khóa luận chính thức-Thái Ngọc Trâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁI NGỌC TRÂM
NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC ẢO CÁC PHÂN TỬ NHỎ CÓ

KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA THỤ
THỂ GIỐNG TOLL 4
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
TP. HỒ CHÍ MINH - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁI NGỌC TRÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. Lê Minh Trí
PGS. TS. Thái Khắc Minh
TP. Hồ Chí Minh - 2020

ĐẠI HỌC Y DƯỢC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
KHOA DƯỢC
TP. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 08 năm 2020
GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA KHÓA LUẬN THEO Ý

KIẾN ĐÓNG GÓP CỦA HỘI ĐỒNG
Tên đề tài khóa luận: Nghiên cứu sàng lọc ảo các phân tử nhỏ có khả năng ức
chế hoạt tính sinh học của thụ thể giống Toll 4
Họ và tên sinh viên: Thái Ngọc Trâm
Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Lê Minh Trí, PGS. TS. Thái Khắc Minh
Khóa luận đã được bổ sung, sửa chữa các nội dung sau:
1. Chỉnh sửa các lỗi chính tả và format
2. Chỉnh sửa và thêm một số thông tin ở phần tổng quan, kết quả và bàn luận
Giảng viên phản biện Giảng viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng
i
Sinh viên thực hiện: THÁI NGỌC TRÂM
Giáo viên hướng dẫn: PSG.TS. THÁI KHẮC MINH, PSG.TS. LÊ MINH TRÍ
Đặt vấn đề
Thụ thể giống Toll 4 (TLR4) đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch bẩm sinh và
thu nhận do có khả năng gắn kết với MD2 để nhận dạng Lipopolysacarid từ vi khuẩn,
nên việc ức chế hoạt tính sinh học của TLR4 là một liệu pháp tiềm năng để điều trị
các bệnh viêm và nhiễm khuẩn, trong đó nhiễm khuẩn huyết được quan tâm hàng
đầu. Đề tài này được thực hiện với mục tiêu thiết kế các phân tử nhỏ có khả năng gắn
kết TLR4 và MD2, từ đó ức chế hoạt tính sinh học của TLR4.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: cấu trúc phức hơp TLR4-MD2-LPS từ Ngân hàng dữ liệu
protein, tương tác giữa các acid amin quan trọng của bề mặt dimer hóa giữa TLR4 và
MD2 sau khi gắn kết LPS.
Phương pháp nghiên cứu: mô hình 3D-pharmacophore với phần mềm MOE 2015.10;
thư viện ZINC với công cụ ZINCPharmer, mô phỏng docking phân tử với LeadIT
2.1.8, mô phỏng động lực học phân tử với phần mềm GROMACS 2018, năng lượng
liên kết tự do với công cụ g-mmpdsa.
Kết quả và bàn luận
Các mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng và tiến hành sàng lọc ảo qua thư
viện ZINC cũng như mô phỏng docking phân tử thu được 99 và 231 chất dock thành
công lên MD2 và TLR4 tương ứng. Sau quá trình mô phỏng động lực học phân tử và
ước tính năng lượng gắn kết tự do. Kết quả thu được, ZINC14793499,
ZINC58997973, ZINC58998032 ổn định trong quá trình mô phỏng động lực học và
có khả năng gắn kết MD2 tốt nhất.
Kết luận và đề nghị
Phương pháp nghiên cứu in silico được áp dụng thành công để tìm ra các chất có tiềm
năng ức chết hoạt tính sinh học TLR4 trên thư viện ZINC. Các chất có kết quả sàng
lọc tốt nhất cần được tiến hành các thử nghiệm in vitro để tìm ra các chất có hoạt tính
sinh học thật sự.
ii
IN SILICO VIRTUAL SCREENING FOR SMALL
MOLECULAR INHIBITORS OF TOLL-LIKE RECEPTOR 4
Student: THÁI NGỌC TRÂM
Supervisor: Assoc. Prof. PhD. THÁI KHẮC MINH, Assoc. Prof. PhD. LÊ MINH
TRÍ
Introduction
Toll-like receptor 4 (TLR4) plays an important role in the innate immune and
reception system because of the ability of binding with MD2 to identify
Lipopolysacarid from bacteria, so the inhibition on the biological activity of TLR4 is
a potential therapy to treat bacterial inflammation and infection. The main objective
of this study is to perform virtual screening for small molecular inhibitors for TLR4
and MD2 by in silico methods.
Materials and methods
Materials: the crystal structure TLR4-MD2-LPS from the protein data bank, the
interaction between TLR4 and MD2 in the dimer interface.
Methods: 3D-pharmacophore, molecular docking, molecular dynamics simulations
and free energy caculation were employed to conduct the virtual screening for ZINC
database.
Result and discussion
Applying pharmacophore and molecular docking models for screening virtually the
ZINC database, this study obtained and docked successfully 99 and 231 compounds
for the binding TLR4 and MD2, respectively. 5 most potential compounds for binding
MD2 were chosen by analyzing docking results by means of docking score. After
performing molecular dynamics simulations and free energy caculation of these
selected compounds, ZINC14793499, ZINC58997973, ZINC58998032 are
discovered to be the most potential compounds for TLR4 inhibitors
Conclusion and suggestion
The in silico models and methods for discovering TLR4 inhibitors were generated
and applied for screening the ZINC database successfully. Potential results of the
study should be evaluated by the in vivo experiments to discover the real bioactivity.
iii
MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................. iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................x
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................2
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỤ THỂ GIỐNG TOLL.................................................2
1.2. THỤ THỂ GIỐNG TOLL 4 .............................................................................4
1.2.1. Cấu trúc của phức hợp TLR4-MD2 ..........................................................4
1.2.2. Cấu trúc LPS .............................................................................................6
1.2.3. Cơ chế kích hoạt TLR4 .............................................................................7
1.2.4. Sự tương tác giữa TLR4 và MD2 sau khi gắn kết LPS ............................8
1.2.5. Vai trò sinh học của TLR4 ......................................................................10
1.2.6. Các chất ức chế TLR4 từ tự nhiên ..........................................................12
1.2.7. Các thuốc ức chế TLR4 hiện nay ............................................................13
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................16
2.1. MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE ...........................................................17
2.1.1. Cơ sở xây dựng mô hình 3D-pharmacophore .........................................17
2.1.2. Công cụ xây dựng mô hình 3D-pharmacophore .....................................18
2.2. SÀNG LỌC QUA THƯ VIỆN ZINC ............................................................18
2.3. MÔ HÌNH MÔ TẢ DOCKING PHÂN TỬ...................................................19
2.3.1. Các bước xây dựng mô hình mô tả docking phân tử ..............................19
2.3.2. Đánh giá kết quả docking........................................................................21
2.4. MÔ PHỎNG ĐỘNG LỰC HỌC PHÂN TỬ .................................................21
2.4.1. Các bước mô phỏng động lực học phân tử .............................................21
2.4.2. Đánh giá kết quả mô phỏng động lực học phân tử .................................23
iv
2.5. NĂNG LƯỢNG GẮN KẾT TỰ DO .............................................................24
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................26
3.1. MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE ...........................................................26
3.1.1. Mô hình 3D-pharmacophore cho các chất gắn kết MD2 ........................26
3.1.2. Mô hình 3D-pharmacophore cho các chất gắn kết TLR4 .......................27
3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC QUA THƯ VIỆN ZINC .........................................28
3.3. KẾT QUẢ MÔ HÌNH MÔ TẢ DOCKING PHÂN TỬ ................................30
3.3.1. Mô hình mô tả docking phân tử ..............................................................30
3.3.2. Phân tích kết quả docking phân tử ..........................................................31
3.4. KẾT QUẢ MÔ PHỎNG ĐỘNG LỰC HỌC PHÂN TỬ ..............................39
3.4.1. Độ ổn định của MD2 trong quá trình mô phỏng động lực học ...............39
3.4.2. Độ ổn định của tại vị trí gắn kết giữa MD2 với các phối tử ...................40
3.4.3. Độ ổn định của phối tử trong quá trình mô phỏng động lực học phân tử
...........................................................................................................................41
3.4.4. Tương tác giữa protein và phối tử ...........................................................43
3.5. NĂNG LƯỢNG GẮN KẾT TỰ DO .............................................................44
3.6. BÀN LUẬN ...................................................................................................48
3.6.1. Nhận xét kết quả......................................................................................48
3.6.2. So sánh với các nghiên cứu trên thế giới ................................................48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................
PHỤ LỤC ......................................................................................................................
v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ALI Acute lung injury Tổn thương phổi cấp tính
ARDS Acute respiratory distress Hội chứng suy hô hấp cấp tính
syndrome
ARF Acute renel failure Suy thận cấp tính
CADD Computer-aided design drug Phương pháp thiết kế thuốc với sự hỗ
trợ máy tính
CD14 Cluster of Differentiation 14
DAMP Damage-associated molecular Mẫu phân tử liên quan đến tổn thương
patterns
IL Interleukine Interleukin
Kdo 3-deoxy-D-manno-octulosonic Acid 3-deoxy-D-manno-oct-2-
acid ulosonic
LBP Lipopolysacarid binding Protein gắn với lipopolysacarid
protein
LOS Lipooligosacarit Lipooligosacarid
LPS Lipopolysacarit Lipopolysacarid
LRR Leucine-rich repeats Vùng giàu leucin
MD2 Myeloid Differentiaon factor 2
MI/R Myocardial Tổn thương thiếu máu cục bộ/tái tưới
ischemic/reperfusion (MI/R) máu cơ tim
injury
MyD88 Myeloid differentiation Protein đáp ứng tế bào tủy biệt hóa sơ
primary response gene 8 cấp 88
PAMP Pathogen-associated molecular Mẫu phân tử liên quan đến mần bệnh
patterns
PRR Pattern recognition receptors Thụ thể nhận dạng mẫu
RMSD Root mean square deviation Căn bậc hai độ lệch trung bình bình
phương
SMPPII Small Molecule Protein- Các phân tử nhỏ ức chế tương tác
Protein-interaction inhibitors protein-protein
RMSF Root mean quare fluctuations Căn bậc hai độ dao động trung bình
bình phương
TIR toll–interleukine 1 (IL-1) Thụ thể nội bào toll-interleukin 1
receptor
TIRAP TIR domain-containing Protein tiếp hợp chứa vùng TIR
adaptor protein
TLR Toll-like receptor Thụ thể giống Toll
TRAM TRIF-related adaptor molecule Phân tử đáp ứng TRIF
TRIF TIR domain-containing Protein tiếp hợp cảm ứng interferon-ß
adaptor inducing IFN- ß chứa vùng TIR
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các cấu trúc tinh thể của TLR4-MD2-LPS, TLR2-TLR1-Pam3CSK4,
TLR2-TLR6-Pam2CSK4. .............................................................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc vùng ngoại bào của TLR4. ...........................................................4
Hình 1.3. Cấu trúc MD2. .............................................................................................5
Hình 1.4. Cấu trúc phức hợp TLR4-MD2...................................................................6
Hình 1.5. Bề mặt tương tác chính giữa TLR4 và MD2 hình thành trước khi gắn kết
LPS. .............................................................................................................................6
Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc cơ bản của lipopolysacarid. .................................................7
Hình 1.7. Cơ chế nhận dạng LPS và các con đường truyền tín hiệu của TLR4. ........8
Hình 1.8. Cấu trúc phức hợp TLR4-MD2-LPS. .........................................................9
Hình 1.9. Sự gắn kết LPS lên phức hợp TLR4-MD2. ................................................9
Hình 2.1. Các bước tiến hành trong nghiên cứu. ......................................................17
Hình 2.2. Các bước tiến hành trong nghiên cứu. ......................................................17
Hình 3.1. Bề mặt dimer hóa giữa TLR4 và MD2. ....................................................26
Hình 3.2. Mô hình 3D-pharmacophore cho các chất gắn lên MD2. .........................27
Hình 3.3. Mô hình 3D-pharmacophore cho chất gắn kết với TLR4. ........................28
Hình 3.4. Bề mặt khoang gắn kết chứa các acid amin quan trọng của MD2. ...........30
Hình 3.5. Bề mặt khoang gắn kết chứa các acid amin quan trọng của TLR4...........31
Hình 3.6. Sự phân bố tỷ lệ theo điểm số docking của các chất docking thành công.
...................................................................................................................................31
Hình 3.7. Biểu đồ tỷ lệ các chất tạo tương tác với các acid amin tại bề mặt gắn kết
của MD2. ...................................................................................................................32
Hình 3.8. Biểu đồ tần suất tạo liên kết của các acid amin tại khoang gắn kết của MD2.
...................................................................................................................................33
Hình 3.9. Sự tương tác giữa ZINC14793499 và khoang gắn kết MD2 ....................33
Hình 3.10. Sự tương tác giữa ZINC58997973 và khoang gắn kết MD2. .................34
vii
...................................................................................................................................36
Hình 3.15. Biểu đồ tỷ lệ các chất tạo tương tác với các acid amin tại bề mặt gắn kết
của TLR4. ..................................................................................................................37
Hình 3.16. Biểu đồ tần suất tạo liên kết của các acid amin tại bề mặt dimer hóa của
MD2. .........................................................................................................................38
Hình 3.17. Biểu đồ giá trị RMSD của MD2 riêng lẻ cũng như protein này trong các
phức hợp. ...................................................................................................................39
Hình 3.18. Giá trị RMSF của apo-protein và của protein trong các phức hợp với phối
tử................................................................................................................................40
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tương tác giữa các acid amin quan trọng trong bề mặt dimer hóa giữa
TLR4 và MD2. ..........................................................................................................10
Bảng 1.2. Kết quả thử nghiệm lâm sàng của các chất ức chế TLR4. .......................15
Bảng 3.1. Các acid amin quan trọng trên TLR4 tương tác với MD2. ......................27
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc của mô hình Ph-MD2i...................................................29
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc mô hình Ph-TLR4i. .......................................................29
Bảng 3.4. Sự tương tác của các chất có điểm số docking tốt nhất lên TLR4. ..........38
Bảng 3.5. Giá trị RMSD của các phối tử trong các phức hợp. .................................41
Bảng 3.6. Tần suất biểu hiện liên kết hydro giữa phối tử và protein ........................43
Bảng 3.7. Năng lượng gắn kết tự do của các phối tử với protein. ............................45
Bảng 3.8. Biểu đồ năng lượng gắn kết tự do theo thời gian của các phức hợp. .......46
Bảng 3.9. Sự khác nhau giữa kết quả của hai nghiên cứu ........................................49
ix
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc, chân thành nhất đến thầy PGS. TS. Lê Minh
Trí, PGS. TS. Thái Khắc Minh đã luôn tận tình hướng dẫn, sẵn sàng giải đáp mọi thắc
mắc, động viên và sửa từng lỗi nhỏ cho khóa luận của em từ những ngày đầu đến khi
hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giảng viên phản biện TS. Võ Thị Cẩm Vân,
cô đã dành thời gian đọc bài và cho em những đóng góp hữu ích để khóa luận được
hoàn thành tốt hơn.
Em xin chân thành cảm ơn sự góp ý của các thầy cô hội đồng PGS. TS. Trương
Phương, PGS. TS. Lê Minh Trí, PSG. TS. Thái Khắc Minh, PSG. TS. Huỳnh Thị
Ngọc Phương, TS. Võ Thị Cẩm Vân. Em cũng cảm ơn các thầy PSG. TS. Trần Thành
Đạo, TS. Trần Ngọc Châu, ThS. Mai Thành Tấn đã giúp đỡ em trong quá trình làm
khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành anh Ths. Trần Thái Sơn, DS. Bùi Quốc Dũng đã
giúp đỡ và động viên em rất nhiều trong nhưng lúc em gặp khó khăn trong quá trình
hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các chị kỹ thuật viên cùng các anh chị và các bạn tại lab
Hóa dược đã giúp đỡ, hỗ trợ em rất nhiều trong quá trình làm khóa luận.
Mình xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả các bạn lab Hóa Dược 314: Thu Hạnh,
Hoàng Minh, Hằng Ngô, Hoàng Tùng, Xuân Tiên, Giang Sơn, Ánh Tuyết, Hoàng
Tiến đã giúp đỡ, động viên mình rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Mình xin gửi lời cảm ơn đến hội bạn thân: Đoan Trang, Bảo Trân, Minh Trang, Bích
Trâm, Như Trang, Yến Nhi, Kim Ngân, Cẩm Thu, Mộng Kha và các bạn khác đã
luôn bên mình, quan tâm, động viên về mặt tinh thần những lúc khó khăn nhất.
Thái Ngọc Trâm
x
Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đặt vấn đề
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lipopolysacarid (LPS) là thành phần chính của màng ngoài của vi khuẩn gram âm và
được biết đến là một chất kích thích mạnh phản ứng miễn dịch bẩm sinh. Một lượng
nhỏ LPS được giải phóng từ mầm bệnh lây nhiễm có thể bắt đầu các phản ứng miễn
dịch bẩm sinh giúp hệ thống miễn dịch chống lại nhiễm trùng nặng hơn. Tuy nhiên,
khi phản ứng miễn dịch đáp ứng LPS không được kiểm soát đúng cách có thể dẫn
đến hội chứng sốc nhiễm trùng và gây tử vong. Trong gần hai thập kỷ qua, cấu trúc
tinh thể của hầu hết các thụ thể và protein phụ trợ liên quan đến nhận dạng LPS đã
được xác định. TLR4 là thụ thể quan trọng liên quan đến nhận dạng LPS và bắt đầu
tín hiệu. Các đặc trưng cấu trúc phổ biến của LPS ở các loài vi khuẩn khác nhau được
nhận dạng bởi một loạt các thụ thể LPS và protein phụ bao gồm protein liên kết LPS
(LBP), CD14 và quan trọng nhất là phức hợp thụ thể giống Toll 4 (TLR4) với MD2
[1, 2]. Nếu hệ thống TLR4 không được điều hòa có thể gây ra các bệnh khác nhau
như bệnh tự miễn và sốc nhiễm trùng, trong đó nhiễm trùng huyết và sốc nhiễm trùng
gây ra hàng triệu ca tử vong trên toàn thế giới mỗi năm và là nguyên nhân gây tử
vong số một trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt [3]. Tuy nhiên, hiện nay trên thị
trường vẫn chưa có thuốc ức chế TLR4 nên việc nghiên cứu các chất ức chế TLR4
đang được đẩy mạnh. Cấu trúc của các protein này cung cấp những hiểu biết hữu ích
cho việc khám phá các loại thuốc chống nhiễm trùng huyết cũng như các bệnh viêm
khác.
Bên cạnh đó, việc nghiên cứu và phát triển thuốc là một quá trình tốn thời gian và tốn
kém. Trung bình, phải mất 10-15 năm và 1-10 tỷ USD để giới thiệu một loại thuốc
vào thị trường. Đây là lý do tại sao các phương pháp thiết kế thuốc với sự hỗ trợ máy
tính (CADD) đã được sử dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm để đẩy nhanh quá
trình. CADD giúp các nhà khoa học tập trung vào các hợp chất hứa hẹn nhất để họ
có thể giảm thiểu các nỗ lực thử nghiệm tổng hợp và sinh học. Trong thực tế, sự lựa
chọn các phương pháp CADD được sử dụng thường được xác định bởi sự sẵn có của
các cấu trúc 3D được xác định bằng thực nghiệm của các protein mục tiêu [4]. Do
đó, phương pháp CADD được sử dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm để đẩy nhanh
quá trình nghiên cứu.
Đề tài “Nghiên cứu sàng lọc ảo các phân tử nhỏ có khả năng ức chế hoạt tính sinh
học TLR4” thực hiện các phương pháp nghiên cứu in silico bao gồm xây dựng mô
hình 3D-pharmacophore, mô hình docking phân tử, sàng lọc ảo trên ngân hàng ZINC,
mô hình động lực học phân tử, tính năng lượng liên kết tự do để tìm các chất có khả
năng ức chế TLR4, đồng thời tiết kiệm thời gian và chi phí nghiên cứu.
1
Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ THỤ THỂ GIỐNG TOLL
TLR là một họ các thụ thể nhận dạng mẫu (PRR), tạo nền tảng và đóng vai trò quan
trọng trong các phản ứng miễn dịch bẩm sinh. Đến nay các nhà khoa học đã phát hiện
được 10 loại TLR ở người và 13 loại TLR ở chuột, mặc dù TLR 10 không hoạt động
ở chuột. TLR có thể nhận dạng được các mẫu phân tử liên quan đến mầm bệnh
(PAMP) và các mẫu phân tử liên quan đến tổn thương (DAMP). Chúng được biểu
hiện trên tất cả các tế bào miễn dịch bẩm sinh như đại thực bào, bạch cầu trung tính,
tế bào đuôi gai, tế bào mast, bạch cầu ưa kiềm và bạch cầu ưa acid. Kích hoạt TLR
dẫn đến kích thích các tầng tín hiệu của vật chủ như một cơ chế bảo vệ chống lại sự
tấn công của mầm bệnh và sửa chữa các mô bị tổn thương dẫn đến sản xuất các loại
cytokin gây viêm và chất điều biến miễn dịch. Kích hoạt TLR4 quá mức sẽ phá vỡ
cân bằng hệ thống nội mô miễn do sản xuất các cytokin và chemokin tiền viêm liên
tục góp phần vào sự tiến triển của nhiều bệnh chẳng hạn như các bệnh tự miễn bao
gồm lupus ban đỏ và viêm khớp dạng thấp, các bệnh khác như ung thư, đái tháo
đường type 1, nhiễm trùng máu và bệnh Alzheimer. Các chất đối kháng hoặc ức chế
tín hiệu TLR là các phương pháp tiềm năng cho các chiến lược trị liệu. Do đó, hiện
nay có nhiều báo cáo mô tả cấu trúc, đặc điểm, tín hiệu TLR, các chất điều hòa ngược
và các chất ức chế con đường tín hiệu TLR [1].
Các TLR là các protein xuyên màng loại I bao gồm 3 vùng: 1) 20-27 lần vùng giàu
leucin (LRR) ngoại bào để nhận biết PAMP/DAMP, 2) vùng xuyên màng, 3) thụ thể
nội bào toll-interleukin 1 (TIR) cần được kích hoạt để truyền các tín hiệu xuôi dòng.
Các miền ngoại bào của TLR chứa các gốc glycan đóng vai trò là các vị trí gắn kết
cho các ligand. Các đặc điểm chính phân biệt các TLR khác nhau là độ đặc hiệu phối
tử, đường dẫn truyền tín hiệu và vị trí trong tế bào [1].
Cho đến nay, các cấu trúc của sáu trong số mười TLR của con người phức tạp với
các phối tử sinh lý hoặc tổng hợp của chúng đã được báo cáo. TLR2 là thụ thể duy
nhất trong số các TLR của con người vì có thể tạo thành các heterodimer với các TLR
khác, TLR1 và TLR6. Các phối tử chính của phức hợp TLR1-TLR2 là triacyl
lipopeptid, tương tác với diacyl lipopeptid yếu hơn đáng kể [5, 6]. Ngược lại, phức
hợp TLR2-TLR6 có thể liên kết với diacyl lipopeptid đươc thể hiện trong Hình 1.1.
Các lipoprotein và lipopeptid này là các protein vi khuẩn đa dạng về chức năng và
cấu trúc được neo vào màng bởi hai hoặc ba chuỗi lipid liên kết cộng hóa trị [7].
2
Hình 1.1. Các cấu trúc tinh thể của TLR4-MD2-LPS, TLR2-TLR1-Pam3CSK4, TLR2-
TLR6-Pam2CSK4.
Chức năng chính của TLR là khả năng nhận biết nhiều mầm bệnh. Mỗi tế bào của hệ
thống miễn dịch chứa một loại TLR cụ thể có chức năng đặc biệt trong việc nhận biết
PAMP/DAMP và làm trung gian cho các phản ứng miễn dịch. TLR còn thể hiện trên
các tế bào đuôi gai tham gia miễn dịch bẩm sinh và thu nhận. TLR nhận ra mầm bệnh
và truyền tín hiệu đến các tế bào trình diện kháng nguyên tiêu diệt vi khuẩn bằng thực
bào. Điều đáng lưu ý là sự hiện diện của toàn bộ nhóm TLR trên các tế bào đuôi gai
chưa trưởng thành sẽ hỗ trợ quá trình trưởng thành của chúng. Tầm quan trọng của
TLR1, 2 và 6 nằm ở khả năng nhận biết lipoprotein của vi khuẩn và glycolipid; TLR7,
8 và 9 xác định các acid nucleic như vi khuẩn và virus (ssRNA và mô đun DNA CpG
không được methyl hóa); TLR3 nhận ra virus dsRNA; TLR4 phát hiện fibronectin và
LPS; TLR5 xác định vi khuẩn Flagellin; TLR11 và 12 nhận dạng profilin và TLR10
vẫn chưa được biết như Hình 1.1. TLR kích thích sự chết theo chu trình của của các
tế bào bị nhiễm khuẩn, làm ngừng tổng hợp protein, hạn chế nhiễm trùng và điều hòa
phản ứng miễn dịch như ở tế bào đuôi gai trong tình trạng viêm nhiễm của nhiễm
trùng huyết [1].
3
1.2. THỤ THỂ GIỐNG TOLL 4

