(123doc) Nghien Cuu Quy Trinh San Xuat Che Pham Probiotic Nham Bo Sung Vao Thuc An Cho Tom Hum Nuoi Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
TRẦN VŨ ĐÌNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

PROBIOTIC NHẰM BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO
TÔM HÙM NUÔI LỒNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Nha Trang - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
TRẦN VŨ ĐÌNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

PROBIOTIC NHẰM BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO
TÔM HÙM NUÔI LỒNG
Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

Mã số: 60 54 10
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. VŨ NGỌC BỘI
TS. NGUYỄN VĂN DUY
Nha Trang – 2013

-i-
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa từng
đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào.
Tác giả luận văn
Trần Vũ Đình Nguyên

- ii -
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này.

Trƣớc hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu - Trƣờng Đại học Nha Trang, Ban Chủ
nhiệm Khoa Công nghệ thực phẩm và Lãnh đạo Khoa Sau đại học sự kính trọng, niềm
tự hào đƣợc học tập tại Trƣờng trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin đƣợc giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội và TS.
Nguyễn Văn Duy - Trƣờng Đại học Nha Trang đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Đặc biệt, xin đƣợc ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: ThS. Lê Đình Đức - Bộ môn
Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, các cán bộ
phòng thí nghiệm Công nghệ chế biến và Công nghệ thực phẩm, các thầy cô giáo - Trung
tâm Thí nghiệm thực hành - Trƣờng Đại học Nha Trang đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại Trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè đã tạo điều kiện và
động viên khích lệ tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua.
Học viên
Trần Vũ Đình Nguyên
- iii -
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN………………………. .....................................................................i

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT ................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................viii
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 4
1.1. Giới thiệu về probiotic và vi khuẩn Bacillus ...................................................... 4
1.1.1. Giới thiệu về probiotic .................................................................................... 4
1.1.2. Cơ sở khoa học của công nghệ probiotic ......................................................... 5
1.1.2.1. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và tác dụng của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của
vật chủ. .................................................................................................................... 5
1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của probiotic.................................................................... 6
1.1.3. Phân loại probiotic.......................................................................................... 8
1.1.4. Probiotic từ vi khuẩn Bacillus ......................................................................... 9
1.2. Ứng dụng chế phẩm probiotic trong nuôi tôm hùm và nuôi trồng thủy sản ...... 10
1.2.1 Tôm hùm ....................................................................................................... 10
1.2.2. Tình hình sản xuất thức ăn và phòng trừ dịch bệnh ở tôm hùm ..................... 12
1.2.3. Bệnh Vibriosis đối với tôm hùm và động vật thủy sản .................................. 13
1.2.4. Ứng dụng của probiotic ................................................................................ 16
1.2.4.1. Trong y học, chăn nuôi và bảo vệ môi trƣờng ............................................ 16
1.2.4.2. Trong nuôi trồng thủy sản .......................................................................... 18
1.3. Tình hình nghiên cứu về sản xuất chế phẩm probiotic trong lĩnh vực nuôi tôm 20
1.3.1. Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic ......................................................... 20
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 22
1.3.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .................................................................. 27
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 29
2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 29
- iv -
2.1.1. Chủng vi sinh vật .......................................................................................... 29
2.1.2. Thức ăn tôm hùm và dầu mực ...................................................................... 29
2.1.3. Hóa chất, môi trƣờng .................................................................................... 29
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng .................................................................................... 31
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 31
2.2.1. Xác định hoạt tính sinh protease ................................................................... 31
2.2.2. Xác định hoạt tính kháng Vibrio spp. gây bệnh trên tôm hùm ....................... 32
2.2.3. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn ....................................................................... 32
2.2.4. Định danh vi khuẩn Bacillus ......................................................................... 32
2.2.5. Xác định khả năng sinh trƣởng ..................................................................... 32
2.2.6. Nuôi cấy và thu sinh khối probiotic .............................................................. 33
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác đị nh các điều kiện nuôi cấy thí ch hợp ......................... 33
2.2.8. Bố trí thí nghiệm xây dựng quy trình lên men ở quy mô pilot ....................... 34
2.2.9. Xác định các thông số của quá trình đông khô .............................................. 35
2.2.10. Bố trí thí nghiệm xác định chất chống đông phù hợp cho quá trình đông khô
các vi khuẩn probiotic ............................................................................................ 37
2.2.11. Xác định tỷ lệ tế bào sống sau đông khô .................................................... 38
2.2.12. Xác định hàm lƣợng ẩm tồn dƣ ................................................................... 39
2.2.13. Khảo sát tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn ...................................................... 39
2.2.14. Xử lý thống kê ............................................................................................ 40
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 41
3.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy vi khuẩn và thu sinh khối từ canh trƣờng nuôi . 41
3.1.1. Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng nghiên cứu ................................ 41
3.1.1.1. Xác định hoạt tính sinh protease ngoại bào ................................................ 41
3.1.1.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn ................................................................. 42
3.1.2. Đƣờng cong sinh trƣởng và xác định hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian .. 45
3.1.2.1. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên cứu .................... 45
3.1.2.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian .......................................... 48
3.1.3. Một số đặc điểm sinh học của các chủng probiotic nghiên cứu ..................... 49
3.1.4. Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy các chủng vi khuẩn
đã lựa chọn ............................................................................................................. 53
-v-
3.1.4.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng probiotic
nghiên cứu ............................................................................................................. 53
3.1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu ...... 54
3.1.4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu . 55
3.1.4.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu 56
3.1.4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu .......... 57
3.1.5. Xây dựng quy trình lên men ......................................................................... 58
3.1.5.1. Xác định pH thích hợp cho quá trình lên men ............................................ 58
3.1.5.2. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men .................................... 59
3.1.5.3. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình lên men ................................... 59
3.1.5.4. Đề xuất quy trình lên men ......................................................................... 60
3.2. Xây dựng quy trình đông khô .......................................................................... 61
3.2.1. Xác định quy trình đông khô đối với sinh khối vi khuẩn ............................... 61
3.2.2. Chất chống đông........................................................................................... 63
3.3. Xây dựng quy trình sản xuất và sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic ........ 65
3.3.1. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic .......................................... 65
3.3.2. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm ..................................................................... 66
3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic phối trộn với thức ăn tôm hùm......... 67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 72
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 77
- vi -
DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT
OD : Optical Density (Mật độ quang)

