Ứng dụng của Real time PCR trong điều trị HBV

Theo dòng chảy phát triển của nền y tế nước nhà và yêu cầu thực tế của xã hội, một số sản
phẩm ứng dụng Real-time PCR mới tiếp tục được phát triển và thương mại hóa. Đơn cử ở đây
là các bộ kit xác định kiểu gen (genotyping kit) của vi-rút viêm gan C (HCV) và xác định các đột
biến kháng thuốc lamivudine và adenovir ở vi-rút viêm gan B (HBV)
Về nguyên tắc, các phản ứng Real-time PCR loại này sẽ sử dụng những mồi hoặc mẫu dò đặc
hiệu cho từng đột biến hoặc kiểu gen muốn phát hiện. Nếu sử dụng các chất phát huỳnh quang
gắn DNA như SYBR Green thì mỗi phản ứng chỉ dành riêng cho một đột biến, tức là singleplex.
Nếu sử dụng mẫu dò TaqMan đánh dấu màu huỳnh quang khác nhau, chúng ta có thể phát
hiện lên đến 4-5 đột biến trong cùng 1 phản ứng, sẽ tiết kiệm hóa chất và thời gian ghê lắm.

Kết quả của xét nghiệm PCR đo tải lượng virus viêm gan B HBV-DNA mang ý nghĩa
nhằm xác định chính xác thời điểm nên thực hiện việc sử dụng thuốc ức chế virus
điều trị bệnh viêm gan B.

1. Xét nghiệm HBV-DNA PCR định lượng

Xét nghiệm PCR định lượng HBV-DNA còn được gọi là đo tải lượng virus viêm gan
B có trong máu - đây là một kỹ thuật xét nghiệm hiện đại nhằm mục đích xác định chính
xác số lượng cũng như nồng độ chủng víu có trong mỗi đơn vị thể tích huyết thanh/huyết
tương, áp dụng với đơn vị đo IU/ml hoặc copies/ml (trong đó 1IU sẽ tương đương với 5-6
copies). Từ đó, bác sĩ có thể đánh giá mức độ virus đang nhân lên trong tế bào gan. Nồng
độ chủng virus cao là khi con số này đạt trên 10.000 IU/ml, đạt mức trung bình là khoảng
2000 đến 10.000 IU/ml, đạt mức thấp là dưới 2000 IU/ml.

Theo dõi, kiểm tra mức độ HBV-DNA xuất hiện trong máu định kỳ tháng, và định kỳ năm là
yếu tố quan trọng nhằm quản lý tình trạng bệnh. Dựa vào đó xác định đúng thời điểm có
thể điều trị và theo dõi các đáp ứng của cơ thể bệnh nhân, sau đánh giá kỹ thuật cũng như
thời gian ngưng điều trị.

Hiện nay, xét nghiệm PCR định lượng HBV-DNA được áp dụng kỹ thuật hiện đại
Realtime-PCR tự động hoàn toàn từ bước tách chiết các phần tử DNA cho tới giai đoạn
tiến hành phản ứng PCR, kết quả cho ra nhanh chóng, đạt chính xác cao, độ nhạy đạt
99%, độ đặc hiệu lên tới 99%.

Xét nghiệm này có thể giúp phân biệt các trường hợp khác nhau:

 (1) Không thấy xuất hiện HBV-DNA trong bệnh phẩm mẫu máu

 (2) Nồng độ HBV-DNA đạt dưới ngưỡng được phát hiện (khoảng 20 IU/ml)

 (3) Đo được nồng độ HBV-DNA cụ thể.

Xét nghiệm HBV-DNA bằng kỹ thuật PCR hay còn gọi là HBV định lượng Realtime -
PCR là một trong nhiều hạng mục giúp ta đánh giá được hiệu quả điều trị virus viêm gan B
và cân nhắc có nên điều trị viêm gan B bằng thuốc kháng virus không. Đối với những bệnh
nhân mắc viêm gan B dùng thuốc kháng virus viêm gan B khoảng 1 đến 3 tháng mà số
lượng virus giảm 100 lần, thì có thể đánh giá là thuốc kháng virus hiệu quả.

