NHẬN BIẾT NHÓM PHỤ LIÊN HỢP CỦA DÒNG NẤM Rhizoctonia solani

GÂY BỆNH CHÁY LÁ SẦU RIÊNG Ở BÌNH DƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT

GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG rDNA-ITS
IDENTIFICATION OF Rhizoctonia solani ISOLATE CAUSING FOLIAR
BLIGHT IN DURIAN IN BINH DUONG BY rDNA-ITS SEQUENCES
Từ Thị Mỹ Thuận, Bùi Cách Tuyến
Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Abstract
The rDNA-ITS sequence of an isolate of Rhizoctonia solani AG1 causing foliar
blight in durian (Durio zibethinus Murr.) in Binh Duong was determined and
compared to those of R. solani AG1-IA, AG1-IB, AG1-IC and AG1-ID. The 5.8S
rDNA gene sequence (155 bp) was highly conserved among all isolates but
differences in nucleotide sequence of the ITS1 and ITS2 regions were observed
between durian isolate and subgroups of R. solani AG1. The similarity of the
nucleotide sequence between durian isolate and AG1-ID isolates was 95.4-96.5% and
98.7-99.2% in the ITS1 and ITS2 regions, respectively. Sequence similarity of 76-
81%, 82-91% and 76-82% for the ITS (including ITS1, 5.8S and ITS2) region was
observed between durian isolate and AG1-IA, AG1-IB, AG1-IC isolates,
respectively. These results showed that the R. solani isolate causing foliar blight in
durian is AG1-ID.

1. Mở đầu
Rhizoctonia solani Kuhn [giai đoạn hữu tính là Thanatephorus cucumeris
(Frank) Donk] là loài nấm có tầm quan trọng về mặt kinh tế, gây hại cho nhiều
loại cây trồng. Dựa vào sự liên hợp của sợi nấm, R. solani được phân chia thành 13
nhóm liên hợp (Anastomosis Group –AG) từ AG1 đến AG13 (Carling và cs, 2002).
Trong số đó, AG1 bao gồm nhiều dòng phân lập gây bệnh cho nhiều cây trồng khác
nhau và được chia nhỏ thành 3 nhóm phụ dựa trên cây ký chủ ban đầu, triệu chứng
bệnh và đặc điểm nuôi cấy: AG1-IA (khô vằn lúa); AG1-IB (cháy mạng nhện) và
AG1-IC (chết rạp cây con) (Sneh và cs, 1991). Gần đây, một nhóm phụ mới, AG1-
ID, đã được đề nghị cho các dòng R. solani gây đốm cháy lá cà phê ở Philippines
(Priyatmojo và cs, 2001).
1
 Việc phân nhóm các dòng phân lập R. solani theo phản ứng liên hợp đã được
hỗ trợ bởi các bằng chứng phân tử, bao gồm phân tích trình tự vùng rDNA-ITS
(internal transcribed spacer). Kuninaga và cs (1997) đã giải trình tự vùng ITS của 45
dòng R. solani thuộc nhiều AG khác nhau và tìm thấy rằng các dòng phân lập của
mỗi AG tập hợp thành nhóm với nhau. Fenille và cs (2003), dựa trên mức độ tương
đồng về trình tự của vùng rDNA-ITS, đã chứng minh rằng những dòng R. solani ở
Brazil gây bệnh cháy lá đậu nành là AG1 IA và những dòng gây triệu chứng thối trụ
hạ diệp đậu nành là AG-4 HGI. Toda và cs (2004) khẳng định phân tích trình tự
rDNA-ITS là công cụ phân tử thích hợp nhất để nhận biết chính xác R. solani AG1-
ID và phân biệt các nhóm phụ trong R. solani AG1. Các kết quả này cho thấy phân
tích trình tự vùng ITS có thể được sử dụng để nhận biết nhóm phụ AG của R. solani.
Mục tiêu của nghiên cứu này là giải trình tự vùng rDNA-ITS của dòng R. solani gây
cháy lá sầu riêng ở Bình Dương để nhận biết nhóm phụ AG của nó dựa trên việc so
sánh trình tự đọc được với các số liệu có sẳn của các dòng R. solani khác trong cơ sở
dữ liệu của NCBI.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu
Lá sầu riêng bị bệnh cháy lá được thu thập ở huyện Phú Giáo tỉnh Bình
Dương. Nấm R. solani (ký hiệu SR650) được phân lập từ mô lá bị bệnh trên môi
trường WA 2%. Khuẩn lạc thuần nhận được bằng kỹ thuật cắt đầu sợi nấm và nuôi
trồng trên môi trường PDA.
Phương pháp
Thử nghiệm phản ứng liên hợp: Dòng nấm R. solani SR650 được nuôi cấy bắt cặp lần
lượt với các dòng tester của AG1-IA, 1-IB, 1-IC, 2-2 IIIB, 2-2 IV, 2-3, BI, 4, 5, 6 và
7 (do Giáo Sư H. Naito của trường Đại học Hokkaido, Nhật cung cấp) theo phương
pháp của Kronland và Stanghellini (1988). Sự liên hợp sợi nấm được quan sát dưới
kính hiển vi sau khi nhuộm sợi nấm với dung dịch Safranin O 0,03%. Thực hiện 3 lần
lặp lại cho mỗi tổ hợp bắt cặp. Phản ứng liên hợp được xem là dương tính khi hai sợi
nấm tiếp xúc nhau, sự hợp nhất của màng tế bào rõ, tế bào tại điểm liên hợp và các tế
bào lân cận chết.