CFU : Colony Forming Unit
FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm và dƣợc
: phẩm Hoa Kỳ)
TCBS : Thiosulphate citrate bile salt agar
FCR : Hệ số chuyển đổi thƣ́c ăn
TSB : Trypton Soy Broth
TSA : Trypton Soy Agar
APW : Alkaline Peptone Water
LB : Lauria Broth
GRAS : Generally recognized as safe
- vii -
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bệnh gây bởi Vibrio spp. trong nuôi trồng thủy sản ..................................... 15
Bảng 1.2 Chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi tôm, cua, cá, sò và hiệu quả của
chúng .................................................................................................................... 19
Bảng 3.1 Hoạt tính sinh protease ngoại bào ................................................................ 41
Bảng 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với chủng
V1.1...................................................................................................................... 43
V3.3...................................................................................................................... 43
DYO5 ................................................................................................................... 45
Bảng 3.5 Kết quả định danh chủng B3.10.2 bằng bộ kít hóa sinh API 50CHB ............ 51
Bảng 3.6 Quy trình đông khô sinh khối các chủng probiotic nghiên cứu ..................... 62
Bảng PL.1. Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1 của các chủng probiotic nghiên
cứu theo thời gian. ................................................................................................ 77
Bảng PL.2. Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V3.3 của các chủng nghiên cứu theo
thời gian. .............................................................................................................. 77
Bảng PL.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.1 trên môi trƣờng TSB và LB . 77
Bảng PL.4. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.2 trên môi trƣờng TSB và LB . 78
Bảng PL.5. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.7.1 trên môi trƣờng TSB và LB ... 78
Bảng PL.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.7.4 trên môi trƣờng TSB và LB ... 78
Bảng PL.7. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu 79
Bảng PL.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến các chủng nghiên cứu .............................. 79
Bảng PL.9. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu 79
Bảng PL.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu.......... 79
Bảng PL.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu ....... 80
Bảng PL.12. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình lên men bằng thiết bị BioFlo 110 ........ 80
Bảng PL.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình lên men bằng thiết bị BioFlo 11081
Bảng PL.14. Tỷ lệ sống của chủng B3.7.4 sau khi đông khô ....................................... 81
Bảng PL.15. Tỷ lệ sống của chủng B3.10.2 sau khi đông khô ..................................... 81
Bảng PL.16. Ảnh hƣởng của dầu mực vào thức ăn bổ sung probiotic đối với thời gian
tan trong môi trƣờng nƣớc biển ............................................................................. 82
Bảng PL.17. Áp suất bay hơi theo nhiệt độ ................................................................. 82
- viii -
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác đị nh các thông số đông khô tối ƣu cho quá trì nh
đông khô vi khuẩn probiotic ...................................................................... 37
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chất chống đông phù hợp cho quá
trình đông khô vi khuẩn probiotic .............................................................. 38
Hình 3.1 Hoạt tính sinh protease ngoại bào của các chủng probiotic nghiên cứu ......... 41
Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng V1.143
Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng DY05 ........ 44
Hình 3.5 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.1 trên môi trƣờng TSB và LB ..... 46
Hình 3.6 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.2 trên môi trƣờng TSB và LB ..... 46
Hình 3.7 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.7.1 trên môi trƣờng TSB và LB ....... 47
Hình 3.8 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.7.4 trên môi trƣờng TSB và LB ....... 47
Hình 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1 của các chủng nghiên cứu theo
thời gian .................................................................................................... 48
Hình 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V3.3 của các chủng .......................... 49
nghiên cứu theo thời gian ............................................................................................ 49
Hình 3.11 Hình ảnh hình thái khuẩn lạc của các chủng probiotic nghiên cứu .............. 50
Hình 3.12 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào các chủng probiotic nghiên cứu ................... 50
Hình 3.13 Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu .. 53
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến các chủng nghiên cứu ............................... 54
Hình 3.15 Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu .. 55
Hình 3.16 Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu ................... 56
Hình 3.17 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu ........... 57
Hình 3.18 Ảnh hƣởng của pH đến quá trình lên men .................................................. 58
Hình 3.19 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trì nh lên men ........................................... 59
Hình 3.20 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.2 khi nuôi trên thiết bị lên men
BioFlo 110 ................................................................................................. 60
Hình 3.21 Sơ đồ quy trì nh lên men ............................................................................. 61
Hình 2.22 Chế phẩm probiotic trƣớc (a) và sau khi đông khô (b) ................................ 62
- ix -
Hình 3.23 Tỷ lệ sống của chủng B3.10.2 sau đông khô ............................................... 63
Hình 3.24 Tỷ lệ sống của chủng B3.7.4 sau đông khô ................................................. 63
Hình 3.26 Quy trì nh sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô ............................... 65
Hình 3.27 Chế phẩm probiotic Bio – Lobster .............................................................. 67
Hình 3.28 Ảnh hƣởng của tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn bổ sung probiotic đối với thời
gian tan trong môi trƣờng nƣớc biển .......................................................... 67
Hình 3.29 Thức ăn khi mới cho vào nƣớc biển(A) và sau khi để 8 giờ (B) .................. 68
Hình 3.30 Thức ăn trộn quá nhiều dầu mực ................................................................ 68
-1-
LỜI MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Tôm hùm là một loại đặc sản có giá trị kinh tế cao nên nghề nuôi tôm hùm đang
rất đƣợc quan tâm phát triển ở khu vực miền Trung cũng nhƣ trong cả nƣớc. Nghề
nuôi tôm hùm phát triển mạnh từ năm 2000 mang lại công ăn việc làm và thu nhập cho
ngƣ dân các tỉnh Khánh Hoà, Phú Yên, Ninh Thuận, Bình Định và Bình Thuận.
Gần đây, việc nuôi tôm trên khắp thế giới thƣờng xuyên bị ảnh hƣởng bởi các
bệnh do vi khuẩn, gây ra tổn thất nặng nề. Trong đó điển hình là nhóm vi khuẩn
Vibrio, ví dụ nhƣ vi khuẩn Vibrio alginolyticus là một trong những tác nhân gây ra
bệnh đỏ thân ở tôm hùm. Một yếu tố nữa ảnh hƣởng đến quá trình nuôi tôm là do sức
đề kháng của tôm yếu làm quá trình lột xác không thực hiện đƣợc khi tôm đến kỳ lột
xác và làm cho tôm dễ bị nhiễm bệnh. Để kiểm soát vi sinh vật gây hại, phƣơng pháp
truyền thống là dùng các hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh, tuy nhiên các hóa chất
diệt khuẩn nhƣ chlorin ngoài việc làm tăng mật độ Vibrio sau khi sử dụng, các dẫn
xuất của chlorin còn là những chất gây đột biến và ung thƣ nhƣ: chloroform (CHCl3),
bromodichloro-methane (CHBrCl2), dibromodichlo-romethane (CHBrCl2), và
bromoform (CHBr3). Các loại kháng sinh tạo ra các chủng kháng kháng sinh, các
plasmid mã hóa cho các gen kháng kháng sinh có thể truyền từ vi sinh vật gây bệnh ở
thủy sản sang các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và ngƣời. Vì lẽ đó ngày nay nhiều
loại kháng sinh đã bị cấm sử dụng trong nuôi thủy sản và làm thế nào để cải thiện môi
trƣờng sinh thái của nuôi trồng thủy sản đã trở thành tâm điểm chú ý của nuôi trồng
thủy sản quốc tế.
Từ lâu đã có những mối quan tâm đến việc tìm ra các chất thay thế kháng sinh
trong nuôi trồng thủy sản, các hoạt chất, chế phẩm sinh học giúp tăng sức đề kháng
của vật nuôi, cải thiện và nâng cao hiệu quả chăn nuôi. Những vi sinh vật sống trong
đƣờng tiêu hóa của vật nuôi có ảnh hƣởng sâu sắc đến các quá trình sinh trƣởng, phát
triển của vật nuôi. Vì vậy, điều quan trọng là phải hiểu cơ chế của hệ vi sinh vật đƣờng
tiêu hóa vật nuôi, tìm ra các hoạt chất thay thế các chất kháng sinh độc hại. Cơ sở khoa
học của việc sử dụng các chế phẩm vi sinh là tăng sức khỏe cho động vật nuôi, cải
thiện môi trƣờng và khống chế số lƣợng vi sinh gây bệnh (Farzanfar, 2006). Trong
trạng thái bình thƣờng thì trong hệ tiêu hóa có sự cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và gây
bệnh. Nó bị ảnh hƣởng bởi các tƣơng tác, quan hệ cộng sinh và cạnh tranh. Hệ vi sinh
-2-
vật có lợi không chỉ bảo vệ bộ máy tiêu hóa mà còn tăng khả năng hấp thụ thức ăn
giúp cho vật chủ tăng khả năng sinh trƣởng và phát triển.
Nuôi trồng thủy sản, cũng nhƣ ngành công nghiệp khác, liên tục đòi hỏi kỹ
thuật mới, sử dụng các tác nhân mới nhƣ vi khuẩn lactic và Bacillus spp. đƣợc đƣa vào
để thúc đẩy sự tăng trƣởng của vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản. Ngày nay, các chế
phẩm sinh học đƣợc ứng dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ, Nhật Bản, các nƣớc châu Âu,
Indonesia, Ấn Độ và Thái Lan, với kết quả khả quan. Nghiên cứu về probiotic có thể
tạo ra một lĩnh vực mới của sản phẩm công nghiệp, giống nhƣ các lĩnh vực công
nghiệp chế biến sản phẩm nuôi trồng và chế biến thực phẩm nuôi trồng thủy sản.
Trung Quốc là một nƣớc lớn trong nuôi trồng thủy sản. Trong những năm gần đây,
chính phủ Trung Quốc đã nhận thức đƣợc giá trị kinh tế và lợi ích xã hội tiềm năng
của các ứng dụng của men vi sinh trong nuôi trồng thuỷ sản, và gần đây, quan tâm
nhiều hơn đến việc nghiên cứu và phát triển của men vi sinh trong nuôi trồng thủy sản.
Do đó, chính phủ đã tăng kinh phí nghiên cứu cho nó. Probiotic chủ yếu ức chế sự
tăng trƣởng và giảm khả năng gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh, tăng cƣờng dinh
dƣỡng của các loài động vật thủy sản, cải thiện chất lƣợng nƣớc nuôi trồng thủy sản và
giảm việc sử dụng kháng sinh và hóa chất khác, do đó giảm ô nhiễm môi trƣờng của
các kháng sinh còn lại và hóa chất. Điều này có nghĩa là lợi ích của men vi sinh sẽ
đƣợc lâu dài, và các ứng dụng của men vi sinh sẽ trở thành một lĩnh vực quan trọng
trong việc phát triển nuôi trồng thủy sản trong tƣơng lai (Maqsood, 2010). Sử dụng
các chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản nói chung và trong nuôi tôm nói riêng ở nƣớc
ta là một xu hƣớng tích cực và ngày càng mở rộng.
Chính từ những lý do trên, dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Vũ Ngọc Bội và TS.
Nguyễn Văn Duy, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất chế
phẩm probiotic nhằm bổ sung vào thức ăn cho tôm hùm nuôi lồng”.
Mục tiêu của đề tài
- Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic.
- Thử nghiệm phối trộn chế phẩm probiotic vào thức ăn của tôm hùm.
Nội dung nghiên cứu
1) Nghiên cứu quy trình nuôi cấy vi khuẩn và thu sinh khối từ canh trường nuôi.
2) Xác định các thông số thích hợp cho quy trình đông khô chế phẩm vi khuẩn:
kỹ thuật đông khô, chất chống đông…
-3-
3) Xây dựng quy trình sản xuất và sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic.
4) Đánh giá khả năng sử dụng chế phẩm trong lĩnh vực làm thức ăn nuôi tôm
hùm lồng.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài.
Việc sử dụng các chế phẩm sinh học, nhất là probiotic, trong nuôi trồng hải sản
là hƣớng nghiên cứu khá mới, đầy triển vọng nhằm góp phần phòng trừ dịch bệnh, cải
thiện chất lƣợng sản phẩm, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng và phát triển bền vững
nghề nuôi trồng thủy sản. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic cho đối
tƣợng tôm hùm là một vấn đề mới trên thế giới và Việt Nam.
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng bổ sung vào thức ăn cho
tôm hùm sẽ góp phần làm tăng sức đề kháng bệnh tật, tăng khả năng hấp thụ chất dinh
dƣỡng, nâng cao khả năng sinh trƣởng và phát triển của tôm hùm.
Việc sử dụng chế phẩm probiotic làm hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh,
các chất kích thích tăng trƣởng làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm, tránh đƣợc
việc tồn đọng dƣ lƣợng các chất độc hại trên tôm hùm gây ảnh hƣởng không có lợi cho
sức khỏe ngƣời tiêu dùng và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng xung quanh. Từ đó tăng
khả năng tiêu thụ, xuất khẩu sản phẩm, mang lại giá trị lợi nhuận và hiệu quả kinh tế
cao. Đó cũng chính là góp phần vào việc phát triển nền kinh tế đất nƣớc, phát huy thế
mạnh tiềm năng, sử dụng các nguồn lợi từ biển, góp phần giải quyết việc làm cho
ngƣời lao động trong lĩnh vực nuôi trồng và chế biến thủy sản.
-4-
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về probiotic và vi khuẩn Bacillus
1.1.1. Giới thiệu về probiotic
Thuật ngữ “probiotic” đƣợc Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những
chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trƣởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác. Năm
1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ: “Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi
khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng
hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ” (Parker, 1989). Do
vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa hay dự phòng sinh học (có lẽ là do ghép 2 chữ
tiếng Anh: Prophylxia – phòng bệnh, dự phòng và biotics – sự sống).
Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới đƣợc chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhƣng
tác dụng của nó đã đƣợc nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là ngƣời đầu tiên đặt nền
móng cho việc sử dụng probiotic, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic để kéo dài tuổi
thọ con ngƣời vào năm 1908. Ngày nay chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng khá hiệu quả
trong chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con ngƣời
và bảo vệ môi trƣờng. Tuy nhiên việc dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản
(tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây.
Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu hiệu)
do giáo sƣ, tiến sỹ Teruo Higa, Trƣờng đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất
năm 1980 đã đƣợc sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng nhƣ bảo vệ môi
trƣờng đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980). Đến nay chế phẩm này đƣợc hơn 80
nƣớc và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dƣơng trong
đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
Thành phần của các chế phẩm probiotic là các vi sinh vật đƣợc sử dụng phổ
biến nhƣ: vi khuẩn lactic (Lactobacilli, Streptococci và Bifidobacteria), Bacillus sp.,
nấm men (Saccharomyces cerevisiae) và nấm sợi (Aspergillus oryzae). Những chủng
probiotic này đƣợc tìm thấy trong ruột của động vật khỏe mạnh với số lƣợng lớn.
Chúng đƣợc xem là an toàn (GRAS) theo lời của FDA, Mỹ. Các chế phẩm probiotic
đƣợc sử dụng dƣới nhiều dạng nhƣ: dạng bột, dạng viên nén, viên nang hay bột nhão
(Fuller, 1992).
Tiêu chuẩn lựa chọn robiotic:
- Kiểm tra in vitro đối với hoạt tính kháng khuẩn.
-5-
- Kiểm tra khả năng bám dính và tồn tại của chủng probiotic.
- Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm sinh học trên vật chủ, hiệu quả kinh tế
trƣớc khi sản xuất thƣơng mại.
Một probiotic phải có hiệu quả và an toàn (Verschuere et al, 2000). Nó không
có hại và có thể nhận đƣợc bởi động vật chủ thông qua hệ tiêu hóa trực tiếp. Nó không
chứa gen kháng độc lực hoặc kháng kháng sinh.
1.1.2. Cơ sở khoa học của công nghệ probiotic
1.1.2.1. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và tác dụng của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật
chủ.
Theo Jans (2005), một mặt hệ vi sinh vật đƣờng ruột liên quan đến việc tiêu
hóa, mặt khác nó tác động đến hệ thống miễn dịch do đó mục tiêu của việc sử dụng
chế phẩm sinh học là để giúp ổn định sức khỏe và dinh dƣỡng cho vật chủ. Sự hỗ trợ
của hệ vi sinh vật đƣờng ruột giúp ức chế sự phát triển của mầm bệnh, tác nhân gây
bệnh tiềm năng và các vi sinh vật khác từ đó ngăn chặn các vi sinh vật có hại xâm
nhập vào cơ thể.
Trong hệ vi sinh vật đƣờng ruột, số lƣợng loài đƣợc xác định có khoảng 400
đến 500 loài khác nhau. Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của
đƣờng tiêu hóa cũng khác nhau:
- Dạ dày: 101-103 cfu/ml, chủ yếu gồm Lactobacilli, Enterobacteria,
Bacteroides.
- Tá tràng: 101-104 cfu/ml.
- Ruột non: 105-108 cfu/g, chủ yếu gồm Bacteroides (104-107), Steptococci,
Lactobacilli, Enterobacteria.
- Ruột già: 109-1012 cfu/g, chủ yếu gồm Bifidobacteria, Bacteroides,
Enterobacteria (105-107), Enterococci (102-105), Lactobacilli, Clostridia,
Fusobacteria, Veillomella, Staphylococci, nấm men, Proteus, Pseudomonas.
Tùy thuộc vào điều kiện trong đƣờng tiêu hóa mà trạng thái cân bằng động giữa
các loài khác nhau đƣợc thành lập. Theo Jans (2005), hệ vi sinh vật ở trạng thái cân
bằng khi nhóm vi khuẩn kị khí (Clostridia, Bifidobacteria, Lactobacilli, Bacteroides,
Eubacteria) chiếm trên 90%; nhóm vệ tinh (Satellite flora) gồm chủ yếu là
Enterococcus và E. coli chiếm khoảng 1% và nhóm còn lại (Residual flora) gồm các
vi sinh vật có hại nhƣ Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas... chiếm dƣới 0,01%.
-6-
Nhóm vi khuẩn chính, nhóm vệ tinh và nhóm vi sinh vật còn lại tạo thành một tỷ lệ
90:1:0,01 đƣợc gọi là "eubiosis", tiếng Hy Lạp có nghĩa là "chung sống" của các vi
sinh vật với nhau cũng nhƣ với các sinh vật chủ. Mối quan hệ này là quan hệ cộng sinh
giữa vật chủ và hệ vi sinh vật. Vật chủ sẽ tạo điều kiện sống lý tƣởng nhƣ nhiệt độ ,
pH, chất dinh dƣỡng và đào thải các chất chuyển hóa . Khi hệ vi sinh vật ở trạng thái
cân bằng sẽ chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây hại , tổng hợp vitamin B và K ,
kích thích hệ miễn dịch và sinh trƣởng của vật chủ . Nếu mối quan hệ này bị gián đoạn
nghiêm trọng, tình trạng này đƣợc gọi là dysbiosis (“chung sống có hại”). Sự cân bằng
của hệ vi sinh vật trong đƣờng tiêu hóa bị tác động bởi các nhân tố vô sinh và hữu sinh
nhƣ: sinh lý vật chủ (hệ miễn dịch, muối mật, enzyme…), thành phần và chất lƣợng
thức ăn. Tác động của dysbiosis làm cho vật chủ có thể trạng yếu, tăng trƣởng kém và
các triệu chứng về tiêu hóa.
1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của probiotic
a. Cạnh tranh dinh dƣỡng
Bên cạnh cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng cacbon, nitơ và nhiều loại muối khoáng,
tất cả các vi sinh vật đều cần sắt để tăng trƣởng. Siderophore là một chất có khả năng
gắn với ion sắt, hòa tan sắt dễ dàng cho vi sinh vật. Các vi sinh vật vô hại sinh
siderophore có thể sử dụng nhƣ probiotic để cạnh tranh sắt với các vi khuẩn gây hại
(Vine et al., 2006).
b. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh
Khả năng bám dính của các vi khuẩn probiotic vào niêm mạc ruột đƣợc xem là
một trong những tiêu chí lựa chọn chủng probiotic. Các tế bào biểu mô đƣờng ruột là
tế bào chủ cho hàng triệu vị trí gắn thụ thể của vi khuẩn khác nhau. Khi probiotic liên
kết với vị trí gắn thụ thể trên tế bào biểu mô sẽ làm thay đổi niêm mạc của tế bào đó và
tế bào lân cận. Do đó vi khuẩn có hại ít có khả năng bám dính lên miên mạc ruột.
