dụng cho các loại mẫu mà nó đã
được xác nhận để phân tích không?
– Khoảng giá trị đã thẩm định có bao gồm giá trị đang được
đo không?
• Trách nhiệm của quản lý PXN là đảm bảo phương pháp
đang sử dụng để tạo ra số liệu, để trả lời một câu hỏi
cụ thể, đã được chứng minh là phù hợp với mục đích
đó.
• Việc tạo ra số liệu không đáng tin có thể dẫn tới kết
quả sai lệch, khiến bác sỹ điều trị đưa ra các kết luận
sai lầm và kéo theo các hậu quả sâu rộng khác.
 Yêu cầu của ISO 15189
5.5 Giai đoạn trong xét nghiệm
– Xác nhận lại giá trị sử dụng của quy trình xét
nghiệm (Verification of examination
procedures)
– Thẩm định phương pháp của quy trình xét
nghiệm (Validation of examination
procedures)
– Đo lường sự không chắc chắn của các giá trị
định lượng đã đo (Measurement uncertainty
of measured quantity values)
 5.5.1.1 Tổng quan
– PXN phải lựa chọn các quy trình xét nghiệm
đã được thẩm định cho mục đích sử dụng đã
định
– Danh tính của những người thực hiện các
hoạt động trong xét nghiệm phải được lưu hồ
sơ
– Các yêu cầu cụ thể (đặc tính hiệu suất hoạt
động– performance specifications) cho mỗi
quy trình xét nghiệm phải liên quan tới mục
đích sử dụng của xét nghiệm đó.
 Thẩm định (Validation) và
Xác nhận lại (Verification) là gì?
– Xác nhận lại (Verificaiton): xác nhận, thông
qua việc cung cấp bằng chứng khách quan,
rằng những yêu cầu cụ thể đã được thỏa mãn.
– Thẩm định (Validation): xác nhận, thông qua
việc cung cấp bằng chứng khách quan, rằng
những yêu cầu nhằm phục vụ một mục đích
sử dụng hoặc ứng dụng cụ thể đã được thỏa
mãn.
 5.5.1.2 Xác nhận lại các quy
trình xét nghiệm
– Các quy trình xét nghiệm đã được thẩm định và sử dụng mà không
sửa đổi phải được xác nhận lại một cách độc lập bởi PXN
– PXN phải thu thập thông tin từ nhà sản xuất/nhà phát triển
phương pháp để xác nhận các đặc điểm hiệu suất của quá trình.
– Việc xác nhận lại độc lập phải xác nhận, qua việc thu thập bằng
chứng khách quan, rằng hiệu suất đề ra của quá trình đã được đáp
ứng.
– Hiệu suất đề ra của quá trình xét nghiệm được xác nhận trong quá
trình xác nhận lại giá trị sử dụng phải là những hiệu suất liên quan
tới mục đích sử dụng của kết quả xét nghiệm
– PXN phải lưu hồ sơ quy trình dùng để xác nhận lại và ghi nhận các
kết quả thu được. Nhân viên có thẩm quyền phải xem xét kết quả
xác nhận lại và ghi biên bản.
Khi nào thực hiện xác nhận lại giá trị
sử dụng của phương pháp
(Method Verification)?
• Xác nhận lại giá trị sử dụng cần được thực
hiện khi:
– Có sự thay đổi quan trọng, ví dụ sử dụng thiết
bị mới nhưng tương tự thiết bị đã có,
– Thay đổi vị trí của thiết bị,
– Khi thiết bị được cập nhật phần mềm, hoặc
– Khi việc kiểm soát chất lượng cho thấy hiệu
suất hoạt động của một phương pháp đã thiết
lập đang thay đổi theo thời gian.
5.5.1.3 Thẩm định quy trình xét nghiệm
– PXN phải thẩm định các quy trình xét nghiệm
lấy từ các nguồn sau:
a) Phương pháp không chuẩn;
b) Phương pháp được thiết kế hoặc phát triển bởi PXN;
c) Phương pháp chuẩn nhưng được sử dụng ngoài phạm
vi dự kiến;
d) Phương pháp đã thẩm định nhưng lại bị sửa đổi.
– Việc thẩm định phải được thực hiện với quy mô
đủ rộng và xác nhận, qua việc cung cấp bằng
chứng khách quan (dưới dạng đặc điểm hiệu
suất hoạt động - performance characteristics),
chứng tỏ các yêu cầu cụ thể cho mục đích sử
dụng của xét nghiệm đã được thỏa mãn.
5.5.1.3 Thẩm định quy trình xét nghiệm
– PXN phải lưu hồ sơ quy trình sử dụng để thẩm
định phương pháp và ghi lại các kết quả thu
được. Nhân viên có thẩm quyền phải xem xét
các kết quả thẩm định và ghi lại biên bản.
– Khi có sự thay đổi cho một quá trình xét
nghiệm đã được thẩm định, ảnh hưởng của
thay đổi đó phải được ghi lại, và khi thích
hợp, phải thực hiện việc thẩm định phương
pháp mới.
Yêu cầu Xác nhận lại (Verification) và
Thẩm định (Validation)
Thông tin Hành động

Phương pháp đã được thẩm định và được PXN sử dụng mà không sửa Xác nhận lại giá trị sử
đổi gì dụng
(Phương pháp đã được thẩm định trước đó và có thông tin)