Khi men ALT tăng trên 2 lần giá trị bình thường hoặc có bằng chứng xác nhận có xơ hóa
gan tiến triển/xơ gan với bất kể ALT ở mức nào. Các trường hợp xảy ra khi đo tải lượng
virus viêm gan B bằng phương pháp PCR:

 HBV-DNA ≥ 105 copies/ml (20.000 IU/ml) nếu HBeAg (+)

 HBV-DNA ≥ 104 copies/ml (2.000 IU/ml) nếu HBeAg (-).

Xét nghiệm HBV-DNA bằng kỹ thuật PCR giúp đánh giá được hiệu quả điều trị virus viêm gan
B
2. Đo tải lượng virus viêm gan B
Đối với những bệnh nhân viêm gan B có định lượng HBV-DNA cao, nếu bệnh tình cứ tiến
triển như vậy trong một thời gian dài, thì tỉ lệ biến chứng thành xơ gan và ung thư
gan tương đối cao.

Vì vậy, người bệnh cần theo dõi thêm một số chỉ số chức năng gan, kết quả siêu âm để
đánh giá tình trạng bệnh tình và có phương án điều trị chuẩn xác, từ đó làm giảm nguy
hiểm của bệnh viêm gan B mãn tính.

Thông thường, giá trị trung bình của HBV-DNA:

 Từ 10^3 - 10^5 copies/ml máu thì virus đang ở giai đoạn sao chép chưa mạnh

 Từ 10^5 - 10^7 copies/ml máu thì virus đang ở giai đoạn sao chép tương đối
mạnh
  Từ vượt ngưỡng 10^7 copies/ml máu thì virus đang ở giai đoạn sao chép rất
mạnh.

Hàm lượng virus trong máu người bệnh càng cao thì nguy cơ gan tổn thương cũng như
biến chứng xơ gan và ung thư gan càng lớn. Bên cạnh đó, càng dễ lây nhiễm cho người
khác.

Nếu như đo tải lượng HBV-DNA cao, chức năng gan có bất thường, kết quả siêu âm thấy
gan bị tổn thương, thêm vào đó, người bệnh có xuất hiện thêm một số triệu chứng như mệt
mỏi, đau hạ sườn phải, buồn nôn... thì tức là bệnh nhân đang ở giai đoạn miễn dịch đào
thải (khi hệ miễn dịch chống lại và ức chế virus). Lúc này cần điều trị kháng virus kết hợp
với điều trị tái tạo và hỗ trợ lá gan ngay. Bởi vì, lúc này không điều trị càng kéo dài thì hệ
miễn dịch phá huỷ những tế bào nhiễm virus viêm gan B càng nhiều, từ đó sẽ làm quá trình
xơ gan xảy ra nhanh hơn.

Kết quả của xét nghiệm PCR đo tải lượng virus viêm gan B HBV-DNA mang ý nghĩa để
xác định chính xác thời điểm nên thực hiện việc sử dụng thuốc ức chế virus điều trị bệnh
viêm gan B.

Trong toàn quá trình tiến hành điều trị bệnh nhân cần được đo định lượng víu liên tục và
định kỳ nhằm mục đích đánh giá đúng hiệu quả việc điều trị trên cơ sở sự biến đổi về tải
lượng chủng virus trên mỗi lần kiểm tra. Trường hợp tải lượng chủng virus đã có chiều
hướng giảm dần, sau đó lại gia tăng mạnh mẽ ở lượt kiểm tra kế, thì nguy cơ cao tình trạng
chủng virus viêm gan B đã kháng thuốc. Lúc đó, cần có chỉ định thay đổi trong phác đồ trị
liệu để kịp ứng phó với những bất thường dễ gặp của bệnh nhân.