1.2.1. Cấu trúc của phức hợp TLR4-MD2
1.2.1.1. Cấu trúc TLR4
TLR4 là một thụ thể xuyên màng thuộc họ LRR. Cấu trúc của TLR được chia thành
3 vùng: vùng ngoại bào, vùng xuyên màng và vùng thụ thể Toll-interleukin-1 nội bào
(TIR). Cấu trúc tinh thể của toàn bộ TLR4 chưa được xác định, tuy nhiên cấu trúc
tinh thể của vùng ngoại bào TLR4 với MD2 và LPS đã được chụp bằng phương pháp
nhiễu xạ tia X.
Vùng ngoại bào của TLR4 bao gồm 608 acid amin (từ acid amin 26 đến 671và có
hình dạng giống móng ngựa bao gồm bề mặt lồi và lõm như Hình 1.2 [8]. Các phiến
β song song tạo thành mặt lõm của vùng ngoại bào, trong khi đó mặt lồi bao gồm các
vòng xoắn dạng 3 [9]. Vùng ngoại bào chịu trách nhiệm nhận biết các phân tử cấu
10
trúc cụ thể từ vi khuẩn tấn công, cũng là vị trí liên các phối tử dẫn đến việc kích hoạt
và dimer hóa TLR4 với MD2. Vùng đầu N là vùng kỵ nước cao kéo dài từ acid amin
27 đến acid amin 201 và chứa các đoạn LRR từ 1 đến 6. Vùng trung tâm chứa vùng
dễ biến đổi và rất quan trọng trong việc nhận dạng LPS, bao gồm LRR từ 7 đến 12.
Cuối cùng, vùng đầu C chứa các LRR từ 13 đến 22 [8, 10].
Hình 1.2. Cấu trúc vùng ngoại bào của TLR4.

Vùng xuyên màng của TLR4 ở người (632-652 acid amin) tạo thành một cấu trúc
xoắn ốc gồm 21 acid amin, theo sau là vòng lặp và một chuỗi xoắn ốc cận màng.
Vùng TIR nội bào bao gồm 187 acid amin và chịu trách nhiệm cho sự khởi đầu của
chuỗi truyền tín hiệu xuôi dòng [11, 12].
4
1.2.1.2. Cấu trúc MD2

MD2 nhỏ hơn TLR4 và là mô đun liên kết LPS chính của phức hợp thụ thể TLR4-
MD2 có cấu trúc gấp β, bao gồm hai phiến β song song ngược chiều như Hình 1.3 [8,
13]. Hai phiến được tách ra khỏi nhau trên một mặt của cấu trúc để phần bên trong
kỵ nước tiếp xúc và tương tác với các phối tử. Nếp gấp này rất giống với nếp gấp
immunoglobulin. Tuy nhiên, MD2 không có đủ cầu nối disulfid để nối hai tờ gấp
giống như immunoglobulin. Do đó, có thể tách hai phiến này và tiếp xúc với túi bên
trong khoang kỵ nước vì thiếu cầu nối disulfid [8, 13].
Hình 1.3. Cấu trúc MD2.

1.2.1.3. Cấu trúc phức hợp TLR4-MD2
TLR4 và MD2 có thể ở dạng đơn phân tử hoặc ở dạng phức hợp TLR4-MD2 như
Hình 1.4.
5
Hình 1.4. Cấu trúc phức hợp TLR4-MD2.

Khi chưa gắn kết với LPS, giữa TLR4 và MD2 hình thành một bề mặt tương tác
chính. Sự tương tác giữa TLR4 và MD2 được trung gian bởi một mạng lưới liên kết
hydro và được tăng cường điện tích. Các acid amin tích điện âm trong vùng A tương
tác với các acid amin tích điện dương Arg68 và Lys109 trong MD2. Vùng B của
TLR4 tích điện dương tương tác với các aicd amin tích điện âm trong vòng lặp và
chuỗi xoắn của MD2. Các phần của MD2 tương tác với các vùng A và B của TLR4
được đặt tên lần lượt là các vùng A’ và B’ [14].
Hình 1.5. Bề mặt tương tác chính giữa TLR4 và MD2 hình thành trước khi gắn kết LPS.
1.2.2. Cấu trúc LPS
Lipopolysacarid (LPS) là một PAMP đặc trưng được tìm thấy trong màng ngoài của
hầu hết các vi khuẩn gram âm. Ngoài ra, LPS là một lipopolysaccharid đa phân tử có
ba vùng như Hình 1.6 một phân tử lipid A (endotoxin), một loại đường lõi bao gồm
các acid 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) và kháng nguyên O gồm các đơn vị
oligosacarid lặp [14].
6
Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc cơ bản của lipopolysacarid.