Phương pháp chuẩn – mở rộng và sửa đổi (ví dụ: thiết bị mới) Thẩm định

Phương pháp chuẩn – sử dụng ngoài phạm vi dự kiến Thẩm định

Phương pháp được PXN thiết kế và phát triển Thẩm định

Phương pháp đã được thẩm định, sau đó bị sửa đổi Thẩm định
Thẩm định Phương pháp định tính
– Độ đặc hiệu (Specificity) và độ nhạy (Sensitivity)
xét nghiệm là các thông số cần quan tâm
– Độ nhạy xét nghiệm: xác suất xét nghiệm có kết
quả dương tính với người bệnh có triệu chứng (Sn =
Dương tính) .
– Độ đặc hiệu xét nghiệm: xác suất xét nghiệm có
kết quả âm tính với người bệnh không có triệu
chứng (Sp = Âm tính).
Thẩm định Phương pháp Định tính –
Cách thực hiện
– Yêu cầu thực hiện với ít nhất 10 mẫu dương tính và
10 mẫu âm tính đã biết
– Thực hiện chạy các mẫu theo quy trình xét nghiệm
cần được thẩm định.
– Một số PXN có thể xem xét chạy mẫu 2 lần bởi 2
người và sử dụng các kết quả tương đồng của 2 lần
chạy đó (use the results which were agreeing
between analysts)
– Phân tích kết quả theo bảng … (contingency table)
như sau:
 Contingency Table
Phương pháp Kết quả dự kiến Tổng

Dương tính Âm tính

Dương tính TP (10) FP (0) TP + FP (10)

Âm tính FN(0) TN (10) FN + TN (10)

Tổng TP + FN (10) FP + TN (10)

Độ nhạy = 100x {TP/ (TP+FN)} TP (True Positive) = Dương tính thật

FP (False Positive) = Dương tính giả
Độ đặc hiệu = 100x {TN / (FP+TN)} TN (True Negative) = Âm tính thật
FN (False Negative) = Âm tính giả
 Tiêu chuẩn chấp nhận
– PXN tự đặt ra tiêu chuẩn chấp nhận cho các kết
quả thẩm định
– Tiêu chuẩn chấp nhận phải được đặt ra trước khi
thực hiện chạy mẫu.
– Thông thường, một số PXN có thể đặt tiêu chuẩn
chấp nhận như sau:
• Độ nhạy: > 95 %
• Độ đặc hiệu: > 95%
 Bài tập
• Việc thẩm định phương pháp cho bộ kit thử thai của
hãng Biocare được thực hiện ở PXN của bạn.
- 500 phụ nữ mang thai đã được kiểm tra, trong đó có
479 kết quả dương tính, còn lại là âm tính.
- 506 phụ nữ không mang thai đã được kiểm tra, trong
đó có 490 kết quả âm tính, còn lại là dương tính.
• Tiêu chuẩn chấp nhận của cả độ nhạy và độ đặc hiệu
là 98%.
• Sử dụng bảng Contingency để tính toán kết quả thẩm
định phương pháp.
• Bạn có kết luận gì sau khi đã có kết quả thẩm định
phương pháp?
Thẩm định Phương pháp Định lượng
 Xác định độ chụm (Precision)
 Độ lặp lại (Repeatability)
 Độ chụm trung gian Thẩm định phương pháp
cơ bản
 Xác định độ đúng/độ chính xác
 Measuring Interval/Linearity
 Độ đặc hiệu phân tích,
 Bao gồm các chất gây nhiễu,
 Độ nhạy phân tích/Ngưỡng phát hiện
 Ngưỡng định lượng
 Độ chính xác và độ chụm
– Độ chính xác đề cập tới mức độ gần đúng giữa kết quả
một phép đo và giá trị thật của đại lượng đo. Khi giá trị
đo được càng xa với giá trị thật, thì phương pháp đó
càng không chính xác.
– Độ chụm liên quan tới mức độ gần đúng giữa các bộ số
liệu của 1 biến số ngẫu nhiên thu thập được qua các lần
quan sát lặp lại. Nếu những bộ số liệu đó phân bố gần
nhau, chúng được cho là đã được thu thập với độ chụm
cao.
(Precision is related to the closeness to one another of a
set of repeated observation of a random variable. If such
observations are closely gathered together, then they
are said to have been obtained with high precision.)
 Độ chụm và độ chính xác
• Chụm và không chính xác • Chụm và chính xác
Phân tán (không chụm) và
không chính xác
 Độ chụm (Precision)
• Độ lặp lại:
– Độ lặp lại là giá trị định lượng biểu hiện sự không đồng nhất trong một
bộ các kết quả đo lặp lại khi chúng được thực hiện trong cùng điều
kiện (hoặc thực hiện trong cùng 1 lần chạy)
– Repeatability is a quantitative value indicating the disagreement
among a set of replicate measurements when all measurements are
made under identical conditions (or within a single run of a
procedure).
• Độ tái lặp:
– Một bộ các điều kiện bao gồm địa điểm khác, người thực hiện khác, hệ
thống đo lường khác, hoặc ngay cả phương pháp đo lường khác được
áp dụng cho cùng một đối tượng hoặc một đối tượng tương tự
– A set of conditions that includes different location, operators,
measuring systems, or even methods on the same or similar
objects.
• Độ chụm trung gian (Intermediate precision) (Độ tái lặp trong
PXN – Intra-lab reproducibility):
– Độ chụm trong PXN là một giá trị định lượng biểu hiện sự không đồng
nhất giữa các kết quả đo lặp lại trong một khoảng thời gian dài.
– Within-laboratory precision is a quantitative value indicating the
disagreement among replicate measurements over a longer time.
Vật liệu cho thử nghiệm đo độ chụm
• Do độ chụm có thể trực tiếp liên quan tới nồng độ, nồng độ của chất
phân tích phải tập trung lại hoặc ở gần điểm có ý nghĩa lâm sàng.
Ví dụ: phương pháp đo nồng độ đường huyết (glucose) phải được đánh giá
ở nồng độ gần 7.0 mmol/L vì ở nồng độ cao hơn, kết quả đường huyết lúc
đói có thể chỉ thị bệnh lý.
• Việc đo độ chụm tại các điểm cận trên và cận dưới của khoảng đo lường
cũng rất quan trọng.
• Một số loại vật liệu được dùng cho thử nghiệm đo độ chụm bao gồm:
– Các mẫu chứng (ngoại trừ loại dùng để đánh giá xem việc phân tích có được
kiểm soát hay không) other than those used to assess whether the assay is
in control),
– Các mẫu chuẩn,
– Mẫu bệnh nhân đã được phân tích,
– Hoặc vật liệu thích hợp khác đã biết giá trị đo. or suitable materials that
have a known value.
• Các vật liệu sử dụng nên đại diện cho các loại mẫu xét nghiệm về: nồng
độ chất phân tích và chất thử, sự đồng nhất và ổn định, nhưng không
cần thiết phải là Vật liệu so sánh chuẩn (Certified Reference Material)
 Xác nhận lại hiệu suất độ chụm
Verification of Precision Performance
• Độ chụm có thể được báo cáo theo:
– Độ lệch chuẩn (standard deviation - SD) hoặc
– Hệ số biến thiên (coefficient of variation - CV%), (biểu hiện độ lệch
chuẩn dưới dạng phần trăm của giá trị trung bình của các số đo lặp
lại).
• Trong cả 2 trường hợp, giá trị trung bình cũng nên được báo cáo
• Khi tăng giá trị độ lệch chuẩn hoặc hệ số biến thiên, điều đó cũng
biểu thị sự tăng độ phân tán (imprecision) của phương pháp đo.
• Thông thường, CV > 10% chỉ thị phương pháp đo có độ phân tán
cao.
• Tham khảo thêm hướng dẫn của CLIA và Westgard để thiết lập
giới hạn chấp nhận được.
 Thiết kế thí nghiệm –
Số ngày và số lần lặp lại
• Sử dụng ít nhất 2 – 3 mẫu chứng có nồng độ khác nhau
• Phân tích:
- Chia mỗi mẫu chứng đã chọn (2-3 mẫu) thành 3 mẫu giống nhau.
- Chạy các bộ mẫu đó trong cùng 1 lần chạy trong cùng 1 ngày.
- Thực hiện trong 5 ngày liên tiếp
(Analyze one run per day with three replicate samples at each of
two/three concentrations daily for five days.)
• Ghi chú:
– Chạy kèm các mẫu QC thường dùng hàng ngày
– Các mẫu dùng cho thí nghiệm xác định độ đúng (trueness) cũng
có thể được đo trong cùng lần chạy
– Chuẩn máy như hướng dẫn của nhà sản xuất
Tính toán Độ lệch chuẩn của Độ lặp lại
(Sr)