Probiotic có thể tìm thấy điểm gắn trong rất nhiều vị trí, do đó ngăn ngừa vi khuẩn có
hại xâm nhập. Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trƣng (chất bám
dính và các phân tử thụ thể của ruột) và cơ chế không đặc trƣng (dựa vào những yếu
tố hóa học). Một vài thành phần cấu tạo của vi khuẩn: protein, thành tế bào,
carbonhydrate, và acid lipoteichoic đƣợc xem là có liên quan đến tính bám dính của
probiotic vào ruột.
-7-
c. Sản xuất các hợp chất kháng khuẩn
Thành phần chất tiết ra khó có thể xác định đƣợc nên đƣợc gọi chung là chất ức
chế. Vi khuẩn lactic từ lâu đƣợc biết là chủng vi khuẩn tiết ra chất kháng khuẩn
(bacteriocin). Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản là nhóm Gram âm. Nhiều
vi khuẩn tiết ra chất ức chế chống lại các vi khuẩn gây bệnh nhƣ Aeromonas
hydrophila và Vibrio parahaemolyticus (Nair et al., 1985). Cơ chế tiết ra chất chống
lại vi khuẩn gây bệnh trong các thử nghiệm ở mức tế bào in-vitro rất phổ biến trong
môi trƣờng nƣớc. Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng có nhiều dòng vi khuẩn
in-vitro kìm hãm đƣợc các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Những nghiên cứu
này cũng chứng minh khả năng kìm hãm vi khuẩn của những dòng vi khuẩn thông
thƣờng dễ tìm thấy trong môi trƣờng (Fuller, 1989). Những quần thể sinh vật này có
thể tiết vào môi trƣờng những chất có tính sát khuẩn hoặc kìm khuẩn, gây ảnh hƣởng
đến quần thể vi sinh khác, nhằm gián tiếp cạnh tranh dinh dƣỡng và năng lƣợng có sẵn
trong môi trƣờng. Sự hiện diện của những vi khuẩn này sản sinh chất kìm hãm, có thể
tiết trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trƣờng nƣớc làm rào cản gây ức
chế các vi sinh vật gây bệnh (Vine et al., 2006).
d. Ức chế cơ chế kiểm soát mật độ tới hạn (Quorum Sensing)
Theo Đặng Tố Vân Cầm (2009), mỗi vi khuẩn có thể phóng thích ra một loại
phân tử hóa học đặc trƣng. Các phân tử này sẽ khuếch tán vào trong môi trƣờng nƣớc.
Khi tích lũy đến một nồng độ tới hạn nào đó, các phân tử hoá học sẽ trở thành một loại
tín hiệu giúp vi khuẩn có thể dò tìm và nhận biết đồng loại. Nói cách khác, Quorum
Sensing là cơ chế vi khuẩn điều khiển gene liên quan đến mật độ quần thể bằng cách
tạo ra (producing), phóng thích (releasing) và dò tìm (detecting) các phân tử tín hiệu;
là tiến trình các tế bào vi khuẩn thông tin liên lạc với nhau bằng các phân tử tín hiệu.
Nhờ Quorum Sensing, vi khuẩn có thể kích hoạt sự hoạt động của các gen mã
hóa các tiến trình nhƣ: tạo màng sinh học, tạo bào tử, phát sáng, sản xuất kháng sinh,
tiết ra các độc tố,… Hệ thống Quorum Sensing của vi khuẩn đã đƣợc phát hiện từ lâu.
Chúng có chức năng điều khiển độc lực của rất nhiều loài vi khuẩn và là tác nhân gây
bệnh cho ngƣời, cho vật nuôi và cho cây trồng. Các phân tử tín hiệu của vi khuẩn
Gram âm là Acyl Homoserine Lactone (AHL).
-8-
Việc phá hủy hệ thống Quorum Sensing của tác nhân gây bệnh nhằm làm bất
hoạt mà không ảnh hƣởng đến sự phát triển của tác nhân gây bệnh, là hƣớng nghiên
cứu - ứng dụng hoàn toàn mới trong lĩnh vực phòng trị bệnh bằng probiotic.
e. Cải thiện chất lƣợng nƣớc
Theo Sihag và Sharma (2012), việc bổ sung chế phẩm sinh học giúp cải thiện
chất lƣợng nƣớc, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus spp. Trong ao nuôi chứa nhiều bùn sẽ
tích tụ nhiều nitrogen, một số vi khuẩn gram âm tiết ra chất nhầy làm ngăn cản
khuyếch tán oxy vào lớp bùn đáy. Dó đó lớp chất thải ở đáy ao không bị phân hủy,
probiotic giúp phân hủy làm sạch chất thải ở đáy ao. Nhóm vi khuẩn có lợi có khả
năng loại bỏ chất thải chứa nitơ (ammonia, nitrite và nitrát) nhờ enzyme ngoại bào do
chúng chuyển hóa. Cho nên nhóm vi khuẩn này giải phóng enzyme trong ao có tác
dụng làm giảm vi khuẩn, virus gây bệnh trong ao (Bùi Quang Tề, 2009). Nhóm vi
khuẩn này lấn át nhóm vi khuẩn gây bệnh nhƣ Vibrio spp., Aeromonas spp… Khi vi
khuẩn probiotic đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi có tảo, một số chủng vi khuẩn ức
chế sự tăng trƣởng của các loại tảo đơn bào (Pavlova lutheri) ở các mức độ khác nhau
(Munro et al.,1995).
1.1.3. Phân loại probiotic
Các chế phẩm sinh học đƣợc sử dụng ở động vật có thể đƣợc chia thành ba
nhóm chính: vi khuẩn lactic, Bacillus spp. và nấm men (Jans, 2005).
- Vi khuẩn lactic: Vi khuẩn này đƣợc sử dụng trong nhiều thiên niên kỷ trong
việc sản xuất sản phẩm sữa lên men và thực phẩm muối chua. Một số chủng vi khuẩn
đƣợc lựa chọn làm chế phẩm probiotic nhƣ: Lactobacillic, Pediococci, Bifidobacteria
và Enterococci. Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic chuyển đổi một số loại đƣờng
thành acid lactic. Tính năng đặc trƣng của nhóm chế phẩm sinh học này là sinh các
chất kháng khuẩn và sự hình thành màng sinh học để bảo vệ màng nhầy ruột. sản xuất
các chất ức chế nhƣ aicd béo mạch ngắn làm giảm pH. Loại trừ các vi sinh vật gây
bệnh hoặc ngăn chặn chúng dính vào màng nhầy ruột. Sự gia tăng số lƣợng vi khuẩn
lactic tạo thành một hàng rào chống lại các vi sinh vật khác trong ruột. Ngăn chặn sản
xuất độc tố. Kích thích hệ thống miễn dịch trong ruột. Ảnh hƣởng các điều kiện lý hóa
trong ruột, ví dụ pH và thế oxy hóa khử, qua đó hạn chế các điều kiện tăng trƣởng.
Ảnh hƣởng trên sự chuyển hóa của các acid mật và do đó thúc đẩy sự hấp thụ chất béo,
tác dụng trên biểu mô ruột, cải thiện khả năng hấp thụ.
-9-
- Vi khuẩn Bacillus: Là vi sinh vật đƣợc tìm thấy phổ biến trong đất, vi khuẩn
có dạng hình que, bắt màu gram dƣơng. Khả năng tự nhiên của men vi sinh Bacillus
chống lại các ảnh hƣởng bên ngoài. Rengpipat và cs (2000), chỉ ra rằng việc sử dụng
các vi khuẩn Bacillus sp. cung cấp bảo vệ bệnh bằng cách kích hoạt hệ miễn dịch tế
bào và miễn dịch dịch thể ở tôm Sú (Penaeus monodon). Vi sinh vật thuộc nhóm
Bacillus nhờ môi trƣờng thích hợp sẽ phát triển số lƣợng rất lớn, cạnh tranh sử dụng
hết thức ăn của động vật nguyên sinh, Vibrio và các vi sinh vật có hại, ngăn cản sự
phát triển của chúng, từ đó giảm đƣợc các tác nhân gây bệnh.
- Nấm men: Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae đã đƣợc sử dụng trong
nhiều thế kỷ đối với sản xuất thực phẩm. Nấm men đã đƣợc sử dụng khoảng 370 trƣớc
Công nguyên, Hippocrates đã phát hiện ra tác dụng lợi tiểu của nấm men và coi nó
nhƣ là một loại thuốc. Một số chủng Saccharomyces cerevisiae có thể để cung cấp
chất dinh dƣỡng: peptide, vitamin, acid hữu cơ.
1.1.4. Probiotic từ vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn, gram dƣơng, tế bào hình que và thẳng,
kích thƣớc 0,5 – 2,5 x 1,2 – 10 μm, di động bằng chu mao. Chi Bacillus rất đa dạng về
sinh lý và sinh thái. Chúng là vi sinh vật hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhƣng trong điều
kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Là vi khuẩn dị dƣỡng hóa năng, hoại sinh thu năng
lƣợng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ. Các chủng này sinh trƣởng tốt trong môi
trƣờng chứa glucose, amonium sulphate và một vài loại muối khoáng. Nhiều loài
Bacillus có khả năng kháng nhiệt, chịu đƣợc điều kiện khô hạn, pH cực trị, chất khử và
các phân tử có hại khác. Đa số Bacillus sinh trƣởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với
pH = 9 – 10 nhƣ Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 nhƣ
Bacillus acidocaldrius. Về nhiệt độ có nhiều chủng ƣa nhiệt độ cao (450 – 750C), hay
ƣa lạnh (50 – 250C), nhƣng thƣờng gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 340 – 370C (Gordon,
1973).
Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nƣớc, không khí,
một số loài còn thấy trong khoang miệng, trong đƣờng ruột của ngƣời và động vật
(Lƣơng Đức phẩm, 1998).
Các loài thuộc chi Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ
nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trƣờng hợp chỉ hơi phình to lên một
chút. Mỗi tế bào sinh dƣỡng thƣờng chỉ hình thành một nội bào tử. Thông thƣờng bào
- 10 -
tử đƣợc tạo ra khi tế bào đã trãi qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt
chất dinh dƣỡng (sự suy giảm của cacbon, nitơ, phốt pho), quá trình này cần phải bắt
đầu trƣớc khi sự cạn kiệt toàn bộ các chất dinh dƣỡng, nếu không sự hình thành bào tử
không thể đƣợc hoàn thành do các chất dinh dƣỡng còn quá thấp cho quá trình hình
thành bào tử (Perez, 2000). Khi bào tử trƣởng thành tế bào dinh dƣỡng tự phân giải,
bào tử đƣợc giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Nội bào tử của vi khuẩn đƣợc sinh ra không
phải để sinh sôi nảy nở mà để chịu đựng với các điều kiện bất lợi. Bào tử có màng
nhiều lớp, chứa ít nƣớc tự do và do đó có thể tồn tại trong nhiều năm, chịu đựng tốt
với nhiều tác động bất lợi có thể làm chết các tế bào dinh dƣỡng, bào tử có khả năng
chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng (Gordon,
1973; Lƣơng Đức phẩm, 1998).
Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ,
nhƣ protein, khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào. Ngoài ra, chúng còn có khả
năng sinh ra amylase làm loãng tinh bột, biến chất này thành dễ hòa tan và thủy phân
tiếp theo thành các dextrin và các loại đƣờng hợp thành. Một số chủng thuộc loài
Bacillus subtilis, B. mesentericus… có thể có khả năng sinh ra enzym cenlulase và
hemicellulase phân hủy cellulose, hemicellulose (Lƣơng Đức Phẩm, 1998).
Ngoài các enzym trên, các vi khuẩn còn có khả năng sinh ra các chất có hoạt
tính kháng sinh nhƣ insulin, subtilin từ Bacillus subtilis, bacterioxin từ B.
licheniformis… (Lƣơng Đức Phẩm, 1998).
Khả năng gây bệnh của chi Bacillus đối với các sinh vật khác là không phổ
biến. Có 4 loài B. theringiensis, B. larvae, B. popilliae, B. lentimorbus và một số
chủng của B. sphaericus gây độc với côn trùng, B. anthracis và B. cereus gây độc cho
ngƣời và động vật (Gordon, 1973).
1.2. Ứng dụng chế phẩm probiotic trong nuôi tôm hùm và nuôi trồng thủy sản
1.2.1 Tôm hùm
Tôm hùm là một đối tƣợng có giá trị kinh tế. Từ năm 1992 nghề nuôi tôm hùm
ở Việt Nam đã bắt đầu phát triển. Trong nhƣ̃ng năm gần đây sản lƣợng tôm hùm nuôi
ổn định khoảng 2000 tấn/năm (Lai Van Hung, 2008). Nuôi tôm hùm là nghề có giá trị
kinh tế cao, góp phần nâng cao giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam. Nuôi tôm
hùm lồng đã tạo ra công ăn việc làm, tăng thu nhập cho ngƣời dân địa phƣơng, và
đóng góp đáng kể vào sự phát triển kinh tế của các tỉnh ven biển (Dean D, 2011).
- 11 -
Một số loài tôm hùm có giá trị kinh tế thuộc giống Panulirus gặp ở biển Việt Nam
(Nguyễn Thị Bí ch Thúy, 1998).
Ngành chân đốt (Arthropoda)
Lớp giáp xác (Crustacea)
Bộ mƣời chân (Decapoda)
Họ tôm hùm gai (Palinuridae)
Giống Panulirus
Loài tôm hùm Bông – Panulirus ornatus (Fabricius, 1798)
Loài tôm hùm Đá – Panulirus homarus (Linnaeus, 1758)
Loài tôm hùm Đỏ - Panulirus longipes (A. Milne Edwards, 1868)
Loài tôm hùm Sỏi – Panulirus stimpsoni (Holthuis, 1963)
Loài tôm hùm Tre – Panulirus polyphagus (Herbst, 1793)
Loài tôm hùm Sen – Panulirus versicolor (Latreille, 1804)
Loài tôm hùm Ma – Panulirus penicillatus (Olivier, 1791)
Tuỳ theo giai đoạn phát triển mà tôm hùm phân bố ở những độ sâu khác nhau.
Giai đoạn trƣởng thành, chúng sống ở độ sâu 20 m trở lên, giai đoạn ấu trùng và con
non chủ yếu tập trung ở các bãi đá, san hô độ sâu từ 2 – 10 m. Tôm hùm thƣờng sống
ở các rạn san hô ngầm xa bờ, xen kẽ đá san hô, nơi có nhiều hang hốc, khe rãnh ven
biển, độ sâu từ 5 – 35 m, độ mặn khoảng 30 - 340/00, nhiệt độ từ 220 - 320C và độ trong
suốt cao. Chúng có tập tính sống quần tụ chủ yếu ở tầng đáy với chất đáy sạch, không
bùn.
Tôm hùm lớn lên nhờ quá trình lột xác. Tôm càng nhỏ, quá trình lột xác càng
ngắn và tôm lớn càng nhanh. Tôm hùm có chu kỳ lột xác dài hơn so với các loài giáp
xác khác, do đó tốc độ tăng trƣởng của chúng cũng chậm hơn.
Tôm hùm là loài ăn tạp, trong tự nhiên thức ăn chủ yếu là cá, tôm, cua, ghẹ nhỏ,
cầu gai,…ngoài ra, chúng còn ăn các loại rong rêu. Tôm hùm bắt mồi tích cực về đêm
và gần sáng. Tuy nhiên, hệ số thức ăn (FCR) tính theo trọng lƣợng tƣơi khá cao và
khác nhau tùy theo loài. Đối với tôm hùm bông cỡ 10-90g/ con, FCR là 17-20; cỡ 100-
500 g/con, FCR là 11-26; cỡ 600-1000 g/con, FCR là 27-32 (Nguyễn Thị Bí ch Thúy ,
1998).
Tôm hùm sinh sản ở tất cả các thời điểm trong năm nhƣng mùa sinh sản chính
tôm là từ tháng 8 đến tháng 9. Giai đoạn ấu trùng phát triển từ thời gian tháng 10 đến
- 12 -
12. Phải mất 10 đến 12 tháng để phát triển thành tôm trƣởng thành. Cho đến nay, các
trại sản xuất giống tôm hùm giống vẫn chƣa thành công nên chủ yếu vẫn phải dựa từ
nguồn tôm giống tự nhiên (Dean, 2011).
Tôm hùm phân bố rộng khắp ở v ùng biển nhiệt đới từ Ấn Độ Dƣơng đến Thái
Bình Dƣơng. Ở nƣớc ta , Tôm hùm đƣợc phân bố chủ yếu ở vùng biển miền Trung từ
Quảng Bình đến Bình Thuận . Nhờ có giá trị kinh tế cao nên nghề nuôi tôm hùm lồng
có tiềm năng lớn để phát triển tại Việt Nam (Lai Van Hung, 2008).
Các nƣớc sản xuất nhiều tôm hùm nhƣ : Australia, New Zealand, Nam Phi,
Cuba, Brazil, Mexico và Mỹ, với hơn 70% đánh bắt từ vùng biển Caribbean và Đông
Nam khu vực Đại Tây Dƣơng và phía đông Ấn Độ Dƣơng (Philips và Kittaka, 2000).
1.2.2. Tình hình sản xuất thức ăn và phòng trừ dịch bệnh ở tôm hùm
Mặc dù nhiều nghiên cứu đƣa ra các công thức thức ăn, nhu cầu dinh dƣỡng
cho tôm hùm Bông, tuy nhiên qui trình kỹ thuật sản xuất thức ăn để có thể đảm bảo
các yêu cầu nhƣ: tính ổn định trong môi trƣờng nƣớc, mùi vị hấp dẫn của viên thức ăn
đối với tôm hùm ở các giai đoạn phát triển khác nhau thì vẫn còn rất ít. Mới đây đã có
nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất thức ăn cho tôm hùm (Lại Văn Hùng, 2007).
Nuôi tôm hùm là nghề có giá trị kinh tế cao, góp phần nâng cao giá trị xuất
khẩu thuỷ sản của Việt Nam. Tuy nhiên dịch bệnh trên tôm thời gian qua gây thiệt hại
lớn. Các loại bệnh gây chết tôm hùm vẫn là các bệnh nhƣ bệnh sữa, mang đen, đỏ
thân, hở mang. Theo Vụ Nuôi trồng thủy sản (Bộ Nông nghiệp – Phát triển nông thôn),
cả nƣớc hiện có trên 49.500 lồng nuôi tôm hùm, trong đó Phú Yên có 29.000 lồng,
Khánh Hòa 19.000 lồng. Sản lƣợng tôm hùm nuôi hàng năm cả nƣớc đạt trên 2.000
tấn. Với giá thị trƣờng 2 tỷ đồng/tấn, tôm hùm nuôi mang lại giá trị kinh tế rất lớn.
Từ năm 2008 đến nay, tình trạng tôm hùm bị chết do bệnh sữa xảy ra ở hầu hết
các địa phƣơng có nghề nuôi tôm hùm. Trong đó, Khánh Hòa là tỉnh thiệt hại nặng nề
nhất, tỷ lệ tôm chết bình quân hàng năm khoảng 30% tổng lƣợng nuôi, năm 2008 tỷ lệ
chết trên 50%, gây tổn thất hàng trăm tỷ đồng.
Từ đầu năm 2012, ngƣời nuôi tôm hùm gặp khó khăn vì bệnh sữa bùng phát
trên tôm. Lợi dụng dịch bệnh, thƣơng lái ép giá tôm thƣơng phẩm làm ngƣời nuôi tôm
thua lỗ nặng. Theo Báo cáo của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, nghề nuôi
tôm Hùm tại Phú Yên, từ đầu vụ thả nuôi (tháng 11/2011) đến nay, cả tỉnh đã có gần
75.600 con tôm hùm nuôi bị chết, chiếm hơn 20,5% số lƣợng tôm nuôi do tác động
- 13 -
xấu do thời tiết và môi trƣờng nƣớc bị ô nhiễm đã làm tôm hùm nuôi bị mắc các bệnh
nhƣ đục thân, đen mang, lỏng cổ, đƣờng ruột và bệnh sữa. Tính đến giữa tháng 4, tại 2
tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên có trên 600.000 con tôm gần đến tuổi thu hoạch chết vì
bệnh sữa, thiệt hại lên tới hàng trăm tỷ đồng. Phú Yên, thủ phủ nuôi tôm hùm cả nƣớc
cũng đang vật lộn với việc dập dịch.
Chi cục Thú y tỉnh Phú Yên cho biết đến nay lƣợng tôm chết đã giảm nhiều
nhƣng dịch bệnh vẫn còn lây lan. Chƣa có thống kê chính xác, nhƣng 100% hộ nuôi
tôm hùm tại Phú Yên đều có tôm nhiễm bệnh, tùy mức độ nặng nhẹ, ít hay nhiều. Tại
Khánh Hòa, từ đầu năm đến nay, bệnh sữa trên tôm hùm tiếp tục bùng phát ở hầu hết
các địa phƣơng trong tỉnh. Trong đó, xã Vạn Thạnh, huyện Vạn Ninh là địa phƣơng bị
thiệt hại nặng nề nhất, mỗi ngày có khoảng 400 – 500 kg tôm bị chết, trong đó có trên
80% chết vì bệnh sữa, gây thiệt hại cho ngƣời nuôi hàng trăm tỷ đồng.
Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Phú Yên, chính vì lợi nhuận cao
mà ngƣời dân đổ xô vào nuôi tôm hùm, số lồng tôm hùm thả nuôi tăng gây nên hệ lụy
phá vỡ quy hoạch, ô nhiễm môi trƣờng ở nhiều vùng nuôi. Dịch bệnh cũng bùng phát
khiến tôm nuôi chết hàng loạt gây thiệt hại nặng về kinh tế. Hoạt động nuôi lồng trên
biển cũng đƣợc Tổng cục thủy sản dự báo sẽ làm tăng thêm lớp trầm tích chất thải dày
khoảng 3-5 cm, làm xấu đi môi trƣờng tại những khu vực này. Chất lƣợng nƣớc tại các
vùng nuôi tôm hùm cũng bị suy giảm nghiêm trọng do hàm lƣợng NH 3 và H2S cao
trong tầng nƣớc sát đáy và tầng đáy, chúng đƣợc coi là những nguyên nhân chủ yếu
làm cho tôm hùm chết hàng loạt. Việc phát triển mô hình nuôi trồng thủy sản trên biển
sẽ làm cho môi trƣờng nƣớc của những khu vực này bị ô nhiễm ngày càng nghiêm
trọng.
1.2.3. Bệnh Vibriosis đối với tôm hùm và động vật thủy sản
Tôm và môi trƣờng sống là một thể thống nhất. Khi chúng mắc bệnh là kết quả
tác động qua lại giữa cơ thể và môi trƣờng sống. Do đó tôm bị bệnh phải có 3 nhân tố
(Bùi Quang Tề, 2009):
- Môi trƣờng sống: t0, pH, O2, CO2, NH3, NO2, kim loại nặng,... Những yếu tố
này thay đổi bất lợi cho tôm và tạo điều kiện thuận lợi cho tác nhân gây bệnh (mầm
bệnh) dẫn đến dễ mắc bệnh.
- Tác nhân gây bệnh: virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và những sinh vật hại
khác.
- 14 -
- Vật nuôi: có sức đề kháng hoặc mẫn cảm với các tác nhân gây bệnh.
Trong đó bệnh do tác nhóm vi khuẩn gây ra thiệt hại lớn cho việc nuôi thủy sản.
Những vi khuẩn Vibrio thƣờng xuyên có mặt trong môi trƣờng và gây bệnh Vibriosis
thƣờng thấy phổ biến trong ngành nuôi thủy sản hiện nay.
Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là các vi khuẩn Gram âm, có dạng hình
que hay hình dấu phẩy, kích thƣớc tế bào 0,3 - 0,5 × 1,4 - 2,6 µm. Vibrio không hình
thành bào tử và có khả năng chuyển động nhờ tiên mao, đa phần có phản ứng Oxydase
(+), có khả năng oxy hóa và lên men trong môi trƣờng O/F Glucose, không sinh H 2S
và mẫn cảm với Vibriostat (0/129). Hầu hết các loài giống Vibrio đều phân bố trong
môi trƣờng nƣớc mặn, thích hợp ở 20-40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn
70‰, Vibrio là vi khuẩn đặc trƣng cho vùng nƣớc biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ
25 - 300C, nên Vibrio luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi động vật thủy sản biển, đặc
biệt giáp xác nuôi thâm canh ven biển và trên biển. Môi trƣờng TCBS (Thiosulphate
citrate bile salt agar) là môi trƣờng chọn lọc của Vibrio spp.. Dựa vào màu sắc khuẩn
lạc trên môi trƣờng chọn lọc này, Vibrio spp. đƣợc chia thành 2 nhóm: Nhóm có khả
năng lên men đƣờng sucrose và có khuẩn lạc màu vàng; Nhóm không có khả năng lên
men đƣờng sucrosse và có khuẩn lạc màu xanh lá cây trên môi trƣờng TCBS (Đỗ Thị
Hòa và cs, 2004).
Trong bệnh Vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân
thứ cấp (tác nhân cơ hội), ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trƣờng nhƣ cơ
học, hóa học. Hóa học có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh Vibriosis
ở động vật thủy sản. Vi khuẩn Vibrio spp. có thể cảm nhiễm và gây nhiều bệnh khác
nhau ở động vật thủy sản, đặc biệt là cá và giáp xác sống ở vùng nƣớc có độ mặn cao.
Các loài Vibrio ở động vật thủy sản thƣờng gặp bao gồm: Vibrio anguillarum, V.
harveyi, V. vulnificus, V. salmonicida… (Thompson et al., 2004).
Ở động vật thủy sản, Vibrio có thể gây một số bệnh khác nhau với những dấu
hiệu bệnh lí nhƣ sau :
- Bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm: Khi tôm bị bệnh thƣờng yếu, lờ đờ, kém bắt
mồi, nặng có thể bỏ ăn, trong bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục. Bệnh thƣờng xảy
ra ở các trại tôm giống gây thiệt hại lớn, đặc biệt ở các giai đoạn tiền ấu trùng. Nếu
bệnh xảy ra ở dạng cấp tính, có thể làm cho tôm ấu trùng chết hàng loạt, tỷ lệ chết có
thể lên đến 100% trong bể ấp do sự nhiễm khuẩn toàn thân. Từ mẫu tôm bị phát sáng
- 15 -
ngƣời ta phân lập đƣợc Vibrio harveyi, V. vunlnificus và V. parahaemolyticus (Đỗ Thị
Hòa và cs, 2004).
Bảng 1.1 Bệnh gây bởi Vibrio spp. trong nuôi trồng thủy sản
Loài Vibrio Vật chủ Bệnh
Vibrio harveyi Peneause monodon Bệnh phát sáng
(Tôm sú)
Litopenaeus vannamei Tỷ lệ tử vong
(Tôm thẻ chân trắng) 85%
Epinephelus coioides
(Cá mú) Viêm dạ dày
Sulculus diversicolor
(Bào ngƣ Nhật Bản)
V. alginolyticus P. monodon (Tôm sú) Bệnh vỏ
V. parahaemolyticus P. monodon (Tôm sú) Bệnh đỏ đuôi, tử