Phần lipid A kỵ nước gắn liền với chuỗi carbohydrat dài và phân nhánh, chịu trách
nhiệm cho hầu hết các hoạt động miễn dịch của LPS, bao gồm một xương sống
diglucosamin phosphoryl hóa với bốn đến bảy chuỗi acyl. Bốn trong số các nhóm
acyl được liên kết trực tiếp với các vị trí 2, 3, 2’ và 3’ của xương sống glucosamin và
hai nhóm còn lại được gắn vào các nhóm hydroxyl của chuỗi lipid. Lipid A từ các
loài vi khuẩn khác nhau cho thấy sự đa dạng cấu trúc đáng kể [14, 15]. Số lượng và
chiều dài của chuỗi acyl có thể khác nhau và các nhóm phosphat có thể được thay thế
bởi các nhóm hóa học khác.
Vùng đường lõi được bảo tồn tương đối giữa các loài vi khuẩn và chứa carbohydrat
như heptose và Kdo thường không được tìm thấy trong các tế bào chủ. Vùng kháng
nguyên O bao gồm nhiều bản sao của các đơn vị lặp lại carbohydrat. Các tế bào vi
khuẩn tạo ra một tập hợp các đơn vị lặp lại rất không đồng nhất với các cấu trúc khác
nhau. Loại bỏ toàn bộ chuỗi carbohydrat bằng cách thủy phân acid chỉ có tác dụng
rất ít đối với hoạt động gây viêm của LPS, chứng minh rằng carbohydrat lõi và kháng
nguyên O chỉ có vai trò nhỏ trong việc nhận biết bởi các thụ thể miễn dịch của vật
chủ [15, 16].
1.2.3. Cơ chế kích hoạt TLR4
LPS ban đầu được tách từ màng vi khuẩn và được giải phóng giải phóng dưới dạng
các micell. Sau đó protein liên kết LPS (LBP) trong huyết thanh chuyển LPS sang
CD14-một protein có thể được tìm thấy ở dạng hòa tan hoặc được liên kết với bề mặt
tế bào bằng một neo glycosylphosphatidylinositol. CD14 tách các tập hợp LPS thành
các phân tử đơn phân và đưa chúng vào phức hợp TLR4-MD2. Khi liên kết LPS,
phức hợp TLR4-MD2-LPS (tỷ lệ gắn kết 1:1:1) tiến hành dimer hóa với một phức
7
hợp tương tự khác để hình thành phức hợp cuối cùng TLR4-MD2-LPS (tỷ lệ gắn kết
2:2:2) như Hình 1.7. Sự dimer hóa này khởi đầu một tín hiệu và truyền xuống vùng
TIR nội bào. Sự tương tác của vùng TIR nội bào với các protein tiếp hợp kích hoạt
nhiều tầng tín hiệu xuôi dòng bao gồm cả NF-κB và sản phẩm cuối cùng là các
cytokin tiền viêm [15, 17, 18].
Hình 1.7. Cơ chế nhận dạng LPS và các con đường truyền tín hiệu của TLR4.
Vùng TLR là vùng tương tác protein-protein trung gian giữa các TLR và protein tiếp
hợp. Đối với TLR4, vùng TIR nội bào đóng vai trò rất quan trọng cho việc truyền tín
hiệu, bởi vì một đột biến điểm duy nhất trong vùng TIR có thể ngăn chặn đáp ứng
với LPS [19].
Có bốn protein tiếp hợp chứa vùng TIR: MyD88, TIRAP, TRIF, TRAM. Các TLR
khác nhau sử dụng các kết hợp protein adaptor khác nhau, riêng TLR4 là TLR duy
nhất được biết đến sử dụng tất cả các protein tiếp hợp này [19].
1.2.4. Sự tương tác giữa TLR4 và MD2 sau khi gắn kết LPS
Cấu trúc tinh thể của phức hợp MD2-TLR4, được liên kết với một dạng rút gọn với
LPS của E. coli đã được xác định [10]. Sau khi gắn kết với LPS tạo ra sự hình thành
phức hợp TLR4, MD2 và LPS với tỷ lệ 2:2:2 như Hình 1.8 nhờ vào sự dimer hóa.
8
Hình 1.8. Cấu trúc phức hợp TLR4-MD2-LPS.

Các mối quan hệ hoạt động cấu trúc của LPS đã được nghiên cứu trong nhiều thập
kỷ bằng cách sử dụng LPS tự nhiên và biến đổi hóa học [10]. Cấu trúc tinh thể của
TLR4-MD2-LPS giải thích cho lý do tại sao LPS với sáu chuỗi lipid là tối ưu để kích
hoạt tín hiệu TLR4. Trong cấu trúc tinh thể, năm trong số sáu chuỗi lipid của LPS E.
coli bị chôn vùi hoàn toàn bên trong túi, nhưng chuỗi còn lại tiếp xúc một phần với
bề mặt MD2 và hình thành bề mặt tương tác kỵ nước cùng với acid amin bề mặt kỵ
nước của MD2, thúc đẩy quá trình dimer hóa giữa MD2 và TLR4 như Hình 1.9.
Hình 1.9. Sự gắn kết LPS lên phức hợp TLR4-MD2.

Cả hai tương tác kỵ nước và hydro đều đóng góp phần lớn và sự dimer hóa giữa MD2
và TLR4 được thể hiện ở Bảng 1.1.
9
Bảng 1.1. Tương tác giữa các acid amin quan trọng trong bề mặt dimer hóa giữa TLR4 và
MD2.
Acid amin trên TLR4 Tương tác Acid amin trên MD-2
Phe440 kỵ nước Ile124
Leu444 kỵ nước Phe126
Phe463 kỵ nước Leu87
kỵ nước Met85
kỵ nước Val82
Ser416 (cho) liên kết hydro (nhận) Gly123
Asn417 (nhận) liên kết hydro (cho) Lys125
Glu439 (nhận) liên kết hydro (cho) Arg90
1.2.5. Vai trò sinh học của TLR4

Các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh hay thu nhận qua con đường TLR đóng vai trò quan
trọng trong một loạt các bệnh bao gồm nhiễm trùng huyết, bệnh truyền nhiễm, xơ
vữa động mạch, suy thận, bệnh gan, bệnh phổi và thiếu máu cục bộ cơ tim/chấn
thương tái tưới máu [20, 23]. TLR4 được thể hiện trong nhiều loại tế bào bao gồm
các tế bào miễn dịch và không miễn dịch. Ngoài ra, khả năng của các thụ thể này
nhận ra PAMP là biểu hiện cho vai trò riêng biệt của chúng trong nhiễm trùng, viêm
và tổn thương mô nhiễm khuẩn huyết và shock nhiểm khuẩn.
1.2.5.1. Nhiễm khuẩn huyết và shock nhiễm khuẩn
Trong số các bệnh PAMP/TLR4, nhiễm khuẩn huyết là bệnh nghiêm trọng nhất. Đó
là một phản ứng quá mức và không được kiểm soát của sinh vật chủ đối với mầm
bệnh bên ngoài, dẫn đến rối loạn chức năng cơ quan đe dọa tính mạng cấp tính [24].
Tỷ lệ mắc toàn cầu của hội chứng này chiếm 437 trên 100.000 người trong khoảng
thời gian từ năm 1995 đến 2015, theo phân tích hồi cứu của một cơ sở dữ liệu quốc
tế [25]. Sốc nhiễm khuẩn với nồng độ LPS trong máu tăng, biểu hiện quá mức các
cytokin tiền viêm, kích hoạt hệ thống đông máu và tích lũy các sản phẩm thoái hóa
fibrinogen dẫn đến phá vỡ hệ thống huyết động học cục bộ cũng như toàn thân và rối
loạn chức năng hệ thống nội mô thông qua con đường truyền tín hiệu TLR4 [20].
Nhiễm khuẩn huyết cũng là một trong những biến chứng có thể xảy ra của bệnh cúm
nặng. Bệnh biến chứng thực vật điển hình nhất là Streptococcus pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Staphylococcus aureus, cũng như
Enterobacteriaceae spp., Aspergillus spp. và các loại khác [20].
Do vai trò to lớn của tầng tín hiệu TLR4, các thành phần ngoại bào và nội bào của nó
là mục tiêu điều trị rất hấp dẫn để điều trị cả rối loạn cấp tính (ví dụ như nhiễm khuẩn
10
huyết) và rối loạn mạn tính, liên quan đến sản xuất cytokin quá mức (còn gọi là cơn
bão cytokin trong những trường hợp nhiễm khuẩn huyết).
1.2.5.2. Xơ vữa động mạch
Xơ vữa động mạch là một bệnh viêm trong đó các tế bào được kích hoạt có liên quan
đến sự khởi đầu và tiến triển của nó. Một số nghiên cứu chỉ ra TLR4 được kích hoạt
gợi ra việc sản xuất các cytokin và chemokin gây viêm cũng đã phát hiện ra rằng
TLR4 được biểu hiện nổi bật trong các tế bào nội mô của tổn thương xơ vữa động
mạch ở người, nhưng biểu hiện kém trong các động mạch bình thường [26]. Trong
tổn thương xơ vữa động mạch sớm, LPS và các phối tử khác có thể kích thích biểu
hiện TLR4 trên các đại thực bào. Các thụ thể được kích hoạt sau đó có thể bắt đầu
dòng thác tín hiệu gây ra sự biểu hiện của các cytokin gây viêm, protease và các gốc
oxy và nitơ gây độc tế bào. Những thực thể này tăng tốc hơn nữa sự tiến triển của tổn
thương xơ vữa động mạch [27]. Trong tổn thương xơ vữa động mạch tiên tiến, LPS
có thể gây ra sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn mạch máu, cũng như biểu hiện của
enzym thoái hóa elastin thông qua TLR4 [28]. Hơn nữa, tín hiệu TLR4 cũng có thể
liên quan đến mất ổn định mảng xơ vữa động mạch. Nghiên cứu đã chứng minh rằng
LPS tạo ra sự biểu hiện của ma trận metallicoproteinase-9 (MMP-9) bởi TLR4 trong
các đại thực bào; MMP-9 đã được chứng minh là làm suy giảm collagen, do đó dẫn
đến mảng bám bị vỡ [29].
1.2.5.3. Tổn thương gan
Trong nhiều dạng bệnh gan như bệnh gan do rượu hoặc không do rượu, suy gan và
viêm gan là kết quả của một loạt các tổn thương dẫn đến việc kích hoạt quá trình
viêm nhiễm và tổn thương gan. Các nghiên cứu [21] đã chỉ ra rằng có sự tang biểu
hiện các thụ thể TLR4 trong u hạt gan và tổn thương gan do LPS. Các mầm bệnh kích
hoạt TLR4 cũng kích hoạt các gốc tự do oxy hóa, là nguyên nhân chính gây tổn
thương tế bào gan cấp tính và tử vong ở gan. Ngoài ra, LPS vi khuẩn có nguồn gốc
từ ruột nội sinh cũng được coi là đồng yếu tố quan trọng trong sinh bệnh học của tổn
thương gan.
Trong gan, LPS liên kết với LBP, sau đó tạo điều kiện cho nó chuyển sang màng
CD14 trên bề mặt tế bào Kupffer trong gan. Hơn nữa, TLR4 cũng có thể tương tác
với một phối tử protein được giải phóng từ các tế bào gan bị tổn thương để làm tăng
tổn thương hiện có ở gan [30].
1.2.5.4. Chấn thương tái tưới máu và thiếu máu cục bộ
Việc phục hồi lưu lượng máu đến tim thiếu máu cục bộ thường gây ra tổn thương
thiếu máu cục bộ/tái tưới máu cơ tim (MI/R). Một phản ứng viêm được kích hoạt bởi
11
chấn thương MI/R có thể gây ra tổn thương không thể phục hồi cho các mô khả thi
xung quanh vùng nhồi máu, do đó kéo dài thêm tổn thương. Hiện vẫn chưa rõ làm
thế nào các con đường tín hiệu miễn dịch bẩm sinh được bắt đầu trong chấn thương
MI/R. TLR4, cũng có trong tế bào cơ tim, được cho là có vai trò trong việc làm trung
gian tổn thương thiếu máu cục bộ/tái tưới máu cơ tim MI/R. Các nghiên cứu [23] đã
chỉ ra rằng thụ thể TLR4 được điều chỉnh tăng để đáp ứng với tổn thương cơ tim.
Hơn nữa, TLR4 kích hoạt phiên mã phụ thuộc NF-κB của các gen cytokin gây viêm
trong chấn thương MI/R. Chấn thương qua trung gian TLR4 dường như xảy ra thông
qua kích hoạt c-Jun NH2-terminal kinase và chuyển đoạn nhiễn sắc thể của NF-κB .
Người ta cũng tin rằng TLR4 nhận ra các phân tử nội sinh bị phơi nhiễm trong quá
trình tổn thương tế bào và tái cấu trúc ma trận ngoại bào, không phụ thuộc vào sự
xâm nhập của mầm bệnh [31]. Do đó, ức chế đường truyền tín hiệu TLR4 có thể là
mục tiêu điều trị tiềm năng để điều trị tổn thương cơ tim trong điều trị thiếu máu cục
bộ/tái tưới máu.
1.2.5.5. Bệnh thận
Suy thận cấp tính (ARF) xảy ra ở gần 5% nhập viện và là nguyên nhân hàng đầu gây
bệnh tật và tử vong. Một nguyên nhân phổ biến của ARF là nhiễm trùng huyết, kết
quả của nhiễm trùng quá mức. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự xâm nhập của LPS
dẫn đến apoptosis tế bào thận và thâm nhiễm bạch cầu trung tính ở thận [22].
Sau khi kích thích với LPS trong nhiễm trùng thận hoặc các phối tử nội sinh khác từ
các tế bào hình ống hoại tử, TLR4 được kích hoạt đã được chứng minh là kích thích
đặc biệt con đường NF-κB để đáp ứng với stress oxy hóa. Hơn nữa, hoạt hóa TLR4
trên các tế bào biểu mô hình ống và các tế bào miễn dịch lưu hành dẫn đến việc tiết
ra các cytokin và chemokin trực tiếp hoặc gián tiếp góp phần gây tổn thương thận.
1.2.5.6. Bệnh phổi
Các nghiên cứu cho thấy biểu hiện gia tăng của TLR2, TLR4 và CD14, cũng như các
cytokin tiền viêm IL-8 và IL-1β ở bệnh nhân hen suyễn bạch cầu trung tính và bệnh
nhân giãn phế quản so với nhóm chứng. Những nhóm này cũng có nồng độ nội độc
tố đường thở cao hơn nhóm đối chứng [32]. Trong một nghiên cứu khác, cũng có sự
gia tăng biểu hiện của các cytokin gây viêm phổi xảy ra trong phổi trong quá trình
nội độc tố thực nghiệm. Việc sản xuất cytokin góp phần thêm vào tổn thương phổi
cấp tính (ALI) và hội chứng suy hô hấp cấp tính (ARDS). Một nghiên cứu đã chỉ ra
rằng LPS gây ra các cytokin gây viêm trong phổi thông qua thác tín hiệu TLR4, cho
thấy vai trò của phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong sinh bệnh học của ALI/ARDS [33].
1.2.6. Các chất ức chế TLR4 từ tự nhiên
12
Chất ức chế TLR4 từ tự nhiên chủ yếu thu được từ vi khuẩn gram âm và vi khuẩn
lam hoặc từ thực vật. Ở vi khuẩn và vi khuẩn lam, các phân tử có hoạt tính đối kháng
TLR4 có cấu trúc LPS hoặc Lipooligosacarid (LOS); trong thực vật, chất đối kháng
là các phân tử trọng lượng phân tử thấp có cấu trúc không liên quan đến LPS. Các
chất đối kháng TLR4 tự nhiên đã được chứng minh là có tác dụng trong khoang ngoại
bào, bằng cách ngăn chặn sự hình thành phức hợp TLR4-MD2 và hoạt động trên
CD14 hoặc trên MD2 [34].
Các phân tử có nguồn gốc tự nhiên với hoạt tính đối kháng TLR4 được chứng minh
tốt, hiện được báo cáo trong tài liệu gồm:
- LPS và lipid A từ Rhodobacter sphaeroides
- LOS từ Bartonella quintana
- LPS từ Oscillatoria Planktothrix FP1
- Curcumin từ Curcuma longa
- Sulforaphan và iberin từ rau họ cải
- Xanthohumol từ hoa bia và bia
- Celastrol từ Trippetgium wilfordii
Các phân tử khác từ thực vật và thảo dược như berberin, atractylenolid I và acid
zhankuic A, đã được mô tả là các phân tử đối kháng TLR4; tuy nhiên, cơ chế hoạt
động chỉ được đưa ra giả thuyết và chưa được chứng minh bằng thực nghiệm.
1.2.7. Các thuốc ức chế TLR4 hiện nay
Một số chất đối kháng TLR4 đã được tổng hợp, phần lớn trong số chúng bắt chước
cấu trúc của lipid A, phối tử MD2 tự nhiên. Lipid A nổi tiếng nhất bắt chước là
Eritoran và chất này được đưa vào giai đoạn lâm sàng. Các chất đối kháng TLR4
khác có cấu trúc hóa học không liên quan đến lipid A đã được phát triển một cách
đáng tin cậy. Tuy nhiên, chỉ TAK-242 (resatorvid) được đưa vào thử nghiệm lâm
sàng.
TAK-242 là một hợp chất phân tử nhỏ có tác dụng ức chế chọn lọc tín hiệu TLR4.
TAK-242 ức chế con đường TLR4 bằng cách liên kết trực tiếp với Cys747 trong miền
TLR4 nội bào [35]. Người ta đã quan sát thấy TAK-242 phá vỡ sự tương tác của
TLR4 với các protein tiếp hợp, miền TIRAP và TRAM. Một số nghiên cứu khác đã
chứng minh hiệu quả của TAK-242 trên mô hình nhiễm trùng huyết ở cả hai phương
pháp đơn trị và kết hợp [36]. Ngoài những điều trên, TAK-242 còn bảo vệ chống lại
tổn thương do thiếu máu cục bộ/tái tưới máu cấp tính ở chuột với liều 3 mg/kg [37].
Một số nghiên cứu đã chứng minh hoạt động chống viêm TAK-242 ở các loài gặm
13
nhấm khác so với chuột [38, 39]. Cuối cùng, TAK-242 được đưa vào các thử nghiệm
lâm sàng. Kết quả thửu nghiệm lâm sàng của TAK-42 được trình bày ở Bảng 1.2.
Eritoran có lẽ là chất ức chế TLR4 được biết đến nhiều nhất. Hợp chất này bắt chước
lipid A, nhưng có bốn thay vì sáu chuỗi acid béo, một trong số chúng không bão hòa.
Phân tích tinh thể của phức hợp Eritoran-MD2 cho thấy Eritoran liên kết MD2 tương
tự như lipid A, bằng cách cho bốn chuỗi acid béo vào túi liên kết MD2. Tuy nhiên,
khi gắn kết với khoang MD2, Eritoran bị xoay 180o so với lipid A [8]. Theo mô hình
này, Eritoran hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh cổ điển với LPS để gắn kết
với MD2. Sau khi thu được kết quả thành công trên các mô hình động vật, Eritoran
đã được đề xuất thử nghiệm trên người [40, 42]. Kết quả thử nghiệm lâm sàng của
Eritoran được thể hiện ở Bảng 1.2.
14
Bảng 1.2. Kết quả thử nghiệm lâm sàng của các chất ức chế TLR4.
Hợp chất Kết quả thử nghiệm lâm sàng
TAK-242 Thử nghiệm ngẫu nhiên, mù đôi, có