D = Tổng số ngày (5)

n = Tổng số mẫu lặp lại hàng
ngày (3)
xdi = kết quả của mẫu I cho
ngày d, và
xd = kết quả trung bình của
ngày d
Tính toán giá trị trong PXN
 So sánh Độ lặp lại tính được và
giá trị của nhà sản xuất
• Nếu độ lặp lại tính được có SD nhỏ hơn SD
của nhà sản xuất, người sử dụng đã chứng tỏ
độ chụm của phương pháp nhất quán với giá
trị nhà sản xuất báo cáo
• Xác nhận lại độ lặp lại nhà sản xuất đưa ra
bằng cách so sánh độ lặp lại tính được với
giá trị báo cáo của nhà sản xuất.
So sánh các giá trị xác định bởi PXN
với giá trị của nhà sản xuất
• Xác nhận lại các giá trị xác định bởi PXN
bằng cách so sánh chúng với giá trị báo
cáo của nhà sản xuất.
• Nếu giá trị tính toán bởi của PXN có SD
nhỏ hơn SD của nhà sản xuất, PXN đã
chứng tỏ phương pháp có độ chụm nhất
quán với giá trị báo cáo của nhà sản xuất
 Thẩm định giá trị độ chụm
Validation of precision
• Nhìn chung, các thử nghiệm thẩm định giá trị độ
chụm yêu cầu thực hiện trong vòng tối thiểu 20 ngày
• Thực hiện chạy mẫu 2 lần/ 1 ngày (tổng cộng 40
lần/20 ngày)
• Với mỗi nồng độ thử nghiệm: chia chất cần phân tích
(mẫu) thành 40 mẫu giống nhau; phân tích 2 mẫu
trong mỗi lần chạy
Within each run, analyze two aliquots of test material
for each concentration used.
• 2 lần chạy trong 1 ngày cần cách nhau ít nhất 2 tiếng
đồng hồ.
• Sử dụng ít nhất 2 – 3 mẫu chứng có nồng độ khác nhau
• Phân tích:
- Chia mỗi mẫu chứng đã chọn (2-3 mẫu) thành 3 mẫu giống
nhau.
- Chạy các bộ mẫu đó trong cùng 1 lần chạy trong cùng 1
ngày.
- Thực hiện trong 5 ngày liên tiếp
2/3 Quality control levels are to be analysed in 5 different
runs/days at 3 replicates per run/day.
• Các loại mẫu khác có thể sử dụng như: mẫu bệnh nhân đã
được phân tích, mẫu so sánh chuẩn, hoặc mẫu EQA đã biết
kết quả, với điều kiện các mẫu này phải ổn định trong suốt
thời gian thử nghiệm
• Tiêu chuẩn chấp nhận: CV của cả độ lặp lại
(repeatability)và độ chụm trung gian/độ tái lặp
(intermediate precision/ reproducibility) phải ≤ 10%
Thực hiện thử nghiệm xác định độ đúng
như thế nào?
• Có 2 phương pháp cơ bản để thực hiện thử nghiệm xác
định độ chính xác.
– Độ tương thích.
• Độ đúng có thể được đánh giá thông qua thử nghiệm so sánh mẫu tách
(split-sample comparison)
• Phân tích ít nhất 20 mẫu bệnh nhân với nồng độ phân bố đều trên dải
đo lường của phương pháp,
• Kết quả thu được từ 2 phương pháp (phương pháp đang được thẩm
định và phương pháp dùng để so sánh) được so sánh để xác định xem
có sự khác biệt đáng kể hay không.
– Lặp lại được giá trị mong muốn của vật liệu so sánh chuẩn
Recovery of expected values from certified reference
materials.
• Độ đúng cũng có thể được đánh giá bằng cách phân tích mẫu ngoại
kiểm hoặc các vật liệu so sánh chuẩn khác, và
• So sánh kết quả thu được từ phương pháp đang thẩm định với giá trị
mong muốn của các mẫu đó.
 Phương pháp tương thích
• Việc lựa chọn quy trình so sánh (comparative
measurement procedure) có ý nghĩa quyết định
với sự phiên giải kết quả của thử nghiệm này.
– Nếu PXN dự tính chứng minh độ đúng nhất quán với
giá trị đưa ra bởi nhà sản xuất, quy trình so sánh phải
giống với quy trình đã được sử dụng bởi nhà sản xuất.
– Khi quy trình mới được chỉnh sửa từ một quy trình cũ
của cùng 1 nhà sản xuất, hoặc khi nhà sản xuất sử
dụng một quy trình cũ cho máy phân tích mới, quy
trình đang dùng tại PXN có thể được sử dụng như quy
trình so sánh để so với quy trình của nhà sản xuất.
– Giá trị độ đúng được báo cáo bởi nhà sản xuất có thể
được áp dụng trong trường hợp này và dùng như cơ
sở chứng minh độ đúng của thử nghiệm này.
 Phương pháp tương thích
• Thông thường, quy trình đang dùng khác với
quy trình so sánh, hoặc là một phương pháp
so sánh chuẩn, hoặc được thực hiện trong
PXN tham chiếu, và PXN muốn chứng minh
rằng độ đụng của quy trình mới tương ứng
với một quy trình khác, không giống quy
trình so sánh đã được nhà sản xuất sử dụng.
• Trong trường hợp này, giá trị báo cáo bởi
nhà sản xuất không phù hợp để dùng như cơ
sở chứng minh độ đúng của thử nghiệm này.
 Phân tích thống kê độ chính xác
của kết quả thử nghiệm
• thường bao gồm
– Phân tích hồi quy (regression)
– Phân tích độ lệch (bias)
Thử nghiệm độ chính xác (tiếp)

