Tham Dinh Qui Trinh Phan Tich Cap Nhat - dk42 Dk31 LT

THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH
(VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES)
BÀI GIẢNG LỚP DK40
TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

LBM. HPT-KNT-ĐC
CẦN THƠ – 02/03/2020 1

VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES
MỤC TIÊU
1. Trình bài về qui trình phân tích
2. TRình bày thẩm định qui trình phân tích
3. Phân tích phạm vi thẩm định và tái thẩm định quy trình
phân tích
4. Các yêu cầu cần thực hiện để thẩm định qui trình phân tích
theo các hướng dẫn hiện hành
2
NỘI DUNG
1. Định nghĩa và phân loại qui trình phân tích
2. Trình bày phạm vi thẩm định & tái thẩm định qui trình phân tích
3. Trình bày được các yêu cầu thẩm định qui trình phân tích theo
các hướng dẫn của ICH, USP, AOAC, FDA
4. Phân tích được từng yêu cầu trong việc thẩm định qui trình phân tích
5. Một số ví dụ thẩm định quy trình: thuốc tân dược, dược liệu, môi trường,
dịch sinh học
3
TÀI LIỆU THAM KHẢO
4
1. QUI TRÌNH PHÂN TÍCH
1.1. Định nghĩa
Qui trình thử nghiệm (test procedure), mô tả chi tiết các bước
cần thiết để thực hiện một thử nghiệm (analytical test)
❖Chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn đối chiếu, các thuốc thử...
❖ Sử dụng các trang thiết bị máy móc, thiết lập đường chuần,…
❖ Xử lý, tính toán và biện giải kết quả,…
5
1.2. Phân loại
Các loại qui trình phân tích
Thử định tính Thử tinh khiết Thử định lượng

(Identification tests) (Impurity tests) (Assay Procedures)
6
1.2.1. Thử định tính VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES
Nhằm đảm bảo rằng chất cần phân

tích có mặt trong mẫu đem thử.
Thường được so sánh với tính chất
mẫu chuẩn (các loại phổ, các đặc
trưng về sắc ký, phản ứng hoá học,...)
7
1.2.2. Thử tinh khiết
1. adenine
adenosine
❖ Định Lượng Tạp Chất
adenosine bảo quản 1200C/36 giờ
❖ Thử Giới Hạn của tạp chất
Mức độ tinh khiết của mẫu cần thử thử. 3,4 sản phẩm
phân hủy của
adenosine
adenosine bảo quản
200 200
1200C/24 ngày
Lincomycin B
mAU
mAU
100 100
Lincomycin
5.117
10.123
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Minutes
SKĐ mẫu viên nang lincomycine tạp phân hủy

8
1.2.3. Thử định lượng
❖ Nguyên liệu làm thuốc: là xác định hàm lượng của thành phần
chính có trong mẫu thử.
❖ Chế phẩm: là xác định hàm lượng của các hoạt chất có trong
mẫu chế phẩm.
❖ Độ hòa tan: tỉ lệ dược chất được phóng thích theo thời gian
❖ Dịch sinh học: nồng độ thuốc có trong dịch sinh học giúp đánh
giá tương đương sinh học, SKD, nghiên cứu DĐH của thuốc.
9
2. THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH
2.1. Định nghĩa
Thẩm định qui trình phân tích là một quá trình (procedure)
Tiến hành thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp
để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến
Khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được
10
2.2. Mục đích
Xây dựng qui trình phân tích
Thực hiện các chỉ ✓ Bắt buộc ✓ Có thể đưa vào
tiêu đề ra cũng như các chuyên luận

✓ Định kỳ.
Dược điển
kiểm tra chất lượng ✓ Đảm bảo qui trình
✓ Tiêu chuẩn cơ sở
cho tiêu chuẩn KN. đề xuất đạt độ tin
để xin đăng ký
cậy trong suốt quá
lưu hành.
trình phân tích.
11
3. PHẠM VI THẨM ĐỊNH- TÁI THẨM ĐỊNH
❖ Qui trình phân tích đã có trong DĐVN IV, USP, BP, EP, JP, AOAC
international không cần phải thẩm định toàn bộ (có thể kiểm tra lại về tính
tương thích hệ thống với qui trình định lượng bằng LC hay GC)
khi tất cả các thông số về thiết bị, điều kiện phân tích, hóa chất sử
dụng,…hoàn toàn giống nhau.
❖ Tuy nhiên, thực tế áp dụng khi chuyển sang phòng thí nghiệm khác thường
phải được tái thẩm định do hầu hết các trường hợp đều có sự khác biệt
ít nhất về một trong các thông số trên.
12
Phạm vi thẩm định
❑ Qui trình phân tích mới chưa có trong Dược điển
❑ Có trong Dược điển nhưng có sự thay đổi một trong các yếu tố.
Tái thẩm định một phần hoặc hoàn toàn
❑ Thay đổi qui trình phân tích đã được thẩm định: thành phần công thức,
qui trình tổng hợp dược chất, thông số trong qui trình, trang thiết bị phân tích
có đặc tính khác, phòng thí nghiệm có điều kiện môi trường khác, hóa chất,
thuốc thử hay nguồn chuẩn, người phân tích.
❑ Xét duyệt tại các Cơ quan kiểm nghiệm quốc gia xin đăng ký lại để lưu
hành mặt hàng (thẩm định định kỳ).

13
Asean guideline 2011
Đăng ký theo tiêu chuẩn dược điển
❖ Định tính: tính đặc hiệu
❖ Định lượng: tính đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại (hoạt chất, tạp chất trong thử
tinh khiết, độ giải phóng hoạt chất trong thử độ hòa tan)
❖Thử giới hạn tạp chất: tính đặc hiệu
Đăng ký theo tiêu chuẩn cơ sở
❖ Phương pháp không có trong dược điển: thẩm định qui trình phân tích đầy
đủ theo hướng dẫn của Asean.
❖ PP đã có trong dược điển: áp dụng như pp đăng ký theo dược điển
14
4. CÁC YÊU CẦU THỰC HIỆN THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH
<1225> USP 40- Validation of International Conference on

compedial methods Harmonisation/ICH- Q2 (R1) 2005
15
4.1. Theo Q2(R1)-ICH (International Conference on Harmonization, 11-2005)
Kiểu qui trình THỬ TINH KHIẾT

Định tính Định lượng
Yêu cầu thẩm định Định lượng Giới hạn
Tính đặc hiệu2 + + + +
Độ chính xác