vong 80%
V. anguillarum Salmo salar L. (Cá
hồi) Vibriosis
Oncorhynchus mykiss
(Cá hồi)
V. vulnificus Oreochromis niloticus Vibriosis

(Cá rô phi).
(Chatterjee and Haldar, 2012)

- Bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác, còn có tên gọi khác: Bệnh vỏ (shell disease),
bệnh đốm nâu, đốm đen (Brown or black spot disease), bệnh hoại tử phụ bộ (Necrosis
of Apendgages disease), ở cua biển khi bị bệnh này có tên gói là bệnh rỉ sắt, bệnh hoa
mai. Giáp xác khi bị bệnh này thƣờng có một số dấu hiệu sau: xuất hiện các vùng mềm
trên vỏ, sau đó tạo nên các điểm nâu, đen hay trắng, tại đó vỏ kitin bị ăn mòn, các phần
phụ (chân bơi, râu…) và đuôi tôm có thể phồng lên rồi cụt dần , có sắc tố đen nâu trên
mô gan tụy. Bệnh này có thể xảy ra ở các giai đoạn phát triển khác nhau: tôm mẹ, tôm
- 16 -
thịt, ấu trùng và hậu ấu trùng trong các trại giống. Cũng có trƣờng hợp bệnh xảy ra
kèm theo một số dấu hiệu khác trong các ao nuôi tôm nhƣ: tôm bị bệnh thƣờng bẩn
mình, bẩn mang, có màu hồng đỏ trên cơ thể, yếu, bỏ ăn rồi chết. Hiện tƣợng chết có
thể xảy ra khi bệnh ở mức độ cấp tính. Nếu mãn tính có thể gây chậm lớn, phân đàn,
mềm vỏ,… Có nhiều loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ bệnh này: Vibrio alginolyticus, V.
parahaemolyticus, V. ordali,…
- Các loài Vibrio alginolyticus, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. anguillarum và
V. owensii DY05 là những các tác nhân gây bệnh ở tôm hùm, đặc biệt là tỷ lệ gây chết
cao ở ấu trùng tôm hùm (Shields, 2011; Goulden et al., 2012).
1.2.4. Ứng dụng của probiotic
1.2.4.1. Trong y học, chăn nuôi và bảo vệ môi trƣờng
a. Trong y học
Khi probiotic đƣợc đƣa vào đƣờng ruột, các vi sinh vật hữu ích trong chế phẩm
làm sạch đƣờng ruột, cân bằng hệ sinh thái của các vi sinh vật trong đƣờng ruột, ức
chế các vi sinh vật gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có
hại này gây nên, làm cho các chức năng của đƣờng ruột đƣợc hoạt động tốt hơn. Chế
phẩm probiotic còn liên quan đến việc làm sạch đƣờng ruột có tác dụng thúc đẩy quá
trình lọc máu và lọc các chất độc cần bài tiết, tăng cƣờng hệ số tiêu hóa của thức ăn:
tăng hệ số hấp thu và sử dụng các chất dinh dƣỡng trong thức ăn. Ngoài ra, chế phẩm
probiotic làm bình thƣờng chức năng miễn dịch của cơ thể, làm lành mạnh và hoạt hóa
khả năng tự nhiên của tế bào.
Tác dụng cuối liên quan đến dịch chiết từ chế phẩm probiotic có hoạt chất sinh
học, nhƣ acid amin, các enzyme, các nucleotit, các acid nucleic, các vitamin, đặc biệt
là biotin. Các hoạt chất này có liên quan đến khả năng đổi mới tế bào cơ thể, làm tăng
kháng thể và khả năng miễn dịch… cũng có thể làm chậm quá trình lão hóa, làm tăng
sức đề kháng chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh.
b. Trong chăn nuôi
Probiotic giúp hệ vi sinh vật đƣờng ruột của vật nuôi phát triển bình thƣờng,
tăng cƣờng khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dƣỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia
súc chế phẩm này giúp cho hệ vi sinh vật trong dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn.
Hơn nữa, probiotic có tác dụng làm tăng sức khỏe vật nuôi, tăng sức đề kháng và khả
năng chống chịu với các điều kiện bất lợi cho vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh
- 17 -
thƣờng gặp, nhất là bệnh ỉa phân trắng (Huang và cs, 2004). Một số nghiên cứu khác
cho thấy, probiotic làm cho gia súc gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lƣợng thịt, tăng
năng suất chăn nuôi (Fuller, 1998). Cuối cùng, chế phẩm này làm ức chế và có thể tiêu
diệt đƣợc các vi sinh vật có hại, làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối ô nhiễm chuồng
trại chăn nuôi (Võ Thị Hạnh và cs, 2005).
Vì vậy, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nƣớc uống cho vật nuôi
đều có tác dụng dƣơng tính. Dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể con
vật nhƣ chó, lợn… sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái thì khi cho con
bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại (Lƣơng Đức Phẩm, 1998).
c. Trong bảo vệ môi trƣờng
Các vi sinh vật của chế phẩm probiotic, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic và
nhóm vi khuẩn Bacillus có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột, nhƣ
Samonella, Vibrio, Shigella. Ngoài ra, axit lactic tạo thành có tác dụng làm sạch ruột,
làm cơ chất dinh dƣỡng rất tốt cho động vật tiêu hóa. Các hoạt chất kháng sinh do các
vi khuẩn này sinh ra đều có khả năng ức chế sinh trƣởng của các vi sinh vật gây hại.
Nhóm vi khuẩn Bacillus là các vi khuẩn sống hiếu khí tùy tiện và có khả năng
sinh ra các enzyme thủy phân ngoại bào. Vì vậy, khi vào môi trƣờng nuôi thủy sản
chúng có thể sinh sản rất mạnh, ngoài khả năng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh
phát triển, chúng còn phân hủy các chất hữu cơ do thức ăn thừa và phân của vật nuôi
bài tiết… để làm giảm thiểu ô nhiễm (Lƣơng Đức Phẩm, 1998).
Trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ ta thấy xuất hiện khí H2S và các
khí thối khác là dẫn xuất của khí này. Trong probiotic có vi khuẩn tía có khả năng sử
dụng khí H2S làm thức ăn, mùi hôi thối giảm đi rõ rệt. Đồng thời các nấm men trong
chế phẩm có khả năng lên men rƣợu từ đƣờng có trong môi trƣờng, tạo mùi thơm, cải
thiện mùi cho môi trƣờng và nâng cao hệ số tiêu hóa của thức ăn cho vật nuôi.
Tác dụng của chế phẩm trong bảo vệ môi trƣờng đƣợc thể hiện rất đa dạng:
- Khi phun chế phẩm vào những chỗ có mùi hôi thối nhƣ cống, rãnh, hố xí,
đống rác thải, chuồng trại chăn nuôi, cũng nhƣ vật nuôi đều có tác dụng làm mất mùi
hoặc giảm mùi rõ rệt, giảm số lƣợng ruồi nhặng và các loại côn trùng so với trƣớc khi
sử dụng chế phẩm.
- Đối với các đống rác ngoài tác dụng làm giảm hoặc mất mùi hôi thối còn có
hiện tƣợng thể tích giảm nhanh là do các vi sinh vật trong chế phẩm tiết ra hệ enzyme
- 18 -
thủy phân các chất hữu cơ. Đó là các nhóm enzyme amylase, protease, cellulase và đặc
biệt là cellulase, hemicellulase làm tạo mùn nhanh chóng hơn.
- Phun chế phẩm vào kho bảo quản nông sản có tác dụng ngăn chặn đƣợc quá
trình thối rữa.
- Cho vật nuôi uống chế phẩm đều tốt, giảm mùi hôi thối của phân.
- Với môi trƣờng nƣớc nuôi tôm, cá khi dùng chế phẩm nƣớc ao đầm có pH
thay đổi từ từ hoặc thay đổi không quá đột ngột. Các chỉ số BOD, COD cũng vậy, hàm
lƣợng NH3 và H2S thƣờng không quá giới hạn cho phép thì thời gian thay nƣớc sẽ kéo
dài hơn. Điều quan trọng hơn cả là vật nuôi khỏe hơn, tăng trọng nhanh hơn và chi phí
thức ăn cho một đơn vị tăng trọng giảm (Lƣơng Đức Phẩm, 1998).
1.2.4.2. Trong nuôi trồng thủy sản

