ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE CỦA CAO

CHIẾT

Một trong những giải pháp hiệu quả để ngăn ngừa và điều trị bệnh tiểu đường là làm
chậm quá trình hấp thu glucose bằng cách ức chế sự hoạt động của enzyme tiêu hóa tinh
bột như α-glucosidase.

Tiếp theo, ảnh hưởng của điều kiện chiết (nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ nguyện
liệu/dung môi chiết) đến khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của rong T. ornate được
nghiên cứu.

Xác định hoạt tính ức chế enzyme α-glucosiadase

Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được xác định theo phương pháp của Kim và
cộng sự [9]. Cho 0,05 ml mẫu vào hỗn hợp gồm 0,1 ml enzyme (0,2 U/ml) và 2,3 ml đệm
phosphate (0,01 M; pH 7,0). Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 37°C trong 5 phút. Tiếp theo,
cho 0,1 ml dung dịch cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (3 mM) vào hỗn hợp để
thực hiện quá trình phản ứng. Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ 37°C trong 30 phút. Cuối
cùng, thêm 1,5 ml dung dịch Na2CO3(0,1 M) và độ hấp thụ quang học của hỗn hợp được
đo ở bước sóng 401 nm. Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được tính theo công
thức sau:

Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase

A1: Độ hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm (có chứa dịch chiết).

A0: Độ hấp thụ quang của mẫu trắng (không bổ sung dịch chiết).

Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cũng được đánh giá dựa trên giá trị IC50
(mg/ml). Giá trị này là nồng độ chất ức chế (dịch chiết) cho hoạt tính ức chế là 50%.

3.7. Xác định kiểu ức chế enzyme α-glucosidase của dịch chiết
Dịch chiết thu nhận trong điều kiện chiết thích hợp được sử dụng để nghiên cứu kiểu ức
chế enzyme (enzyme kinetic). Kiểu ức chế enzyme được xác định theo phương pháp của
Kellogg và cộng sự [6]. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme được thực hiện
theo Kim và cộng sự [9]. Trong nghiên cứu này, sử dụng các nồng độ cơ chất khác nhau
từ 1 - 4 mM, nồng độ chất ức là 0 và 1 mg/ml. Kiểu ức chế được xác định dựa vào đồ thị
Lineweaver–Burk, biểu diễn mối liên hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng.

Phương pháp chiết, dung môi chiết, nguyên liệu

Khi thức ăn được hấp thu vào cơ thể thì các carbohydrate trong thức ăn được thủy phân
thành những phân tử đường nhỏhơn bởi những enzyme ở ruột non. Tiến trình phân
hóanày đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để phá vỡcác phân tử
carbohydrat lớn thành olisaccharid. Enzyme α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếp tục
phân hóa các olisaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào
máuTinh bột bị thủy phân dưới xúc tác của enzyme α-amylase tạo thành các phân tử
đường maltose. Sau đó các phân tử đường maltose tiếp tục bị thủy phân bởi 17 enzyme a-
glucosidase tạo thành các phân tử đường glucose làm tăng hàm lượng đường glucose
trong máu. Dưới tác động cao chiết sẽ làm ức chế sự thủy phân tinh bột thành đường
malotse, đường maltose không bị thủy phân thành các phân tử đường glucose

CHƯƠNG 2

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÁC MẪU
LÁ ĐẾN KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE

Mục tiêu: xác định nồng độ cao chiết ethanol của các mẫu lá thích hợp ức chế hoạt động
của enzyme α-glucosidase.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố,
gồm 5 nghiệm thức, với 3 lần lặp lại:

Nghiệm thức 1: Nồng độ cao chiết là 10 µg/mL.

Nghiệm thức 2: Nồng độ cao chiết là 25 µg/mL.

Nghiệm thức 3: Nồng độ cao chiết là 50 µg/mL.

Nghiệm thức 4: Nồng độ cao chiết là 75 µg/mL.

Nghiệm thức 5: Nồng độ cao chiết là 100 µg/mL.