Raw Data Table

Lab Accu-Chek Lab Accu-Chek

Glucose Glucose, Glucose Glucose,
mg/dL mg/dL mg/dL mg/dL
19 12 108 118
29 25 146 158
34 30 189 184
35 36 200 184
37 38 217 189
37 30 232 222
38 40 237 214
45 42 254 244
47 52 266 243
49 45 302 283
55 55 321 296
55 55 325 309
59 57 330 292
62 57 355 341
74 78 365 344
80 81 403 342
82 85 405 387
87 83 458 484
105 112 552 551
 Phân tích hồi quy
Vẽ biểu đồ số liệu so sánh...
Accu-Chek Vs Lab Regression Analysis
500
Vẽ đồ thị:
450
• Kết quả xét nghiệm được đặt ở trục y

(Y - Axis) Accu-Chek Glucose, mg/dL

400

350

• Kết quả so sánh/ hiện tại được đặt ở 300

trục x 250

200

• Biểu thị mối quan hệ chung 150

100

50

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
(X - Axis) Lab Glucose, mg/dL
 Phân tích hồi quy
Vẽ biểu đồ số liệu so sánh...
Accu-Chek Vs Lab Regression Analysis
500

450
(Y - Axis) Accu-Chek Glucose, mg/dL

400

350

300

250

200

150

100

50

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
(X - Axis) Lab Glucose, mg/dL
 Phân tích hồi quy
Vẽ biểu đồ số liệu so sánh...
Accu-Chek Vs Lab Regression Analysis
500

450
(Y - Axis) Accu-Chek Glucose, mg/dL

400

350

300

250

200

150

100

50

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
(X - Axis) Lab Glucose, mg/dL
 Thử nghiệm độ chính xác (tiếp)
• Phê duyệt số liệu hồi quy:
– Hệ số tương quan (Correlation Coefficient) (r) – thể hiện
đặc tính phân bố của các kết quả quanh đường hồi quy
tuyến tính (the line of best fit).
– Độ dốc (Slope) - The “lean” of the line of best fit (độ
lệch tỷ lệ - proportional bias)
– Điểm cắt trục Y (Y-Intercept) – nơi đường hồi quy tuyến
tính cắt trục Y (độ lệch bất biến – constant bias)
• Tiêu chuẩn chấp nhận:
– Hệ số tương quan (Correlation Coefficient) (r) – càng
gần 1.0 càng tốt
– Độ dốc (Slope) - càng gần 1.0 càng tốt
– Y-Intercept - càng gần 0.0 càng tốt
• Phương trình: y = mx + b
m là độ dốc của đường hồi quy tuyến tính
b là điểm cắt trục Y – điểm cắt của đường hồi
quy tuyến tính với trục y, nói cách khác, giá trị y
khi x = 0. Giá trị này có thể là số âm hoặc số
dương. Một cách giải thích thông thường khác,
điểm cắt trục y biểu thị lỗi hệ thống bất biến
(constant systematic error) hoặc độ lệch bất
biến (constant bias). Giá trị này càng gần 0 càng
tốt.
Thử nghiệm độ chính xác (tiếp)

Quy trình đường hồi quy tuyến tính:

y = mx + b
m = độ dốc
b = điểm cắt trục Y
Thử nghiệm độ chính xác (tiếp)

Quy trình đường hồi quy tuyến tính:

y = 0.991x + 8.4

Độ dốc
Thử nghiệm độ chính xác (tiếp)