2
Trích DNA tổng số : Nấm được nuôi trong môi trường lỏng PDB, lắc 150 vòng/phút ở
27-28oC trong 4 ngày. Khối sợi nấm được nghiền trong nitơ lỏng và DNA tổng số
được trích theo quy trình của Lee và Taylor (1990).
Khuếch đại vùng rDNA-ITS: phản ứng PCR được thực hiện với cặp primer ITS5 và
ITS4 (White và cs, 1990) để khuếch đại vùng ITS bao gồm 5.8S của gen rRNA nhân.
Thể tích phản ứng là 25µl có chứa chứa dung dịch đệm PCR 1x, MgCl2 1,5mM,
dNTPs 400µM, mỗi primer 200pM, DNA khuôn 100ng và Taq DNA polymerase 1U
(BioRad). Một máy điều nhiệt tuần hoàn được sử dụng với chu kỳ: biến tính ban đầu
ở 94oC trong 3 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ với 94oC 1 phút, 56oC 30 giây, 72oC 1
phút và giai đoạn kéo dài ở 72oC 7 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 1%, nhuộm với ethidium bromide và quan sát dưới đèn UV.
Kỹ thuật giải trình tự DNA và phân tích số liệu: trước khi giải trình tự, sản phẩm PCR
được làm tinh với GFX PCR and Gel band Purification Kit của Amersham. Vùng
rDNA-ITS được giải trình tự sử dụng primer ITS1 và ITS4 (White và cs, 1990) với
kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) và được phân
tích bằng máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 (Applied Biosystem). Số liệu
về trình tự được so sánh sử dụng chương trình CLUSTAL X (version 1.8).
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Thử nghiệm liên hợp
Thử nghiệm phản ứng liên hợp cho thấy dòng SR650 đều liên hợp với các
dòng tester của AG1-IA, AG 1-IB và AG 1-IC (Hình 1) và không liên hợp với các
dòng AG tester còn lại. Như vậy, theo kết quả này, dòng SR650 được phân bổ vào
AG1.
Theo Sneh và cs (1991), các dòng phân lập trong AG1 được chia thành 3
nhóm phụ dựa trên nguồn gốc ký chủ, triệu chứng hại, và các đặc điểm nuôi cấy;
AG1-IA (khô vằn lúa), -IB (cháy mạng nhện), và –IC (chết rạp cây con). Tuy nhiên,
dãy ký chủ của AG1-IA và –IB trùng lấp nhau. Dạng hạch cũng có thể thay đổi tùy
theo môi trường nuôi cấy đã sử dụng, vì vậy sự nhận biết các nhóm phụ AG1 dựa trên
dạng hạch không phải luôn luôn đáng tin cậy và sự khác biệt về mặt hình thái khuẩn
lạc không đủ cho phân nhóm phụ AG (Sherwood 1969). Thêm vào đó, các dòng phân
lập từ 3 nhóm phụ này không thể phân biệt được bằng phản ứng liên hợp. Gần đây,
dựa trên đặc điểm nuôi cấy, phân tích RAPD, và phân tích trình tự vùng rDNA-ITS,

3
tác nhân gây bệnh đốm lá cà phê ở Philippines được đề nghị như một nhóm phụ mới
của R. solani AG1, gọi là AG1-ID (Priyatmojo và cs, 2001; Toda và cs, 2004). Vì
vậy, chỉ dựa vào kết quả thử nghiệm liên hợp thì dòng SR650 mặc dù được phân bổ
vào AG1 nhưng chưa thể xác định nhóm phụ của nó.