kiểm soát placebo ở giai đoạn 2 cho
(Resatorvid)
thấy TAK-24 không thể ức chế nồng độ
cytokin ở bệnh nhân nhiễm trùng huyết
và sốc hoặc suy hô hấp [43].
Eritoran Giai đoạn 2 của các nghiên cứu mù đôi,

kiểm soát placebo cho thấy Eritoran
(E5564)
được dung nạp tốt nhưng không làm
giảm viêm hệ thống đáng kể [40].
Thử nghiệm ngẫu nhiên, mù đôi, kiểm
soát placebo ở giai đoạn 3 với kết quả
ghi nhận được là điều trị không cải thiện
khả năng sống sót sau 28 ngày [44].
Thử nghiệm ngẫu nhiên, mù đôi, thử
nghiệm giả dược, thử nghiệm tăng dần
liều ở giai đoạn 2 cho thấy Eritoran
được dung nạp tốt nhưng tỷ lệ tử vong
không giảm đáng kể [45].
15
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu trên máy tính dựa trên tương tác protein-protein giữa TLR4
và MD2 để xây dựng các phân tử nhỏ có khả năng gắn kết trên TLR4 và MD2, từ đó
ức chế con đường tín hiệu xuôi dòng, ngăn chặn việc hoạt hóa tín sinh học. Quy trình
nghiên cứu được trình bày trong Hình 2.1.
Hiện nay, cấu trúc tinh thể của phức hợp TLR4-MD2-LPS đã được xác định bằng
phương pháp nhiễu xạ tia X và được công bố ở Ngân hàng dữ liệu Protein với mã
PDB:3FXI, độ phân giải 3,10 Å. Theo các nghiên cứu đã được công bố, TLR4 và
MD2 có hai bề mặt tương tác: bề mặt tương tác chính và bề mặt dimer hóa. Trong đó
bề mặt dimer hóa đóng vai trò quan trọng trong quá trình dimer hóa giữa TLR4 và
MD2 sau khi gắn kết LPS, từ đó truyền tín hiệu đến vùng TIR nội bào, hoạt hóa con
đường truyền tín hiệu xuôi dòng. Vì thế, trong nghiên cứu này sử dụng phương pháp
thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu nhằm tập trung tìm kiếm các cấu trúc phân
tử nhỏ có khả năng gắn kết với TLR4 hoặc MD2 tại bề mặt dimer hóa, từ đó ức chế
sự dimer hóa của hai protein.
Đối tượng của nghiên cứu này bao gồm:
i. Thư viện cấu trúc hóa học ZINC
ii. Cấu trúc tinh thể của phức hợp TLR4-MD2-LPS từ ngân hàng dữ liệu protein.
iii. Tương tác protein-protein của TLR4-MD2.
Các phương pháp và phần mềm được sử dụng lần lượt trong phương pháp nghiên cứu
là:
- Phương pháp 3D-pharmacophore: Molecular Operating Environment (MOE)
2015.10.
- Sàng lọc qua thư viện ZINC: công cụ ZINCPharmer.
- Phương pháp docking phân tử: Molecular Operating Environment (MOE) 2015.10,
LeadIT 2.1.8, Sybyl-X 2.0.
- Phương pháp mô phỏng động học phân tử: GROningen MAchine for Chemical
Simulations (GROMACS) 2018.
- Tính năng lượng gắn kết tự do: công cụ g-mmpbsa.
16
Cấu trúc tinh thể phức hợp TLR4-

MD2-LPS
Mô hình 3D-pharmacophore MOE 2015.10
Sàng lọc qua thư viện ZINC ZINCPharmer
Mô hình mô tả docking phân tử LeadIT 2.8.1
Mô hình mô tả động lực học phân tử GROMACS 2018
Năng lượng gắn kết tự do g-mmpbsa
2.1. MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE

Hình Cácbước
2.1.Các
Hình2.2. bướctiến
tiếnhành
hành trong
trong nghiên
nghiêncứu.
cứu.
2.1.1. Cơ sở xây dựng mô hình 3D-pharmacophore
Cơ sở để xây dựng các mô hình 3D-pharmacophore trong nghiên cứu này là tương
tác protein-protein của TLR4-MD2 để sàng lọc và thiết kế các phân tử nhỏ ức chế
tương tác bề mặt protein-protein (SMPPII). Bề mặt tương tác và các khoang gắn kết
được phân tích để xác định các tương tác giữa các acid amin quan trọng, từ đó xây
dựng các các điểm thuộc tính pharmacophore.
Bảng 1.1 ở mục 1.2.4 trình bày sự tương tác giữa các acid amin quan trọng trong bề
mặt dimer hóa giữa TLR4 với MD2. Mặc dù trong bề mặt tương tác, có nhiều acid
17
amin tham gia vào sự gắn kết, nhưng các acid amin quan trọng được lựa chọn bằng
các phương pháp khác nhau trong đó có đột biến. Và đây là cơ sở cho việc xây dựng
mô hình 3D-pharmacophore.
Nghiên cứu này thực hiện xây dựng các mô hình 3D-pharmacophore theo hướng xây
dựng trực tiếp dựa trên những acid amin quan trọng, bắt chước những tương tác ban
đầu của chúng trong phức hợp TLR4-MD2-LPS đã được chụp bằng phương pháp
nhiễu xạ tia X.
2.1.2. Công cụ xây dựng mô hình 3D-pharmacophore
Phần mềm Molecular Operating Environment (MOE) 2015.10 được ưu tiên sử dụng
để xây dựng các mô hình 3D-pharmacophore theo phương pháp dựa trên cấu trúc
đích tác động. Trong phần mềm này, công cụ được sử dụng là Computer
→ Pharmacophore → Query Editor giúp truy vấn các pharmacophore có thể có từ
các nguyên tử được chọn và xây dựng một cách tự động điểm pharmacophore này
trong mô hình. Các thông số được ứng dụng và quan trọng trong công cụ này:
-Scheme: trường lực được sử dụng (mặc định Unified).
-Title: tên mô hình.
-Create → Feature: xây dựng các điểm pharmacophore từ các điểm được chọn.
-Apply: áp dụng các đặc tính tùy chỉnh cho pharmacophore.
-Essential: thiết lập một điểm pharmacophore là “bắt buộc”.
-R (radius): bán kính của pharmacophore.
-Volume: giới hạn kích thước cho các pharmacophore.
2.2. SÀNG LỌC QUA THƯ VIỆN ZINC
Thư viện ZINC được lựa chọn để tiến hành sàng lọc các mô hình pharmacophore
được xây dựng nhằm ức chế hoạt tính sinh học của thụ thể TLR4 với công cụ
ZINCPharmer.
Các mô hình 3D-pharmacophore sau khi được xây dựng hoàn chỉnh bằng phần mềm
MOE 2015.10 được lưu dưới dạng file *.ph4 và được tải trực tiếp lên trang web
ZINCPharmer tại địa chỉ http://zincpharmer.csb.pitt.edu. Chọn “Search ZINC” để
vào giao diện chính của công cụ này. Tiếp theo, chọn “Load features...” để tải các
file *.ph4 lên trang web. Tại đây có thể thực hiện một số điều chỉnh nếu cần như bán
kính, góc,... hoặc bật tắt tùy chọn “Enabled” đối với một số thuộc tính.
Trong tab “Filters” thiết lập các thông số như sau:
- Max hits per Mol (số hit chọn tối đa cho mỗi phân tử): chọn giá trị 1.
18
- Subset selection (lựa chọn tập con để sàng lọc): chọn “ZINC Purchasable: Last
updated 12/20/14” là tập hợp con mới nhất của ZINCPharmer.
Cuối cùng chọn “Submit Query” để tiến hành sàng lọc.
Khi quá trình sàng lọc kết thúc, chọn “Save Result” để lưu kết quả dưới dạng file
*.sdf. Kết quả được mở hoặc được ghép lại với nhau (trong trường hợp thực hiện
nhiều tập hợp pharmacophore riêng lẻ cho một mô hình với những tùy chọn
“Enabled” khác nhau) bằng phần mềm MOE 2015.10.
Trong quá trình sàng lọc các tập hợp pharmacophore riêng lẻ cho một mô hình thì
việc trùng lặp các chất là không thể tránh khỏi. Do đó phần mềm MOE 2015.10 cũng
được sử dụng để hỗ trợ việc xóa các cấu trúc trùng nhau bằng cách nhấp chuột phải
vào cột mol, chọn Select Entries → Unique để chọn các chất không bị trùng lắp, sau
đó chọn Invert để chọn các chất bị trùng lắp, tiếp theo nhấp chuột phải → Delete →
Selected để tiến hành xóa các chất trùng.
Tiếp theo tiến hành sàng lọc các chất theo định luật 5-Lipinski để loại bỏ các chất
không có khả năng làm thuốc. Luật 5 Lipinski (1997) thường được áp dụng trong
sàng lọc trên máy tính. Theo luật Lipinski thì các chất có hấp thu kém hoặc thấm kém
là các chất có nhiều hơn 5 nhóm cho hydro trong liên kết hydrogen (H-bond donor,
các nhóm OH, NH…), nhiều hơn 10 nhóm nhận hydro trong liên kết hydrogen (H-
bond acceptor, số lượng các nguyên tử O, N…), khối lượng phân tử lớn hơn 500 và
logP lớn hơn 5 [46]. Quá trình này cũng được thực hiện nhờ phần mềm MOE 2015.10
bằng cách chọn Selected Entries → Druglike.
Sau khi tiến hành xong tất cả các bước sàng lọc, kết quả cuối cùng được xuất dạng
*.mdb. Tập tin này sẵn sàng cho quá trình chuẩn bị trước khi tiến hành docking phân
tử.
2.3. MÔ HÌNH MÔ TẢ DOCKING PHÂN TỬ
2.3.1. Các bước xây dựng mô hình mô tả docking phân tử
2.3.1.1. Chuẩn bị cấu trúc protein
Cấu trúc protein của TLR4 và MD2 được chuẩn bị bằng công cụ QuickPrep của phần
mềm MOE 2015.10 với các thông số như sau:
- Protonate: proton hóa và tích điện cho các acid amin của protein.
- Tether and Fix: các nguyên tử trong protein được xác định vùng không gian chuyển
động nhằm đảm bảo các nguyên tử không lệch quá xa so với tọa độ ban đầu.
- Refine: tối thiểu hóa năng lượng. Giá trị RMS Gradient là 0,0001 kcal/mol/A.
19
Sau khi chuẩn bị với công cụ QuickPrep, protein lưu dưới dạng file *.pdb.
2.3.1.2. Chuẩn bị cấu trúc 3D của phối tử
Các ligand được xuất dưới dạng file *.mol2 bằng phần mềm MOE 2015.10, sau đó
các file này được Import vào phần mềm Sybyl-X 2.0 và được xử lý theo 3 bước để
tìm ra cấu dạng có năng lượng thấp nhất:
- Tối thiểu hóa năng lượng lần một được thực hiện bằng công cụ Compute →
Minimize → Molecule, với các thông số được thiết lập như sau:
+ Method: Conj Grad
+ Termination: Energy Change: 0,0001 kcal/mol
+ Max Iterations: 10.000
+ Modify → Change: Gasteiger-Huckel
+ Các thông số khác mặc định.
- Sau khi tối thiểu hóa năng lượng lần một, tiến hành động lực học phân tử bằng công
cụ Computer → Dynamics → Setup Simulated Annealing, thiết lập thông số Run =
5, các thông số khác mặc định. Quá trình này nhằm giúp phân tử vượt qua trạng thái
năng lượng tối thiểu cục bộ.
- Tiến hành tối thiểu hóa năng lượng lần hai với các thông số giống lần một, từ đó
tìm được trạng thái năng lượng tối thiểu toàn phần của mỗi phân tử.
Lưu các phân tử sau khi đã hoàn thành xong ba bước trên vào một cơ sở dữ liệu dạng
file *.sdf để sử dụng cho việc docking.
2.3.1.3. Tiến hành docking phân tử
Cấu trúc protein đã được chuẩn bị như trên được đưa vào phần mềm LeadIT 2.1.8
bằng cách chọn công cụ Load or Prepare Receptor → Select → chọn file protein
dạng *.pdb đã chuẩn bị. Sau đó, khoang gắn kết được tạo thành bằng cách chọn chế
độ Sphere, sau đó chọn các acid amin quan trọng và đánh dấu trên cửa sổ Project
Tree. Khoang gắn kết được lưu lại và tiến hành docking.
Nếu cấu trúc protein có ligand gắn kết, chọn chế độ Reference Ligand, sau đó chọn
Ligand, bề mặt khoang liên kết sẽ được tạo thành dựa trên bề mặt gắn kết giữa ligand
và phối tử.
Tiến hành docking bằng công cụ Docking → Define FlexX Docking → Docking
Library → Load File. Các thông số cho quá trình docking được thiết lập như sau:
- Number of Poses to Keep: Top 10 - số cấu dạng (pose) giữ lại.
20
- Docking Details, trông phần Maximum Number of Solutions per Iteration (số lần tối
đa cho mỗi lần lặp lại) là 1.000 và Maximum Number of Solutions per Fragmentation
(số lần tối đa cho việc bẻ gãy) là 200. Các thông số khác mặc định.
Chọn Apply and Dock để bắt đầu kết quả docking.
Sau khi docking để lưu kết quả, chọn Docking → Export Poses và lưu dưới dạng file
*.sdf. File này được nhập vào bằng phần mềm MOE 2015.10 ở dạng file *mdb để
phân tích kết quả docking.
2.3.2. Đánh giá kết quả docking
Kết quả docking được đánh giá dựa trên hai yếu tố chính: điểm số docking và các
tương tác được tạo thành trong sự gắn kết protein-ligand. Trong đó, việc phân tích
các liên kết giữa protein-ligand đóng vai trò quan trọng vì đó là cơ sở trong việc
khẳng định các ligand có thực sự tạo được tương tác với các acid amin quan trọng
hay không.
Điểm số docking được tính toán và báo cáo bằng phần mềm LeadIT 2.1.8. Việc phân
tích sự gắn kết protein-ligand được thực hiện với sự hỗ trợ của của phần mềm MOE
2015.10.
2.4. MÔ PHỎNG ĐỘNG LỰC HỌC PHÂN TỬ
Sau quá trình mô phỏng docking phân tử, năm chất có điểm số docking tốt nhất lên
bề mặt dimer hóa của MD2 được lựa chọn để tiến hành mô phỏng động lực học phân
tử.
2.4.1. Các bước mô phỏng động lực học phân tử
2.4.1.1. Xây dựng topology
Xây dựng topology cho protein
Cấu trúc của phức hợp TLR4-MD2-LPS được tải về từ Ngân hàng dữ liệu protein
(PDB), sau đó được xử lý bằng phần mềm MOE 2015.10 để giữ lại thụ thể MD2 cần
chạy mô phỏng động lực học và lưu thành file protein.pdb. Sau đó, sử dụng lệnh
pdb2gmx trong GROMACS 2018 để chuyển định dàng file *.pdb thành *.gro bằng
trường lực CHARM27 và mô hình dung môi nước TIP3. Kết thúc lệnh, file topology
của protein được tạo dưới dạng topol.top.
Xây dựng topology cho phối tử
Từ kết quả mô phỏng docking phân tử, cấu dạng tốt nhất của năm chất tốt nhất khi
docking lên bề mặt dimer hóa của MD2 được trích xuất dưới dạng *sdf, sau đó sử
dụng phần mềm MOE 2015.10 để thêm hydrogen và lưu thành file ligand.mol2. Tiếp
21
theo, topology của phối tử được xây dựng nhờ công cự SwissParam tại địa chỉ
http://www.swissparam.ch theo trường lực CHARM27, sử dụng file ligand.itp và
ligand.gro từ kết quả thu được để tiến hành cho các bước sau.
Xây dựng topology cho phức hợp
Tạo file complex.gro bao gồm tọa độ của có chứa toạ độ của các acid amin protein
và phối tử. Sau đó, file topol.top được cập nhật các thông số và topology của ligand
để tạo topology cho cả phức hợp.
2.4.1.2. Tạo hộp mô phỏng và thêm dung môi
Hệ được đặt vào khối hộp đa diện, sau đó được thêm dung môi nước bằng mô hình
TIP3P vào hệ thống. Các phân tử dung môi được bổ sung và cập nhật vào file
topol.top. Kết quả thu được là file newbox.gro và file solv.gro.
2.4.1.3. Thêm ion
Tại giai đoạn này, hộp nước được trung hòa điện tích bằng cách thêm ion Na+ hoặc
Cl- . Các thông số được cập nhật vào file topol.top.
2.4.1.4. Tối thiểu hóa năng lượng
Để loại bỏ các tương tác không tốt trong hệ, tiến hành tối thiểu hóa năng lượng với
các thông số trong file em.mdp với thời gian 100 ps.
2.4.1.5. Cân bằng
Hệ được cân bằng qua hai bước:
- Giai đoạn NVT (số hạt N, thể tích V và nhiệt độ T): là giai đoạn cân bằng đẳng
nhiệt-đẳng tích với nhiệt độ ổn định là 300 oK, thời gian 1000 ps trong bộ phận ổn
định nhiệt Berendsen, các thông số khác được thiết lập trong file nvt.mdp.
- Giai đoạn NPT (số hạt N, áp suất P và nhiệt độ T) là giai đoạn cân bằng đẳng nhiệt-
đẳng áp với áp suất ổn định 1 bar (0,987 atm), thời gian 1000 ps trong bộ phận điều
áp Parrinello-Rahman, các thông số khác được thiết lập trong file npt.mdb.
Kết thúc hai quá trình trên, phần mềm xuất hai file nvt.ipr và npt.ipr tương ứng. Sau
đó câu lệnh mx mdrun được sử dụng để mô phỏng quá trình quá trình cân bằng. Kết
thúc giai đoạn này npt.gro và npt.cpt được xuất để làm cơ sở dữ liệu cho bước sau.
2.4.1.6. Tiến hành mô phỏng động lực học phân tử
Hệ được tiến hành chạy mô phỏng động lực học với thời gian 20 ns với các thông số
quy định trong file md.mpd tại nhiệt độ 300K và áp suất 1 bar. Sử dụng câu lệnh câu
lệnh gmx mdrun để mô phỏng quá trình động lực học phân tử. Kết quả phần mềm
xuất được dưới dạng *.xtc để phân tích.
22
2.4.2. Đánh giá kết quả mô phỏng động lực học phân tử
2.4.2.1. Độ ổn định của protein, phối tử và phức hợp
RMSD (căn bậc hai độ lệch trung bình bình phương) được sử dụng để đo lường sự
thay đổi trung bình về độ dịch chuyển của tập hợp các nguyên tử được lựa chọn cho
một khung cụ thể đối với khung tham chiếu và được tính cho tất cả các khung trong
quỹ đạo. RMSD cho mỗi khung x và được lặp lại cho tất cả các khung trong quỹ đạo
được tính theo công thức (1):
N
1 2
RMSDx =√ ∑ (r'i (tx )-ri (tref )) (1)
N
i=1
Trong đó:
N: tổng số nguyên từ được lựa chọn
tref: thời gian tham chiếu
r'i : vị trí của các nguyên tử được chọn trong khung x sau khi đặt chồng lên khung
tham chiếu, trong đó khung x được ghi tại thời điểm tx
Theo dõi RMSD có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc về cấu trúc trong suốt quá trình mô
phỏng. Phân tích RMSD có thể chỉ ra nếu mô phỏng đã cân bằng và ổn định thì giá
trị RMSD sẽ dao động xung quanh một giá trị trung bình trong thời gian mô phỏng
gần kết thúc. Giá trị RMSD dao động trong khoảng 0,1-0,3 nm là hoàn toàn chấp
nhận được đối với các protein nhỏ, hình cầu. Tuy nhiên, những thay đổi lớn hơn nhiều
chỉ ra rằng protein đang trải qua một sự thay đổi lớn về hình dạng trong quá trình mô
phỏng. Nếu RMSD của protein vẫn tăng hoặc giảm trung bình khi kết thúc mô phỏng,
thì hệ thống đã không được cân bằng và mô phỏng có thể không đủ dài để phân tích
chính xác hơn.
2.4.2.2. Độ ổn định của các acid amin tại vị trí gắn kết trong protein
RMSF (cân bậc hai độ dao động trung bình bình phương) rất hữu ích để mô tả các
thay đổi cục bộ dọc theo chuỗi protein. RMSF cho mỗi acid amin i và được lặp lại
cho tất cả acid amin trong protein được tính theo công thức (2):
T
1 2
RMSFi =√ ∑ <(r'i (t)-ri (tref )) > (2)
T
t=1
Trong đó:
23
T: thời gian quỹ đạo mà RMSF được tính