− + − +
+ Độ lặp lại
− +3 − +3
+ Độ chính xác trung gian
− + − +
+ Độ sao lại
Độ đúng − + − +
Giới hạn phát hiện − -1 + −1
Giới hạn định lượng − + − −1
Tính tuyến tính − + − +
Khoảng giá trị − + − +
+: chỉ tiêu phải thẩm định; −: chỉ tiêu không cần phải thẩm định
1: chỉ tiêu chỉ cần trong một số trường hợp;
2: trong trường hợp không thực hiện thì phải thay thế bằng các qui trình phân tích hỗ trợ khác;
3: trong trường hợp đã xác định độ sao lại thì không cần phải xác định độ chính xác trung gian
16
4.2. <1225> USP 40/NF35- Validation of compendial procedures
Phân Phân tích loại 2
Phân tích Phân tích
Yêu cầu thẩm định tích Thử giới
Định lượng loại 3 loại 4
loại 1 hạn
Độ đúng + + * * -
Độ lặp lại + + - + -
Tính đặc hiệu + + + * +
Giới hạn phát hiện - - + * -
-
Giới hạn định lượng - + - *
Tính tuyến tính + + - * -

Miền giá trị + + * * -
*: Yêu cầu tùy thử nghiệm riêng

Loại 1: Định lượng thành phần chính hay hoạt chất trong thành phẩm thuốc
Loại 2: Thử định lượng và xác định giới hạn tạp chất phân hủy trong nguyên liệu hay chế phẩm.
Loại 3: Qui trình phân tích định lượng cho những tiêu chuẩn: độ hòa tan, phóng thích thuốc…
Loại 4: Thử định tính 17
<1225> USP 40- Validation of compedial methods
Theo Q2(R1)-ICH (International Conference on Harmonization, 11-2005)
18
4.3. Asean guideline 2011
Loại qui trình Định lượng
phân tích Định Xác định tạp chất + Độ hòa tan
tính + Hàm lượng
Các chỉ tiêu Định lượng Thử giới hạn

Độ đúng - + - +
Độ lặp lại - + - +
Độ chính xác trung gian +(1) +(1)
Tính đặc hiệu (2) + + + +
Giới hạn phát hiện - - (3) + -
Giới hạn định lượng - + - -
Tính tuyến tính - + - +
Khoảng xác định - + - +
(1) Nếu đánh giá độ tái lập thì không cần đánh giá chỉ tiêu này
(2) Qui trình kém đặc hiệu có thể bổ trợ bằng qui trình khác
19
TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ (3) Có thể cần trong một số trường hợp
4.4. Quyết định 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013 về việc
ban hành Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc
20
Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013
21
22
23
24
25
26
27
28
5. PHÂN TÍCH CÁC YÊU CẦU THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH
5.1. TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG
❖ Quy trình định lượng bằng HPLC, GC, CE phải thực hiện
❖ Tính tương thích hệ thống luôn được thực hiện với phương pháp sắc ký trước
khi tiến hành thẩm định qui trình phân tích nhằm đảm bảo toàn bộ hệ thống
(thiết bị, mẫu phân tích, dụng cụ, vận hành hệ thống, các yếu tố ảnh hưởng
đến đặc tính sắc ký...) có hiệu năng phù hợp.
❖ Các thông số được dùng để đánh giá tính phù hợp hệ thống: tR, S, Rs, As, N,
k’.
❖ Độ lặp lại của các thông số kỹ thuật của hệ thống khi tiến hành trên
mẫu chuẩn và mẫu thử với ít nhất 6 lầnSD

tiêm mẫu liên tiếp.
RSD =  100
X 29
❖ Yêu cầu: RSD ≤ 2%
30
31
System suitability- LC/PDA
32
System suitability-
System suitability
LC/PDA
33

System suitability- LC/MS
34
35
Sắc ký đồ điển hình tính tương thích hệ thống
Sắc ký đồ overlay của aldicarb Sắc ký đồ overlay của carbaryl 36

37
Specificity/ selectivity
5.2. TÍNH ĐẶC HIỆU/ TÍNH CHỌN LỌC
❖ Xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích và không bị ảnh hưởng bởi
sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử: gồm các tạp chất, sản phẩm
phân hủy, chất nền,…
❖ Một QTPT kém đặc hiệu có thể được bổ trợ bằng một hoặc nhiều QTPT khác.
Đảm bảo xác định

đúng chất cần thử
5.2.1. QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH
(Identification tests)
Cần phân biệt các chất có
cấu trúc gần giống nhau
38
Ñònh tính aspirin bằng uv-vis
39
Tính ñaëc hieäu trong thử phản ứng ñònh tính
❖ Phaûn öùng chæ ñuû ñaëc tröng cho moät nhoùm chöùc, moät heä voøng..
do ñoù phaûi keát hôïp nhieàu phaûn öùng hoaëc ghi phoå…
❖ IR vôùi ñôn chaát nghuyeân lieäu: coù theå boû bôùt caùc phương pháp khác
❖ Neáu duøng SKLM ñeå ñònh tính thì duøng 2-3 heä dung moâi coù ñoä phaân cöïc
khaùc nhau vaø duøng kyõ thuaät SK choàng veát chaát thöû vaø chaát ñoái chieáu.
40
Specificity/Identification-TLC
41
Specificity/Identification-TLC
42
Specificity/Identification-UV
43
Specificity/Identification-IR
44
Specificity/Assay
5.2.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
Đảm bảo kết quả xác định hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu là đặc hiệu,
chính xác, không bị ảnh hưởng của các thánh phần khác có trong mẫu.
❑ Tính đặc hiệu
➢ Biểu thị bằng hiệu các kết quả thu được từ mẫu tự tạo và mẫu trắng (placebo)
➢ Độ nhiễu của phương pháp
❑ Tiến hành
Mẫu tự tạo: công thức và thành phần hoàn toàn giống mẫu thử
Mẫu trắng: thành phần giống mẫu thử nhưng không có chất cần định lượng
✓ Xác định các mẫu trên bằng phương pháp đề xuất
✓ Kết quả thu được so với mẫu trắng
✓ Xác định HIỆU hay độ sai lệch của các kết quả thu được
45
Specificity/Assay
A. PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ THỂ TÍCH
46
Specificity/Assay
A. PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ THỂ TÍCH
47
Specificity/Assay
B. PHƯƠNG PHÁP QUANG HỌC
48
Specificity/Assay UV-VIS
Abs
0.9
0.8 Mẫu chuẩn
0.7
Mẫu thử
0.6
0.5 Mẫu trắng
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
nm
250 300 350 400
Tính đặc hiệu của gel piroxicam 0.5%
49
Specificity/Assay
318 nm
Mẫu trắng
Mẫu giả định
Đònh löôïng paracetamol ôû böôùc soùng 318nm baèng QPÑH baäc hai
trong cheá phaåm nhieàu thaønh phaàn Dimitalgin.
50
Specificity/Assay AAS
51
Specificity/Assay AAS
52
Specificity/Assay HPLC-GC
C. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (HPLC, GC)

53
Specificity/Assay HPLC
54
55
Đầu dò PDA: sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic để chứng minh
pic sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên
56
57
Max plot
2-O-nornuciferin
UV
Tinh khiết pic
58
O-nornuciferin
pronuciferin
Isoliensinin
nuciferin isoliensinin
nuciferin
e
pronuciferin O-nornuciferin
b
a
Hình 2. Phổ UV tại thời gian lưu
của các alkaloid trong mẫu đối
Hình 1. Sắc ký đồ pha động (a), mẫu đối chiếu (b), mẫu trắng chiếu (a) và mẫu thử (b)
(c), mẫu thử (d), mẫu thử thêm chất đối chiếu (e)
Nguồn trích dẫn:

Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Tô Yến Ngọc, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn.
“Xây dựng quy trình định lượng đồng thời nuciferine, pronuciferine, o-
nornuiferuine và isoliensinine trong lá sen bằng phương pháp HPLC với
đầu dò PDA”. Tạp chí Dược học số 445 (53), 2013.
59
Isoliensinin
Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ,
9.8
Lữ Thiện Phúc, Mạch Khắc Duy.
Xây dựng qui trình định lượng,
định tính điểm chỉ một số alkaloid
chính có trong tâm sen Việt Nam
(Nelumbo nucifera Gaertn) bằng
kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao
với đầu dò dãy diod quang.
Tạp chí Y học thực hành,
số (852+853), 2012.
(3)
(2)
(1)
Kiểm tra độ tinh khiết pic pronuciferin

60
Nguồn trích dẫn:

Huỳnh Lâm Tú Anh, Đỗ Châu
Minh Vĩnh Thọ. Nghiên cứu
xây dựng qui trình phân tích
một số glucocorticoid ngụy tạo
trong các loại mỹ phẩm trị
mụn, làm trắng da bằng
phương pháp HPLC/PDA). Tạp
Chí Y Dược Cần Thơ, số 3-4
năm 2016, 187-190.
Hình 1. Overlay sắc ký đồ mẫu thử giả lập thêm chuẩn (a), mẫu thử giả lập (b),
mẫu hỗn hợp chuẩn (c), mẫu trắng giả lập (d), dung môi pha mẫu MeOH (e),
pha động (f) ở điều kiện sắc ký thích hợp
61
62
63
64
Mẫu trắng Chuẩn desloratadin

nồng độ 100 µg/ml
Viên desloratadin Viên desloratadin

nồng độ 100 µg/ml thêm chuẩn
Siro desloratadin Siro desloratadin

nồng độ 100 µg/ml thêm chuẩn
65
Specificity/Assay LC-PDA
Nghiên cứu về độ bền vững của thuốc
❑ Thẩm định qui trình định lượng trong trường hợp có sản phẩm phân hủy
❑ Chưa xác định được chế phẩm có hay không có sản phẩm phân hủy
➢ Tự tạo mẫu biết chắc chắn là có sản phẩm phân hủy
➢ So sánh kết quả định lượng với mẫu không có sản phẩm phân hủy
❑ Ví dụ 1: định lượng vitamin B1
➢ Đo phổ UV hay phép đo bạc: không đặc hiệu
➢ Đo phổ huỳnh quang (theo USP) hay HPLC
❑ Ví dụ 2: khảo sát độ ổn định chế phẩm gel piroxicam 0,5%
66
Specificity/Assay LC-PDA
(a)
(b)
Sắc ký đồ của dung dịch Piroxicam chuẩn 250 ppm khi để ở 80°C trong 2 ngày (a)
và để ngoài ánh sáng trực tiếp trong 5 giờ (b)
67
Specificity/Assay CE-PDA

Nguyễn Đức Tuấn (2009).
Xây dựng qui trình định lượng, đồng thời
lovastatin, atorvastatin và simivastatine
bằng phương pháp CE/PDA.
Tạp chí Dược học 401 Vol. 49, 45-50 .
2: Hỗn hợp chuẩn

2a, 2b, 2c: mẫu thử ATOR, LOV và SIM
68
Specificity/Assay LC-MS/MS
TÍNH ĐẶC HIỆU- QTĐL VỚI ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ (MS)
69
70
71
72
73
74
75
Theo các tiêu chuẩn của Cộng đồng Châu Âu (EC, 2002), độ lệch
chuẩn tương đối của thời gian lưu cho các chất phân tích ở 3 mức
nồng độ khác nhau đối với kỹ thuật sắc ký lỏng không vượt quá 2,5%.
76
77
78
79
80
81
Nguồn trích dẫn:
Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner.
Analysis of alkaloids in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by non aqueous capillary
electrophoresis using ultraviolett and mass spectrometric detection.
Journal of Chromatography A, 1302 (2013), 174-180.
82
Specificity/Assay CE-PDA-MS
Fig 1. Chemical structure of the determined alkaloids in Lotus leaves: caaverine (1), isoliensinine (2),
norarmepavine (3), armepavine (4), nuciferine (5), o-nornuciferine (6) and pronuciferine (7).
83
Figure 2: CE separation of a standard mixture and a Lotus leaf extract (sample NN-1a) under optimized
conditions (capillary: fused silica, 50 µm i.d., effective length 52 cm; buffer: 100 mM ammonium
acetate in MeOH/ACN/water (70/25/5) with 0.6% acetic acid; injection: hydrodynamic at 50 mbar
for 2 s; voltage: 25 kV; temp: 30°C; detection wavelength: 225 nm). Peak assignment: 1. caaverine,
2. isoliensinine, 3. norarmepavine, 4. armepavine, 5. nuciferine, 6. nornuciferine, 7. pronuciferine.
84
Kiểm tra độ tinh khiết pic của 7 alkaloid trên lá sen bằng CE/PDA/MS
DAD1 B, Sig=225,20 Ref=off (THO\LOTA0207.D)
mAU
Peak purity of mix-Standard

40
30
20
10
2 4 6 8 10 12 5 14 16 min
*DAD1 B, Sig=225,20 Ref=off (THO\LOTA0226.D)
mAU
Peak purity of Sample NN-1a 2

40
6
3
1 4
30
7
20
10
2 4 6 8 10 12 14 16 min*
| |
| ' ' ' ' |
Calculated
++++++++++++++++++++++
13.95 14 min 200 250 300 350 400 450 500 550 nm
85
Figure 4: CE-MS analysis of

a standard solution and sample
NN-1a. Analytical conditions as
for Figure 2, except a capillary
length of 90 cm.
MS conditions: ESI positive;
sheath gas: 4 psi (nitrogen);
dry gas: 4 L min-1 (nitrogen);
probe temperature: 250°C;
spray voltage: 4.5 kV;
sheath liquid: methanol/water
=1/1 with 0.6 % acetic acid,
flow rate: 0.2 mL min-1.
86
87
Đảm bảo xác định đúng, chính xác hàm lượng hoặc giới
5.2.3. Thử tinh khiết hạn của các tạp chất có trong mẫu thử (tạp liên quan,
(ICH, Asean, USP 36) kim loại nặng, tạp phân hủy, dư lượng dung môi...)
Trường hợp có chuẩn tạp chất