Quy trình đường hồi quy tuyến tính

y = 0.991x + 8.4

Độ dốc
• điểm cắt của đường hồi quy tuyến tính với trục y, nói
Điểm cắt trục y cách khác, giá trị y khi x = 0. Giá trị này có thể là số âm
hoặc số dương.
• Một cách giải thích thông thường khác, điểm cắt trục y
biểu thị lỗi hệ thống bất biến (constant systematic
error) hoặc độ lệch bất biến (constant bias). Giá trị này
càng gần 0 càng tốt.
 Thử nghiệm độ chính xác (tiếp)
• Phân tích độ lệch:
– Tính toán sự chênh lệch theo đơn vị mg/dL hoặc % giữa thiết bị XN cạnh
giường và thiết bị XN của PXN cho mỗi bộ số liệu đôi (paired data-points).
– Tính toán sự chênh lệch (hoặc độ lệch của từng mẫu riêng lẻ) theo đơn vị có
thể báo cáo và/hoặc
– phần trăm chênh lệch (hoặc phần trăm độ lệch của từng mẫu riêng lẻ) giữa
kết quả của mỗi mẫu thu thập được từ 2 quy trình xét nghiệm
– Độ lệch của từng mẫu riêng lẻ theo đơn vị có thể báo cáo = bi.
– = (kết quả từ quy trình xét nghiệm – kết quả từ quy trình so sánh)
– Độ lệch của từng mẫu riêng lẻ theo % = %bi

• Tiêu chuẩn chấp nhận (Glucose – đường huyết):

– 95% thiết bị đo tại giường có kết quả nằm trong khoảng +/- 15 mg/dL so với
kết quả của PXN khi kết quả <75 mg/dL; hoặc nằm trong khoảng +/-20% so
với kết quả của PXN khi kết quả ≥ 75 mg/dL (NCCLS document C30A-2)
 Phân tích độ lệch
• Vẽ đồ thị cho mỗi mẫu: độ lệch và/hoặc % độ lệch
(trục x) so với kết quả theo quy trình so sánh (trục y)
• Kiểm tra đồ thị chênh lệch độ lệch để xác định xem
sự chênh lệch giữa các quy trình có tương đối bất
biến trên dải nồng độ đã thử nghiệm hay không.
• Nếu phát hiện độ lệch bất biến hoặc phần trăm độ
lệch bất biến so với nồng độ, thì giá trị độ lệch trung
bình biểu thị cho sự chênh lệch trung bình giữa 2 quy
trình.
• Giá trị này được so sánh với giá trị báo cáo bởi nhà
sản xuất để chứng minh độ đúng của quy trình xét
nghiệm.
 Phân tích độ lệch
Đồ thị độ lệch
Accu-Chek vs Lab Bias Chart

50
45
40
35
30
25
20
15
Accu-Chek Bias*

10
5
0
-5 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
-10
-15
-20
-25
-30
-35
*Bias is calculated as mg/dL difference from lab results
-40
<75 mg/dL and as % difference from lab results >75 mg/dL.
-45
-50
Lab Glucose, mg/dL
 Phân tích độ lệch
• Cho rằng tỷ lệ đào thải sai là a. Các giá trị
thường được chọn cho tỷ lệ lỗi (error rate)
là 1% và 5%
• Xác định điểm t(%) = (100 - a/2) của phân bố
t (t-distribution) với n-1 bậc tự do (degree
of freedom), trong đó:
– n là số mẫu bệnh nhân.
– Ví dụ: nếu a = 1%, n = 20, điểm (100-a/2) của phân bố t với 19 bậc tự do là 2,861
– Các giá trị khác của phân tích two-sided t có thể lấy được từ các bảng thống kê
 Phân tích độ lệch
• Nếu phần trăm độ lệch dự đoán %b nằm
trong giới hạn xác nhận lại, PXN đã chứng
minh được rằng % độ lệch nhất quán với giá
trị báo cáo bởi nhà sản xuất
• Nếu độ lệch dự đoán nằm ngoài giới hạn xác
nhận lại, PXN đã không chứng minh được độ
đúng nhất quán với giá trị báo cáo bởi nhà
sản xuất, và nên liên lạc với nhà sản xuất để
nhờ hỗ trợ.
Bài tập nhóm
Lặp lại được giá trị mong muốn của vật
liệu so sánh chuẩn với giá trị cho trước
• Nguồn của vật liệu so sánh chuẩn
– Vật liệu so sánh chuẩn lấy từ các chương trình kiểm
tra năng lực (ngoại kiểm)
– Vật liệu được cung cấp bởi nhà sản xuất nhằm mục
đích xác nhận lại độ đúng hoặc QC
– Vật liệu được cung cấp bởi nhà cung cấp thứ 3, và
đã được cho trước giá trị cho một số quy trình đo
lường khác nhau.
 Quy trình chứng minh độ đúng với
vật liệu so sánh chuẩn
• Chọn vật liệu tốt nhất có thể và phù hợp với quá
trình xét nghiệm
• Sử dụng ít nhất 2 nồng độ của chất phân tích.
• Chuẩn bị mẫu theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Chú ý đảm bảo mẫu được trộn đều trước khi
phân tích.
• Phân tích mỗi mẫu từ 3 tới 5 lần; trong mỗi lần
chạy, mỗi mẫu được đo 2 lần (in duplicate).
• Tính giá trị trung bình (x) và độ lệch chuẩn (SD)
của kết quả đo tại mỗi nồng độ.
 Kiểm thử chấp nhận (acceptance
test) để chứng minh độ đúng với vật
liệu so sánh chuẩn
• Việc xác nhận lại giá trị độ đúng của nhà sản xuất được thực
hiện theo các bước sau: :
– (1) Cho rằng tỷ lệ đào thải sai là a. Các giá trị thường được chọn
cho tỷ lệ lỗi (error rate) là 1% và 5%
– (2) Cho rằng nhà sản xuất không đưa ra độ lệch liên quan tới giá
trị cho trước (ß=0).
– (3) Xác định điểm t(%) = (100 - a/2) của phân bố t (t-distribution)
với 2n-1 bậc tự do (degree of freedom), trong đó:
n = số mẫu được phân tích
2 = số mẫu được lặp lại trong mỗi lần chạy (sử dụng 3 hoặc 4 nếu đó
là số lần lặp lại thực tế).
Ví dụ, nếu a = 1%; n = 5; điểm (100-a/2) của phân bố t với 9 bậc tự
do là 3,250. Các giá trị t khác có thể lấy được từ bất cứ quyển sách
thông kê chuẩn nào.
 Kiểm thử chấp nhận (acceptance
test) để chứng minh độ đúng với vật
liệu so sánh chuẩn
– (4) Tính khoảng xác nhận lại cho độ lệch theo
đơn vị báo cáo theo công thức:
 Kiểm thử chấp nhận (acceptance
test) để chứng minh độ đúng với vật
liệu so sánh chuẩn
• (5) Nếu khoảng xác nhận lại bao gồm cả giá trị cho
trước thì độ đúng báo cáo bởi nhà sản xuất đã được
xác nhận
• (6) Nếu độ lệch đo được hoặc độ lệch % chênh lệch
nhiều với giá trị cho trước, nhưng vẫn nằm trong
khoảng xác nhận lại, PXN có thể nên thực hiện thử
nghiệm chi tiết hơn bằng cách phân tích thêm từ 2
đến 5 mẫu (trong các lần chạy khác nhau) và tính lại
các thông số từ tất cả các số liệu đã thu được.
• Nếu giá trị cho trước không nằm trong khoảng xác
nhận lại, PXN đã không chứng minh được độ đúng của
phương pháp nhất quán với giá trị báo cáo bởi nhà sản
xuất.
 Độ tuyến tính
• Khả năng (trong một khoảng cho phép) cung cấp kết
quả có tỷ lệ trực tiếp với nồng độ của chất phân tích
trong mẫu phân tích;
• Ghi chú:
– a) Độ tuyến tính thường ám chỉ phản ứng hệ thống toàn
diện (ví dụ: kết quả phân tích cuối cùng chứ không phải
kết quả thô từ máy);
– b) Độ tuyến tính của một hệ thống được đo bằng cách
kiểm tra các nồng độ của chất phân tích. Giá trị thật các
mức độ này đã biết trước thông qua tính toán hoặc do
mối quan hệ tương quan giữa chúng (không cần biết rất
chính xác); khi các kết quả thu được từ hệ thống được
so sánh với các giá trị thật này trên đồ thị, mức độ
đường cong của đồ thị tiến tới thành đường thẳng là giá
trị độ tuyến tính của hệ thống.
 Thiết lập khoảng tuyến tính
• Để thiết lập khoảng
tuyến tính, nên sử dụng Nồng độ Thể tích Rep Rep 2 Rep 3 Re
6-11 nồng độ chất phân tổng 1 p4