Hình 1. Sự liên hợp giữa dòng SR650 và dòng tester AG1-IC

Giải trình tự vùng rDNA-ITS

Trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR650 đã đọc được là 679 bp, trong đó
vùng ITS1 dài 259 bp (từ nucleotide 1- 259), vùng 5.8S dài 155 bp (từ nucleotide
260-414) và vùng ITS2 dài 265 bp (từ nucleotide 415-679). So sánh trình tự đọc được
của dòng SR650 với trình tự tương ứng của các nhóm phụ AG1 sử dụng chương trình
CLUSTAL X (version 1.8) cho thấy dòng SR650 có tỷ lệ tương đồng cao nhất với
các dòng AG1-ID (accession AB 122125, AB122126, AB122127, AB122128,
AB122129, AB122130, AB122131, AB122132) (Hình 2). Vùng mã hóa 5.8S của
dòng SR650 là hoàn toàn bảo tồn và tương tự với trình tự của các dòng khác. Tỷ lệ
tương đồng giữa dòng SR650 và các dòng AG1-ID là 95,4-96,5% trong vùng ITS1 và
98,9-99,2% trong vùng ITS2. Tỷ lệ tương đồng DNA toàn vùng (bao gồm ITS1,
5.8S và ITS2) giữa dòng SR650 với các dòng AG1-ID là 97,8-98,4%. Trong khi đó,
so với các dòng AG1-IA (accession AB122135, AB122133, AY270011, AF308631

4
và AF354097) tỷ lệ này là 76-81%, với AG1-IB (accession AB122138, AB122139,
AB000039, AY152695 và AF308626) là 82-91%, với AG1-IC (accession AY
154300, AB000035, AB122141, AB122142, AF308630 và AF354058) là 76-82 % .
Toda và cs (2004) cho biết tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide trong vùng
rDNA-ITS giữa các dòng gây cháy lá cà phê AG1-ID là 99-100%. Trong nghiên cứu
này, tỷ lệ tương đồng giữa dòng SR650 và các dòng AG1-ID được so sánh là thấp
hơn (98%). Điều này có thể hiểu được, vì trong cùng một AG, có sự tương đồng di
truyền cao hơn giữa các dòng phân lập từ một nguồn gốc địa lý hơn là giữa các dòng
phân lập từ các vùng địa lý khác nhau (Jabaji-Hare và cs, 1990). Các dòng AG1-ID
mà Toda và cs (2004) đã so sánh đều được thu thập ở Philippines, hơn nữa, đều từ
một cây ký chủ (cà phê).
Như vậy, sự tương đồng cao trong trình tự nucleotide vùng rDNA-ITS cho
phép phân bổ dòng SR650 vào nhóm phụ AG1-ID. Trên thế giới, chỉ mới có một báo
cáo về nhóm phụ AG1-ID từ bệnh cháy lá cà phê ở Philippines (Priyatmojo và cs,
2001). Và kết quả nghiên cứu này là báo cáo đầu tiên về nhóm phụ AG1-ID của R.
solani ở nước ta.

AB122125 AAGGATCAT-ATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA 60
AB122131 AAGGATCAT-ATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA
AB122130 AAGGATCAT-ATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA
AB122132 AAGGATCAT-ATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA
AB122127 AAGGATCAT-ATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA
AB122129 AAGGATCATTATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA
AB122128 AAGGATCATTATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA
AB122126 AAGGATCATTATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA
SR-650 --GGGGAATTATTGTATTTATTACCGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA
** ** **** ******** ***********************************

AB122125 A-TGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAG 120

AB122131 AATGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAG
AB122130 A-TGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAG
AB122132 A-TGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAG
AB122127 A-TGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAG
AB122129 A-TGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAG
AB122128 A-TGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAG
AB122126 A-TGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAG
SR-650 A-TGTGCACATTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTCACAAG
* ******** ******************************************* *****

AB122125 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT 180

AB122131 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT
AB122130 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT
AB122132 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT
AB122127 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT
AB122129 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT
AB122128 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT
AB122126 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT
SR-650 GTCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTT
************************************************************

5
AB122125 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT 240
AB122131 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT
AB122130 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT
AB122132 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT
AB122127 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT
AB122129 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT
AB122128 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT
AB122126 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT
SR-650 GGCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATT
************************************************************
↓
AB122125 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA 300
AB122131 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA
AB122130 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA
AB122132 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA
AB122127 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA
AB122129 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA
AB122128 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA
AB122126 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA
SR-650 GATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA
************************************************************

AB122125 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT 360

AB122131 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT
AB122130 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT
AB122132 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT
AB122127 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT
AB122129 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT
AB122128 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT
AB122126 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT
SR-650 GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT
************************************************************