❑ Thử định lượng
Cần chứng tỏ phân biệt được chất phân tích (dược chất) trong sự hiện diện của tạp chất
và/hoặc tá dược.
❖Thêm vào mẫu thử tinh khiết có chứa tạp chuẩn một lượng chất chuẩn của hoạt chất
ứng với hàm lượng tạp chất thích hợp và/hoặc thêm vào một lượng tá dược.
❖Chứng minh kết quả định lượng tạp chất không bị ảnh hưởng bởi thành phần thêm
vào bằng cách so sánh kết quả định lượng trước và sau khi thêm.
❑ Thử giới hạn
❖Thêm vào mẫu thử tinh khiết có chứa tạp chuẩn một lượng chất chuẩn của chất phân
tích tương ứng với hàm lượng tạp chất thích hợp.
88
❖Chứng minh từng tạp chất vẫn tách hoàn toàn và tách khỏi các thành phần khác
Specificity/Purity
89
Specificity/Purity
Trường hợp không có tạp chuẩn
Trong trường hợp này, tính đặc hiệu nên được xác định trên mẫu được bảo quản trong
những điều kiện khắc nghiệt
❖ Ánh sáng (chiếu tia UV/Vis)
❖ Nhiệt độ (50oC – 100oC)
❖ Độ ẩm (70% - 90%)
❖ Thủy phân trong môi trường acid/base (HCl/NaOH 0,1N – 2N)
❖ Oxy hóa khử bằng hydroperoxyd 30%
Mục đích: phân hủy mẫu, chứng tỏ không có sự ảnh hưởng của các chất khác.
So sánh kết quả phân tích của mẫu chứa tạp chất hoặc sản phẩm phân hủy với các kết
quả từ một qui trình độc lập khác (ví dụ: Dược điển hoặc một QT phân tích khác đã
được thẩm định)
90
Specificity/Purity
Stress Forced degradation Stress stability

parameter (5 – 15% decomposition)
Acid 0.2 ml 1N HCl / 5 ml API-solution / pH ± 2 (2 weeks)

3h, 6h, 12h, 24h…7d (RT & 60°C)
Base 0.2 ml 1N NaOH / 5 ml API-solution pH ± 10 (2 weeks)

/ 3h, 6h, 12h, 24h…7d (RT & 60°C)
H2O2 / 0.2 ml 5% or 35% H2O2 / 5 ml 1 g/ml oxygen bubbled through

Oxygen API-solution (RT, to 7d & 60°C, 3h) (8 hours) 0.1 – 2% H2O2 (24
hours)
Heat 60°C / 5 ml solution (3h, 6h…7d) -
Heat 105° C / solid API (1d and 7d) 60°C (4 weeks)
UV or 365 nm or white fluorescent light /

Light solid API (1d and 7d)
Humidity - 50°C / 80% RH (4 weeks)
91
Specificity/Purity
SKĐ của Meloxicam trong MT kiềm
92
Specificity/Purity
Thử giới hạn tạp chất (không có tạp chuẩn): Sử dụng mẫu chuẩn đối chiếu là
mẫu thử pha loãng, có thể xác định lượng tạp chất bằng cách dùng mẫu thử
pha loãng ra nhiều lần, trường hợp này chỉ kết luận là tạp chất nhưng không
định danh là tạp gì.
93
Specificity/Purity
94
5.3. GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (Limit of detection)
Là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu (ppm, ppb...) có thể phát hiện được
nhưng không nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng
PPPTcó nhiễu nền

(UV,HPLC, GC, CE)
A. LOD-
QUY TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG
n=3
Tỷ lệ đáp ứng S/N nằm giữa 3:1 hoặc 2:1

95
thường được chấp nhận để thiết lập LOD và 10:1 với LOQ
Tỷ lệ đáp ứng S/N nằm giữa 3:1 hoặc 2:1

thường được chấp nhận để thiết lập LOD và 10:1 với LOQ
96
Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) ảnh hưởng đến độ chính xác
của kết quả định lượng và có thể tính theo công thức
2H
S/N =
h
o H: là chiều cao của pic chất phân tích trên SKĐ thu được với
dung dịch chất chuẩn có nồng độ đã định, chiều cao này được
đo từ đỉnh pic đến đường nền ngoại suy trên một khoảng bằng
20 lần chiều rộng của pic ở nửa chiều cao của pic.
o h: là khoảng dao động của nhiễu đường nền trên SKĐ thu được
với mẫu trắng, nhiễu đường nền được tính về hai phía của
đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của píc,
bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của píc tại nửa
chiều cao.
97
Aldicar
Methomyl b
Methiocar
b
98
99
100
Xác định LOD bằng phương pháp 3
o Hệ số tương quan R2 = 0,99945 Test lại ở nồng độ LOD

o Độ lệch chuẩn S = 410430,8
Ngoại suy o Hệ số góc a = 338142,8
o Giới hạn phát hiện LOD = 3,3*S/a = 4,01 g/ml
o Giới hạn định lượng LOQ = 10*S/a = 12,14 g/ml

101
Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học
VKN VSTP QUỐC GIA
5.3.4. Dựa vào độ lệch chuẩn
102
103
104
105
B. LOD- QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH
❖ Cần xác định được nồng độ nào mà tại đó sẽ xác định chắc chắn sự có
mặt của chất phân tích.
❖ Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ nhỏ khác nhau, mỗi
nồng độ phân tích lặp lại 10 lần.
❖ Xác định tỷ lệ phần trăm số lần phát hiện (dương tính) hoặc không phát
hiện (âm tính).
106
5.3. GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (Limit of quantitation)
❖ Lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử (ppm, ppb...) còn có thể
xác định được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
❖ Được sử dụng đặc biệt trong xác định tạp chất và sản phẩm phân hủy, dược chất
trong dịch sinh học.
❖ LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng.
❖ Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào
từng phương pháp cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp.
❖ Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu phân tích, do đó
cần thực hiện trên nền mẫu thật.
107
LOQ thường kết hợp
với tính LOD
LOQ trong nhiều
trường hợp có thể là
điểm thấp nhất của
khoảng tuyến tính
108
109
110
111
❖ Nhằm tìm giá trị LOQ thực tế cho phương pháp, tiến hành phân tích
mẫu thêm chuẩn ở nồng độ sao cho tại đó đáp ứng các tiêu chí của độ
đặc hiệu và đồng thời độ thu hồi cũng đáp ứng theo các quy định
quốc tế (EC, 2002; AOAC Guidelines, 2002).
❖ Kết quả phân tích 10 mẫu, khảo sát và thẩm tra tại nồng độ bằng 2 lần
LOD, cho thấy rằng: florfenicol và amoxicillin đạt độ đặc hiệu, độ thu
hồi, độ lặp lại tại nồng độ 5,0 µg/kg; florfenicol amin và doxycycline đạt
tại nồng độ 10,0 µg/kg theo các tiêu chí quy định (EC, 2002)
112
113
114
115
Ví dụ: Bằng HPLC pha đảo đã xác định được một pic của tạp chất có trong
hoạt chất có thời gian lưu là 17 phút.
Để phát hiện tạp chất, SKĐ cho đường nền có độ nhiễu là N = 13 mm.
Khi tiến hành sắc ký tạp chất có nồng độ 0,5 mcg/ml thu được chiều cao của
pic là 37 mm
Như vậy LOD là 0,5 mcg/ml và LOQ = (0,5/3) x10  1,6mcg/ml
116
Linearity-Range
5.5. TÍNH TUYẾN TÍNH-MIỀN GIÁ TRỊ
117
Linearity-Range
118
Linearity-Range
40-140%
trắc nghiệm F trắc nghiệm T
0,9950  R2  1,0000 (ICH, AOAC, FDA)
119
120
121
Linearity-Range
STT Nồng độ (µg/ml) Trung bình diện tích pic
Amoxicillin
1 59,96 25119142
2 79,95 32444965
3 99,94 39521696
4 119,93 45736411
5 139,91 52267343
122
Linearity-Range
Xaây döïng pthq - ñònh löôïng aspirin baèng Uv-vis
Nồng độ Abs