Đối chứng dương là Acarbose có 5 mức nồng độ là 40, 60, 80, 100, 120 (µg/mL) và được
thực hiện tương tự cao chiết. Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày trong Bảng 6

Tiến hành thí nghiệm: Phản ứng ức chế sự thủy phân tinh bột của enzyme α-glucosidase
được thực hiện theo phương pháp của Hogan et al. (2010) và Đái Thị Xuân Trang và ctv.
(2012) và có điều chỉnh như sau: Cao ethanol từ các mẫu lá được pha trong dung dịch
DMSO thành nồng độ 1 mg/mL, hỗn hợp được ly tâm 10 phút. Pha loãng phần dịch trích
thu được trong dung dịch đệm phosphate pH = 7 thành các mức nồng độ: 10, 25, 50, 75
và 100 (µg/mL). Enzyme α-glucosidase được pha trong dung dịch đệm phosphate pH = 7
thành nồng độ 0,2 U/mL. 100 μL enzyme α-glucosidase được ủ với 50 μL cao chiết ở các
mức nồng độ khác nhau ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 10 phút. Tiếp theo, cho vào hỗn
hợp phản ứng 50 μL pNPG nồng độ 4mM. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 37oC với khoảng
thời gian 20 phút. Sau cùng, phản ứng được kết thúc bằng việc bổ sung 1000 μL Na2CO
0,2M. Hoạt động ức chế của enzyme α-glucosidase được xác định bằng cách đo độ hấp
thu quang phổ ở bước sóng λ = 400 nm của lượng p-nitrophenol tạo thành từ pNPG trong
phản ứng. Song song, tiến hành đánh giá hiệu quả ức chế enzyme α-glucosidase với đối
chứng dương là Acarbose ở các mức nồng độ tương ứng (Hình 12)
Hình 12: Quy trình khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase.

Chỉ tiêu đánh giá: Phần trăm enzyme α-glucosidase bị ức chế (%) và giá trị IC50. Phần
trăm enzyme α-glucosidase bị ức chế (%) được tính dựa vào lượng pnitrophenol tạo
thành từ pNPG trong phản ứng thông qua giá trị đo độ hấp thu quang phổ.

B-A

Phần trăm enzyme α-glucosidase bị ức chế (%) = ---------- x 100

Trong đó: A: Giá trị quang của mẫu thật.

B: Giá trị quang của mẫu đối chứng.

Các chất ức chế (Acarbose, Tannin) có tác động mạnh đến khả năng hoạt động của
enzyme α-amylase bằng cách kìm hãm theo hướng cạnh tranh hay phi cạnh tranh, kết quả
làm ảnh hưởng đến sự liên kết giữa trung tâm hoạt động của enzyme với cơ chất (Kandra,
2004; Cheng, 2005 và Lê Thanh Hải, 2013). Vì vậy, Acarbose được sử dụng như nghiệm
thức đối chứng trong các thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase. Kết
quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của
 Kết quả trong nghiên cứu này chứng minh các chất trong lá Ổi ức chế enzyme

α-amylase và α-glucosidase in vitro một cách có ý nghĩa thống kê và kiểm soát

tình trạng tăng đường huyết sau bữa ăn ở chuột bệnh tiểu đường. Từ các kết quả được
trình bày ở trên cho thấy lá Ổi có thể được sử dụng để kiểm soát bệnh tiểu đường.

Trong nghiên cứu này, khả năng kiểm soát đường huyết của cao chiết lá cây Ổi được chứng minh trên
chuột bệnh tiểu đường cũng như khả năng ức chế enzyme biến dưỡng carbohydrate của cao chiết lá Ổi in

vitro cũng được chứng minh trong nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết cao lá Ổi

Lá Ổi sau khi phơi khô được chiết bằng dung môi ethanol. Cao thô ethanol được sử dụng cho thí nghiệm
khảo sát khả năng hạ đường huyết trên chuột tiểu đường được gây bệnh bằng alloxan monohydrate.

Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase được khảo sát ở các cao lá Ổi chiết bằng dung môi nước,
methanol và butanol để được các cao thô nước, methanol và butanol.

2.2.2 Khảo sát tính an toàn của cao ethanol trên chuột nhắt trắng bình thường

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cao chiết đối với chuột được thực hiện ở nồng độ cao chiết 400
mg/kg trọng lượng chuột, sử dụng 0,1 ml/2 lần/ngày trong 7 ngày. Đường huyết và trọng lượng của chuột
được đo vào các ngày thứ 7 sau khi chuột uống cao chiết. Mỗi nhóm chuột thí nghiệm gồm 4 con, chuột
bình thường không được uống cao chiết được sử dụng như nghiệm thức đối chứng.

2.2.3 Khảo sát khả năng hạ đường huyết của cao ethanol lá Ổi

Chuột chín tuần tuổi khỏe mạnh được tiêm dung dịch alloxan monohydrate ở nồng độ 135 mg/kg trọng
lượng chuột để gây BTĐ. Sau khi chuột BTĐ ổn định 3 ngày, khả năng hạ đường huyết của các cao
ethanol lá Ổi được xác định bằng cách cho chuột BTĐ uống thuốc điều trị ĐTĐ gliclazide (10 mg/kg
trọng lượng chuột) hoặc các cao ethanol của lá Ổi (400 mg/kg trọng lượng chuột) hoặc không được uống
thuốc hay cao ethanol lá Ổi. Chuột BTĐ uống cao chiết lá Ổi 0,1 ml/2 lần/ngày trong 20 ngày điều trị.
Trọng lượng và đường huyết được xác định vào 7-8 giờ sáng trước khi chuột được cho ăn. Sau khi đo các
chỉ tiêu khoảng 60 phút chuột được cho ăn và uống nước bình thường.

2.2.4 2.2.3 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao

chiết lá Ổi
Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase

Phản ứng ức chế sự thủy phân tinh bột của enzyme α-amylase bởi cao chiết lá Ổi được thực hiện theo
phương pháp của Adisakwattana et al., (2009) có hiệu chỉnh như sau 500 µl hỗn hợp phản ứng trong 0,02
M dung dịch đệm natri phosphate pH 6,9 có chứa 6 mM natri clorua, bao gồm 1 mg/ml tinh bột, cao chiết
ở các nồng độ 0,1, 0,2 và 0,4 mg/ml và 2,5 U enzyme α-amylase. Hỗn hợp phản ứng sau khi được ủ 15
phút ở 37°C được thêm 500 µl thuốc thử DNSA và đun sôi hỗn hợp phản ứng trong 5 phút. Hỗn hợp phản
ứng được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 540 nm. Mẫu đối chứng dương được thực hiện bằng
thuốc acarbose.

Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase: Khả năng ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase
bởi các cao chiết thực vật được thực hiện theo phương pháp của Hogan et al., (2010) có hiệu chỉnh như
sau: 50 µl cao chiết lá Ổi ở nhiều nồng độ khác nhau được ủ với 25 µl enzyme α- glucosidase nồng độ 20
U/ml (nồng độ cuối cùng trong phản ứng 1 U/ml), sau đó 175 µl dung dịch đệm phosphate nồng độ 100
mM, pH 6,8 được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Sau khi hỗn hợp pu được ủ ở 37°C trong thời gian 30
phút, 250 µl của 4 mM pNPG được cho vào hỗn hợp phản ứng và ủ 30 phút ở 37°C. Sau đó hỗn hợp phản
ứng được đo mật độ quang ở bước sóng 450 nm.

3.1 Sự an toàn (không gây độc tính cấp) của cao ethanol lá Ổi trên chuột

Để đánh giá sự an toàn của cao ethanol lá Ổi, chuột nhắt trắng được cho uống cao ethanol ở nồng độ 400
mg/kg trọng lượng