↓
AB122125 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT 420
AB122131 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT
AB122130 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT
AB122132 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT
AB122127 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT
AB122129 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT
AB122128 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT
AB122126 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT
SR-650 TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAAT
************************************************************

AB122125 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG 480

AB122131 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG
AB122130 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG
AB122132 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG
AB122127 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG
AB122129 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG
AB122128 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG
AB122126 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG
SR-650 CTTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTG
************************************************************

AB122125 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTT 540

AB122131 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTT
AB122130 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTT
AB122132 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTT
AB122127 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTT
AB122129 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTT
AB122128 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTACGCTTGGTT
AB122126 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTT
SR-650 CAGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTT
*************************************************** ********

AB122125 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA 600

AB122131 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA
AB122130 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA
AB122132 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA
AB122127 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA

6
AB122129 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA
AB122128 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA
AB122126 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA
SR-650 CCACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAA
************************************************************

AB122125 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCA-TTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT 660

AB122131 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCA-TTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT
AB122130 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCA-TTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT
AB122132 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCA-TTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT
AB122127 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCA-TTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT
AB122129 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCA-TTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT
AB122128 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCA-TTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT
AB122126 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCA-TTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT
SR-650 TGCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCGACTTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCT
************************** * *******************************

AB122125 GATCTCAAATCAGGTAGGA 679

AB122131 GATCTCAAATCAGGTAGGA
AB122130 GATCTCAAATCAGGTAGGA
AB122132 GATCTCAAATCAGGTAGGA
AB122127 GATCTCAAATCAGGTAGGA
AB122129 GATCTCAAATCAGGTAGGA
AB122128 GATCTCAAATCAGGTAGGA
AB122126 GATCTCAAATCAGGTAGGA
SR-650 GATCTCAAATCAGGTAGGA
*******************

Hình 2. So sánh trình tự vùng ITS1-5.8S-ITS2 của dòng SR650 và các dòng AG 1-
ID. Dấu sao (*) chỉ vị trí tương đồng giữa tất cả các dòng. Mũi tên (↓) chỉ giới hạn
của vùng rDNA 5.8S.
LỜI CẢM ƠN
Các tác giả chân thành cảm ơn Giáo sư H. Naito của trường Đại Học Hokkaido, Nhật
về việc cung cấp các dòng R. solani AG testers. Cảm ơn sự tham gia của kỹ sư Lê
Tuấn Kiệt trong nghiên cứu này. Cảm ơn Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa
Sinh Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. đã hỗ trợ hóa chất và cho phép sử dụng
trang thiết bị để hoàn thành nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Fenille R. C., Ciampi M. B., Kuramae E. E., and Souza N. L., 2003. Identification of
Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rDNA-ITS sequences.
Fitopatologia 28.
Jabaji-Hare S. H., Meller Y., Gill S. and Charest P. M., 1990. Investigation of genetic
relatedness among anastomosis groups of Rhizoctonia solani using cloned DNA
probes. Canadian Journal of Plant Pathology 12: 393-404.
Kronland W. C., and Stanghellini M. E., 1988. Clean slide technique for the
observation of anastomosis and nuclear condition of Rhizoctonia solani .
Phytopathology 78: 820-822.

7
Kunigana S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997. Sequence variation
of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia
solani. Curr Genet 32: 237 – 243.
Lee S. B., and Taylor J. W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single
spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA
fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London,
Tokyo.p. 70-71.
Priyatmojo A., Escopalao V. E., Tangonan N. G., Pascual C. B., Suga H., Kageyama
K. and Hyakumachi M., 2001. Characterization of a new subgroup of Rhizoctonia
solani Anastomosis Group 1 (AG-1-ID), Causal agent of a necrotic leaf spot on
coffee. Phytopathology 91:1054-1061.
Sherwood R.T., 1969. Morphology and physiology in four anastomosis groups of
Thanatephorus cucumeris. Phytopathology 59 : 1924-1929.
Sneh B., Burpee L., and Ogoshi A., 1991. Identification of Rhizoctonia species. APS
Press, St. Paul, MN.
Toda T., Mghalu J. M., Priyatomojo A., and Hyakumachi M., 2004. Comparison of
sequences for the internal transcribed spacer region in Rhizoctonia solani AG 1-ID
and other subgroups of AG 1. J. Gen. Plant Pathol 70: 270-272.
White T. J., Bruns T., Lee S., and Taylor J., 1999. Amplification anhd direct
sequencing of fungal ribosome ARN genes for phylogenetics. P 315 - 322. In: Innis
M. A., Gelfanhd D. H., White J. J. (eds) PCR protocols, a guide to methods and
applications. Academic Press, New York.

&&&&&