(mcg/ml) (280.8nm)
0.900
0.800 y = 0.0086x - 0.0016
9.98 0.084
0.700 R2 = 0.9998
19.96 0.169
Do hap thu
0.600
29.94 0.254 0.500
0.400
39.92 0.340 0.300
49.91 0.435 0.200
0.100
59.89 0.512
0.000
69.87 0.596 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00
79.85 0.687 Nong do (mcg/ml)
89.83 0.768
123
Linearity-Range
❖ Xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng
(điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất), cần khoảng
10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau.
❖ Tiến hành đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc
của tín hiệu vào nồng độ. Vẽ đường cong tương quan, quan sát sự phụ thuộc cho
đến khi không còn tuyến tính.
❖ Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng
nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử dụng có độ nhạy khác nhau.
124
Linearity-Range
❖ Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn
và xác định hệ số hồi quy tương quan.
❖ Có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu,
không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính.
❖ Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của
đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn.
125
Linearity-Range
Xây dựng đường cong chuẩn với chuẩn tinh khiết
126
127
Linearity-Range
128
Armepavine, DAD1 B DAD1, 10.670 (211 mAU,Apx) of LOTA0203.D
Area = 0.60123057*Amt +1.2042052
mAU
Area Rel. Res%(7): 47.469
350 175
300 150
250 125
200 100
150 75
50 225
100
50 25
0
0 Correlation: 0.99730
0 200 400 Amount[mcg/ml] 200 400 nm
129
Linearity-Range
Xây dựng đường cong chuẩn trên nền mẫu trắng
❖ Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ khác nhau
(ít nhất 6 nồng độ), trong khoảng tuyến tính ước lượng ở trên, mỗi nồng độ làm 3 lần.
❖ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ
(trục hoành x). Tính các hệ số hồi quy trong phương trình hồi quy và hệ số tương quan
(R) tương tự như trên.
❖ Đường chuẩn xây dựng trên nền mẫu trắng thường cho độ tin cậy cao
hơn khi xây dựng với chuẩn tinh khiết, do có thể loại trừ phần nào các ảnh hưởng của
nền mẫu.
❖ Trong nhiều trường hợp khó tìm được mẫu trắng phù hợp và không được có
chất phân tích, có thể sử dụng phương pháp lập đường chuẩn trên nền mẫu thực.
130
Linearity-Range
131
Linearity-Range
Xây dựng đường cong chuẩn trên nền mẫu thực
Có thể loại trừ được các ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả
phân tích. Sau khi lập được phương trình đường chuẩn
y = ax + b, có thể dễ dàng tính được nồng độ: X = b/a. 132
Linearity-Range
Xây dựng đường cong chuẩn sử dụng nội chuẩn
❖ Một phương pháp rất hữu ích trong phân tích, đặc biệt trong phân tích hiện đại là
sử dụng nội chuẩn.
❖ Nội chuẩn được thêm vào mẫu cùng với ngoại chuẩn với nồng độ phù hợp và
giống nhau (C-is)
❖ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn chia cho nội chuẩn
(trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ ngoại chuẩn (trục hoành x).
❖ Tính các hệ số hồi quy (a, b trong phương trình hồi quy y = ax + b) và hệ số tương
quan (R) tương tự.
133
Linearity-Range
Concentration of EX-STD
134
Linearity-Range
❖ Khi phân tích mẫu, nội chuẩn cũng phải được thêm vào (tốt nhất là từ
đầu, sau khi cân, đong) để sao cho tạo được nồng độ cuối cùng bằng nồng độ
nội chuẩn trong các dung dịch chuẩn.
❖ Với cách tiến hành như thế này có thể hạn chế được hầu hết các ảnh
hưởng trong quá trình phân tích (bao gồm từ cân mẫu, chuẩn bị mẫu đến phân
tích trên thiết bị) đến kết quả phân tích
135
Linearity-Range
❖ Đối với các kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng-khối phổ, việc sử dụng nội chuẩn là một
yêu cầu tiên quyết.
❖ Các chất nội chuẩn được ưu tiên lựa chọn là các chất đồng vị, thông thường như 2H,
13C, 15N... Ví dụ, khi phân tích chloramphenicol thì ngoài chất ngoại chuẩn là
chloramphenicol, sử dụng thêm chất nội chuẩn là chloramphenicol-d5; melamin thì
sử dụng melamin- 15N... Các chất đồng vị này có ưu điểm nổi bật là tính chất hóa lý
gần như tương tự chất phân tích do đó đại diện tốt cho chất phân tích trong cả quá
trình.
❖ Ngoài ra, trong một số trường hợp có thể chọn các chất nội chuẩn khác, với
điều kiện là các chất này phải có một số tính chất cơ bản giống chất phân tích, và có
thể phân tích được bằng phương pháp đang thực hiện.
136
Linearity-Range
Compound name: THI
137
Linearity-Range
Các lưu ý khi xây dựng đường cong chuẩn
❖ Đường chuẩn quyết định sự đúng đắn của kết quả phân tích
❖ Kiểm soát được sự chính xác của các nồng độ chuẩn khi xây dựng đường chuẩn là
cần đảm bảo độ chính xác của chất chuẩn về hàm lượng, độ tinh khiết.
❖ Theo yêu cầu của ISO 17025, các chất chuẩn khi sử dụng cần có chứng nhận (CoA)
của nhà sản xuất và vẫn còn hạn sử dụng.
❖ Trong một số trường hợp, có thể bố trí các thí nghiệm để đánh giá chất lượng
chất chuẩn trước khi đưa vào sử dụng
❖ Tín hiệu các lần đo của mỗi nồng độ phải có độ lặp lại đạt yêu cầu (n=3)
để kiểm tra độ lặp của các nồng độ chuẩn
❖ Loại trừ sai số thô (Dixon-test) nếu cần thiết: Một số trường hợp, có thể gặp các
sai số thô, dẫn đến việc đường chuẩn không đáp ứng yêu cầu, có thể cân nhắc loại
trừ các điểm này để đảm bảo sự chính xác.
138
Linearity-Range
Giới hạn chấp nhận của đường cong chuẩn
139
Linearity-Range
5.5. TÍNH TUYẾN TÍNH-MIỀN GIÁ TRỊ
❑ Khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp của chất cần phân tích
mà còn đáp ứng độ chính xác, độ đúng, tính chất tuyến tính
❑ Ví dụ: Khoảng nồng độ tuyến tính hay khoảng nồng độ tuân theo
định luật Lambert-Beer là 4 – 12ppm.
❑ Được xác định bằng cách khảo sát tính tuyến tính
140
Linearity-Range
141
Linearity-Range
142
Linearity-Range
Range
Assay
 80 to 120% of test concentration
Content uniformity
 70 to 130% of test concentration
Dissolution
 Q-20% to 120%
Impurities
 Reporting level – 120% of specification
Assay & Impurities
 Reporting level to 120% of assay specification
143
Precision
5.6. ĐỘ CHÍNH XÁC (ĐỘ CHỤM)
❖ Sai số ngẫu nhiên ✓ RSD