3. Cách lấy mẫu bệnh phẩm và bảo quản khi đo tải

lượng virus viêm gan B bằng PCR
3.1. Cách lấy mẫu
 Huyết tương/huyết thanh có khả năng chống đông bởi EDTA

 Dung lượng: 4ml

3.2. Bảo quản

Ly tâm tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm từ huyết tương/huyết thanh bảo quản trong 6 giờ
đồng hồ, sau thời điểm lấy mẫu bệnh phẩm. Chuyển huyết tương/huyết thanh vào ống vô
trùng có nắp đậy và lưu trữ tủ đông.
4. Cách đọc kết quả PCR đo tải lượng virus viêm
gan B

Đọc hiểu các chỉ số trong xét nghiệm định lượng virus viêm gan B là điều vô cùng cần thiết
Đọc hiểu các chỉ số trong xét nghiệm định lượng virus viêm gan B là điều vô cùng cần thiết,
không chỉ đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh mà còn là yếu tố quyết định đến phác
đồ điều trị. Trong các chỉ số xét nghiệm, người bệnh cần đặc biệt quan tâm tới những chỉ
số sau:

 HBV-DNA: Là phần nhân của virus viêm gan B. Xét nghiệm HBV-DNA có ý nghĩa
là xem trong máu có mang virus hoàn chỉnh (gồm nhân và vỏ) hay không. HBV-
DNA phản ánh sự sao chép của virus và cho biết số lượng hạt virus tồn tại trong
máu.

 HBsAg: Là kháng nguyên bề mặt virus HBV. Để kết luận có bị viêm gan B hay
không phụ thuộc vào xét nghiệm HBsAg. Bởi không ít người bệnh viêm gan B
mạn dù có nồng độ HBV-DNA trong máu thấp, thậm chí dưới ngưỡng phát hiện
nhưng vẫn tiến triển thành biến chứng xơ gan, ung thư gan. Nếu HBsAg (+)
nghĩa là đã mắc viêm gan B, nếu HBsAg (-) là không bị viêm gan B.

 HBeAg: là kháng nguyên nội sinh của virus HBV, là một dạng protein do các tế
bào HBV tiết ra. Sự có mặt của kháng nguyên này (HBeAg (+)) chứng tỏ là bạn
 đang có nồng độ virus trong máu cao và rất dễ lây truyền cho người khác. Nếu
HBeAg âm tính (HBeAg (-)) thì nồng độ virus trong máu thấp hoặc virus đang
trong giai đoạn nằm yên, không nhân bản sao chép và nguy cơ lây nhiễm cho
người khác thấp.

 Các chỉ số men gan: Như ALT, AST cho biết mức độ tổn thương gan do virus gây
ra.

4.1. Xác định trường hợp không cần dùng thuốc

Khi HBsAg (+) nhưng HBeAg (-), định lượng virus viêm gan B HBV-DNA trên 10^4
copies/ml, chỉ số men gan ALT/AST dưới 40 UI/ml, siêu âm thấy gan chưa bị hoại tử là lúc
này virus không hoạt động nên không cần điều trị bằng thuốc.

4.2. Xác định trường hợp nghiêm trọng phải điều trị bằng
thuốc
Khi xét nghiệm kháng nguyên bề mặt HBsAg (+) và kháng nguyên nội sinh HBeAg (+), định
lượng virus viêm gan B HBV-DNA trên 10^5 copies/ml, men gan tăng gấp hơn 2 lần bình
thường, siêu âm thấy gan bị hoại tử, kèm theo các triệu chứng lâm sàng mệt mỏi, chán ăn,
vàng da vàng mắt, đau tức hạ sườn phải... thì kết quả này cho biết virus đang nhân lên cần
phải dùng thuốc ngay. Thuốc sẽ được kê đơn sao cho thích hợp nhất với mức độ bệnh tình
và thể trạng của người bệnh.

Ngoài ra, trường hợp HBsAg (+), HBeAg (-), định lượng virus viêm gan B HBV-DNA trên
10^4 copies/ml tuy virus chưa hoạt động nhưng men gan cao gấp 2 lần, đã có triệu chứng
lâm sàng thì vẫn phải điều trị theo phác đồ chỉ định của bác sĩ. Điều này cho biết người
bệnh đã từng mắc viêm gan B mạn tính, virus đã hoạt động nhưng sau đó không hoạt
động nữa. Trường hợp này cần dùng thuốc giảm triệu chứng, giảm men gan chứ không
cần dùng thuốc ức chế sự nhân lên của virus.

5. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm

HBV PCR
 Ống lấy mẫu bệnh phẩm nếu có chất Heparin chống đông có thể khiến mẫu bệnh
phẩm bị ức chế với phản ứng PCR.

 Nên tiến hành phân tích ngay sau khi lấy được mẫu bệnh phẩm vì trong thời gian
bảo quản lâu mà có một chút sai sót kỹ thuật cũng sẽ dẫn đến việc sai số trong
kết quả PCR. Trường hợp chưa thể phân tích xét nghiệm ngay lập tức nên bảo
quản mẫu bệnh phẩm bằng tủ âm mục đích tránh sự ức chế PCR.

Dựa trên kết quả phân tích PCR đo tải lượng virus viêm gan B, người bệnh có thể nắm
được tình hình sức khoẻ của bản thân và bác sĩ sẽ có cơ sở để xác định đâu là trường hợp
không cần sử dụng thuốc hay cần sử dụng thuốc ức chế virus. Tuy nhiên, phương pháp đo
tải lượng virus viêm gan B HBV-DNA PCR vẫn có thể sai số trong điều kiện lấy mẫu và bảo
quản không đúng cách và quy trình, vậy nên bác sĩ cần lưu ý để có kết quả phân tích bệnh
chính xác cho bệnh nhân.
 Tên xét nghiệm: HBV đo tải lượng Real-time PCR

Ý nghĩa: Là xét nghiệm đánh giá lượng virus cũng như theo dõi đáp ứng điều trị viêm gan

Xét nghiệm PCR định lượng HBV-DNA còn được gọi là đo tải lượng virus viêm gan B
một kỹ thuật xét nghiệm hiện đại nhằm mục đích xác định chính xác số lượng cũng nh
có trong mỗi đơn vị thể tích huyết thanh/huyết tương, áp dụng với đơn vị đo IU/ml hoặ
1IU sẽ tương đương với 5-6 copies). Từ đó, bác sĩ có thể đánh giá mức độ virus đang
gan.
Theo dõi, kiểm tra mức độ HBV-DNA xuất hiện trong máu định kỳ tháng, và định kỳ nă
nhằm quản lý tình trạng bệnh. Dựa vào đó xác định đúng thời điểm có thể điều trị và th
Diễn giải: của cơ thể bệnh nhân, sau đánh giá kỹ thuật cũng như thời gian ngưng điều trị.
 Hiện nay, xét nghiệm PCR định lượng HBV-DNA được áp dụng kỹ thuật hiện đại Rea
hoàn toàn từ bước tách chiết các phần tử DNA cho tới giai đoạn tiến hành phản ứng P
nhanh chóng, đạt chính xác cao, độ nhạy đạt 99%, độ đặc hiệu lên tới 99%.
Xét nghiệm này có thể giúp phân biệt các trường hợp khác nhau:
(1) Không thấy xuất hiện HBV-DNA trong bệnh phẩm mẫu máu
(2) Nồng độ HBV-DNA đạt dưới ngưỡng được phát hiện (khoảng 20 IU/ml)
(3) Đo được nồng độ HBV-DNA cụ thể.

Xét nghiệm HBV đo tải lượng Real-time PCR thường được sử dụng chẩn đoán và theo
Chỉ định:
+ Bệnh viêm gan B

Xét nghiệm liên quan HBsAg test nhanh/định lương, Anti-HBs, Anti-HBe (HBeAb), HBeAg, HBcAb

Hướng dẫn trước khi  Thông thường, bạn không cần chuẩn bị gì.
lấy mẫu:  Không sử dụng ống chống đông Heparin do có thể bị ức chế phản ứng PCR.

HBV GENOTYPE REAL-TIME PCR

 

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích
Xác định genotype của virus viêm gan B (HBV) trong máu.

Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR. 

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận
về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau
đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm dung cho tube 0,2 ml.

Máy ly tâm 25000 x g.

Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.

Tủ âm sâu (-20ºC) hoặc (-70ºC) (nếu có).

Máy vortex.

Tủ an toàn sinh học.

Micropipettes các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao      

Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 1 mẫu/lần thực hiện (VD)

STT Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao Đơn vị Số lượng

1 Bông Kg 0,001

2 Dây garô Cái 0,001

3 Cồn ml 1,000
4 Bơm kim tiêm Cái 1,000

5 Panh Cái 0,0001

6 Khay đựng bệnh phẩm Cái 0,0001

7 Hộp vận chuyển bệnh phẩm Test 0,001

8 Tube đựng bệnh phẩm Cái 2,000

9 Găng không có bột tal  Cái 0,500

10 Sinh phẩm chẩn đoán Test 1,000

11 Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng Test 2,000

12 Kít tách DNA Test 3,000

13 Ngoại kiểm (nếu có)*   0,020

14 Ependoff 1,7ml Tube 3,000

15 Ependoff 0,2ml Tube 3,000

16 Đầu côn 10 µl có lọc Cái 3,000

17 Đầu côn 30 µl Cái 1,200

18 Đầu côn 200 µl có lọc Cái 5,200

19 Đầu côn 1 ml có lọc Cái 3,000

20 Ethanol BDH ml 2,000

21 Water-DEPC Treated ml 2,000

 22 Giấy thấm Cuộn 0,100

23 Giấy xét nghiệm Tờ 2,000

24 Sổ lưu kết quả xét nghiệm Tờ 0,001

25 Bút viết kính Cái 0,020

26 Bút bi Cái 0,010

27 Mũ Cái 0,020

28 Găng tay Đôi 0,100

29 Găng tay xử lý dụng cụ Đôi 0,020

30 Quần áo bảo hộ Bộ 0,005

31 Dung dịch nước rửa tay ml 8,000

32 Cồn sát trùng tay nhanh ml 1,000

33 Dung dịch khử trùng ml 10,000

34 Khăn lau tay Cái 0,010

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình
ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại
kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm
Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần. 

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 3).

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).

Tiến hành kỹ thuật:

Bộ sinh phẩm HBV genotype.

Tách chiết DNA

Thực hiện phản ứng real-time PCR

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để
tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube HBV Genotype A rPCR
Mix, HBV Genotype B rPCR Mix và HBV Genotype C rPCR Mix. 

Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình real-time PCR.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-
time PCR.

Chọn màu “FAM” cho tất cả các mẫu, chứng dương và chứng âm.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.

Lưu file dữ liệu vào máy tính. 

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.  

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Điều kiện của phản ứng 
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín
hiệu nền với cả 3 genotype.

Chứng âm có đường biểu diễn thẳng và không vượt qua tín hiệu nền. 

Phân tích mẫu

Mẫu có đường biểu diễn dương tính tại vị trí tương ứng với genotype nào thì kết luận
mẫu nhiễm genotype đó. Một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều genotype.

Mẫu có đường biểu diễn âm tính với tất cả các genotype thì kết luận: “Mẫu nhiễm HBV
genotype khác ngoài 3 genotype A, B, C” (vì mẫu đã được xác định dương tính với HBV
trước đó).

In đồ thị kết quả 

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Tất cả các mẫu đều dương tính kể cả chứng âm.

Nguyên nhân 1:
Lô thí nghiệm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ môi trường của khu vực thao
tác hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu. 

Khắc phục:
Chiếu UV và vệ sinh khu vực thao tác bằng nước Javel để khử nhiễm. Tiến hành lại thí
nghiệm thật cẩn thận.

Nguyên nhân 2:
Kit bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR trong quá trình sử dụng. 

Khắc phục:
Thay kit mới và thực hiện quá trình như hướng dẫn ở nguyên nhân 1.

Trường hợp này không thể lấy kết quả, phải khắc phục và tiến hành lại thí nghiệm.