tref : thời gian tham chiếu
ri : vị trí của acid amin
r'i : vị trí của các nguyên tử trong acid amin 𝑖 sau khi đặt chồng lên tham chiếu Xác
định tương tác giữa protein và phối tử
Các đỉnh biểu thị các vùng protein dao động nhiều nhất trong quá trình mô phỏng.
Thông thường, vùng đầu N và C dao động nhiều hơn bất kỳ phần nào khác của
protein. Các yếu tố cấu trúc thứ cấp như chuỗi xoắn α và chuỗi β thường cứng hơn
phần không cấu trúc của protein và do đó dao động ít hơn các vùng vòng.
2.4.2.3. Tương tác giữa protein và phối tử
Đánh giá mức độ tương tác giữa protein và phối tử dựa trên việc phân tích liên kết
hydro và các liên kết khác được hình thành trong quá trình mô phỏng động lực học.
Liên kết hydro mạnh và rất mạnh được phân tích nhờ sự hỗ trợ của phần mềm VMD
với khoảng các giữa nhóm cho và nhận ≤ 3,2 Å và góc giữa nhóm cho (D), hydro và
nhóm nhận (A) được viết ngắn gọn D-H-A ≥ 130o [47]. Nếu tỷ lệ hydrogen chiếm
càng cao cho thấy liên kết hydro được hình thành càng nhiều trong suốt quá trình mô
phỏng động lực học [48].
2.5. NĂNG LƯỢNG GẮN KẾT TỰ DO
G_mmpbsa là một công cụ GROMACS dựa trên phương pháp MM/PBSA để tính
toán các năng lượng liên kết tự do. Trong nghiên cứu này, năm chất tốt nhất về điểm
số docking lên bề mặt dimer hóa MD2 đã được mô phỏng động lực học ở trên cũng
được sử dụng để tính toán năng lượng gắn kết tự do trong 20ns.
Nói chung, năng lượng gắn kết tự do của protein và phối tử trong dung môi được tính
theo công thức (3):
∆Ggắn kết =Gphức hợp -(Gprotein +Gligand ) (3)
Với Gphức hợp là năng lượng tự do của phức chất gồm protein liên kết với phối tử;
Gprotein , Gligand tương ứng là năng lượng tự do của protein cô lập và phối tử trong dung
môi. Năng lượng tự do của mỗi phần được tính công thức 4:
G=EMM -TS+Gsolvat hóa (4)
Trong đó EMM là thế năng cơ học phân tử trong chân không gọi tắt là thế năng chân
không, 𝑇 và 𝑆 biểu thị cho nhiệt độ và entropy tương ứng, Gsolvat hóa là năng lượng tự
do của quá trình solvat hóa.
24
Thế năng chân không (EMM ) bao gồm năng lượng của cả tương tác gắn kết cũng như
không gắn kết và được tính toán dựa trên các tham số trường lực cơ học phân tử
(MM). EMM được tính theo công thức (5)
EMM =Egắn kết +Ekhông gắn kết =Egắn kết +(EvdW +Etĩnh điện ) (5)
Trong đó trong đó 𝐸𝑔ắ𝑛 𝑘ế𝑡 là các tương tác bao gồm liên kết, góc, góc nhị diện và
tương tác không chính xác. Các Ekhông gắn kết bao gồm cả tương tác tĩnh điện và van
der Waals.
Năng lượng tự do solvat hóa (Gsolvat hóa ) là năng lượng cần thiết để chuyển một chất
tan từ chân không vào dung môi. Trong phương pháp MM-PBSA, Gsolvat hóa được
tính toán bằng mô hình dung môi ẩn và được tính theo công thức (6), (7):
Gsolvat hóa =Gphân cực +Gkhông phân cực
(6)
Gkhông phân cực =Gkhoang +GvdW (7)
Trong đó Gphân cực và Gkhông phân cực là các đóng góp tĩnh điện và không tĩnh điện cho
năng lượng tự do solvat hóa tương ứng. Gphân cực được ước tính bằng cách giải phương
trình Poisson − Boltzmann (PB). Gkhông phân cực bao gồm cả lực đối kháng và hấp dẫn
giữa chất tan và dung môi được tạo bởi khoang gắn kết (Gkhoang ) và tương tác van der
Waals (GvdW ). Gkhoang được tạo bởi chất tan để tạo ra một khoang trong dung môi và
phụ thuộc vào hình dạng của chất tan. GvdW là năng lượng van der Waals hấp dẫn
giữa dung môi và chất tan.
Giá trị ∆G càng âm và biên độ dao động càng ít thì sự gắn kết giữa protein và ligand
diễn ra càng mạnh và ổn định.
25
Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Kết quả và bàn luận
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE
Các mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng theo hướng tìm chất gắn kết TLR4
dựa trên cấu trúc protein MD2 và ngược lại. Như trình bày ở trên, các mô hình 3D-
pharmacophore được xây dựng dựa trên các tương tác dựa trên các tương tác giữa
các acid amin quan trọng khi quá trình dimer hóa xảy ra giữa TLR4 và MD2 sau khi
gắn kết với LPS như Hình 3.1.
Hình 3.1. Bề mặt dimer hóa giữa TLR4 và MD2.

Theo Hình 3.1, có hai mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng:
- Mô hình chất gắn kết MD2 dựa trên cấu trúc TLR4 được ký hiệu Ph-MD-2i.
- Mô hình chất gắn kết TLR4 dựa trên cấu trúc MD2 đưuọc ký hiệu Ph-TLR4i.
3.1.1. Mô hình 3D-pharmacophore cho các chất gắn kết MD2
Quá trình dimer hóa xảy ra giữa TLR4-MD2 sau khi gắn kết với LPS khởi đầu cho
con đường truyền tín hiệu xuôi dòng để thể hiện hoạt tính sinh học. Để thiết kế các
chất ức chế sự dimer hóa giữa TLR4-MD2, mô hình 3D-pharmacophore Ph-MD-2i
được xây dựng dựa trên các tương tác của các acid amin quan trọng giữa TLR4 và
MD2. Mô hình này được xây dựng trực tiếp dựa trên các acid amin quan trọng thuộc
TLR4 tham gia quá trình dimer hóa. Các tương tác acid amin quan trọng trong quá
trình dimer hóa giữa TLR4-MD2 được trình bày ở Bảng 1.1.
26
Kết quả cho thấy cả hai tương tác kỵ nước và tương tác hydro đều đóng góp quan
trọng trong quá trình dimer hóa giữa TLR4 và MD2. Trong đó, trên thụ thể TLR4 có
6 acid amin quan trọng gắn kết lên các acid amin quan trọng của thụ thể MD2 như
Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các acid amin quan trọng trên TLR4 tương tác với MD2.
Tương tác Kỵ nước Hydro
Acid amin trên TLR4 Phe440, Leu444, Phe463 Ser416, Asn417, Glu439
Do đó, mô hình 3D-pharmacophore Ph-MD-2i xây dựng dựa trên nguyên tắc bắt
chước thuộc tính 6 acid amin để các chất sàng lọc được có khả năng gắn kết lên thụ
thể MD2. Hình 3.2 thể hiện các điểm pharmacophore được xây dựng dựa trên các
acid amin quan trọng trên thụ thể TLR4.
Hình 3.2. Mô hình 3D-pharmacophore cho các chất gắn lên MD2.
Hình 3.2 cho thấy từ 6 acid amin quan trọng trên thụ thể TLR4, có 6 điểm
pharmacophore được được xây dựng với các kí hiệu từ F1 đến F6. Cụ thể, F1:Don
(cho hydro); F2, F3:Acc (nhận hydro); F4, F5, F6:Hyd (kỵ nước). Ngoài ra còn cho
thấy các điểm pharmacophore không nằm trong khoang của thụ thể MD2 mà chỉ nằm
trên khu vực cửa đi vào khoang cũng chính là bề mặt dimer hóa của MD2.
3.1.2. Mô hình 3D-pharmacophore cho các chất gắn kết TLR4
Tương tự như mô hình Ph-MD-2i , mô hình Ph-TLR4i được xây dựng dựa trên các
tương tác của các acid amin quan trọng giữa TLR4 và MD2. Mô hình này được xây
dựng trực tiếp dựa trên các acid amin quan trọng thuộc MD2 tham gia quá trình dimer
27
hóa. Bảng 1.1 cho thấy trên thụ thể MD2 có 8 acid amin quan trọng tương tác với 6
acid amin quan trọng trên thụ thể TLR4. Trong đó, 3 acid amin Leu87, Met85, Val82
của thụ thể MD2 đều tương tác kỵ nước với Phe463 trên TLR4. Acid amin Leu87
được lựa chọn để xây dựng pharmacophore khả năng tương tác với Phe463 tốt hơn
Met85 và Val82 do khoảng cách từ Leu87 đến Phe463 ngắn nhất 3,55 Å và năng
lượng âm nhất -4,465 kcal/mol. Hình 3.3 thể hiện các điểm pharmacophore được xây
dựng dựa trên các acid amin quan trọng trên thụ thể MD2.
Hình 3.3. Mô hình 3D-pharmacophore cho chất gắn kết với TLR4.
Hình 3.3 cho thấy từ 6 acid amin quan trọng trên thụ thể MD2, có 6 điểm
pharmacophore được được xây dựng với các kí hiệu từ F1 đến F6. Cụ thể, 6 điểm
thuộc tính gồm F1:Acc (nhận hydro); F2, F3:Don (cho hydro), F4, F5, F6:Hyd (kỵ
nước). Ngoài ra, Hình 3.3 cho thấy các điểm pharmacophore nằm trên bề mặt lồi của
vùng đầu C trên thụ thể TLR4, tương ứng là bề mặt dimer hóa với thụ thể MD2.
3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC QUA THƯ VIỆN ZINC
Mô hình 3D-pharmacophore Ph-MD2i được sàng lọc với tổ hợp 5 và 6 điểm thuộc
tính của mô hình pharmacophore trên ZINCPharmer và kết quả sàng lọc được thể
hiện dưới Bảng 3.2.
28
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc của mô hình Ph-MD2i.