❖ Đại lượng đặc trưng ✓ µ
Độ lặp lại của qui trình
Cách tiến hành Tiêu chuẩn đánh giá
144
Precision
5.6.1. Ý nghĩa
Mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng rẽ xi so với Xtb thu được
khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất
trong cùng điều kiện xác định.
145
Precision
5.6.2. Phân loại
146
Precision
147
Precision
Độ chính xác trong ngày (intra-day precision) và liên ngày (interday-precision)
Tiến hành định lượng 6 mẫu thử/ ngày theo phương pháp dự kiến trong
ba ngày (18 mẫu thử) hay nhiều ngày liên tiếp.
❖Intra-day precision: Sự khác biệt trong vòng 1 ngày
❖Inter-day precision: Sự khác biệt trong vòng nhiều ngày
148
Precision
5.6.3. Cách tiến hành
149
Precision
150
Precision
151
Precision
152
Precision
Cách tiến hành
Độ lặp lại (ICH)
❖Tiến hành tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của phương pháp (ví
dụ: ba lần phân tích/nồng độ x 3 nồng độ khác nhau).
❖Hoặc tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.
Độ chính xác trung gian (Ruggedness): khác nhau trong vòng PTN.
(Ngày phân tích, người phân tích, thiết bị)
Độ sao chép lại: khác nhau giữa hai PTN và không cần thử ĐCX trung gian.
153
Precision
154
Precision
155
Precision
Ví dụ: Xác định độ chính xác khi phân tích viên alpha-chymotrypsin bằng
phương pháp quang phổ tử ngoại
Kết quả
Số lần xác định Kết quả xử lý thống kê
(%)
1 98,5 n =7
2 98,1 = 98,47 %
3 98,7 SD = 0,62 %
4 99,7 RSD% = CV% =  0,63 %
5 98,1 e =  0,57% (với t = 2,47 ở P = 0,95 và n = 7)
6 98,4 Khoảng tin cậy :  = 98,47 %  0,57 %
7 97,8
156
Precision
Độ chính xác trung gian khi phân tích viên nén Amlodipine 5mg bằng HPLC
Mẫu Hệ thống HPLC 1 Hệ thống HPLC 2

S1 S2 S3 S1 S2 S3
Kiểm nghiệm viên 1 100,54 100,08 99,89 99,62 99,82 99,94

Kiểm nghiệm viên 2 100,19 100,07 99,73 99,94 100,13 99,97
Trung bình 100,37 100,08 99,81 99,78 99,98 99,96
(KN viên 1 + 2)
Trung bình (HPLC 1+2 ) 100,07 100,03 99,88
RSD S1 S2 S3
Hệ HPLC 1+2 0,42% 0,07% 0,11%
Kiểm nghiệm viên 1+2 0,39% 0,14% 0,11%
157
Precision
5.2.2. Xá
c đ i ̣n h đ ô ̣ c h i ́n h x a ́c t r u n g g i a n :
Theo qui đị n h c u ̉a I S O 5 7 2 5 , đ ô ̣ l ặ p l a ̣i đ a ̃ đ ư ợ c t i ê ́n h a ̀n h v ớ i 3 k i ê ̉m n g h i ê ̣m v i ê n l a ̀ L

1,
L2, L3 trên cù n g m ô ̣t m â ̃u t h ử c h o k ê ́t q u a ̉:
Chế p h â ̉m V i t a m i n o l l o t A
L1 L2 L3
Hà m l ư ợ n g V i t a m i n D
3 mcg/g
20,23 20,18 19,88
20,03 19,68 20,25
20,13 19,35 20,30
19,85 19,98 19,65
20,05 19,33 19,63
20,15 19,23 19,53
n=18, x = 19,86
SD1 SD2 SD3
SD12 SD22 SD32
2 2 2
SD2 = SD1 + SD2 + SD3 = 0,093
3
SD = 0,305 → RSD = 1,53%
n =18, P = 0,95, t = 2,11
e =  (2,11x0,305: 18 ) =  0,1517
 = 19,86  0,15
158
Precision
Xác định độ chính xác dựa trên độ đúng của mẫu tân dược amoxicilin
STT Mẫu thử Tỷ lệ phục hồi Amoxicillin (%)

1 101,62
2 Dung dịch 80% 101,78
3 101,45
4 99,91
5 Dung dịch 100% 99,12
6 98,84
7 99,70
8 Dung dịch 120% 100,25
9 100,49
RSD 9 bình thử (%) 1,07
Mức độ tin cậy e (95%) (%)  0,829
Độ lệch chuẩn tương đối của mẫu thử (RSD) ≤ 2%, n ≥ 6
159
Precision
5.6.4. Tiêu chuẩn đánh giá
Tiêu chuẩn đánh giá phụ thuộc rất nhiều vào loại phân tích
❖ ICH: Phân tích thường quy các thuốc tân dược: RSD ≈ 2%
(PL.8 Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
❖ USFDA-2012: Phân tích các mẫu sinh học: RSD ≈ 15%-20% ở LLOQ và
10%-15%. Phân tích mẫu thực phẩm và mẫu môi trường: RSD 2% - 20%
❖ 657/2002/EC
❖ AOAC-2012
160
Precision
657/EC-2002
161
Precision
657/EC-2002
162
Precision
AOAC international 2012
163
Precision
164
Precision
165
Makus Ganzera, Christoph Egger, Hermann Stuppner. Quantitative analysis of flavonoids and
phenolic acid in Arnica motana by MEKC. Chimica Acta, vol 614, 2008, p.196-200.
166
167
Precision
168
Precision
Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner.
Quantitative determination of phenolic compounds in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by
capillary zone electrophoresis. Planta Medica vol 78, 2012, p.1796-1799.
169
Precision
170
mAU
35 Mixed standard 1 3 5 6 7 8
30 4
25
2
20
15
10
210 nm
5
0
0 2 4 6 8 10 min
mAU
8
35
Sample LN-1a 1
30 5 6
25 4a
20
15 3
10 2 4 7
210 nm
5
0
0 2 4 6 8 10 min
Fig. 3. CE-separation of a standard mixture and a Lotus leaf extract (sample LN-1a)
under optimized conditions (capillary: fused silica, 50 µm i.d. x 62 cm; buffer: 30 mM
borax pH 8.0 with 15% MeCN; temperature: 30 °C; separation voltage: 30 kV;
detection wavelength: 210 nm); peak assignment according to Fig.1.
171
Precision
172
Accuracy
5.7. ĐỘ ĐÚNG
❖ Sai số hệ thống ✓ Tỉ lệ phục hồi (R)