Ngoài ra, sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản giúp phân hủy các chất
hữu cơ trong nƣớc (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trƣờng nƣớc
bị ô nhiễm), hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy, giảm các
độc tố trong môi trƣờng nƣớc (do các chất khí: NH3, H2S… phát sinh), do đó sẽ làm
giảm mùi hôi trong nƣớc, giúp tôm cá phát triển tốt, nâng cao khả năng miễn dịch của
tôm cá (do kích thích tôm, cá sản sinh ra kháng thể). Hơn nữa chế phẩm probiotic sẽ
ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi
sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại). Trong môi
trƣờng nƣớc, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát
triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế đƣợc mầm bệnh phát triển để gây bệnh
cho tôm cá. Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ pH của nƣớc, ổn định màu
nƣớc do probiotic hấp thu chất dinh dƣỡng hòa tan trong nƣớc nên hạn chế tảo phát
triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí thay nƣớc. Cuối cùng, chế phẩm probiotic còn có tác
dụng gián tiếp làm tăng oxy hòa tan trong nƣớc, giúp tôm cá đủ oxy để thở, do đó tôm
cá sẽ khỏe mạnh, ít bệnh, ăn nhiều, mau lớn (Phạm Văn Ty và cs, 2007).
- 19 -
Bảng 1.2 Chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi tôm, cua, cá, sò và hiệu quả của chúng
Loài vi khuẩn Vật chủ Ảnh hƣởng Tài liệu tham khảo
Động vật thân mền
Roseobacter sp. Pecten maximus (Sò Tăng tỷ lệ sống Ruiz-Ponte et al.
BS107 điệp) (1999)
Chủng 11 và C33 Argopecten Avendano &
purpuratus (Sò điệp) Riquelme (1999)
Vibrio sp. 33, Argopecten
Pseudomonas sp. 11 purpuratus Riquelme et al.
và Bacillus sp. B2 (2001)
Chủng CA2 Crassostrea gigas Thúc đẩy phát Douillet &
(Hàu) triển Langdon (1994)
Giáp xác
Vibrio alginolyticus Litopenaeus Tăng tỷ lệ sống Garriques &
vannamei (Tôm thẻ Arevalo (1995)
chân trắng)
Lactobacillus Macrobrachium Tăng tốc độ sinh Venkat et al.
sporogenes rosenbergii (Tôm trƣởng (2004)
càng xanh)
Bacillus spp. S11 Penaeus monodon Rengpipat et al.
(PL- 10) (Tôm sú) (2000)
VKM-124 Penaeus sp. Giảm tỷ lệ chết Maeda et al. (1997)
bởi tác nhân virut
gây bệnh
Pseudoalteromonas Portunus Tăng tỷ lệ sống Nogami & Maeda
undina spp. F3 và trituberculatus (cua) của ấu trùng cua (1992)
PM- 4
Cá
Bacillus toyoi Scophthalmus Tăng khả năng Gatesoupe (1989)
maximus phát triển của ấu
trùng cá bơn
Bào tử chủng Scophthalmus Giảm tỷ lệ chết Gatesoupe (1991b)
- 20 -
Bacillus sp. IP5832 maximus
Streptococcus Scophthalmus Tăng tỷ lệ sống Gatesoupe (1991c)
thermophilus, maximus (Cá bơn)
Lactobacillus
helveticus và
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillus Scophthalmus Tăng tỷ lệ sống Gatesoupe (1994)
plantarum và maximus
Carnobacterium sp.
Vibrio sp. E Scophthalmus Tăng tỷ lệ sống Gatesoupe (1997)
maximus
Lactobacillus Gadus morhua (cá Tăng tỷ lệ sống Strom & Ringo
plantarum tuyết) (1993)
Nƣớc Hippoglossus Tăng tỷ lệ sống Vadstein et al.
hippoglossus (1993)
Bacillus sp. 48 Centropomus Giảm Vibro spp. Kennedy et al.
undecimalis (1998)
Pediococcus Tăng khả năng Gatesoupe (2002)
acidilactici và Pollachius phát triển của ấu Maeda et al. (1997)
Saccharomyces pollachius trùng.
cerevisiae
VKM-124 Sparus auratu (Cá
vền)
Pseudoalteromonas Amphiprion Giảm Vibrio spp. Vine (2004)
AP5 Percula (Cá hề) trong nƣớc
1.3. Tình hình nghiên cứu về sản xuất chế phẩm probiotic trong lĩnh vực nuôi tôm
1.3.1. Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic
Gần đây, một số quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đã đƣợc công bố
(Nguyễn Liêu Ba, 2003; Jans, 2005; Yadav và cs, 2009; Lƣơng Hùng Tiến và cs,
2010. Tuy nhiên việc sản xuất chế phẩm probiotic dạng nƣớc hoặc dạng khô bằng
- 21 -
phƣơng pháp sấy phun cho tỷ lệ sống của vi khuẩn sau khi bảo quản là rất thấp. Hơn
nữa, việc sử dụng phƣơng pháp sấy phun chỉ phù hợp với những chủng vi sinh vật có
khả năng sinh bào tử. Để khắc phục những nhƣợc điểm này ta có thể tiến hành sản
xuất chế phẩm probiotic bằng phƣơng pháp đông khô.
Dựa trên cơ sở của sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm probiotic (Jans, 2005), ta
cần phải thực hiện các bƣớc nhƣ sau: Lựa chọn các chủng vi sinh vật → xác định môi
trƣờng lên men → lên men → ly tâm → sấy khô → bổ sung chất bảo quản → phối
trộn → kiểm soát chất lƣợng → đóng gói.
- Lựa chọn các chủng vi sinh vật
Vi sinh vật đƣợc lựa chọn cho việc sản xuất các chế phẩm sinh học là kết quả
của một quá trình lựa chọn cẩn thận. Chúng đƣợc phân lập từ môi trƣờng tự nhiên. Sau
đó, đƣợc kiểm tra và lƣ̣a chọn để phù hợp với việc bổ sung vào hệ tiêu hóa của động
vật.
- Xác định môi trƣờng lên men
Khả năng lên men của chủng vi sinh vật cũng đƣợc ki ểm tra , bao gồm thành
phần các cơ chất cho quá trì nh lên men và các chất chuyển hóa . Ngoài ra, tỷ lệ sống và
hiệu quả, ảnh hƣởng đến hệ tiêu hóa cũng đƣợc kiểm tra làm cơ sở cho việc lựa chọn
chủng probiotic.
- Lên men
Sản xuất si nh khối bằng cách lên men , tất cả các nguyên liệu sƣ̉ dụng đƣợc
kiểm soát chất lƣợng nghiêm ngặt . Việc bổ sung chất dinh dƣỡng , các thông số cho
quá trình lên men luôn đƣợc theo dõi, giám sát chặt chẽ.
- Ly tâm
Tiến hành quá trì nh ly tâm để thu đƣợc sinh khối tế bào , quá trình này thƣờng
sƣ̉ dụng các thiết bị ly tâm để tách đƣợc tế bào vi khuẩn ra khỏi dị ch lên men.
- Sấy khô
Mục đích của quá trình là tách nƣớc ra khỏi tế bào, giúp tăng thời gian bảo quản
chế phẩm sinh học. Sử dụng phƣơng pháp đông khô , quá trình sấy nếu cần thiết có thể
bổ sung các chất bảo vệ để giúp nâng cao khả năng sống sót của tế bào vi sinh vật sau
khi sấy.
- Bổ sung chất bảo quản
- 22 -
Công đoạn này giúp tăng thời gian bảo quản vi sinh vật trong một số sản phẩm .
Chất này sẽ giúp tăng khả sống sót của vi sinh vật , giúp nâng cao tính ổn định của sản
phẩm.
- Kiểm soát chất lƣợng
Kiểm soát chất lƣợng đƣợc thực hiện trong quá trình sản xuất và sản phẩm cuối
cùng. Nó bao gồm quá trì nh kiểm tra độ thuần khiết của chủng vi sinh vật , phân tích
các chất không mong muốn (ví dụ độc tố nấm mốc và kim loại nặng). Vi sinh vật đƣợc
kiểm tra tí nh an toàn không gây bất kỳ nguy hiể m cho sƣ́c khỏe động vật ngay cả trong
trƣờng hợp sƣ̉ dụng quá liều . Ngoài ra, chế phẩm còn đƣợc kiểm tra tí nh an toàn với
con ngƣời và môi trƣờng, đảm bảo không gây ảnh hƣởng tiêu cƣ̣c nào.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Ngày nay probiotic đƣợc sử dụng khá hiệu quả để phòng bệnh. Nhiều vi sinh
đƣợc sử dụng để sản xuất ra các chế phẩm nhằm kiểm soát côn trùng gây hại cho cây
trồng nhƣ vi khuẩn Bacillus thuringiensis, nấm Beauveria bassiana, Metarrhizium
anisopliae,... Ngoài ra các chế phẩm vi sinh còn đƣợc sử dụng để làm phân bón vi sinh
nhằm phân giải các chất hữu cơ làm giàu cho đất. Các chế phẩm vi sinh sử dụng trong
các hệ thống xử lý rác thải và nƣớc thải. Nhƣng việc sử dụng các chế phẩm vi sinh
trong nuôi thủy sản vẫn còn là vấn đề khá mới. Các chế phẩm sử dụng trong nuôi thủy
sản hiện nay có thể chia làm 3 loại. Các chế phẩm có tính chất probiotic gồm những vi
sinh vật sống nhƣ các vi khuẩn thuộc giống Bacillus, Lactobacillus, Saccharomyces…
ngƣời ta thƣờng trộn vào thức ăn. Nhóm thứ hai gồm các vi sinh vật có tính đối kháng
hoặc cạnh tranh thức ăn với vi sinh vật gây bệnh nhƣ vi khuẩn Bacillus licheniformis,
Bacillus sp., Vibrio alginolyticus… Nhóm thứ 3 gồm các vi sinh vật cải thiện chất
lƣợng môi trƣờng nhƣ vi khuẩn Nitrosomonas, Nitrobacter, Actinomyces, các loài
Bacillus khác nhau, các loại tảo, các vi khuẩn tía không lƣu huỳnh nhƣ Rhodobacter
sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas palutris,
Rhodomicrobium vanniell, các loại nấm Aspergillus oryzae, Aspergillus niger,
Rhizopus sp.,… Tuy nhiên có nhiều chủng vi sinh vật thực hiện đƣợc nhiều chức năng
khác nhau nên ranh giới giữa 3 nhóm này đôi khi không đƣợc phân chia rõ ràng, vì vậy
ngày nay nhiều ngƣời gọi chung các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nuôi thủy sản là
probiotic (Maqsood, 2010).
- 23 -
Đã có nhiều dẫn liệu trên thế giới cho thấy đã ứng dụng chế phẩm probiotic vào
trong việc nuôi tôm nhƣ: Griffith (1995) thông báo nhờ việc đƣa probiotic vào nuôi
tôm giống ở Ecuador trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ
để làm vệ sinh ở các bể nuôi từ 7 ngày trong một tháng đến 21 ngày trong một năm,
sản lƣợng tôm giống tăng 35%, và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94%.
Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm sinh học trong nuôi
tôm, đặc biệt ở Thái Lan. Jiravanichpaisal và cộng sự (1997), đã sử dụng Lactobacillus
sp. trong nuôi tôm sú. Ở Trung Quốc, nghiên cứu probiotic trong nuôi thủy sản đƣợc
tập trung vào vi khuẩn quang hợp. Zhenguo và cộng sự (1992) nghiên cứu 3 chủng vi
khuẩn quang hợp sử dụng cho tôm bằng cách cho vào thức ăn hoặc cho vào nƣớc nuôi
tôm cho thấy có sự gia tăng khả năng phát triển của tôm, loại trừ nhanh chóng NH 3-N,
H2S, acid hữu cơ và những chất có hại, cải thiện chất lƣợng nƣớc, cân bằng độ pH.
Zhermant và cộng sự (1997), cho biết khi nuôi chủng vi khuẩn probiotic trong bể với
ấu trùng tôm Litopenaeus vannamei với mật độ 103 CFU/ml thì đã ngăn cản đƣợc sự
xâm nhiễm các vi khuẩn gây bệnh ngay ở nồng độ 107 CFU/ml. Nấm men và nấm mốc
cũng đƣợc sử dụng để cải thiện tỷ lệ sống của ấu trùng tôm Litopenaeus vannamei
(Intriago et al., 1998).
Nogami và Maeda (1992), đã phân lập một chủng vi khuẩn từ một ao nuôi tôm.
Các chủng vi khuẩn đƣợc tìm thấy để cải thiện sự phát triển của ấu trùng cua và ức chế
sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt là Vibrio spp. Từ đó, tỷ lệ sống của
ấu trùng cua đã tăng lên rất nhiều bởi việc bổ sung các vi khuẩn probiotic vào môi
trƣờng nƣớc nuôi. Họ cũng cho rằng các vi khuẩn có thể cải thiện tình trạng sinh lý
của ấu trùng cua bằng cách nhƣ là một nguồn dinh dƣỡng cung cấp trong quá trình
tăng trƣởng của nó (Maqsood, 2010).
Garriques và Arevalo (1995), báo cáo rằng việc sử dụng của V. alginolyticus
làm probiotic có thể làm tăng tỷ lệ sống và tăng trƣởng tôm Thẻ chân trắng do vi
khuẩn gây bệnh không có khả năng cạnh tranh, và có thể làm giảm hoặc loại bỏ sự cần
thiết phải dự phòng điều trị kháng sinh trong hệ thống nuôi thâm canh ấu trùng. Họ tin
rằng trong tự nhiên một tỷ lệ rất nhỏ của vi khuẩn Vibrio sp. là thật sự gây bệnh. Trong
nghiên cứu, việc bổ sung các vi khuẩn V. alginolyticus dẫn đến tăng tỷ lệ sống và mức
độ tăng trƣởng.
- 24 -
Jiravanichpaisal và cộng sự (1997), báo cáo việc sử dụng Lactobacillus sp.
nhƣ là các vi khuẩn probiotic ở tôm sú giúp điều trị chống các bệnh đốm trắng và điều
tra sự tăng trƣởng của một số vi khuẩn probiotic, và sự sống của chúng trong nƣớc
biển trong vòng 7 ngày. Khả năng ức chế hoạt động của Lactobacillus sp. đối với hoạt
động của vi khuẩn Vibrio sp., E. coli, Staphylococcus sp., đã đƣợc xác định.
Moriarty (1999), đã báo cáo thử nghiệm thành công vi khuẩn probiotic thay vì
dùng kháng sinh để kiểm soát phẩy khuẩn trong các trang trại tôm ở Negros,
Philippine. Các tác dụng của ozon và probiotic vào sự sống còn của tôm sú (Penaeus
monodon) đã đƣợc ghi lại bởi Meunpol và cộng sự (2003).
Rengpipat và cộng sự (2000), đã nghiên cứu về việc sử dụng Bacillus spp. để
tăng sức đề kháng của tôm sú. Trong một thử nghiệm khác cũng đã đƣợc thực hiện bởi
Rengpipat và cộng sự (2003), về sự tăng trƣởng và khả năng chống vi khuẩn Vibrio
trên tôm sú (P. monodon) đƣợc cho ăn Bacillus sp. S11. Có thể thấy rằng tốc độ tăng
trƣởng và tỷ lệ sống của tôm nuôi đƣợc bổ sung probiotic cao hơn đáng kể hơn so với
khi không bổ sung probiotic vào thức ăn nuôi tôm (Farzanfar, 2006).
Tuy nhiên, do kết quả của sự tích tụ các chất thải từ quá trình trao đổi chất của
sinh vật nuôi cấy, phân hủy thức ăn chƣa sử dụng và phân hủy của vật liệu sinh học
(Prabhu et al., 1999). Lúc này, các ứng dụng của một nhóm vi sinh vật có lợi nhƣ
Lactobacillus, Bacillus, Nitrosomonas, Cellulomonas, Nitrobacter, Pseudomonas,
Rhodoseudomonas, Nitrosomonas và Acinetobacter sẽ rất hữu ích cho việc kiểm soát
các vi sinh vật gây bệnh và chất lƣợng nƣớc (Prabhu et al., 1999; Shariff et al., 2001;
Irianto và Austin, 2002).
Có nhiều báo cáo khác về những lợi thế của việc sử dụng vi khuẩn Gram dƣơng
trong nuôi trồng thủy sản. Theo Irianto và Austin (2002), probiotic kích thích miễn
dịch của vật chủ bằng cách tăng số lƣợng hồng cầu, đại thực bào và tế bào lympho, họ
báo cáo rằng cho ăn với chế phẩm sinh học Gram dƣơng và Gram âm ở 107 CFU/g
thức ăn dẫn đến việc kích thích sự gia tăng số lƣợng hồng cầu, đại thực bào và tế bào
lympho, và hoạt động của lysozyme tăng cƣờng trong vòng 2 tuần cho ăn với chế
phẩm sinh học.
Việc lạm dụng kháng sinh trong cả hai ngành y học và nông nghiệp dẫn đến sự
xuất hiện và lây lan của vi khuẩn kháng thuốc. Vi khuẩn kháng kháng sinh đang gia
tăng (Khachatourions, 1998). Sự gia tăng các mối lo âu về vi sinh vật kháng thuốc đã
- 25 -
dẫn đến đề xuất của thay thế các phƣơng pháp phòng bệnh, chẳng hạn nhƣ vi khuẩn
probiotic (Vaseeharan, Ramasamy, 2003).
Vibrio spp., đặc biệt là V. harveyi là những vi khuẩn chính liên quan đến các
mầm bệnh ở tôm. Thuốc kháng sinh nhƣ chloramphenicol, oxytetracycline,
furazolidone và streptomycine đã đƣợc sử dụng để kiểm soát các vi khuẩn, nhƣng cho
hiệu quả rất thấp. Clo đƣợc dùng rộng rãi trong các trại sản xuất giống để giết các
động vật phù du trƣớc khi thả tôm giống, nhƣng sử dụng nó lại kích thích sự phát triển
của nhiều gen kháng kháng sinh của vi khuẩn. Làm gia tăng nhanh chóng số lƣợng V.
harveyi, bởi vì clo làm giảm số lƣợng các đối thủ cạnh tranh, tiêu diệt tảo, do đó tăng
nguồn thức ăn cho V. harveyi. Nếu kháng sinh hoặc thuốc khử trùng đƣợc sử dụng để
diệt vi khuẩn, một số vi khuẩn sẽ tồn tại, bởi vì chúng mang gen kháng. Và sau đó sẽ
phát triển nhanh chóng bởi vì đối thủ cạnh tranh của chúng đƣợc loại bỏ (Moriarty,
1999). Do một số vấn đề và hạn chế trong việc sử dụng nội tiết tố và thuốc kháng sinh
cho động vật và ngƣời tiêu dùng, vi khuẩn probiotic là một ứng cử viên tốt để cải thiện
việc tiêu hóa các chất dinh dƣỡng và tăng trƣởng của động vật thủy sản (Irianto,
Austin, 2002; Lara-Flores et al., 2003).
Rengpipat và cộng sự (2000) cho rằng việc sử dụng vi khuẩn Bacillus sp. S11
giúp bảo vệ bệnh bằng cách kích hoạt cả hai hệ thống miễn dịch (miễn dịch tế bào và
miễn dịch dịch thể) ở tôm sú (P. monodon). Balca'zar (2003), đã chứng minh rằng một
hỗn hợp của các chủng vi khuẩn (Bacillus và Vibrios sp.) ảnh hƣởng tích cực đến tăng
trƣởng và tỷ lệ sống của tôm, bảo vệ chống lại các mầm bệnh do vi khuẩn Vibrio
harveyi và hội chứng virus đốm trắng. Tác dụng bảo vệ này là do kích thích hệ thống
miễn dịch, bằng cách tăng thực bào và hoạt tính kháng khuẩn.
Sự sinh trƣởng của V. harveyi gây bệnh đã đƣợc kiểm soát bởi các tác dụng
probiotic của Bacillus subtilis BT23 trong điều kiện in vitro và in vivo. Khi tôm sú
đƣợc bổ sung với B. subtilis BT23, đƣợc phân lập từ các ao nuôi tôm, với mật độ của
tế bào 106 - 108 CFU/ml, đƣợc cảm nhiễm với V. harveyi ở mật độ tế bào 103 – 104
CFU/ml cho thấy giảm 90% tỷ lệ tôm chết (Vaseeharan, Ramasamy, 2003). Hiệu quả
probiotic trên tôm thẻ (L. Vannamei) đã đƣợc báo cáo bằng cách sử dụng ba chủng
phân lập từ gan tụy của tôm. Các chủng này đƣợc xác định là Vibrio P62, Vibrio P63
và Bacillus P64 và tỷ lệ phần trăm ức chế đạt đƣợc so với V. harveyi S2 tƣơng ứng là
- 26 -
83, 60 và 58%. Phân tích mô học sau khi các thử nghiệm đã xác nhận rằng các chủng
probiotic không có tác dụng gây bệnh trên vật chủ (Gullian et al., 2004).
Vibrio owensii là loài vi khuẩn mới đƣợc công bố gần đây (Cano-Gómez et al.,
2010) và chủng V. owensii DY05 đã đƣợc chỉ ra là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên
ấu trùng tôm hùm bông ở Australia (Goulden et al., 2012a). Trong một nghiên cứu mới
đây, Goulden và cộng sự (2012b) đã tuyển chọn đƣợc các chủng probiotic (Vibrio sp.
PP05 và Pseudoalteromonas sp. PP107) có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với chủng
DY05 và cho thấy chúng có khả năng bảo vệ ấu trùng tôm hùm bông sau khi lây
nhiễm với DY05.
Từ thực tế cho thấy vấn đề nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic rất đƣợc
quan tâm nghiên cứu. Để sản xuất đƣợc chế phẩm probiotic cần phải dựa trên các tiêu
chuẩn vi sinh vật, khả năng tồn tại của vi sinh vật trong quá trình chế biến và việc bảo
quản sản phẩm. Các yếu tố công nghệ trong sản xuất probiotic đóng một vai trò rất
lớn, nhƣ: Công nghệ lên men đóng vai trò quan trọng vì sự phát triển của vi sinh vật
phụ thuộc vào thành phần chất dinh dƣỡng, điều kiện nuôi cấy, khuấy đảo… Ngoài ra
còn có tác động của nhiệt độ trong công nghệ sấy khô hoặc đông khô làm ảnh hƣởng
đến khả năng sống sót của vi khuẩn. Do đó nghiên cứu công nghệ sản xuất phù hợp
đóng vai trò quan trọng trong sản xuất chế phẩm probiotic.
Để sản xuất đƣợc chế phẩm probiotic, đầu tiên ngƣời ta cần phải chọn đƣợc
chủng vi sinh vật phù hợp. Các vi sinh vật này phải đƣợc công nhận là GRAS (vi sinh
vật an toàn), các vi sinh vật cần phải có khả năng tồn tại trong vật chủ nhƣ chịu đƣợc
pH, điều kiện muối mật… Ngoài ra các vi sinh vật này còn phải có khả năng kích thích
phản ứng miễn dịch, có thể sản sinh các chất kháng khuẩn nhƣ bacteriocin và khả năng
sống sót của vi khuẩn này trong quá trình chế biến (Kosin, Rakshit, 2006).
Quá trình lên men ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả sản xuất probiotic do đó
ngƣời ta đặc biệt quan tâm đến các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men. Ngoài các
yếu tố nhƣ nhiệt độ, pH, thời gian lên men thích hợp ngƣời ta còn quan tâm đến môi
trƣờng nuôi cấy vì môi trƣờng nuôi cấy không chỉ ảnh hƣởng đến khả năng lên men
mà còn ảnh hƣởng đến sự tồn tại của vi khuẩn probiotic sau này. Ví dụ có các nghiên
cứu về ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến các chủng vi khuẩn probiotic ảnh
hƣởng của môi trƣờng đến vi khuẩn Lactobacillus của Siaterlis và cộng sự (2009). Kỹ
- 27 -
thuật lên men đối với sản xuất probiotic của Lacroix và Yildirim (2007), để làm tăng
khả năng sản xuất thƣơng mại và ứng dụng của chế phẩm probiotic.
Để thuận lợi cho quá trình bảo quản cũng nhƣ sử dụng ngƣời ta sử dụng
phƣơng pháp đông khô để sản xuất chế phẩm probiotic. Với phƣơng pháp này cho thấy
khả năng sống sót là cao nhất. Để tăng khả năng sống sót của những vi khuẩn probiotic
ngƣời ta thƣờng bổ sung các chất chống đông để làm tăng hiệu quả của quá trình đông
khô nhƣ là nghiên cứu của Siaterlis và cộng sự (2009), về ảnh hƣởng của chất chống
đông đến sự sống sót của Lactobacillus sau khi đông khô. Ngoài ra ngƣời ta có thể
dùng phƣơng pháp sấy phun để sản xuất probiotic. Nghiên cứu của Yadav và cộng sự
(2009) đã nâng cao tỷ lệ sống của Bacillus coagulans sau khi sấy phun với lactate
canxi.
Mặc dù đã có các công trình nghiên cứu sản xuất probiotic cho động vật thủy
sản nhƣng hiện nay vấn đề nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic vẫn tiếp tục đang
đƣợc đầu tƣ nghiên cứu để xây dựng quy trình sản xuất thƣơng mại. Những nghiên
cứu về chế phẩm probiotic cho tôm hùm còn rất hạn chế.
1.3.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về sản xuất các chế phẩm sinh học để cải
thiện môi trƣờng nuôi tôm hoặc tác dụng của probiotic trong việc nuôi tôm nhƣng còn
tƣơng đối ít. Trong những năm gần đây Bộ Thủy sản đã cho phép lƣu hành sử dụng
nhiều chế phẩm vi sinh, nhiều nơi đã làm quen với với việc sử dụng các chế phẩm vi
sinh này và cho kết quả khá tốt.
Các nghiên cứu sản xuất thành công chế phẩm probiotic nhƣ: Nghiên cứu tạo
chế phẩm Bioche và đánh giá tác dụng của chế phẩm đến môi trƣờng nƣớc nuôi tôm
cá, cũng nhƣ nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus spp. và
Lactobacillus spp. có khả năng ứng dụng để xử lý môi trƣờng nuôi tôm cá của Nguyễn
Liêu Ba (2003).
Nghiên cứu sản xuất thành công chế phẩm BIOII dùng trong nuôi trồng thủy
sản của Võ Thị Hạnh và cộng sự (2003). Chế phẩm BIO II có tác dụng: phân hủy
những thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định pH và màu nƣớc ao, kìm hãm sự
tăng trƣởng của các vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cá nhƣ các vi khuẩn Vibrio spp.,
tăng năng suất nuôi trồng.
- 28 -
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic từ Lactobacillus fermentumha 6 bằng
phƣơng pháp sấy phun của Lƣơng Hùng Tiến và cộng sự (2010).
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thủy (2009), ở Viện nuôi trồng thủy sản 3,
Nha Trang, đã chỉ ra hiệu quả của probiotic trong nuôi tôm hùm gai tại Cam Ranh,
Khánh Hòa. Lợi ích của probiotic đƣợc thêm vào thức ăn chăn nuôi đƣợc đƣợc đánh
giá. Các phƣơng pháp điều trị bao gồm bổ sung Sanolife probiotic ở 4g/kg thức ăn
hoặc 8 g/kg thức ăn. Thức ăn, đã đƣợc pha trộn với các chế phẩm sinh học một giờ
trƣớc khi ăn để đảm bảo đƣợc bao bọc probiotic trên thức ăn. Con vật đƣợc cho ăn một
lần mỗi ngày vào buổi sáng. Mỗi lần điều trị bao gồm 2 lồng (1,8 × 1,9 × 1,2 m), mỗi
lồng thả 4 con tôm hùm (Panulirus ornatus - trọng lƣợng trung bình 867 g), đã đƣợc
ngập nƣớc ở độ sâu 5 m. Lồng đƣợc đặt tại Cam Ranh (Khánh Hòa, Việt Nam). Mẫu
máu đƣợc lấy trƣớc khi thả giống và sau đó tại một khoảng 30 ngày để xác định các
tác nhân gây bệnh khác nhau. Tốc độ tăng trƣởng và lƣợng thức ăn của tôm đƣợc theo
dõi trong thời gian thử nghiệm kéo dài 6 tháng.
Nói tóm lại, tuy đã có những nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic ứng dụng
trong nuôi trồng thủy sản nhƣng còn rất hạn chế và nhất là vấn đề nghiên cứu sản xuất
probiotic trong nuôi tôm hùm lồng vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam.
- 29 -
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
- Chủng Bacillus spp. (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4) đƣợc phân lập từ tôm hùm
bông lấy từ bộ sƣu tập chủng của Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng
Đại học Nha Trang.
- Chủng chuẩn sinh protease Bacillus sp. L5’ đƣợc lấy từ bộ sƣu tập chủng của
Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang.
- Các chủng Bacillus spp. (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4, L5’) đƣợc nuôi cấy
trên môi trƣờng TSB, pH 7,3 ± 0,2, lắc 180 vòng/phút.
- Các chủng Vibrio spp. (V1.1, V3.3) đƣợc lấy từ bộ sƣu tập chủng của Viện
Công nghệ sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang.
- Chủng Vibrio owensii DY05 là chủng vi khuẩn đã đƣợc chứng minh gây bệnh
trên ấu trùng tôm hùm bông (Goulden et al., 2012a), đƣợc cung cấp từ Viện Hải dƣơng
học Australia (AIMS).
- Các chủng Vibrio (V1.1; V3.3; DYO5) đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng TCBS
hoặc TSB, bổ sung 1,5% NaCl, lắc 180 vòng/ phút.
2.1.2. Thức ăn tôm hùm và dầu mực
Thức ăn tôm hùm đƣợc sản xuất theo công thức của Lại Văn Hùng (2007) –
Trƣờng Đại học Nha Trang.
Dầu mực đƣợc cung cấp bởi công ty quốc tế Hải Mã
2.1.3. Hóa chất, môi trƣờng
a) Môi trƣờng tăng sinh APW (Alkaline Peptone Water)