tích, pha loãng theo 1.0L 100 X X X X

bảng 0.8L + 0.2H 100 X X X X

• Mỗi nồng độ nên được 0.6L +0.4H 100 X X X X

lặp lại 2-4 lần. 0.4L +0.6H 100 X X X X

• Các mẫu nên được đo 0.2L + 0.8H 100 X X X X

ngẫu nhiên trong cùng 1 1.0H 100 X X X X

lần chạy hoặc trong các

lần chạy phân tích gộp
nhóm.
Xác nhận lại khoảng tuyến tính
• Để xác định khoảng
tuyến tính, sử dụng ít Nồng độ Thể tích Rep 1 Rep 2
nhất 5 nồng độ được tổng

pha loãng như trong 1.0L 100 X X

bảng 0.75L + 0.25H 100 X X

• Mỗi nồng độ lặp lại ít 0.50L + 0.5H 100 X X

nhất 2 lần.
0.25L + 0.75H 100 X X

1.0H 100 X X
• Các mẫu nên được đo
ngẫu nhiên trong
cùng 1 lần chạy hoặc
trong các lần chạy
phân tích gộp nhóm.
Các nồng độ đánh giá có ý nghĩa lâm
sàng quan trọng
• Việc đánh giá khoảng tuyến tính nên bao
gồm các nồng độ quan trọng sau:
– nồng độ phân tích nhỏ nhất hoặc ngưỡng dưới
của khoảng tuyến tính;
– các giới hạn quyết định lâm sàng khác nhau; và
– nồng độ phân tích lớn nhất hoặc ngưỡng trên
của khoảng tuyến tính.
 Vẽ đồ thị
• Kết quả quan sát được ở trục y
• Giá trị đã biết ở trục x
• Vẽ đường thẳng tốt nhất qua nhiều điểm
nhất có thể, bám theo các điểm thấp hơn
• Đánh giá tổng sai số khi các đường thẳng
phân chia để xác định độ tuyến tính
 Tính giá trị dự kiến
• Các nồng độ ban đầu đã biết là nồng độ thấp
và nồng độ cao
• Một công thức toán học có thể sử dụng để
xác định nồng độ của hỗn hợp là:

Nồng độ = (C1.V1 + C5.V5)