STT Mô hình 3D-pharmacophore Số lượng các chất
1 Ph-MD2i (F1, F2, F3, F4, F5, F6) 0
2 Ph-MD2i ( F2, F3, F4, F5, F6) 16
3 Ph-MD2i (F1, F3, F4, F5, F6) 0
4 Ph-MD2i (F1, F2, F4, F5, F6) 245
5 Ph-MD2i (F1, F2, F3, F5, F6) 0
6 Ph-MD2i (F1, F2, F3, F4, F6) 121
7 Ph-MD2i (F1, F2, F3, F4, F5) 1
Tổng 383
Xóa chất trùng 173
Druglike 101
Mô hình 3D-pharmacophore Ph-TLR4i được sàng lọc với tổ hợp 6 và 5 điểm thuộc
tính của một mô hình pharmacophore trên ZINCPharmer và kết quả sàng lọc được
thể hiện dưới Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc mô hình Ph-TLR4i.

STT Mô hình 3D-Pharmacophore Số lượng chất
1 Ph-TLR4i (F1, F2, F3, F4, F5, F6) 0
2 Ph-TLR4i (F2, F3, F4, F5, F6) 14
3 Ph-TLR4i (F1, F3, F4, F5, F6) 4
4 Ph-TLR4i (F1, F2, F4, F5, F6) 351
5 Ph-TLR4i (F1, F2, F3, F5, F6) 64
6 Ph-TLR4i (F1, F2, F3, F4, F6) 1
7 Ph-TLR4i (F1, F2, F3, F4, F5) 55
Tổng 489
Xóa chất trùng 343
Druglike 240
Kết thúc quá trình sàng lọc thu được hai tập cơ sở dữ liệu tương ứng với hai mô hình
pharmacophore và tiến hành chuẩn bị docking phân tử.
29
3.3. KẾT QUẢ MÔ HÌNH MÔ TẢ DOCKING PHÂN TỬ

3.3.1. Mô hình mô tả docking phân tử
3.3.1.1. Mô hình mô tả docking phân tử lên bề mặt dimer hóa của thụ thể MD2
Mô hình mô tả phân tử docking các chất lên bề mặt dimer hóa của MD2 được thực
hiện bằng phần mềm LeadIT 2.1.8. Tại vị trí dimer hóa, các acid amin quan trọng
được lựa chọn để tạo khoang gắn kết. Kết quả được trình bày trong Hình 3.4.
Hình 3.4. Bề mặt khoang gắn kết chứa các acid amin quan trọng của MD2.
Hình 3.4 cho thấy khoang gắn kết nông, uốn lượn và không liên tục do các acid amin
quan trọng được lựa chọn nằm ở hai cạnh của cửa đi vào túi kỵ nước của MD2. Nếu
các chất có thể dock vào khoang này và tương tác với các acid amin quan trọng thì
có khả năng ức chế sự dimer hóa giữa TLR4 và MD2.
3.3.1.2. Mô hình docking phân tử lên bề mặt dimer hóa của thụ thể TLR4
Khoang gắn kết của TLR4 được thể hiện như Hình 3.5, có thể thấy khoang gắn kết
nông do vị trí gắn kết nằm ở bề mặt lồi của TLR4. Các acid amin quan trọng như
Ser416, Asn417, Leu444, Phe463 nằm ở các góc lồi và các cạnh của khoang với mật
độ điện tích âm cao.
30
Hình 3.5. Bề mặt khoang gắn kết chứa các acid amin quan trọng của TLR4.
Nếu các chất sàng lọc được có khả năng gắn kết vào khoang này vào tạo được liên
kết với các acid amin quan trọng thì có tiềm năng ức chế hoạt tính TLR4.
3.3.2. Phân tích kết quả docking phân tử
3.3.2.1. Kết quả docking các chất lên bền mặt dimer hóa của thụ thể MD2
Từ 101 chất thu được từ kết quả sàng lọc qua mô hình 3D-pharmacophore, có 99 chất
dock thành công lên bề mặt dimer hóa của MD2 chiếm 98% và 2 chất không dock
được chiếm 2%. Tất cả các chất dock thành công có điểm số docking âm, trong đó
có một số chất có điểm số docking tốt nhất < -20 kJ/mol.
3%
Từ -30 đến -20

40% kJ/mol
Từ -20 đến -10
kJ/mol
Từ -10 đến 0 kJ/mol
56%
31
Hình 3.6 cho thấy chỉ có 3% tổng số các chất có điểm số docking từ -30 đến -20
kJ/mol, thể hiện khả năng gắn kết tốt, trong đó chất có điểm số docking tốt nhất là -
21,65 kJ/mol; 56% tổng số các chất có điểm số docking từ -20 đến -10 kJ/mol, thể
hiện khả năng gắn kết vừa phải; 40% tổng số các chất còn lại có khả năng gắn kết
kém với điểm số docking nhỏ hơn -10 kJ/mol. Từ kết quả cho thấy vì bề mặt của vị
trí gắn kết trên thụ thể MD2 nông nên không có chất nào có khả năng gắn kết rất tốt
cũng như chỉ có 3% các chất gắn kết tốt.
80 75
70 63
60 53
Phần trăm
50
40 32
30
20 13
7
10 2 1
0
Acid amin
Hình 3.7. Biểu đồ tỷ lệ các chất tạo tương tác với các acid amin tại bề mặt gắn kết của
MD2.
Hình 3.7 chỉ ra tỷ lệ các chất tạo được liên kết với các acid amin trong bề mặt liên
kết của MD2. Trong đó, Lys125, một trong những acid amin quan trọng tạo được
tương tác nhiều nhất với 75% tổng số các chất dock thành công. Bên cạnh đó, các
chất tạo tương tác với Ile124 và Phe126 cũng chiếm tỷ lệ khá cao tương ứng với 63%
và 53%. Các acid amin quan trọng còn lại tạo được ít tương tác với các chất.
32
50
45
40
35
Tần suất
30
25
20 Liên kết aren-aren
15 Liên kết ion
10
Liên kết hydro
5
0
Ser122
Gly123
Phe121
Lys125
Phe126
Ser127
Val82
Pro157
Leu54
Lys55
Leu87
Pro88
Lys89
Lys91
Ile124
His155
Met85
Arg90
Acid amin
Hình 3.8. Biểu đồ tần suất tạo liên kết của các acid amin tại khoang gắn kết của MD2.
Hình 3.8 cho thấy các acid amin quan trọng Ile124, Lys125, Phe126 đều có tần suất
tạo liên kết cao, trong đó liên kết hydro chiếm phần lớn.
Nghiên cứu tiến hành phân tích tương tác của các chất có điểm số docking tốt với
nhất với các acid amin trong bề mặt gắn kết, đặc biệt với các acid amin quan trọng.
ZINC14793499
Hình 3.9. Sự tương tác giữa ZINC14793499 và khoang gắn kết MD2 (-21,65 kJ/mol).
ZINC14793499 là chất có điểm số docking tốt nhất là -21,65 kJ/mol do tạo được
nhiều liên kết với các acid amin, trong đó có các acid amin quan trọng. O là nhóm
nhận hydro từ Lys125 và Phe126, trong đó liên kết hydro với N trong Phe là mạnh
nhất với. Bên cạnh đó còn có hai tương tác kỵ nước với Ile124 và Lys55.
33
ZINC58997973
ZINC58997973 có điểm số docking tốt thứ 2 do là -20,65 kJ/mol tạo được nhiều liên
kết với các acid amin, trong đó có các acid amin quan trọng. Cụ thể phối tử tạo được
5 liên kết hydro với các acid amin Ile124, Phe126, His155, trong đó 2 liên kết hydro
với Ile là mạnh nhất. Ngoài ra, phối tử còn tạo được 4 liên kết aren-aren với vị trí gắn
kết (Lys125, Phe126).
ZINC20834762
ZINC20834762 có điểm số docking đứng thứ 3 là -20,64 kJ/mol với do tạo được
nhiều liên kết hydro với vị trí gắn kết. Cụ thể, phối tử tạo được 6 liên kết hydro với
các acid amin Lys125, Phe 126, đều là hai acid amin này đều là acid amin quan trọng.
34
ZINC58998032
ZINC58998032 có điểm số docking thứ 4 là -19,42 kJ/mol do tạo được nhiều liên kết
hydro và kỵ nước với khoang gắn kết gồm Lys55, Ile124, Phe126, His155, Asn158.
Trong đó, Ile124 là acid amin quan trọng tạo được 3 liên kết hydro với vai trò là cả
nhóm cho và nhóm nhận. Phe126 đóng tạo được cả liên kết hydro và kỵ nước đối với
phối tử.
ZINC20832594
ZINC20832594 là chất có điểm số docking thứ 5 là -19,28 kJ/mol do cũng tạo được
nhiều liên kết với các acid amin như Leu54, Lys125, Phe126. Phe126 tạo được 3 liên
kết hydro và Lys125 tạo được liên kết hydro và kỵ nước.
35
Qua kết quả phân tích, 5 chất có điểm số docking tốt nhất đều tạo được liên kết với
khoang gắn kết đặc biệt là tạo được liên kết với các acid amin quan trọng gồm Ile124,
Lys125, Phe126. Các acid amin quan trọng khác không tạo được liên kết với các phối
tử này.
Năm chất này được tiến hành mô tả động lực học phân tử trên MD2.
3.3.2.2. Kết quả docking các chất lên bề mặt dimer hóa của thụ thể TLR4
Từ 240 chất thu được từ kết quả sang lọc qua mô hình 3D-pharmacophore, có 231
chất dock thành công lên bề mặt dime hóa của TLR4 chiếm khoảng 96% và 9 chất
dock không thành công chiếm 4%. Phần lớn các chất có điểm số docking âm, các
chất có điểm số docking tốt nhất dao động khoảng -15 kJ/mol.
10%
21%
Từ -20 đến -10 kJ/mol

Từ -10 đến 0 kJ/mol
> 0 kJ/mol
69%
Hình 3.14 cho thấy không có chất nào có điểm số docking từ -30 đến -20 kJ/mol;
khoảng 21% tổng số các chất có điểm số docking từ -20 đến -10 kJ/mol, thể hiện khả
năng gắn kết vừa phải, trong đó chất có điểm số docking tốt nhất là -15,69 kJ/mol;
các chất còn lại có khả năng gắn kết kém lên bề mặt dimer hóa của TLR4. Từ kết quả
cho thấy vì bề mặt của vị trí gắn kết trên thụ thể TLR4 nông, không có các khoang
gắn kết sâu do vị trí gắn kết có bề mặt lồi.
36
90
80
80
65 68
70
60
Phần trăm
50
40 36
30 25
20 16
10
0
Acid amin
Hình 3.15. Biểu đồ tỷ lệ các chất tạo tương tác với các acid amin tại bề mặt gắn kết của
TLR4.
Hình 3.15 chỉ ra tỷ lệ các chất tạo được liên kết với các acid amin trong bề mặt liên
kết của MD2. Trong đó, các acid amin tạo được liên kết với các chất có tỷ lệ cao nhất
đều là các acid amin quan trọng gồm Asn417, Leu439, Phe440 tương ứng với 65%,
68%, 80%. Các acid amin quan trọng còn lại Ser416, Leu444, Phe463 có tạo được
liên kết với các chất nhưng với tỷ lệ thấp hơn.
37
Hình 3.16. Biểu đồ tần suất tạo liên kết của các acid amin tại bề mặt dimer hóa của MD2.
Hình 3.16 cho thấy acid amin quan trọng Asn417 và Leu439 tạo được liên kết với tần
suất cao nhất, trong đó phần lớn tạo được liên kết hydro và chỉ có Leu439 tạo được
liên kết ion.
Tiến hành phân tích tương tác của các chất có điểm số docking tốt nhất với các acid
amin trong bề mặt gắn kết, đặc biệt với các acid amin quan trọng. Kết quả đánh giá
được trình Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Sự tương tác của các chất có điểm số docking tốt nhất lên TLR4.
Tên hợp chất Điểm số docking Acid amin tương tác
(kJ/mol)
ZINC17042759 -15,68 Ser415, Asn417, Gln436
ZINC24023318 -15,31 Ser415, Ser416, Asn417,

Glu439, Ser441
ZINC01879799 -14,56 Ser416, Asn417, Glu439
ZINC17042804 -13,92 Ser415, Asn417, Glu439
ZINC09597615 -13,80 Ser415, Asn417, Leu444,