Pepton : 10 g Natri clorua (NaCl) : 30 g
Nƣớc cất : 1 l pH = 8,5 ± 0,2
b) Môi trƣờng nuôi cấy TSB (Trypton Soy Broth)
Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton: 3 g
NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g
Glucose: 2,5 g Nƣớc cất: 1 l

- 30 -
pH (ở 250C) 7,3 ± 0,2
c) Môi trƣờng rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số TSA (Trypton soy agar)
TSB: 30 g
Agar: 15÷20 g
Nƣớc: 1l
d) Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật LB (Lauria Broth)
Trypton: 10 g; Cao nấm men: 5 g;
Natri clorua (NaCl): 30 g; Nƣớc cất: 1 l
pH = 7 ± 0,2
e) Dung dịch nƣớc muối sinh lý
NaCl: 8,5 g
Nƣớc cất: 1 l
f) Thuốc nhuộm Crytal Violet
Tím violet: 1 g
Rƣợu ethylic: 1 g
Phenol tinh thể : 2 g
Nƣớc cất: 100 ml
g) Thuốc nhuộm Lugol
Iod tinh thể : 1 g
KI :2g
Nƣớc cất : 200 ml
h) Thuốc nhuộm Fuchsin
Fuschin kiềm :1g
Rƣợu ethylic 95% : 10 ml
Phenol tinh thể :5g
Nƣớc cất : 100 ml
i) Chất chống đông
Mantodextrin, lactose và glycerol
- 31 -
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng
- Cân phân tích (Shimadzu, Nhật).
- Máy ly tâm (Ependof Mikro120, Đức).
- Máy ly tâm lạnh ống nhỏ (Mega 17R Labkorea, Hàn Quốc).
- Máy ly tâm thể tích lớn (Labkorea, Hàn Quốc).
- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam).
- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ).
- Máy định lƣợng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS) (Carry 100
Bio, Úc).
- Máy lắc vòng (GFL 3005, Đức).
- Máy lắc ngang (Labkorea, Hàn Quốc).
- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha).
- Tủ sấy (Binder, Đức).
- Nồi hấp thanh trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan).
- Lò vi sóng (Panasonic, Hàn Quốc).
- Thiết bị lên men BioFlo 110.
- Máy đông khô Telstar LyoBeta 35.
- Tủ ấm.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định hoạt tính sinh protease
Xác đị nh theo phƣơng pháp đo đƣờng kính phân giải casein . Vi khuẩn đƣợc nuôi
cấy lắc 180 vòng/phút ở 300C trong môi trƣờng dịch thể, sau 24h tiến hành ly tâm dịch
nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch enzyme nhỏ vào lỗ thạch
đã khoan trên đĩa petri chứa môi trƣờng cơ chất. Để vào tủ ấm 300C sau 24 h xác định
vòng phân giải.
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo công thức: H  D  d , trong đó D: đƣờng
kính vòng phân giải + đƣờng kính lỗ khoan, d: đƣờng kính lỗ khoan.
- 32 -
2.2.2. Xác định hoạt tính kháng Vibrio spp. gây bệnh trên tôm hùm
Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán thạch đĩa (Chythanya et al., 2002) để đánh
giá khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn mới phân lập đƣợc.
Từ môi trƣờng giữ giống, các chủng vi khuẩn đã phân lập đƣợc nuôi cấy trong
môi trƣờng TSB, bổ sung 1,5% NaCl, trong 14 - 16 h. Sau đó dịch nuôi cấy ở mật độ
tế bào khoảng 105 CFU/ml thì đem ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C, thu
dịch nổi. Lấy 80 μl dung dịch này nhỏ vào mỗi giếng của đĩa thạch đã trang đều vi
khuẩn chỉ thị (Vibrio sp. V1.1 hoặc Vibrio sp. V3.3 hoặc Vibrio owensii DY05) sau
khi nuôi tới mật độ 104 CFU/ml. Sau đó, đĩa đƣợc ủ ở 370C trong 24 - 48 h và xác
định đƣờng kính vòng kháng khuẩn (Ravi et al, 2007).
2.2.3. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ đĩa thạch hòa vào một giọt nƣớc cất
trên phiến kính, để khô tự nhiên. Sau đó cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành
nhuộm bằng crytal violet trong 30 giây, rửa với nƣớc cất. Tiếp tục nhỏ dung dịch
lugol, để 30 giây rồi rửa bằng nƣớc cất, thấm khô. Tẩy bằng cồn 960 trong 1 giây và
rửa lại bằng nƣớc cất sau đó nhuộm dung dịch fuschin lên lam kính trong 1 phút, đổ bỏ
dung dịch và rửa qua nƣớc. Để khô tự nhiên, soi vật kính dầu. Khảo sát hình thái tế
bào và tính chất bắt màu của vi khuẩn dƣới kính hiển vi với vật kính dầu X-100. Vi
khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin, vi khuẩn Gram (+) bắt màu
tím của violet.
2.2.4. Định danh vi khuẩn Bacillus
Các chủng Bacillus đƣợc định danh bằng bộ kít hóa sinh API 50CHB
(BioMérieux, Pháp) dựa trên 49 phản ứng lên men đƣờng và 12 thử nghiệm hoạt tính
enzyme theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm
apiweb (BioMérieux, Pháp).
2.2.5. Xác định khả năng sinh trƣởng
Để đánh giá khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn cũng nhƣ khả năng tích lũy sinh
khối ta sử dụng phƣơng pháp đo mật độ quang (OD). Các thí nghiệm đƣợc thực hiện ở
bƣớc sóng 540 nm.
- Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành
một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản
ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi
- 33 -
hiện diện trong môi trƣờng cũng làm môi trƣờng trở nên đục. Giá trị OD (optical
density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trƣởng
càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn thông qua đo độ
đục bằng máy so màu.
- Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng máy quang phổ.
Cho môi trƣờng vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 540 nm, đƣa về
giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào cuvet số 2 và cho vào máy đo, đọc
kết quả hiện trên màn hình.
2.2.6. Nuôi cấy và thu sinh khối probiotic
Nhân giống – lên men: Các chủng vi khuẩn probiotic đƣợc nuôi cấy độc lập
trên các môi trƣờng dinh dƣỡng phù hợp với điều kiện nhiệt độ, pH, sục khí, khuấy
trộn tối ƣu cho từng chủng. Lên men đƣợc tiến hành ở 2 mức độ: quy mô phòng thí
nghiệm đƣợc thực hiện trong bình tam giác 100ml và quy mô công nghiệp đƣợc trong
thiết bị BioFlo 110 (10 lít).
Ly tâm thu sinh khối: sau quá trình tăng sinh, sinh khối tế bào đƣợc thu hồi qua
quá trình ly tâm bằng máy ly tâm liên tục với tốc độ ly tâm trong khoảng 6000-8000
vòng/phút. Hệ thống ly tâm liên tục do Đức sản xuất là hệ thống mới tại Việt Nam cho
phép ly tâm và hạn chế tối đa việc nhiễm khuẩn trong quá trình ly tâm mà các phƣơng
pháp ly tâm theo mẻ hiện hành không thể khắc phục đƣợc. Sau khi ly tâm, sinh khối
đƣợc rửa bằng nƣớc muối sinh lý ở nhiệt độ 4oC.
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác đị nh các điều kiện nuôi cấy thí ch hợp
Các chủng vi khuẩn nghiên cứu đƣợc nuôi trên môi trƣờng TSB tại pH 7,3 ở
nhiệt độ 370C. Để xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp, lần lƣợt các thông số: nguồn
cacbon, nguồn nitơ, nồng độ muối, pH môi trƣờng và nhiệt độ đƣợc thay đổi trong khi
các thông số còn lại đƣợc cố định và cải tiến dần. Sau 3 giờ nuôi, khả năng sinh trƣởng
của vi khuẩn đƣợc xác định bằng phép đo độ đục của dịch nuôi tại bƣớc sóng 540 nm
(OD540) trên máy đo quang phổ Cary 100 Bio (Varian, Mỹ).
- Nguồn cacbon:
Các chủng probiotic đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng gồm các nguồn cacbon khác
nhau: glucose, rỉ đƣờng, tinh bột bắp , tinh bột sắn , tại pH 7,3 lắc 180 vòng/phút. Lƣ̣a
chọn nguồn cacbon thí ch hợp thông qua việc xác đị nh khả năng sinh trƣởng.
- Nguồn nitơ:
- 34 -
Các chủng probiotic đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng gồm các nguồn nitơ khác
nhau: bột mì , amoni sulfat, pepton, tại pH 7,3 lắc 180 vòng/phút. Lƣ̣a chọn nguồn nitơ
thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trƣởng.
- Nồng độ muối:
Các chủng probiotic đƣợc nuôi cấ y trên môi trƣờng TSB , lắc 180 vòng/phút, ở
các nồng độ muối 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, tại pH 7,3. Lƣ̣a chọn nồ ng độ muối thí ch
hợp thông qua việc xác đị nh khả năng sinh trƣởng.
- pH môi trƣờng:
Các chủng probiotic đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng TSB, nồng độ muối 1%, lắc
180 vòng/phút, tại các giá trị pH 5, 6, 7, 8, 9. Lƣ̣a chọn pH môi trƣờ ng thí ch hợp thông
qua việc xác đị nh khả năng sinh trƣởng.
- Nhiệt độ:
Các chủng probiotic đƣợc muôi c ấy trên môi trƣờng TSB , tại pH 8, lắc 180
vòng/phút, ở các nhiệt độ 310, 340, 370, 400C, nhiệt độ phòng (280-310C). Lƣ̣a chọn
nhiệt độ thích hợp thông qua xác định khả năng sinh trƣởng.
2.2.8. Bố trí thí nghiệm xây dựng quy trình lên men ở quy mô pilot
Chủng nghiên cứu có hoạt tính probiotic mạnh đƣợc chọn lên men ở thiết bị
BioFlo 110 thể tích 10 lít. Chủng probiotic đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng TSB cải tiến
chứa nguồn cacbon là rỉ đƣờng. Để xác định điều kiện lên men thích hợp, lần lƣợt các
thông số: pH môi trƣờng, nhiệt độ và thời gian lên men đƣợc thay đổi trong khi các
thông số còn lại đƣợc cố định và cải tiến dần. Khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn đƣợc
xác định bằng phép đo độ đục của dịch nuôi tại bƣớc sóng 540 nm (OD540) trên máy
đo quang phổ Cary 100 Bio (Varian, Mỹ).
- pH:
Môi trƣờng lên men gồm có : 20g/l pepton; 10g/l NaCl; 2,5g/l K2HPO4; 2,5g/l rỉ
đƣờng. Dịch lên men đƣợc hấp khƣ̉ trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút. Tiến hành
lên men ở nhiệt độ 280C, tốc độ quấy đảo 180 vòng/phút, nồng độ muối 1% và các giá
trị pH 6; 7; 8; 9, thời gian lên men là 3 giờ. Tƣ̀ đó lƣ̣a chọn đƣợc pH môi tr ƣờng thích
hợp thông qua việc xác đị nh khả năng sinh trƣởng.
- Nhiệt độ:
Môi trƣờng lên men gồm có : 20 g/l pepton; 10 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4; 2,5 g/l
rỉ đƣờng . Dịch lên men đƣợc hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút. Tiến
- 35 -
hành lên men ở nhiệt độ 280C, tốc độ quấy đảo 180 vòng/phút, nồng độ muối 1%, pH
8 và các giá trị nhiệt độ 28; 31; 34; 37; 40, trong thời gian 3 giờ. Tƣ̀ đó lƣ̣a chọn đƣợc
nhiệt độ thích hợp thông qua việc xác đị nh khả năng sinh trƣởng.
- Thời gian:
Môi trƣờng lên men gồm có : 20 g/l pepton; 10 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4; 2,5 g/l
rỉ đƣờng . Dịch lên men đƣợc hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút. Tiến
hành lên men ở nhiệt độ 340C, tốc độ quấy đảo 180 vòng/phút, nồng độ muối 1%, pH
8. Sau một giờ đồng hồ tiến hành thu dịch lên men đo độ đục ở OD540 . Tƣ̀ đó lƣ̣a chọn
đƣợc thời gian thí ch hợp thông qua việc xác đị nh khả năng sinh trƣởng.
2.2.9. Xác định các thông số của quá trình đông khô
Mục đích để xây dựng quy trình đông khô chế phẩm probiotic.
a. Nguyên lý đông khô
Đầu tiên nguyên liệu đƣợc làm lạnh đông xuống nhiệt độ thấp hơn điểm đông
(tùy loại sản phẩm). Sau khi làm đông, áp suất trong buồng giảm tới 1 giá trị làm thăng
hoa nƣớc đá. Hơi nƣớc tạo bởi thăng hoa sẽ khuếch tán ra khỏi sản phẩm. Trong quá
trình đông khô thì sản phẩm ở trong môi trƣờng áp suất chân không (nhỏ hơn 6,11
mBar) và hơi nƣớc bay ra từ sản phẩm sẽ đƣợc ngƣng tụ tại bề mặt của bộ ngƣng tụ.
Khoảng 90-99% lƣợng nƣớc đƣợc lấy ra từ sản phẩm trong quá trình đông khô
chính. Lƣợng nƣớc bám dính còn lại sẽ đƣợc lấy ra trong quá trình đông khô cuối cùng
dƣới điều kiện áp suất chân không rất thấp (Martin Christ, 2009).
Nếu áp suất khí quyển lớn hơn 6.11 mBar và cố định thì nƣớc sẽ tồn tại ở 3
trạng thái: lỏng, rắn và khí. Bằng việc thay đổi nhiệt độ: Tại áp suất chính xác 6.11
mBar và nhiệt độ 00C thì nƣớc sẽ tồn tại cả ở 3 trạng thái rắn, lỏng, khí. Nếu áp suất
nhỏ hơn 6.11 mBar thì nƣớc sẽ chuyển trực tiếp từ rắn sang khí và ngƣợc lại bằng việc
thay đổi nhiệt độ (quá trình chuyển trực tiếp từ rắn sang khí đƣợc gọi là quá trình
thăng hoa).
b. Các bƣớc của quá trình đông khô
- Phase 1: Cấp đông
Điểm đông có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo nhiệt độ và điện trở
trong phase làm đông tại điều kiện áp suất khí quyển. Điểm đông của sản phẩm là
điểm cắt giữa nhiệt độ và điện trở. Điện trở của sản phẩm thay đổi khi chuyển từ trạng
- 36 -
thái lỏng sang trạng thái rắn. Nếu cấp đông trong các bình cố định thì chiều dày của
lớp sản phẩm từ 1-2 cm. Vì nếu quá dày gây bất lợi cho thời gian sấy.
- Phase 2: Bơm chân không
Nếu sản phẩm đạt nhiệt độ đông khô và toàn bộ sản phẩm đã bị đông thì phase
bơm chân không bắt đầu. Trong phase này bơm chân không chạy khởi động và nhiệt
độ dàn ngƣng giảm xuống đến mức thấp nhất (thời gian chuẩn bị từ 15-30 phút).
Trong phase chuẩn bị giá không đƣợc cấp nhiệt và khoang không có áp suất chân
không, vì vậy van giữa bơm chân không và khoang phải đƣợc đóng.
- Phase 3: Làm khô cấp 1
Tại lúc bắt đầu giai đoạn làm khô cấp 1, áp suất sẽ giảm xuống tới áp suất chân
không, van điều khiển áp suất giữa khoang và bơm chân không mở ra. Trong quá trình
đông khô chính phải quan sát độ chân không và nhiệt độ dàn ngƣng. Nhiệt độ dàn
ngƣng phải thấp hơn nhiệt độ tại sản phẩm khoảng 50-150C trong toàn bộ quá trình. Áp
suất chân không phải thấp hơn áp suất chân không an toàn. Để thăng hoa thì cần thiết
phải cấp nhiệt cho sản phẩm qua giá, nhiệt độ của giá phải đƣợc tăng chậm từng bƣớc
và lớn nhất tới nhiệt độ phòng. Nếu dùng các chai đáy tròn thì năng lƣợng nhiệt đƣợc
cấp từ môi trƣờng.
Áp suất chân không: Nhiệt độ đông của sản phẩm là rất quan trọng để xác định
độ chân không và nhiệt độ khô. Trong quá trình khô, nhiệt độ sản phẩm đƣợc điều
chỉnh chủ yếu bởi áp suất chân không - theo áp suất bay hơi của nƣớc.
Trong quá trình khô thì phải đảm bảo sản phẩm không bị tan chảy, bởi vậy
nhiệt độ khô nên thấp hơn ít nhất nhiệt độ đông 100C. Căn cứ vào nhiệt độ này ta dễ
dàng tra đƣợc áp suất chân không khô theo bảng đƣờng cong áp suất bay hơi (Bảng
PL.17).
Áp suất an toàn: Để sản phẩm có độ an toàn cao nhất thì nhất thiết phải đặt áp
suất an toàn. Nếu áp suất trong buồng khô tăng quá cao (quá giới hạn áp suất an toàn)
thì nhiệt độ của giá cấp cho sản phẩm phải đƣợc dừng và quá trình thăng hoa chậm lại,
tránh đƣợc sự tan chảy của sản phẩm. Nhiệt độ an toàn nên thấp hơn 5 0C so với điểm
tan chảy (hay điểm đông). Theo đƣờng cong áp suất bay hơi dễ dàng tìm đƣợc p safe.
Áp suất báo động: Các máy lớn có máy điều nhiệt bằng chất lỏng thì có thể có
hệ thống cảnh báo áp suất báo động. Nếu áp suất trong buồng khô tăng tới giá trị đặt
áp suất báo động thì máy sẽ cắt cấp nhiệt cho sản phẩm. Bộ điều khiển sẽ cho ra âm
- 37 -
thanh báo động và nhiệt độ giá đƣợc làm lạnh xuống nhiệt độ tiền đông càng nhanh
càng tốt. Nhiệt độ báo động nên thấp hơn nhiệt độ đông từ 30 - 50C.
- Phase 4: Làm khô cấp 2
Nhiệt độ giá sẽ tăng lên đến 200- 300C và áp suất chân không sẽ giảm xuống
thấp nhất có thể (0,01 mBar) để hơi nƣớc thoát ra dễ dàng. Thời gian cho đông khô
cuối phụ thuộc vào từng loại sản phẩm (thông thƣờng 2 giờ).
Kết thúc: Khi kết thúc quá trình làm khô câp 2 thì khoang đông khô phải đƣợc
thông khí, thông thƣờng thông khí bằng không khí hay một loại khí trơ nhƣ nitơ.
Quá trình đông khô mới: Trƣớc khi bắt đầu quá trình đông khô mới thì dàn ngƣng
phải đƣợc xả đá và khoang đông khô phải đƣợc làm sạch và tiệt trùng.
c. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số đông khô tối ƣu cho quá trình đông khô vi
khuẩn probiotic
Cần xác định các thông số về nhiệt độ, áp suất và thời gian đông khô để xây
dựng quy trình đông khô. Quan sát hình thái vật lí (trạng thái, màu sắc) của các lọ
chứa dịch vi khuẩn probiotic ở từng giai đoạn. Sinh khối vi khuẩn sau đông khô sẽ
đƣợc tái huyền phù trong dung dịch NaCl 0,85%, xác định tỷ lệ tế bào sống. Qua đó
lựa chọn đƣợc thông số phù hợp cho quá trình đông khô.
Sinh khối vi khuẩn probiotic
Xác định các thông