(V1+V5)
 Tiêu chuẩn chấp nhận của
độ tuyến tính
– Cần dùng một đồ thị tuyến tính
– Độ tuyến tính thường được thấy rõ trên đồ thị giữa
giá trị quan sát được so với giá trị dự kiến
– Các điểm nên phân bố đối xứng quanh một đường
chéo.
– Kiểm tra kỹ để tìm bằng chứng của rằng có một số
điểm phân bố theo hình vòng cung. Điều này biểu
hiện rằng mô hình tạo ra các lỗi hệ thống mỗi khi nó
thực hiện dự kiến lớn hoặc nhỏ.
Look carefully for evidence of a "bowed" pattern,
indicating that the model makes systematic errors
whenever it is making unusually large or small
predictions.
 Phân tích kết quả tuyến tính
Xem xét bằng mắt.
– Phương pháp thông dụng nhất để diễn giải kết quả
của một thử nghiệm tuyến tính là việc xem xét bằng
mắt đồ thị biểu thị mối quan hệ giữa giá trị đo lặp
lại trung bình với giá trị thật của từng nồng độ
– Yêu cầu: giá trị của trục y (giá trị đo) gần nhất có
thể với với giá trị trục x (giá trị thật).
– Các điểm được nối lại, và việc đánh giá dựa trên
mức độ các số liệu phân bố theo 1 đường thẳng.
– Đánh giá bằng mắt là một công cụ đơn giản dựa vào
trực giác đối với một nhân viên có kinh nghiệm,
nhưng kết quả đánh giá là chủ quan.
 Phân tích kết quả tuyến tính
Bình phương tối thiểu hồi quy tuyến tính - Least
Squares Linear Regression.
• Phương pháp thông dụng nhất để khớp 1 đường
thẳng với số liệu là phương pháp bình phương tối
thiểu hồi quy tuyến tính.
• Giá trị thật được vẽ theo trục x.
• Giá trị đo được vẽ theo trục y.
• Phương pháp bình phương tối thiểu hồi quy tuyến
tính khớp 1 đường thẳng với các điểm số liệu sao cho
tổng bình phương của khoảng cách dọc từ các điểm
tới đường thẳng đó được giảm tối thiểu.
• Việc giảm tối thiếu được thực hiện theo chiều dọc do
trục x biểu thị giá trị thật.
 Vấn đề thường gặp
• PXN phải đảm bảo sự tin tưởng của kết quả xét
nghiệm khi các giá trị không tuyến tính được phát
hiện trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính.
• Các hành động cụ thể sẽ phụ thuộc vào chất phân
tính, phương pháp, mức độ không tuyến tính, và cá
nhân PXN.
• Mỗi trường hợp sẽ khác nhau, do đó dưới đây chỉ là
hướng dẫn chung về việc đánh giá độ không tuyến
tính.
• Trong các bước trước phân tích,
– Thường có sự tham gia của lỗi do con người .
– Nếu các vật liệu không được chuẩn bị hoặc bảo quản
đúng cách, lượng chất phân tích có thể sai lệch hoặc bị
hỏng sau một khoảng thời gian.
 Vấn đề thường gặp
• Lỗi hệ thống có thể được tạo ra bởi
– hiệu chuẩn pipet không đúng,
– một chiếc pipet không chính xác có thể dẫn tới kết quả
không chính xác.
– Mẫu có thể bị ghi nhãn sai hoặc thực hiện nhầm xét
nghiệm.
• Lỗi phân tích có thể bắt nguồn từ nhiều bước trong
quá trình phân tích.
– Một điểm bắt đầu tốt là kiểm tra việc bảo trì bảo dưỡng,
– kiểm tra chất lượng, và
– chuẩn phương pháp.
– dịch chuyển bước sóng của máy quang phổ, thấu kính bị
bẩn hoặc quá cũ, và
– các giếng đếm scintillation có nền bị bẩn
 Bài tập độ tuyến tính
• Xác định thể tích tối thiểu cần dùng cho mỗi
mức kiểm tra độ tuyến tính của hệ thống xét
nghiệm sử dụng 0.25mL/test, với n = 5 lần
đo lặp lại cho mỗi nồng độ, cộng với 0,75ml
thể tích chết. 5 mức độ sẽ được kiểm tra
là100L, 75L+ 25H, 50L+ 50H, 25L +7 5H và
100L. Nồng độ gộp cao nhất là 120 đơn vị và
nồng độ gộp thấp nhất là 40 đơn vị.
• Sau khi thực hiện phân tích, thu được các
kết quả sau:
Level Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 4 Rep 5