Phe440
*Acid amin in đậm là các acid amin quan trọng.
Từ kết quả phân tích Bảng 3.4, năm chất có điểm số docking tốt nhất đều tạo được
tương tác với các acid amin quan trọng. ZINC17042759 mặc dù có điểm số docking
tốt nhất nhưng chỉ tạo được một liên kết với Asn417; trong khi đó ZINC24023318,
38
ZINC09597615 tạo được nhiều tương tác nhất với các acid amin quan trọng trong khoang gắn
kết.
3.4. KẾT QUẢ MÔ PHỎNG ĐỘNG LỰC HỌC PHÂN TỬ
Tiến hành mô phỏng động lực học phân tử năm chất có điểm số docking tốt nhất lên
bề mặt dimer hóa của MD2 nhằm đánh giá và phân tích độ ổn định của phức hợp
protein-phối tử. Quá trình mô phỏng động lực học phân tử được tiến hành với thời
gian 20 ns bằng phần mềm GROMACS 2018. Bên cạnh đó, thụ thể MD2 không gắn
kết với phối tử (apoprotein) cũng được tiến hành mô phỏng động lực học phân tử
riêng lẻ với các điều kiện, thông số tương tự với phức hợp nhằm cung cấp các dữ liệu
để so sánh đối chiếu về chuyển động của protein khi gắn kết với phối tử.
3.4.1. Độ ổn định của MD2 trong quá trình mô phỏng động lực học
Đánh giá độ ổn định của thụ thể MD2 trong các phức hợp với phối tử thông qua giá
trị RMSD của khung và so sánh với apo-protein tham chiếu. Giá trị RMSD được ghi
nhận trong suốt thời gian của quá trình mô phỏng động lực học là 20 ns như biểu đồ
Hình 3.17.
Hình 3.17. Biểu đồ giá trị RMSD của MD2 riêng lẻ cũng như protein này trong các phức
hợp.
39
Hình 3.17 cho thấy trong thời gian 20ns mô phỏng động lực học phân tử, giá trị
RMSD của apo-protein tăng liên tục từ 0 đến 0,4 nm trong khoảng 7 ns đầu tiên. Từ
khoảng thời gian này đến khi kết thúc quá trình mô phỏng động lực học thì giá trị
RMSD có biên độ dao động khoảng 0,1 nm xung quanh giá trị trung bình 0,35 nm,
cho thấy cấu trúc thụ thể MD2 có xu hướng ổn định từ ns thứ 7. Cấu trúc protein
trong phức hợp với phối tử ZINC14793499, ZINC58997973 và ZINC58998032 có
xu hướng bắt đầu ổn định từ khoảng 3ns đến khi kết thúc quá trình mô phỏng động
lực học với dao động khoảng 0,1 nm xung quanh giá trị trung bình tương ứng là 0,3
ns, 0,25 ns và 0,3 ns. Cấu trúc protein trong phức hợp với phối tử ZINC20834762 và
ZINC20832594 có xu hướng bắt đầu ổn định từ 7 ns với khoảng dao động 0,1 nm
xung quanh giá trị trung bình tương ứng 0,35 và 0,3 nm.
Kết quả cho thấy, cấu trúc thụ thể MD2 trong các phức hợp đều có xu hướng ổn định
hơn trong quá trình mô phỏng động lực học so với apo-protein.
3.4.2. Độ ổn định của tại vị trí gắn kết giữa MD2 với các phối tử
Giá trị RMSF được sử dụng để đánh giá độ linh động cũng như ổn đinh của các acid
amin trong protein và so sánh với apo-protein tham chiếu. Giá trị RMSF được tính
dựa trên Cα của các acid amin trong chuỗi MD2 (từ acid amin 19 đến 158) và được
hiển thị ở biểu đồ Hình 3.18.
Hình 3.18. Giá trị RMSF của apo-protein và của protein trong các phức hợp với phối tử.
40
Trên biểu đồ này, các đỉnh biểu thị các vùng protein dao động nhiều nhất trong quá
trình mô phỏng. Thông thường, bạn sẽ quan sát thấy đầu N và C dao động nhiều hơn
bất kỳ phần nào khác của protein. Các yếu tố cấu trúc thứ cấp như chuỗi xoắn α và
chuỗi β thường cứng hơn phần không cấu trúc của protein và do đó dao động ít hơn
các vùng vòng.
Tại vị trí gắn kết, giá trị RMSF của các phức hợp dao động lớn hơn RMSF của apo-
protein, nguyên nhân có thể do tại vị trí gắn kết tương tác với phối tử tạo sự thay đổi
tại vị trí ấy.
3.4.3. Độ ổn định của phối tử trong quá trình mô phỏng động lực học phân tử
Giá trị RMSD cũng được sử dụng để đánh giá độ ổn định của phối tử trong phức hợp
trong quá trình mô phỏng động lực học. Giá trị RMSD của phối tử được thể hiện
trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Giá trị RMSD của các phối tử trong các phức hợp.
Tên hợp chất RMSD của phổi tử (đỏ) và protein (đen) trong
phức hợp
ZINC14793499
41
ZINC58997973
ZINC20834762
ZINC58998032
42
ZINC20832594
Từ kết quả Bảng 3.5, ZINC58997973 có độ ổn định tốt với sự ổn định ngay từ khoảng
2ns đến khi kết thúc quá trình mô phỏng động lực học, với khoảng dao động của
RMSD nhỏ 0,05 nm xung quanh giá trị trung bình 0,25 nm.
Tiếp theo, ZINC14793499, ZINC58998032 đều có giá trị RMSD dao động khoảng
0,1 nm xung quanh giá trị trung bình 0,1 nm trong suốt 20 ns, cho thấy cả hai chất
này đều ổn định trong quá trình mô phỏng động lực học.
Cuối cùng, biểu đồ giá trị RMSD của ZINC20832594 cho thấy chất này bắt đầu ổn
định từ 15 ns đến khi kết thúc. Còn ZINC20834762 có giá trị RMSD dao động lớn
và không xung quanh giá trị trung bình nào. Cả 2 chất này cần thời gian mô phỏng
động lực học dài hơn, có thể 40 ns hoặc 50 ns để có kết luận về độ ổn định của phối
tử chính xác hơn.
3.4.4. Tương tác giữa protein và phối tử
Tần suất biểu hiện liên kết hydro giữa các phối tử và thụ thể MD2 được xác định
bằng phần mềm VMD, với ngưỡng xác định khoảng cách giữa nhóm cho và nhóm
nhận ≤ 3,2 Å, góc D-H-A ≥ 130o, Bảng 3.6 tần suất liên kết hydro ở mỗi phức hợp.
Bảng 3.6. Tần suất biểu hiện liên kết hydro giữa phối tử và protein
Phức hợp protein Nhóm cho liên kết Nhóm nhận liên Tần suất tạo liên
với phối tử hydro kết hydro kết hydro (%)
ZINC14793499 Ser57-Main LID-Main 70,78

LIG-Side Ile124-Main 13,69
Phe126-Main LIG-Side 11,04
Lys58-Side LIG-Side 10,89
43
ZINC58997973 LIG-Side Ile124-Main 97,20

LIG-Side Lys122-Main 79,82
LIG-Side Glu92-Side 51,57
Phe126-Side LIG-Side 26,87
ZINC20834762 Tyr131-Side LIG-Side 57,84

LIG-Side Leu54-Main 28,37
LIG-Side Asp29-Side 14,94
LIG-Side Phe126-Side 12,04
ZINC58998032 LIG-Side Pro88-Main 63,99

LIG-Side Leu54-Main 38,96
LIG-Side Ile124-Main 29,92
LIG-Side Lys122-Main 27,82
ZINC20832594 LIG-Side Phe126-Main 31,17

LIG-Side Asn83-Main 26,07
Ser127-Side LIG-Side 23,93
LIG-Side Ser127-side 22,93
*Acid amin quan trọng được in đậm.

Tất cả các phối tử đều tạo được liên kết hydro với vị trí gắn kết trên MD2, đặc biệt là
có các acid amin quan trọng Ile124 và Phe126. Trong đó, ZINC14793499,
ZINC58997973 tạo được liên kết hydro với cả hai acid amin quan trọng này. Số liên
kết hydro hình thành giữa ligand và phối tử được hiển thị tại PHỤ LỤC 1.
3.5. NĂNG LƯỢNG GẮN KẾT TỰ DO
Kết quả tính năng lượng gắn kết tự do và các năng lượng thành phần được trong suốt
20 ns mô phỏng động lực học được trình bày trong Bảng 3.7.
44
Bảng 3.7. Năng lượng gắn kết tự do của các phối tử với protein.
Phức hợp EvdW Etĩnh điện Gkhông phân cực Gphân cực ∆Ggắn kết
(kJ/mol) (kJ/mol) (kJ/mol) (kJ/mol) (kJ/mol)
ZINC147934 -194,2 ± 0,3 -37,6 ± 0,5 -20,2 ± 0,1 153,3 ± 0,7 -98,8 ± 0,4
99
ZINC589979 -203,9 ± 0,4 -68,7 ± 0,5 -22,1 ± 0,1 187,6 ± 0,6 -107,1 ± 0,4
73
ZINC208347 -104,5 ± 0,4 -36,9 ± 0,4 -11,3 ± 0,1 119,9 ± 0,8 -32,8± 0,6
62
ZINC589980 -224,2 ± 0,4 -67,3 ± 0,5 -21,9 ± 0,1 195,3 ± 0,5 -118,1 ± 0,4
32
ZINC208325 -100,6 ± 0.6 -27,8 ± 0,4 -11,9 ± 0,1 95,3 ± 0,7 -45,1 ± 0,7
94
Từ kết quả cho thấy, tất cả các phức hợp đều có giá trị năng lượng gắn kết tự do âm
và phần lớn được đóng góp từ năng lượng của liên kết van der Waals, thể hiện ái lực
tốt của phối tử đối với thụ thể MD2. Độ ổn định của quá trình gắn kết được hiển thị
dưới dạng biểu đồ trong Bảng 3.8.
45
Bảng 3.8. Biểu đồ năng lượng gắn kết tự do theo thời gian của các phức hợp.
Phức hợp của Biểu đồ

protein với
phối tử
ZINC14793499 50
0
0 5 10 15 20
-50
-100
-150
-200
ZINC58997973 0
-20 0 5 10 15 20
-40
-60
-80
-100
-120
-140
-160
-180
ZINC20834762 100
80
60
40
20
0
-20 0 5 10 15 20
-40
-60
-80
-100
-120
46
ZINC58998032 0
-20 0 5 10 15 20
-40
-60
-80
-100
-120
-140
-160
-180
-200
ZINC20832594 120
100
80
60
40
20
0
-20 0 5 10 15 20
-40
-60
-80
-100
-120
Trong đó, ZINC58998032 có năng lượng gắn kết tự do tốt. Độ ổn định của quá trình
gắn kết được thể hiện ở Bảng 3.8. Phối tử bắt đầu gắn kết với thụ thể từ lúc bắt đầu
cho đến khi kết thúc quá trình mô phỏng động lực học. Từ 0 đến 5 ns, năng lượng
gắn kết giảm dần từ khoảng -80 đến -120 kJ/mol, cho thấy phối tử có ái lực tốt với
protein ngay từ đầu và ngày càng gắn kết mạnh hơn với protein. Từ khoảng thời gian
này cho đến khi kết thúc, năng lượng liên kết ít dao động và dao động xung quanh -
120 kJ/mol, cho thấy phối tử có khả năng gắn kết tốt và ổn định lên MD2.
Chất có năng lượng gắn kết tự do tốt thứ 2 là ZINC58997973. Độ dao động của năng
lượng gắn kết tự do được thể hiện ở Bảng 3.8. Phối tử gắn kết tốt với thụ thể MD2 từ
lúc bắt đầu quá trình mô phỏng động lực học. Từ 1 đến 10 ns đầu tiên, năng lượng
dao động ổn định quanh -100 kJ/mol. Từ 10 đến 20 ns, năng lượng dao động khoảng
-120 kJ/mol, cho thấy phối tử có khả năng gắn kết tốt và ổn định lên MD2.
ZINC14793499 là chất có năng lượng gắn kết tự do tốt thứ 3. Biểu đồ năng lượng
theo thời gian cho thấy, mặc dù có những khoảng thời gian có dao động lớn nhưng
47
xảy ra ở khoảng thời gian ngắn. Nhìn chung, phối tử gắn kết tốt với protein và năng
lượng dao động quanh -100 kJ/mol.
ZINC20834762, ZINC20832594 có năng lượng gắn kết tự do thấp nhất.
ZINC20834762 có biến thiên năng lượng rộng, có những khoảng thời gian phối tử
không liên kết với thụ thể. Về ZINC20832594, sự gắn kết của phối tử lên protein ổn
định ở khoảng 7ns đầu tiên và 14 ns đến khi kết thúc quá trình, khoảng thời gian còn
lại sự gắn kết của phối tử không ổn định và có những lúc không liên kết.
3.6. BÀN LUẬN
3.6.1. Nhận xét kết quả
Từ hai mô hình pharmacophore xây dựng được, tiến hành sàng lọc ảo qua thư viện
ZINC và mô hình mô phỏng docking phân tử, nghiên cứu sàng lọc ra được 99 và 231
chất dock thành công lên vị trí gắn kết của MD2 và TLR4 tương ứng.
Với điểm số docking tốt nhất và hình thành được tương tác với các acid amin quan
trọng trong khoang gắn kết, 5 chất ZINC14793499, ZINC58997973, ZINC20834762,
ZINC58998032, ZINC20832594 được chọn để tiến hành mô phỏng động lực học
phân tử và ước tính năng lượng gắn kết tự do. Kết quả cho thấy ZINC14793499,
ZINC58997973, ZINC58998032 được xem là các chất có tiềm năng nhất trong việc
ức chế hoạt tính sinh học TLR4 khi có năng lượng gắn kết tự do tốt nhất, quá trình
mô phỏng động lực học tương đối ổn định và có liên kết với các acid amin quan trọng.
3.6.2. So sánh với các nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay trên thế giới, các nghiên cứu in silico về các phân tử nhỏ ức chế hoạt tính
sinh học của TLR4 còn hạn chế. Một số nghiên cứu tận dụng những chất biết trước
có khả năng ức chế hoạt tính, sau đó tiến hành tối ưu hóa công thức. Các công thức
được tối ưu hóa tiến hành mô phỏng docking phân tử và mô phỏng động lực học phân
tử để tìm ra những chất có khả năng gắn kết tốt và ổn định.
Một nghiên cứu của nhóm tác giả Ấn Độ vào năm 2018 thực hiện nghiên cứu in silico
để tìm ra các phân tử nhỏ ức chế hoạt tính TLR4 bằng cách xây dựng mô hình 3D-
pharmacophore, mô phỏng docking phân tử, mô phỏng động học phân tử. Kết quả
thu được 2 “hit” có điểm số docking tốt, ổn định trong quá trình mô phỏng động lực
học, khả năng gắn kết lên cả TLR4 và MD2 tại bề mặt tương tác chính và bề mặt
dimer hóa. Các chất này chưa được tiến hành ước tính năng lượng gắn kết tự do để
đánh giá khả năng gắn kết [49].
Đề tài này cũng nghiên cứu các phân tử nhỏ ức chế bằng phương pháp tương tự, tìm
ra các chất có khả năng gắn kết lên TLR4 hoặc MD2 tại bề mặt dimer hóa. Kết quả
48
cuối cùng tìm được 3 “hit” có khả năng gắn kết tốt và ổn định. Kết quả mang tính khả
thi, chính xác cao hơn do thực hiện ước tính năng lượng gắn kết tự do.
Điểm giống: cả hai nghiên cứu đều tập trung nghiên cứu các phân tử nhỏ có khả năng
ức chế tương tác protein-protein (SMPPII).
Điểm khác nhau giữa các kết quả tìm của 2 nghiên cứu được trình bày trong
Bảng 3.9. Sự khác nhau giữa kết quả của hai nghiên cứu
Đề tài Nghiên cứu Ấn Độ
Vị Bề mặt dimer hóa của MD2 Bề mặt tương tác chính giữa
trí TLR4 và MD2
gắn Bề mặt dimer hóa giữa TLR4 và
kết MD2
Cấu
trúc
các
“hit”
49
Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Kết luận và đề nghị
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Nghiên cứu các chất phân tử nhỏ ức chế hoạt tính sinh học của TLR4 vẫn đang là
mục tiêu hấp dẫn của nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới do tính quan trọng và đa
nhiệm của TLR4 trong hệ thống miễn dịch và hiện nay trên thị trường vẫn chưa có
thuốc ức chế TLR4. Đề tài này bước đầu tìm được các chất có khả năng ức chế hoạt
tính sinh học của TLR4 nhờ phương pháp nghiên cứu in silico.
Đề tài “Nghiên cứu và sàng lọc ảo các phân tử nhỏ có khả năng ức chế họat tính sinh
học TLR4” thực hiện các phương pháp nghiên cứu in silico để tìm ra các chất có tiền
năng ức chế hoạt tính sinh học TLR4. Các phương pháp sử dụng bao gồm: xây dựng
mô hình 3D-pharmacophore, sàng lọc qua mô hình ZINC, mô hình mô tả docking
phân tử, mô phỏng động lực học phân tử và tính năng lượng gắn kết tự do. Từ hai mô
hình 3D-pharmacophore xây dựng được, sàng lọc qua thư viện ZINC và mô hình mô
tả docking phân tử thu được 99 và 231 chất có dock thành công lên MD2 và TLR4
tương ứng. Năm chất có điểm số docking tốt nhất lên MD2 được lựa chọn tiến hành
mô phỏng động lực học phân tử và tính năng lượng gắn kết tự do. Kết quả cuối cùng
thu được ZINC14793499, ZINC58997973, ZINC58998032 là ba chất có tiềm năng
gắn kết với MD2 do có năng lượng gắn kết tốt nhất, ổn định trong quá trình mô phỏng
động lực học và tương tác với các acid amin quan trọng.
Để tiến xa hơn trong việc nghiên cứu các chất phân tử nhỏ có khả năng cứ chế hoạt
tính TLR4, nghiên cứu đưa ra những đề nghị sau:
- Thử nghiệm in vitro để xác định hoạt tính sinh học thực sự từ kết quả thu được.
- Tiến hành mô phỏng động lực học phân tử và ước tính năng lượng gắn kết tự do các
chất có điểm số docking tốt nhất và tương tác với các acid amin quan trọng được sàng
lọc từ mô hình Ph-TLR4i.
50
Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tài liệu tham khảo
TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] El-Zayat S. R., Sibaii H. , Mannaa F. A. (2019), "Toll-like receptors activation,
signaling, and targeting: an overview", 43 (1), 187.
[2] Tafazzol A. , Duan Y. J. (2019), "Key residues in TLR4-MD2 tetramer formation
identified by free energy simulations", 15 (10), e1007228.
[3] Roger T., Froidevaux C., Le Roy D. et al. (2009), "Protection from lethal gram-
negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4", 106 (7), 2348-2352.
[4] Zhang S. (2011), "Computer-aided drug discovery and development", Drug
Design and Discovery, Springer, pp.23-38.
[5] Takeuchi O., Kawai T., Mühlradt P. F. et al. (2001), "Discrimination of bacterial
lipoproteins by Toll-like receptor 6", 13 (7), 933-940.
[6] Takeuchi O., Sato S., Horiuchi T. et al. (2002), "Cutting edge: role of Toll-like
receptor 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins", 169 (1), 10-14.
[7] Hutchings M. I., Palmer T., Harrington D. J. et al. (2009), "Lipoprotein biogenesis
in Gram-positive bacteria: knowing when to hold ‘em, knowing when to fold ‘em",
17 (1), 13-21.
[8] Kim H. M., Park B. S., Kim J.-I. et al. (2007), "Crystal structure of the TLR4-
MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran", 130 (5), 906-917.
[9] Kobe B. , Kajava A. V. J. (2001), "The leucine-rich repeat as a protein recognition
motif", 11 (6), 725-732.
[10] Park B. S., Song D. H., Kim H. M. et al. (2009), "The structural basis of
lipopolysaccharide recognition by the TLR4–MD-2 complex", 458 (7242), 1191-
1195.
[11] Akira S. , Takeda K. (2004), "Toll-like receptor signalling", Nat Rev Immunol,
4 (7), 499-511.
[12] Mineev K. S., Goncharuk S. A., Goncharuk M. V. et al. (2017), "Spatial structure
of TLR4 transmembrane domain in bicelles provides the insight into the receptor
activation mechanism", Scientific Reports, 7 (1), 6864.
[13] Ohto U., Fukase K., Miyake K. et al. (2007), "Crystal structures of human MD-
2 and its complex with antiendotoxic lipid IVa", 316 (5831), 1632-1634.
[14] Maeshima N., Fernandez R. J. (2013), "Recognition of lipid A variants by the
TLR4-MD-2 receptor complex", Microbiology, 3 , 3.
[15] Raetz C. R. , Whitfield C. J. (2002), "Lipopolysaccharide endotoxins", 71 (1),