Đông khô số nhiệt độ, áp suất,
thời gian đông khô,
hình thái vật lí
Xác định tỷ lệ sống
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác đị nh các thông số đông khô tối ƣu cho quá
trình đông khô vi khuẩn probiotic
2.2.10. Bố trí thí nghiệm xác định chất chống đông phù hợp cho quá trình đông khô
các vi khuẩn probiotic
Sinh khối tế bào sau khi ly tâm đƣợc bổ sung các chất chống đông
(maltodextrin, lactose, glycerol) ở các nồng độ 1%, 5%, 10% (Hubalek, 2003) và thực
hiện quy trình đông khô. Sinh khối sau khi đông khô đƣợc tái huyền phù trong dung
- 38 -
dịch NaCl 0,85% và xác định tỷ lệ tế bào sống chết. Qua đó lựa chọn chất chống đông
phù hợp. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần.
Chủng vi khuẩn
probiotic
pH = 7,3
Nuôi cấy Nhiệt độ 370C
Lắc 180 vòng / phút
Ly tâm 6000v/p
Ly tâm thu sinh khối Thời gian 30 phút
Nhiệt độ 40 C
Glycerol Lactose Maltodextrin
1% 5% 10%
Đông khô
Xác định tỷ lệ sống
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chất chống đông phù
hợp cho quá trình đông khô vi khuẩn probiotic
2.2.11. Xác định tỷ lệ tế bào sống sau đông khô
Xác định tỷ lệ sống của vi khuẩn probiotic sau khi đông khô bằng phƣơng pháp
đếm khuẩn lạc.
- Nguyên tắc: Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lƣợng tế bào vi
sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia
tạo thành khuẩn lạc trên môi trƣờng chọn lọc. Phƣơng pháp này có đặc điểm là cho
phép định lƣợng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy. Phƣơng
pháp đếm khuẩn lạc có thể thực hiện bằng kỹ thuật hộp trải hay hộp đổ với các thiết bị
hỗ trợ để đọc kết quả.
- 39 -
Trong phƣơng pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng
liên tiếp sao cho chọn đƣợc độ pha loãng có mật độ tế bào thích hợp. Số lƣợng khuẩn
lạc tối ƣu đƣợc đề nghị bởi các cơ quan có uy tín nhƣ FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn
lạc/đĩa. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít
nhất ba lần. Số lƣợng tế bào sống đƣợc tính bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU
(Colony forming unit) trên một đơn vị thể tích (ml).
- Cách tiến hành: Mật độ tế bào ở mỗi mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp
pha loãng, đổ đĩa và đếm khuẩn lạc (CFU/ml). Nuôi cấy vi khuẩn probiotic trên thạch
đĩa, quan sát khả năng sinh trƣởng của khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc và tính mật độ tế
bào của vi khuẩn probiotic trƣớc đông khô (A (CFU/ml)) và sau đông khô (B
(CFU/ml)). Tỷ lệ sống của vi khuẩn probiotic sau đông khô là B/A.
2.2.12. Xác định hàm lƣợng ẩm tồn dƣ
Mẫu đƣợc xác định hàm lƣợng ẩm tồn dƣ dựa trên nguyên tắc sấy mẫu đến khối
lƣợng không đổi ở nhiệt độ 1030C – 1050C.
Tiến hành sấy chén ở 1050C (đến khối lƣợng không đổi), sau đó cho chén vào
bình hút ẩm để 30 phút rồi mang đi cân để xác định khối lƣợng chén sau khi sấy (W1).
Cho mẫu vào cốc sấy cân đƣợc khối lƣợng W2. Đem chén đi sấy trong lò nung đến khi
khối lƣợng không đổi. Lấy chén ra và chuyển vào bình hút ẩm 30 phút và tiến hành
cân đƣợc khối lƣợng W3. Tiếp tục sấy trong 1 giờ và cân lại, nếu giữa hai quá trình cân
không lệch khối lƣợng quá 0,001 g thì dừng. Tất cả khối lƣợng xác định điều đƣợc tính
theo g (AOAC, 1990).
Hàm lƣợng ẩm tính theo công thức:
2.2.13. Khảo sát tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn

Đánh giá mức độ hòa tan của chế phẩm probiotic trong môi trƣờng nƣớc biển
bằng phƣơng pháp đo mật độ quang (OD). Các thí nghiệm đƣợc thực hiện ở bƣớc sóng
540 nm.
Tiến hành sử dụng dầu mực để bao bọc các viên thức ăn đã trộn chế phẩm
probiotic. Tỉ lệ dầu mực đƣợc sử dụng: 10 ml/kg thức ăn, 20 ml/kg thức ăn, 30 ml/kg
thức ăn. Sau đó thức ăn này đƣợc đƣa vào môi trƣờng nƣớc biển. Tiến hành đo độ đục
của nƣớc biển bằng máy quang phổ để đánh giá ảnh hƣởng của tỉ lệ trộn dầu mực vào
thức ăn bổ sung probiotic.
- 40 -
2.2.14. Xử lý thống kê
Các thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, kết quả là trung bình giữa các lần thí
nghiệm. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2007 để vẽ đồ thị và xử lý số liệu nghiên
cứu.
- 41 -
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy vi khuẩn và thu sinh khối từ canh trƣờng nuôi
3.1.1. Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng nghiên cứu
3.1.1.1. Xác định hoạt tính sinh protease ngoại bào
Bảng 3.1 Hoạt tính sinh protease ngoại bào
STT Kí hiệu chủng Đƣờng kính vòng phân giải casein (D-d,mm)
1 B3.10.1 16
2 B3.10.2 16
3 B3.7.1 -
4 B3.7.4 21
5 L5’ 18
Hình 3.1 Hoạt tính sinh protease ngoại bào của các chủng probiotic nghiên cứu
- 42 -
Hoạt tính sinh protease ngoại bào cũng là một trong những tiêu chí để lựa chọn
chủng probiotic do vậy cần xác định hoạt tính sinh protease ngoài bào của bốn chủng
(B3.10.1, B3.10.2, B3.7.4 và B3.7.1) với cơ chất là casein thông qua nuôi cấy và đánh
giá đƣờng kính vòng phân giải casein.
Nhận xét
Từ kết quả đánh giá ở Bảng 3.1 cho thấy có 3/4 chủng probiotic nghiên cứu
Bacillus spp. (B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) có khả năng sinh protease ngoại bào. Trong
đó chủng B3.7.4 có hoạt tính sinh protease mạnh nhất thể hiện qua đƣờng kính vòng
thủy phân protein > 20mm và mạnh hơn so với chủng Bacillus sp. L5’ là chủng chuẩn
có khả năng sinh protease mạnh đã đƣợc nghiên cứu tại Viện C ông nghệ sinh học và
Môi trƣờng – Trƣờng Đại học Nha Trang . Thành phần môi trƣờng là một trong những
yếu tố quyết định đến sự sinh tổng hơp enzyme, vì thế trong trƣờng hợp này chủng
B3.7.1 không sinh protease có thể do trong môi trƣờng còn thiếu các nguyên tố
khoáng.
Kết quả nghiên cứu này tƣơng tự với một nghiên cứu gần đây của Liu và cộng
sự (2009) về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis E20 cho thấy chủng này khả năng sinh
protease mạnh. Sau đó các tác giả này đã thử nghiệm bổ sung chủng này vào thức ăn
nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và nhận thấy tôm có bổ sung chế
phẩm probiotic tăng trƣởng nhanh hơn (Liu và cộng sự, 2009). Kết quả này đƣợc lý
giải là do khả năng tiêu hóa protein của hệ enzyme tiêu hóa của tôm đƣợc hỗ trợ bởi
hoạt động sinh protease của chủng probiotic nên khả năng tiêu hóa của tôm đƣợc bổ
sung chế phẩm probiotic cao hơn so với tôm không đƣợc bổ sung.
Chủng B3.7.4 có hoạt tính sinh protease mạnh nhất trong ba chủng probiotic
nghiên cứu có hoạt tính sinh protease ngoại bào.
3.1.1.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Để sử dụng một chủng vi sinh vật trong sản xuất chế phẩm probiotic thì ngoài
hoạt tính sinh protease thì hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh cũng là một đặc tính cần
quan tâm. Do vậy đề tài tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh của các
chủng nghiên cứu thông qua việc nuôi cấy và đánh giá đƣờng kính vòng kháng khuẩn.
Kết quả thể hiện ở Bảng 3.2, 3.3, 3.4 và Hình 3.2, 3.3, 3.4.
- 43 -
Bảng 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với
chủng V1.1
STT Kí hiệu chủng Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D-d,mm)
1 B3.7.4 10
2 B3.7.1 10
3 B3.10.1 8
4 B3.10.2 9
chủng V3.3

1 B3.7.4 15
2 B3.7.1 7
3 B3.10.1 10
4 B3.10.2 13
- 44 -
Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng DY05
- 45 -
chủng DYO5
1 B3.7.4 13
2 B3.7.1 15
3 B3.10.1 15
4 B3.10.2 29
Nhận xét
Từ kết quả phân tích ở Bảng 3.2, 3.3 và 3.4 cho thấy các chủng probiotic nghiên
cứu đều có hoạt tính kháng khuẩn với chủng chủng V1.1, V3.3 và DY05 theo phƣơng
pháp khuếch tán đĩa thạch sau khi nuôi trên môi trƣờng TSB . Trong đó chủng
probiotic B3.7.4 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với cả hai chủng V1.1 và V3.3
còn chủng B3.10.2 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với chủng DY05.
Vibrio owensii là loài vi khuẩn mới đƣợc công bố gần đây (Cano-Gómez et al.,
2010) và chủng V. owensii DY05 đã đƣợc chỉ ra là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên
ấu trùng tôm hùm bông ở Australia (Goulden et al., 2012a). Trong một nghiên cứu
mới đây, Goulden và cộng sự (2012b) đã tuyển chọn đƣợc các chủng probiotic (Vibrio
sp. PP05 và Pseudoalteromonas sp. PP107) có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với chủng
DY05 và cho thấy chúng có khả năng bảo vệ ấu trùng tôm hùm bông sau khi lây
nhiễm với DY05. Trong nghiên cứu này, các chủng probiotic, nhất là chủng B3.10.2,
cũng có khả năng kháng mạnh với DY05 trong điều kiện in vitro. Do vậy, cần tiếp tục
có những thử nghiệm in vivo để đánh giá hiệu quả của các chủng probiotic tiềm năng
này trên tôm hùm bông.
Các chủng probiotic nghiên cứu đều có hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi
sinh vật chỉ thị Vibrio spp. (V1.1, V3.3) và Vibrio owensii DY05.
3.1.2. Đƣờng cong sinh trƣởng và xác định hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian
3.1.2.1. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên cứu
Để có thể đánh giá khả năng sinh trƣởng của các chủng probiotic và chọn thời
gian thu sinh khối tế bào thích hợp, đề tài đã tiến hành xây dựng đƣờng cong sinh
trƣởng bằng phƣơng pháp đo độ đục ở bƣớc sóng 540 nm (OD540). Kết quả đƣợc thể
hiện ở các Hình 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8.
- 46 -
Trong hệ thống nuôi cấy tĩnh, đƣờng cong sinh trƣởng của quần thể vi khuẩn
chia làm 4 phase: phase lag, phase mũ (hay phase log), phase ổn định và pha tử vong.
Dƣới những điều kiện xác định về nuôi cấy, môi trƣờng, chủng giống, một chủng vi
khuẩn sẽ luôn luôn tạo đƣợc đƣờng cong phát triển giống nhau.
2,5
Mật độ quang (OD540 )
1,5
TSB
1
LB
0,5
0
0 2 4 6 8
i gian(h)
Hình 3.5 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.1 trên môi trƣờng TSB và LB
2,5
1,5 TSB
LB
1
0,5
0
0 2 4 6 8
i gian ( )
- 47 -
2,5

2
1,5
TSB
1
LB
0,5
0
0 2 4 6 8
i gian ( )
2,5
1,5
TSB
1
LB
0,5
0
0 2 4 6 8
i gian ( )
Nhận xét
Kết quả từ Hình 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8 cho thấy các đƣờng cong sinh trƣởng điển
hình của các chủng B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1 và B3.7.4. Tại phase lag không có hoặc
sự gia tăng số lƣợng tế bào rất chậm. Ta có thể thấy pha log của các chủng B3.10.2,
B3.7.1 và B3.7.4 bắt đầu khá sớm và kéo dài đến khoảng 3 giờ nuôi cấy. Khi cuối
phase log, giá trị mật độ quang OD540 đo đƣợc là khoảng 1,6.
- 48 -
Sau khoảng thời gian 3 giờ nuôi cấy, sự sinh trƣởng của các chủng probiotic bắt
đầu đi vào pha ổn định. Ở đây mặc dù sự sinh trƣởng và sự phân chia tế bào vẫn tiếp
tục nhƣng số lƣợng tế bào sinh ra và tế bào chết đi là cân bằng. Giai đoạn này sự phát
triển bắt đầu chậm lại và ổn định là do chất dinh dƣỡng cung cấp bị thiếu và các chất
thải độc do vi sinh vật thải ra. Ở phase ổn định, giá trị mật độ quang OD 540 đo đƣợc là
khoảng 2.
Khi tiến hành nuôi các chủng B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4 trên môi trƣờng
LB và TSB thì kết quả cho thấy sự sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên cứu
trên 2 môi trƣờng này cũng tƣơng đƣơng nhƣ nhau, nên do đó tiến hành chọn môi
trƣờng TSB để nghiên cứu và cải tiến. Sử dụng môi trƣờng TSB sẽ giúp hạ giá thành
sản xuất khi ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic ở quy mô công nghiệp.
Để thu sinh khối tế bào nhằm cho mục đích sản xuất chế phẩm probiotic ta sẽ
thu ở giai đoạn cuối pha log, sau khi nuôi cấy 3 giờ.
3.1.2.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian
Để đánh giá đƣợc thời gian các chủng probiotic nghiên cứu có hoạt tính kháng
khuẩn mạnh nhất. Đề tài tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng
probiotic tại các khoảng thời gian sau khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp khuếch tán trên
đĩa thạch sau khi nuôi cấy trên môi trƣờng TSB.
Hình 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1 của các chủng
nghiên cứu theo thời gian
- 49 -
16
u n (D-d) mm
14
12
B3.7.4
10
B3.10.2
8 B3.7.1
ng
6 B3.10.1
t t nh
0
0 1 2 3 4 5
i gian (h)
Hình 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V3.3 của các chủng
nghiên cứu theo thời gian
Nhận xét
Kết quả từ Hình 3.9 và 3.10 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của các chủng
probiotic nghiên cứu đối với chủng Vibrio spp. (V1.1, V3.3) có sự khác nhau theo thời
gian. Hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất sau khi nuôi cấy từ 3 đến 4 giờ. Trong đó hai
chủng B3.7.4 và B3.10.2 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với chủng V1.1 khi các
chủng này đang sinh trƣởng mạnh. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng B3.10.2 đối với
chủng V3.3 là mạnh nhất sau 3 giờ nuôi cấy. Khả năng kháng mạnh này có thể do lúc
này tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn sinh trƣởng mạnh nên khả năng cạnh tranh
tốt, ngoài ra cũng có thể do những chủng vi sinh này sinh ra các hợp chất kháng
khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn sau khi nuôi cấy 5 giờ của các chủng probiotic nghiên
cứu bắt đầu giảm mạnh. Ở thời gian này sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu đã vào
pha cân bằng do đó khả năng kháng khuẩn giảm có thể do số lƣợng tế bào sống bị suy
giảm.
Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với các chủng
Vibrio spp. (V1.1 và V3.3) là từ 3 đến 4 giờ sau khi nuôi.
3.1.3. Một số đặc điểm sinh học của các chủng probiotic nghiên cứu
Tiến hành nuôi cấy và đánh giá một số đặc điểm về hình thái, sinh lý của các
chủng vi khuẩn tiến hành nghiên cứu. Kết quả thể hiện ở các Hình 3.11 và 3.12.
- 50 -
Hình 3.11 Hình ảnh hình thái khuẩn lạc của các chủng probiotic nghiên cứu
Hình 3.12 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào các chủng probiotic nghiên cứu
Nhận xét:
+ Về hình thái khuẩn lạc:
Kết quả phân tích ở Hình 3.11 cho thấy hình thái khuẩn lạc của các chủng nghiên
cứu trên môi trƣờng TSA. Cả 4 chủng (B3.7.1, B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) đều tạo
- 51 -
khuẩn lạc tròn, bề mặt nhăn và viền khuẩn lạc hình răng cƣa. Hai chủng B3.7.4 và
B3.10.2 có khuẩn lạc màu vàng nhạt và tâm sẫm màu, còn 2 chủng B3.7.1 và B3.10.1
có khuẩn lạc màu trắng đục.
+ Về kết quả nhuộm Gram