100L 38 40 42 40

75L+25H 39

50L+50H

25L+75H

100H

• Xác định độ tuyến tính dùng 2 phương

pháp: xem xét bằng mắt và hồi quy tuyến
tính.
 Độ đặc hiệu phân tích
(Analytical Specificity)
– Còn được gọi là độ lựa chọn (Selectivitiy)
– Là khả năng của phương pháp xét nghiệm phát
hiện chất đích hoặc sinh vật đích duy nhất,
không bị lẫn với các chất giống khác (ví dụ: phát
hiện insulin, không phát hiện proinsulin; phát
hiện HIV-1, không phát hiện HIV-2) hay các chất
nhiễu (bilirubin, lipemia) trong một mẫu
 Ảnh hưởng của chất nhiễu
• Phần lớn các phương pháp đo chất phân tích
cần quan tâm trực tiếp mà không tách nó khỏi
các chất khác có trong mẫu.
• Do đó, việc thiết lập các đặc tính đo lường của
riêng chất phân tích phân biệt với các chất có
tính chất hóa học hoặc vật lý tương tự, hoặc sự
xuất hiện của lỗi ngẫu nhiên tạo ra xu hướng
của kết quả đo lường, là việc có ý nghĩa quyết
định.
• Chất nhiễu có thể tạo ra xu hướng bằng cách
tăng nồng độ chất phân tích đo được.
 Các phương pháp cần độ đặc hiệu
phân tích
Đánh giá độ lựa chọn cần thực hiện cho các
phương pháp sau:
• Phương pháp phát triển nội bộ (In-house)
• Phương pháp lấy theo báo cáo khoa học
• Phương pháp xuất bản bởi các tổ chức tiêu
chuẩn nhưng sử dụng ngoài phạm vi đã được
nêu rõ trong phương pháp chuẩn.
 Thực hiện thử nghiệm xác định độ
đặc hiệu phân tích
Cần làm
Phân tích mẫu theo phương pháp 1
cần đánh giá và một phương pháp
khẳng định khác
Phân tích mẫu có chứa chất cần
phần tích và nhiều loại chất nhiễu
dự kiến
Mẫu đã biết trước nồng độ chất
phân tích được trộn thêm những
nồng độ chất nhiễu khác nhau, và
thực hiện thử nghiệm phục hồi
Bao Cần tính toán/xác định gì từ số liệu
nhiêu lần
Xác định xu hướng của kết quả hoặc sử dụng
phân tích hồi quy (phương pháp chính xác)
Sử dụng kết quả từ kỹ thuật khẳng định để
đánh giá khả năng phương pháp này khẳng
định danh tính chất phân tích và khả năng đo
chất này mà không bị ảnh hưởng bởi các chất
nhiễu.
1 Kiểm tra ảnh hưởng của các chất nhiễu. Sự có
mặt của chất nhiễu có ức chế việc phát hiện
hay định lượng chất cần phân tích không?
Kiểm tra chất cần phân tích ít nhất 5 lần và
xem có sự chênh lệch có ý nghĩa nào giữa hai
kết quả không.
Bài tập xác định độ đặc hiệu
phân tích
 Độ nhạy phân tích –
Analytical Sensitivity
– Một số thuật ngữ đồng nghĩa với độ nhạy phân tích
bao gồm “ngưỡng phát hiện” và “nồng độ tối thiểu
có thể phát hiện”
– Độ nhạy phân tích của một xét nghiệm là khả năng
phát hiện nồng độ nhỏ của một chất cụ thể trong
một mẫu sinh học, dù chất đó là đường huyết hay
HIV-1 proviral DNA
– Loại độ nhạy này được biểu thị dưới dạng nồng độ
(ví dụ mg/dL hoặc số copies/50 triệu tế bào
– Nồng độ phát hiện được càng nhỏ, độ nhạy phân
tích càng cao.
 Độ nhạy phân tích –
Analytical Sensitivity
• Độ nhạy phân tích được xác định bằng 1 trong 2
cách sau:
– Theo kinh nghiệm bằng phương pháp tín hiệu phân
tích tối thiểu phát hiện được (minimal detectable
analytical signal method), bằng cách phân tích
một loạt nồng độ pha loãng của mẫu, trong đó đã
biết trước giá trị của một nồng độ thấp của chất
cần phân tích. Độ nhạy phân tích là giá trị nồng độ
ngay sau giá trị cho kết quả = 0
– Hoặc theo thống kê bằng cách phân tích nhiều lần
mẫu âm tính hoặc mẫu trắng và dùng ngưỡng 3SD
trên giá trị trung bình như ngưỡng phát hiện dưới.
 Giới hạn định lượng
Limit of Quantitation(LoQ)
– LoQ là nồng độ thấp nhất mà tại đó, chất phân tích
không chỉ không thể được phát hiện một cách đáng tin
mà một số mục tiêu đặt trước của độ phân tán cũng
được thỏa mãn.
– Độ nhạy thiết thực (Functional sensitivity) được định
nghĩa là nồng độ cho kết quả theo CV = 20% (hoặc một
giá trị CV khác đã định trước), và như vậy cũng là một
số đo độ chụm của xét nghiệm tại các mức chất phân
tích thấp.
– Các xét nghiệm đo LoQ cũng tốt như xét nghiệm đo độ
chụm của các mẫu ở phía nồng độ thấp, nhằm xác định
CV 20%
 Kế hoạch và báo cáo
thẩm định phương pháp
• Việc thẩm định phương pháp phải được thực hiện, và
ghi lại báo cáo theo quy trình đã phê duyệt
• Tự đề: Mục này nêu tên của phương pháp cần thẩm
định.
• Trách nhiệm: Mục này nêu tên những người tham gia
thực hiện thẩm định phương pháp, và thời gian thực
hiện
• Thông tin tóm tắt về phạm vi của phương pháp và
một đoạn miêu tả phương pháp ngắn gọn, chi tiết về
tình trạng của phương pháp, chất phân tích, đơn vị
đo, loại mẫu, và mục đích sử dụng.
• Lấy mẫu: Việc lấy mẫu và chia mẫu là một phần của
quy trình xét nghiệm. Giải thích loại mẫu sử dụng,
nguồn gốc cũng như truy xuất gốc.
 Validation Plan and Report
• Mục đích: ví dụ về mục đích: thẩm định hoàn chỉnh (full
validation) một phương pháp mới; hay xác nhận lại
(verification) hiệu suất của một phương pháp đã chuẩn hóa với
phạm vi mở rộng, vân vân....
• Quy mô thẩm định: Các đặc tính hiệu suất được đánh giá và bất
cứ yêu cầu đi kèm nào..
• Phương pháp: Mục này nên đưa ra tóm tắt giải thích tóm tắt về:
đặc tính hiệu suất, phác thảo thí nghiệm sẽ được thực hiện như
thế nào, kết quả sẽ được đánh giá ra sao….
• Kết quả: Kết quả và kết luận từ các thí nghiệm phải được so
sánh với tiêu chuẩn chấp nhận. Mỗi đặc tính hiệu suất cần một
mục riêng..
• Kết luận: tuyên bố liên quan tới việc sử dụng thường quy, nội
ngoại kiểm. Quan trọng hơn, phải dưa ra một tuyên bố kết luận
phương pháp có phù hợp với mục đích sử dụng hay không.
• Tài liệu tham khảo: cho phương pháp đã được sử dụng.
• Bằng chứng về việc xem xét và phê duyệt cuối cùng của lãnh
đạo.
Khi nào cần thẩm định lại phương pháp
• Thay đổi ma trận hoặc cách chuẩn bị mẫu\
• Thay đổi công thức thuốc thử, dung môi,
ma trận của cột ….
• Model mới của cùng thiết bị
 Tài liệu tham khảo
• EP15-A2 User verification of performance
for precision and trueness: Approved
guideline- Second edition.
Câu hỏi?