635-700.
[16] Trent M. S., Stead C. M., Tran A. X. et al. (2006), "Invited review: diversity of
endotoxin and its impact on pathogenesis", 12 (4), 205-223.
[17] Pugin J. M., Schürer-Maly C., Leturcq D. et al. (1993), "Lipopolysaccharide
activation of human endothelial and epithelial cells is mediated by
lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD14", 90 (7), 2744-2748.
[18] Chow J. C., Young D. W., Golenbock D. T. et al. (1999), "Toll-like receptor-4
mediates lipopolysaccharide-induced signal transduction", 274 (16), 10689-10692.
[19] Lu Y.-C., Yeh W.-C. , Ohashi P. C. (2008), "LPS/TLR4 signal transduction
pathway", 42 (2), 145-151.
[20] Kuzmich N. N., Sivak K. V., Chubarev V. N. et al. (2017), "TLR4 signaling
pathway modulators as potential therapeutics in inflammation and sepsis", 5 (4), 34.
[21] Velayudham A., Hritz I., Dolganiuc A. et al. (2006), "Critical role of toll-like
receptors and the common TLR adaptor, MyD88, in induction of granulomas and
liver injury", 45 (6), 813-824.
[22] Cunningham P. N., Wang Y., Guo R. et al. (2004), "Role of Toll-like receptor 4
in endotoxin-induced acute renal failure", 172 (4), 2629-2635.
[23] Schuster J. M. , Nelson P. S. J. J. o. L. B. (2000), "Toll receptors: an expanding
role in our understanding of human disease", 67 (6), 767-773.
[24] Singer M., Deutschman C. S., Seymour C. W. et al. (2016), "The third
international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3)", 315 (8),
801-810.
[25] Fleischmann C., Scherag A., Adhikari N. K. et al. (2016), "Assessment of global
incidence and mortality of hospital-treated sepsis. Current estimates and limitations",
193 (3), 259-272.
[26] Guha M. , Mackman N. (2001), "LPS induction of gene expression in human
monocytes", Cell Signal, 13 (2), 85-94.
[27] Smiley S. T., King J. A. , Hancock W. W. (2001), "Fibrinogen stimulates
macrophage chemokine secretion through toll-like receptor 4", J Immunol, 167 (5),
2887-2894.
[28] Watari M., Watari H., Nachamkin I. et al. (2000), "Lipopolysaccharide Induces
Expression of Genes Encoding Pro-Inflammatory Cytokines and the Elastin-
Degrading Enzyme, Cathepsin S, in Human Cervical Smooth-Muscle Cells", The

Journal of the Society for Gynecologic Investigation: JSGI, 7 (3), 190-198.
[29] Leon C. G., Tory R., Jia J. et al. (2008), "Discovery and development of toll-like
receptor 4 (TLR4) antagonists: a new paradigm for treating sepsis and other
diseases", Pharm Res, 25 (8), 1751-1761.
[30] Tsung A., Hoffman R. A., Izuishi K. et al. (2005), "Hepatic ischemia/reperfusion
injury involves functional TLR4 signaling in nonparenchymal cells", J Immunol, 175
(11), 7661-7668.
[31] Kaczorowski D. J., Nakao A., Vallabhaneni R. et al. (2009), "Mechanisms of
Toll-like receptor 4 (TLR4)-mediated inflammation after cold ischemia/reperfusion
in the heart", Transplantation, 87 (10), 1455-1463.
[32] Simpson J. L., Grissell T. V., Douwes J. et al. (2007), "Innate immune activation
in neutrophilic asthma and bronchiectasis", Thorax, 62 (3), 211-218.
[33] Baumgarten G., Knuefermann P., Wrigge H. et al. (2006), "Role of Toll-like
receptor 4 for the pathogenesis of acute lung injury in Gram-negative sepsis", 23 (12),
1041-1048.
[34] Molteni M., Bosi A. , Rossetti C. (2018), "Natural Products with Toll-Like
Receptor 4 Antagonist Activity", Int J Inflam, 2018, 2859135.
[35] Takashima K., Matsunaga N., Yoshimatsu M. et al. (2009), "Analysis of binding
site for the novel small-molecule TLR4 signal transduction inhibitor TAK-242 and
its therapeutic effect on mouse sepsis model", Br J Pharmacol, 157 (7), 1250-1262.
[36] Sha T., Sunamoto M., Kitazaki T. et al. (2007), "Therapeutic effects of TAK-
242, a novel selective Toll-like receptor 4 signal transduction inhibitor, in mouse
endotoxin shock model", Eur J Pharmacol, 571 (2-3), 231-239.
[37] Hua F., Tang H., Wang J. et al. (2015), "TAK-242, an antagonist for Toll-like
receptor 4, protects against acute cerebral ischemia/reperfusion injury in mice", J
Cereb Blood Flow Metab, 35 (4), 536-542.
[38] Kuno M., Nemoto K., Ninomiya N. et al. (2009), "The novel selective toll-like
receptor 4 signal transduction inhibitor tak-242 prevents endotoxaemia in conscious
Guinea-pigs", Clin Exp Pharmacol Physiol, 36 (5-6), 589-593.
[39] Gárate I., García-Bueno B., Madrigal J. L. et al. (2014), "Toll-like 4 receptor
inhibitor TAK-242 decreases neuroinflammation in rat brain frontal cortex after
stress", J Neuroinflammation, 11, 8.
[40] Bennett-Guerrero E., Grocott H. P., Levy J. H. et al. (2007), "A phase II, double-
blind, placebo-controlled, ascending-dose study of Eritoran (E5564), a lipid A
antagonist, in patients undergoing cardiac surgery with cardiopulmonary bypass",
Anesth Analg, 104 (2), 378-383.
[41] Barochia A., Solomon S., Cui X. et al. (2011), "Eritoran tetrasodium (E5564)
treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies", Expert Opin Drug
Metab Toxicol, 7 (4), 479-494.
[42] Tidswell M. , LaRosa S. P. (2011), "Toll-like receptor-4 antagonist eritoran
tetrasodium for severe sepsis", Expert Rev Anti Infect Ther, 9 (5), 507-520.
[43] Rice T. W., Wheeler A. P., Bernard G. R. et al. (2010), "A randomized, double-
blind, placebo-controlled trial of TAK-242 for the treatment of severe sepsis", Crit
Care Med, 38 (8), 1685-1694.
[44] Opal S. M., Laterre P. F., Francois B. et al. (2013), "Effect of eritoran, an
antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS
randomized trial", Jama, 309 (11), 1154-1162.
[45] Tidswell M., Tillis W., Larosa S. P. et al. (2010), "Phase 2 trial of eritoran
tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis",
Crit Care Med, 38 (1), 72-83.
[46] Lipinski C. A., Lombardo F., Dominy B. W. et al. (2001), "Experimental and
computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery
and development settings", Adv Drug Deliv Rev, 46 (1-3), 3-26.
[47] MacLeod J. M. , Rosei F. (2011), "3.02 - Directed Assembly of Nanostructures",
trong Andrews David L., Scholes Gregory D. và Wiederrecht Gary P., chủ biên,
Comprehensive Nanoscience and Technology, Academic Press, Amsterdam, pp.13-
68.
[48] Rungrotmongkol T., Nunthaboot N., Malaisree M. et al. (2010), "Molecular
insight into the specific binding of ADP-ribose to the nsP3 macro domains of
chikungunya and venezuelan equine encephalitis viruses: Molecular dynamics
simulations and free energy calculations", Journal of Molecular Graphics and
Modelling, 29 (3), 347-353.
[49] Mishra V., Pathak C. (2019), "Structural insights into pharmacophore-assisted
in silico identification of protein–protein interaction inhibitors for inhibition of
human toll-like receptor 4 – myeloid differentiation factor-2 (hTLR4−MD-2)
complex", Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 37 (8), 1968-1991.
Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1. Biểu đồ số liên kết hydro hình thành giữa protein và phối tử theo thời gian
Phức hợp Biểu đồ

protein với
phối tử
ZINC14793499 6
0
0 5 10 15 20
ZINC58997973 4
0
0 5 10 15 20
PL.1
ZINC20834762 6
0
0 5 10 15 20
ZINC58998032 7
0
0 5 10 15 20
ZINC20832594 6
0
0 5 10 15 20
PL.2
PL.3

khóa luận chính thức-Thái Ngọc Trâm

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

khóa luận chính thức-Thái Ngọc Trâm

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁI NGỌC TRÂM

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC ẢO CÁC PHÂN TỬ NHỎ CÓ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH - 2020

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁI NGỌC TRÂM

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC ẢO CÁC PHÂN TỬ NHỎ CÓ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. Lê Minh Trí

PGS. TS. Thái Khắc Minh

TP. Hồ Chí Minh - 2020

TP. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 08 năm 2020

GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA KHÓA LUẬN THEO Ý

Họ và tên sinh viên: Thái Ngọc Trâm

1. Chỉnh sửa các lỗi chính tả và format

Thái Ngọc Trâm

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2. THỤ THỂ GIỐNG TOLL 4

Hình 1.2. Cấu trúc vùng ngoại bào của TLR4.

1.2.1.2. Cấu trúc MD2

Hình 1.3. Cấu trúc MD2.

Hình 1.4. Cấu trúc phức hợp TLR4-MD2.

Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc cơ bản của lipopolysacarid.

Hình 1.8. Cấu trúc phức hợp TLR4-MD2-LPS.

Hình 1.9. Sự gắn kết LPS lên phức hợp TLR4-MD2.

1.2.5. Vai trò sinh học của TLR4

Hợp chất Kết quả thử nghiệm lâm sàng

TAK-242 Thử nghiệm ngẫu nhiên, mù đôi, có

Eritoran Giai đoạn 2 của các nghiên cứu mù đôi,

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Cấu trúc tinh thể phức hợp TLR4-

Mô hình 3D-pharmacophore MOE 2015.10

Sàng lọc qua thư viện ZINC ZINCPharmer

Mô hình mô tả docking phân tử LeadIT 2.8.1

Mô hình mô tả động lực học phân tử GROMACS 2018

Năng lượng gắn kết tự do g-mmpbsa

2.1. MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE

T: thời gian quỹ đạo mà RMSF được tính

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Hình 3.1. Bề mặt dimer hóa giữa TLR4 và MD2.

Tương tác Kỵ nước Hydro

Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc của mô hình Ph-MD2i.

Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc mô hình Ph-TLR4i.

3.3. KẾT QUẢ MÔ HÌNH MÔ TẢ DOCKING PHÂN TỬ

Từ -30 đến -20

Từ -20 đến -10 kJ/mol

ZINC17042759 -15,68 Ser415, Asn417, Gln436

ZINC24023318 -15,31 Ser415, Ser416, Asn417,

ZINC17042804 -13,92 Ser415, Asn417, Glu439

ZINC09597615 -13,80 Ser415, Asn417, Leu444,

ZINC14793499 Ser57-Main LID-Main 70,78

ZINC58997973 LIG-Side Ile124-Main 97,20

ZINC20834762 Tyr131-Side LIG-Side 57,84

ZINC58998032 LIG-Side Pro88-Main 63,99

ZINC20832594 LIG-Side Phe126-Main 31,17

*Acid amin quan trọng được in đậm.

Phức hợp của Biểu đồ

Đề tài Nghiên cứu Ấn Độ

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[15] Raetz C. R. , Whitfield C. J. (2002), "Lipopolysaccharide endotoxins", 71 (1),

Degrading Enzyme, Cathepsin S, in Human Cervical Smooth-Muscle Cells", The