❖ Đại lượng đặc trưng ✓ Bias
Tính nguyên vẹn của

qui trình chiết
Cách tiến hành Tiêu chuẩn đánh giá
173
Accuracy
5.7.1. Ý nghĩa
174
Accuracy
Tỷ lệ phục hồi
❖ Nên được xác định ở khoảng nồng độ cần định lượng và phải bao gồm
nồng độ gần với giới hạn dưới định lượng.
❖ Ở mỗi nồng độ riêng biệt phải đáp ứng với mức giới hạn cho phép
175
Accuracy
5.7.2. Cách tiến hành
176
Accuracy
177
Accuracy
178
Tiến hành (ICH-2005 and Validation of Chromatography_ FDA 2008)
❖ Nguyên liệu thuốc (Drug substances)
❖ Chế phẩm thuốc (Drug products)
❖ Thử tinh khiết định lượng thuốc (impurities quantitation)
o Thêm chính xác lượng chất chuẩn của hoạt chất hoặc tạp chất (ở dạng rắn
hoặc dịch pha loãng) ứng với 80, 100, 120% hàm lượng công bố trên nhãn
vào công thức placebo hoặc công thức mẫu thử (với thử tinh khiết
định lượng).
o Mỗi nồng độ được thực hiện lặp lại ba lần và phải nằm trong khoảng phát
hiện của chất phân tích
o Tiến hành định lượng 09 mẫu chuẩn bị theo qui trình phân tích dự kiến
o Tính tỷ lệ phục hồi (R) 179

Accuracy
AOAC & Bioanalytical method validation_ FDA 2012
❖ Với các mẫu thử sinh học (dược động học, tương đương sinh học),
độc chất, môi trường, dược liệu... với nền mẫu phức tạp.
Thêm vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử ứng với
ba mức nồng độ (thấp, trung bình, cao).
❖ Với mẫu mẫu dược liệu hay những mẫu không thể tự tạo mẫu placebo
có thể sử dụng giá trị hàm lượng lý thuyết có trong mẫu ban đầu từ
kết quả độ chính xác.
180
Accuracy
181
Accuracy
5.6.3. Tiêu chuẩn đánh giá
Tiêu chuẩn đánh giá phụ thuộc rất nhiều vào loại phân tích
❖ Phân tích thường quy các thuốc tân dược: R≈ 98-102% (ICH)
và RSD của tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ ≤ 2,0%.
❖ Phân tích các mẫu sinh học: R ≈ trong vòng 15%; ở nồng độ thấp
hơn LOQ trong vòng 20% (FDA)
Phân tích mẫu độc chất và mẫu môi trường: R trong vòng 20%
182
Accuracy
183
Accuracy
AOAC International 2012- Standard method performance
184
Accuracy
❑ Tiêu chuẩn đánh giá phụ thuộc rất nhiều vào loại phân tích
❖ ICH: Phân tích thường quy các thuốc tân dược: R≈ 98-102%
và RSD của tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ ≤ 2,0%.
❖ US-FDA: Phân tích các mẫu sinh học: R ≈ trong vòng 15%; ở nồng độ
thấp hơn LOQ trong vòng 20%
Phân tích mẫu độc chất và mẫu môi trường: R trong vòng 20%
185
Accuracy
Khảo sát độ đúng của paracetamol dựa trên kết quả độ chính xác
Lượng có Lượng Tổng Lượng

Lượng Tỉ lệ hồi
trong mẫu chuẩn lượng tìm chuẩn tìm
chuẩn thêm phục
STT thử thêm vào thấy thây lại
(%) (μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) (%)

1 9,3558 20,7907 9,2895
2 80% 11,5012 9,3558 20,3483 8,8471 98,13
3 9,3558 20,3483 8,8471
4 11,4459 23,0024 11,5012
5 100% 11,5012 11,4459 23,0024 11,5012 100,48
6 11,4459 23,0024 11,5012
7 13,7351 25,2142 13,7130
8 120% 11,5012 13,7351 25,2142 13,7130 99,83
9 13,7351 25,2142 13,7130
TB 98,81
186
Accuracy
Kết quả khảo sát độ đúng của viên amoxicillin dựa trên tá dược
Lượng chuẩn Trung bình Lượng chuẩn Tỉ lệ
Lượng cân tá Amoxicillin
STT Tên mẫu Amoxicillin thêm diện tích pic hồi phục
dược (mg)
vào (mg) Amoxicillin tìm lại (mg) (%)
Chuẩn - - 39546676,5 - -
1. Dung 73,9 93,6 32066462 95,1 101,62
2. dịch 73,8 93,8 32186456,5 95,5 101,78
3. 80% 73,9 93,7 32047426 95,1 101,45
Trung bình = 101,62
RSD = 0,16
Chuẩn - - 39573041,5 - -
4. Dung 72,8 116,7 39335726,5 116,6 99,91
5. dịch 72,2 116,8 39056615,5 115,8 99,12
6. 100% 75,1 116,8 38945456,5 115,4 98,84
Trung bình = 99,29
RSD = 0,56
Chuẩn - - 39562817,5 - -
7. Dung 73,4 140,7 47313195,5 140,3 99,70

8. dịch 75,2 140,2 47406770,5 140,6 100,25
9. 120% 76,2 140,2 47518544,5 140,9 100,49
Trung bình = 100,15
RSD = 0,4
TB (%) 9 bình thử 100,35
RSD (%) 9 bình thử 1,07
187
Accuracy
DAD1 B, Sig=225,20 Ref=off (THO\LOTA0226.D)

mAU
50
40
30
20
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
Overlay điện di đồ ở ba mức nồng độ xác định độ đúng (thấp, cao, trung bình)
188
Accuracy
Một qui trình phải đáp ứng cả độ chính xác lẫn độ đúng.
Qui trình như vậy mới chắc chắn rằng ít bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên
hay sai số hệ thống và nếu có là với mức độ xác suất có thể chấp nhận được.
Đây là hai trong các chỉ tiêu căn bản để thẩm định qui trình thử nghiệm.
189
ĐỘ CHẮC CHẮN (ROBUSTNESS)
❖ Đảm bảo việc thẩm định qui trình trình tích được duy trì ở bất cứ đâu.
❖ Dữ liệu độ chắc chắn được thực hiện nhưng thường không khuyến cáo ghi
vào qui trình thẩm định.
❖ Xác định bằng cách đánh giá dựa trên các thông số thực hiện tính
phù hợp hệ thống (Rs, As..) dưới những điều kiện khác nhau.
190
❖ Phân tích LC sẽ khảo sát kết quả do sự thay đổi điều kiện thực nghiệm.
o pH pha động
o Thành phần pha động
o Cột sắc ký
o Nhiệt độ cột
o Tốc độ dòng
❖ Phân tích GC: Cột sắc ký, tốc độ dòng, nhiệt độ.
191
Độ ổn định (Ruggedness)
❖ Mức độ lặp lại những kết quả thu được của cùng một mẫu thử nhưng được thử với
những thay đổi của điều kiện môi trường thực hiện qui trình như thay đổi phòng thí
nghiệm, kiểm nghiệm viên, dụng cụ, thuốc thử, ngày, …
❖ Được diễn tả bằng RSD%
❖ Tương tự như độ sao chép lại (reproducibility)
❖ Chỉ được USP đề cập
❖ Phân tích cùng một lô đã được làm đồng nhất và phân cho nhiều phòng thí nghiệm
khác nhau và các kỹ thuật viên khác nhau
❖ So sánh độ lặp lại của các kết quả thu được với độ chính xác của qui trình phân tích
ở điều kiện bình thường để có được giá trị của độ thô của qui trình thử nghiệm.
192
TÓM TẮT CÁC BƯỚC THỰC HIỆN CHO VIỆC PHÁT TRIỂN VÀ
THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (LC/GC)
1. Thăm dò điều kiện sắc ký tối ưu (robustness)
❖ Ảnh hưởng pH pha động
❖ Tỉ lệ pha động
❖ Thay đổi cột
❖ Nhiệt độ
❖ Tốc độ dòng
2. Khảo sát tính tương thích hệ thống trên điều kiện tối ưu tìm được
3. Sự ổn định của dung dịch phân tích (98-102% so ban đầu)
4. Sự chiết kiệt/ thời gian chiết mẫu
193
Dung dịch chuẩn Amoxicillin Dung dịch thử (%)
Diện tích pic Diện tích pic

Thời điểm % So với ban đầu % So với ban đầu
Amoxicillin Amoxicillin
0 39757115 100,0 39648236 100,0
4 giờ 39528864 99,4 39467410 99,5
6 giờ 40259156 101,3 39402732 99,4
8 giờ 40190047 101,1 39179841 98,8
12 giờ 39751223 100,0 39151070 98,7
194
0.5g Lotus leaf
raw material powder
+ Wetting with 15 drop s of NH4OH 25%

+ 15ml CHCl3 x 3 times
+ Sonicate: 15min each
+ Centrifuge: 10 min at 3500rpm
CHCl3- Ext Residue
CHCl3 DAD1 B, Sig=225,20 Ref=off (THO\LOTA0121.D)

mAU
Sample was exhausted (three- folded extraction)

40
CHCl3- Residue 30
5
+ Dissolve in MeOH 20 2 6
3
1
10ml volumetric flask 10
4
7
+ Filter: 0.45µm nylon 0
2 4 6 8 10 12 14 min
membrance DAD1 B, Sig=225,20 Ref=off (THO\LOTA0122.D)
mAU
Fourth extraction
Inject sample to CE 40
30
20
10
195
5
TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ 0

5. Thẩm định phương pháp
❖ Tính đặc hiệu
❖ Tính tuyến tính-miền giá trị
❖ LOD-LOQ (mẫu dược liệu, dịch sinh học...)
❖ Độ chính xác
❖ Độ đúng
196
NGHIÊN CỨU NỒNG ĐỘ THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
6 lô từ BV huyết học và truyền máu TP. Cần Thơ

BẢO QUẢN -20OC TRONG TỦ ĐÔNG
197
198
199
200
201
202
CHÚC CÁC BẠN HỌC TẬP TỐT
203

Tham Dinh Qui Trinh Phan Tich Cap Nhat - dk42 Dk31 LT

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Tham Dinh Qui Trinh Phan Tich Cap Nhat - dk42 Dk31 LT

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH

(VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES)

BÀI GIẢNG LỚP DK40

TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

CẦN THƠ – 02/03/2020 1

1. Trình bài về qui trình phân tích

2. TRình bày thẩm định qui trình phân tích

theo các hướng dẫn hiện hành

1. Định nghĩa và phân loại qui trình phân tích

các hướng dẫn của ICH, USP, AOAC, FDA

dịch sinh học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.1. Định nghĩa

cần thiết để thực hiện một thử nghiệm (analytical test)

❖ Xử lý, tính toán và biện giải kết quả,…

1.2. Phân loại

Các loại qui trình phân tích

Thử định tính Thử tinh khiết Thử định lượng

Nhằm đảm bảo rằng chất cần phân

adenosine bảo quản

SKĐ mẫu viên nang lincomycine tạp phân hủy

chính có trong mẫu thử.

mẫu chế phẩm.

2.1. Định nghĩa

tiêu đề ra cũng như các chuyên luận

trình phân tích.

dụng,…hoàn toàn giống nhau.

ít nhất về một trong các thông số trên.

❑ Qui trình phân tích mới chưa có trong Dược điển

Tái thẩm định một phần hoặc hoàn toàn

thuốc thử hay nguồn chuẩn, người phân tích.

hành mặt hàng (thẩm định định kỳ).

Đăng ký theo tiêu chuẩn dược điển

❖ Định tính: tính đặc hiệu

❖Thử giới hạn tạp chất: tính đặc hiệu

Đăng ký theo tiêu chuẩn cơ sở

đủ theo hướng dẫn của Asean.

❖ PP đã có trong dược điển: áp dụng như pp đăng ký theo dược điển

<1225> USP 40- Validation of International Conference on

Kiểu qui trình THỬ TINH KHIẾT

Độ chính xác

Tính tuyến tính + + - * -

*: Yêu cầu tùy thử nghiệm riêng

Theo Q2(R1)-ICH (International Conference on Harmonization, 11-2005)

Các chỉ tiêu Định lượng Thử giới hạn

5.1. TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG

đến đặc tính sắc ký...) có hiệu năng phù hợp.

mẫu chuẩn và mẫu thử với ít nhất 6 lầnSD

TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

Sắc ký đồ điển hình tính tương thích hệ thống

Sắc ký đồ overlay của aldicarb Sắc ký đồ overlay của carbaryl 36

5.2. TÍNH ĐẶC HIỆU/ TÍNH CHỌN LỌC

phân hủy, chất nền,…

Đảm bảo xác định

Ñònh tính aspirin bằng uv-vis

Tính ñaëc hieäu trong thử phản ứng ñònh tính

Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013

Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013

Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013

Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013

❑ Tính đặc hiệu

➢ Độ nhiễu của phương pháp

✓ Xác định các mẫu trên bằng phương pháp đề xuất