Kết quả nhuộm Gram tế bào các chủng probiotic (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1,
B3.7.4) cho thấy cả 4 chủng này đều là trực khuẩn, gram dƣơng. Khi quan sát trên
kính hiển vi, hình dạng tế bào của các vi khuẩn này là hình que ngắn. Sau khi nhuộm
Gram, tế bào của các chủng vi khuẩn bắt màu tím. Việc tế bào vi khuẩn có màu tím là
do thành tế bào dày và đƣợc cấu tạo bởi peptidoglycan, khi tiếp với các thuốc nhuộm,
các lớp peptidoglycan mất nƣớc tạo thành các khoảng trống khiến cho thành tế bào có
thể giữ phức hợp màu tím bên trong.
+ Định danh vi khuẩn chủng B3.10.2
Các chủng Bacillus đƣợc định danh bằng bộ kít hóa sinh API 50CHB
(BioMérieux, Pháp). Kết quả định danh chủng B3.10.2 dựa trên 49 phản ứng lên men
đƣờng và 12 thử nghiệm hoạt tính enzyme đƣợc trình bày trên Bảng 3.5. Phân tích trên
phần mềm apiweb (BioMérieux, Pháp) cho thấy chủng B3.10.2 đƣợc định danh là
Bacillus pumilus với %ID = 99,9 và T = 0,49. Loài vi khuẩn này đƣợc coi là an toàn
cho ngƣời và động vật. Chẳng hạn, chủng Bacillus pumilus GB34 đã đƣợc đăng ký sử
dụng trong chế phẩm kháng nấm Rhizoctonia và Fusarium hại cây trồng (EPA, 2003).
Mới đây, một chủng B. pumilus phân lập từ tôm sú (Penaeus monodon) đã đƣợc tìm
thấy có tính chịu mặn tốt và có khả năng ức chế sinh trƣởng của vi khuẩn gây bệnh
Vibrio alginolyticus (Hill et al., 2009).
Bảng 3.5 Kết quả định danh chủng B3.10.2 bằng bộ kít hóa sinh API 50CHB
TT Phản Cơ chất Chủng Bacillus
ứng B3.10.2 pumilus
A. Các phản ứng lên men đƣờng
0. Đối chứng - -
1. GLY Glycerol W +/-
2. ERY Erythritol - -
3. DARA D-arabinose - -
4. LARA L-arabinose + +
5. RIB D-ribose + +
6. DXYL D-xylose W +/-
7. LXYL L-xylose - -
8. ADO D-adonitol - -
9. MDX Methyl--D-xylopyranoside - -
- 52 -
10. GAL D-galatose W +/-
11. GLU D-glucose + +
12. FRU D-fructose + +
13. MNE D-manose + +
14. SBE L-sorbose - -
15. RHA L-rhamnose - -
16. DUL Dulcitol - -
17. INO Inositol - -
18. MAN D-mannitol + +
19. SOR D-sorbitol - -
20. MDM Methyl--D-manopyranoside W +/-
21. MDG Methyl--D-glucopyranoside - +/-
22. NAG N-acetyl glucosamine W +/-
23. AMY Amygdalin + +/-
24. ARB Arbutin + +
25. ESC Esculin + +
26. SAL Salicin + +
27. CEL D-cellobiose + +
28. MAL D-maltose - +/-
29. LAC D-lactose - -
30. MEL D-melibiose - -
31. SAC D-saccharose + +
32. TRE D-trehalose + +
33. INU Inulin - -
34. MLZ D-melezitose - -
35. RAF D-raffinose - -
36. AMD Amidon - -
37. GLYG Glycogen - -
38. XLT Xylitol - -
39. GEN Gentiobiose + +/-
40. TUR D-turanose - +/-
41. LYX D-lyxose - -
42. TAG D-tagatose + +
43. DFUC D-fucose - -
44. LFUC L-fucose - -
45. DARL D-arabitol - -
46. LARL L-arabitol - -
47. GNT Potassium gluconate W -
48. 2KG Potassium 2-ketogluconate - -
49. 5KG Potassium 5-ketogluconate W -
B. Các hoạt tính enzyme
1. ONPG 2-nitrophenyl- -D-galactopyranoside + +
2. ADH L-arginine - -
3. LDC L-lysine - -
4. ODC L-ornithine - -
5. CIT Trisodium Citrate W +/-
- 53 -
6. H2S Sodium Thiosulfate - -
7. URE Urea - -
8. TDA L-tryptophane - -
9. IND L-tryptophane - -
10. VP Sodium Pyruvate - +
11. GEL Gelatin W +
12. NO2 Nitrat - -
(+): ≥ 85% dƣơng tính, (+/-): 15-85% dƣơng tính, (-): ≤ 15% dƣơng tính, W: yếu
Kết quả cho thấy chủng B3.10.2 là trực khuẩn Gram dương, được định danh là
Bacillus pumilus.
3.1.4. Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy các chủng vi khuẩn
đã lựa chọn
3.1.4.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng probiotic
nghiên cứu
Nguồn cacbon là một trong nhóm chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự sinh trƣởng
của vi sinh vật. Vì thế, đề tài nghiên cứu ảnh hƣởng của các nguồn cacbon: glucose, rỉ
đƣờng, tinh bột bắp, tinh bột sắn đến sự sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên
cứu.
Hình 3.13 Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Nhận xét
Kết quả phân tích từ Hình 3.13 cho thấy sau 3 giờ nuôi trên các nguồn cacbon
khác nhau (glucose, rỉ đƣờng, tinh bột bắp, tinh bột sắn) thì ảnh hƣởng khác nhau đến
sự sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên cứu. Nguồn cacbon từ rỉ đƣờng cho kết
- 54 -
quả sinh trƣởng cao nhất đối với 3 chủng (B3.7.4, B3.10.1 và B3.10.2) và cao thứ 2
(sau glucose) đối với chủng B3.7.1. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của các chủng vi
sinh vật là không giống nhau. Trong nghiên cứu này, nguồn cacbon từ đƣờng (glucose
và rỉ đƣờng) giúp các chủng probiotic nghiên cứu sinh trƣởng tốt hơn so với tinh bột
bắp và sắn. Trong rỉ đƣờng ngoài thành phần saccarose còn có chứa các vitamin kích
thích sinh trƣởng. Do vậy, nguồn rỉ đƣờng có thể thay thế thành phần glucose để làm
môi trƣờng nuôi cấy các chủng probiotic này mà vẫn đảm bảo khả năng sinh trƣởng
của chúng. Đây cũng là nguồn cacbon thƣờng đƣợc sử dụng trong lên men công
nghiệp. Khi sử dụng rỉ đƣờng giúp hạ giá thành môi trƣờng nuôi cấy các chủng
probiotic, từ đó hạ giá thành sản xuất. Sử dụng nguồn rỉ đƣờng cũng giúp giải quyết
khâu tiêu thụ phế phẩm từ ngành sản xuất đƣờng.
Rỉ đường là nguồn cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng của các chủng
probiotic nghiên cứu.
3.1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Để sinh trƣởng, vi sinh vật cần phải sử dụng nguồn nitơ để tổng hợp các chất
chứa nitơ nhƣ acid nucleic, protein. Do đó, đề tài nghiên cứu ảnh hƣởng của một số
nguồn nitơ đến sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên cứu.
Hình 3.14 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến các chủng nghiên cứu
Nhận xét
Kết quả từ Hình 3.14 cho thấy, từ các nguồn nitơ khác nhau sẽ ảnh hƣởng khác
nhau đến sự sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên cứu. Vi sinh vật sử dụng chọn
- 55 -
lọc với nguồn nitơ, không phải chất vô cơ nào chứa nitơ cũng có thể dùng đƣợc trong
nuôi cấy vi sinh. Việc sử dụng nguồn nitơ hữu cơ chủ yếu trong nuôi cấy vi sinh vật là
protein, tuy nhiên do protein thƣờng có trọng lƣợng phân tử lớn nên cần phải phân giải
thành các hợp chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn mới sử dụng. Ở thí nghiệm này cho
thấy trong số các nguồn nitơ thử nghiệm, pepton là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh
trƣởng của các chủng vi sinh vật nghiên cứu.
Pepton là nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trưởng của các chủng probiotic
nghiên cứu.
3.1.4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Các muối vô cơ là nguồn chất dinh dƣỡng không thể thiếu đối với sự sinh
trƣởng của vi sinh vật. Chúng có các chức năng chủ yếu là: duy trì tính ổn định của kết
cấu cá đại phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào.
Do đó, đề tài tiến hành nuôi cấy các chủng probiotic nghiên cứu với các nồng độ muối
(0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%) và đƣợc đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh
trƣởng của các chủng nghiên cứu. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.15.
Hình 3.15 Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các
chủng nghiên cứu
Nhận xét
Kết quả từ Hình 3.15 cho thấy các chủng probiotic có khả năng sinh trƣởng tốt
ở các nồng độ muối từ 1% đến 3%. Tại nồng độ muối 1% thì các chủng phát triển tốt
- 56 -
nhất. Khi nồng độ muối tăng lên thì ức chế khả năng sinh trƣởng phát triển của các
chủng nghiên cứu làm cho tốc độ sinh trƣởng chậm lại. Kết quả này cũng cho thấy
tiềm năng ứng dụng các chủng này trong nuôi trồng hải sản (tôm hùm, tôm sú,…) vì
chúng có khả năng chịu đƣợc môi trƣờng có nồng độ muối cao. Đồng thời, chúng vẫn
sống đƣợc ở nồng độ muối 0% (nƣớc ngọt) cho thấy khả năng thích ứng rộng với nồng
độ muối của các chủng nghiên cứu.
Sử dụng nộng độ muối NaCl từ 1-3% là thích hợp cho sự sinh trưởng của các
chủng probiotic nghiên cứu.
3.1.4.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
pH môi trƣờng có ý nghĩa quyết định đối với sinh trƣởng của vi sinh vật cho
nên đề tài tiến hành nuôi và đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng
của các chủng nghiên cứu. Từ đó chọn đƣợc giá trị pH thích hợp cho sự sinh trƣởng
của các chủng probiotic nghiên cứu. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.16.
2,5
2
pH5
1,5 pH6
pH7
1
pH8
0,5 pH9
0
B3.7.1 B3.7.4 B3.10.1 B3.10.2
C c c ủng ng iên cứu
Hình 3.16 Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Nhận xét
Kết quả từ Hình 3.16 cho thấy pH môi trƣờng có ảnh hƣởng mạnh đến sinh
trƣởng của các chủng nghiên cứu . Sau 3 giờ nuôi cấy , các chủng nghiên cứu sinh
trƣởng mạnh nhất trên môi trƣờng có pH 8. Tại những khoảng pH lân cận (pH 6 - 9),
các chủng nghiên cứu vẫn sinh trƣởng khá tốt. Điều này cho thấy khả năng ứng dụng
rộng rãi của chủng probiotic khi sinh trƣởng đƣợc ở điều kiện pH khác nhau. Tuy
nhiên, chúng bị ức chế mạnh khi nuôi trên môi trƣờng có độ acid cao (pH 5).
- 57 -
Giá trị pH 8 là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của các chủng probiotic
nghiên cứu.
3.1.4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến sự sinh trƣởng của
vi sinh vật, vì các hoạt động trao đổi chất phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ. Do đó, đề
tài tiến hành nuôi cấy các chủng probiotic nghiên cứu ở các nhiệt độ khác nhau để
nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên
cứu.
2,5
B3.10.1
B3.10.2
B3.7.4
2
B3.7.1
1,5
28 31 34 37 40
N iệt độ (0C)
Hình 3.17 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Nhận xét
Kết quả từ Hình 3.17 chỉ ra rằng trong khoảng nhiệt độ nghiên cứu tƣ̀ 280C đến
400C, nhiệt độ không ảnh hƣởng lớn đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu (mật
độ tế bào (OD540) chỉ dao động từ 1,7-2,3 sau 3 giờ nuôi). Các chủng B3.10.1, B3.10.2
và B 3.7.1 sinh trƣởng tốt nhất ở 340C trong khi đó chủng B 3.7.4 sinh trƣởng mạnh
nhất ở 370C. Điều này rất thuận lợi cho việc nuôi cấy sản xuất chế phẩm probiotic ở
điều kiện nhiệt độ phòng , giúp hạ giá thành , giảm chi phí sản xuất ở mức độ công
nghiệp.
Điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của các chủng probiotic nghiên
cứu là 34 – 370C.
Nhận xét chung
Kết quả từ ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy ở trên (nguồn cacbon, nitơ,
nồng độ muối, nhiệt độ, pH) cho thấy sự ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng của các
- 58 -
chủng probiotic nghiên cứu. Ở các điều kiện thích hợp nhƣ sử dụng rỉ đƣờng là nguồn
cacbon, pepton là nguồn nitơ, nồng độ muối 1 – 3%, pH 8, nhiệt độ 34 – 370C giúp các
chủng probiotic (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4) sinh trƣởng mạnh nhất và ngƣợc
lại. Điều kiện này phù hợp đối với sản xuất công nghiệp và ứng dụng chế phẩm trong
nuôi tôm hùm lồng.
3.1.5. Xây dựng quy trình lên men
Sau khi đã xác đị nh đƣợc các thông số về thành phần môi trƣờng nuôi cấy , điều
kiện nuôi cấy, ta tiến hành lên men ở th iết bị lên men thể tí ch lớn , mục đích nhằm tiến
đến ứng dụng lên men ở quy mô công nghiệp . Khi lên men bằng thiết bị BioFlo 110
cần theo dõi các thông số sau: pH, nhiệt độ và thời gian.
3.1.5.1. Xác định pH thích hợp cho quá trình lên men
pH là một trong những yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của vi sinh vật, do
đó khi tiến hành lên men ở quy mô công nghiệp. Đề tài tiến hành nghiên cứu các giá
trị pH khác nhau trong quá trình lên men trong thiết bị BioFlo 110 đối với chủng
B3.10.2.
2,5
Mật độ quang (OD540)
1,5
0,5
0
6 7 8 9
pH
Hình 3.18 Ảnh hƣởng của pH đế n quá trình lên men
Nhận xét
Kết quả tƣ̀ Hì nh 3.18 cho thấy pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến sƣ̣ sinh
trƣởng của vi sinh vật . Khi pH tăng hoặc giảm đều ảnh hƣởng đến sƣ̣ sinh trƣởng của
vi khuẩn. Giá trị pH thích hợp đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp này là pH 8. Với giá trị
pH này thì khá thuận lợi cho việc sản xuất ở quy mô công nghiệp.
- 59 -
pH 8 là thích hợp nhất cho quá trình lên men đối với chủng B3.10.2
3.1.5.2. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men
Nhiệt độ ảnh hƣởng đến các hoạt động trao đổi chất trong quá trình lên men, do
đó cần phải xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men để thu đƣợc sản phẩm
có chất lƣợng ổn định. Đề tài tiến hành lên men chủng B3.10.2 trong thiết bị BioFlo
110 và xác định giá trị nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men.
2,5
1,5
0,5
0
28 31 34 37 40
N iệt độ (0C)
Hình 3.19 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trì nh lên men
Nhận xét
Kết quả tƣ̀ Hình 3.19 cho thấy sƣ̣ ảnh hƣởng của nhiệt độ đ ến sƣ̣ sinh trƣởng
của vi sinh vật . Với giá trị nhiệt độ 340C cho thấy khả năng lên men của chủng
B3.10.2 là tốt nhất . Qua đây, ta cũng thấy đƣợc với giá trị nhiệt độ này thì thuận lợi
cho việc sản xuất chế phẩm probiotic ở quy mô công nghiệp, hạn chế đƣợc chi phí, giá
thành sản xuất.
Nhiệt độ 340C là điều kiện thích hợp nhất cho quá trình lên men đối với chủng
B3.10.2.
3.1.5.3. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình lên men
Tiến hành xác định khả năng sinh trƣởng của chủng B3.10.2 trong quá trình lên
men ở thiết bị BioFlo 110, từ đó lựa chọn thời gian lên men thích hợp để có đƣợc chất
lƣợng sản phẩm tốt nhất.
- 60 -

2,5
1,5
0,5
0
0 2 4 6 8
i gian ( )
Hình 3.20 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.2 khi nuôi trên
thiết bị lên men BioFlo 110
Nhận xét
Kết quả tƣ̀ Hì nh 3.20 cho thấy khả năng sinh trƣởng của chủng B 3.10.2 ở thiết
bị thể tích lớn (10L). Pha log bắt đầu từ khoảng 1 giờ và kéo dài đến khoảng 3 giờ sau
khi nuôi. Khi cuối phase log thì số lƣợng tế bào là lớn nhất, vì ở giai đoạn tiếp theo
trong phase cân bằng, số lƣợng tế bào mới sinh và và số lƣợng tế bào chết đi là bằng
nhau. Để tiến hành thu sinh khối tế bào phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm probiotic
thì thời gian thu sinh khối tế bào tốt nhất là sau 3 giờ nuôi.
Thời gian lên men trong thiết bị BioFlo 110 đối với chủng B3.10.2 là 3 giờ.
3.1.5.4. Đề xuất quy trình lên men
Từ các nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình lên men nhƣ sau: (Hình
3.21).
Thuyết trình quy trình lên men
+ Chủng probiotic:
Chủng để sản xuất probiotic sau khi hoạt hóa sẽ đƣợc chuẩn bị cho quá trình
lên men.
+ Chuẩn bị dịch lên men:
Thành phần môi trƣờng lên men gồm có pepton, NaCl, rỉ đƣờng, K2HPO4. Dich
lên men đƣợc hấp khử trùng ở 1210C trong vòng 15 phút, sau đó chuẩn về pH 8 để
chuẩn bị cho quá trình lên men.
- 61 -
Chủng probiotic
Môi trƣờng TSB cải tiến

Nhiệt độ: 340C
Chuẩn bị dịch lên Lên men
pH=8
men
Tốc độ khuấy:180 vòng /phút
Thu dịch lên men
Tốc độ ly tâm: 6000 vòng/phút

Ly tâm Thời gian: 30 phút.
Nhiệt độ: 40C
Sinh khối tế bào
Hình 3.21 Sơ đồ quy trì nh lên men

+ Lên men:
Chủng probiotic đƣợc bổ sung vào dịch lên men , tỷ lệ bổ sung giống là 5%.
Tiến hành lên men trong thiết bị BioFlo 110 với các thông số nhƣ sau: nhiệt độ 340C,
tốc độ khuấy 180 vòng/phút, pH 8. Tiến hành lên men trong thời gian 3 giờ. Trong quá
trình lên men cần chú ý đến việc phá bọt và đảm bảo đủ hàm lƣợng oxy.
+ Thu dịch lên men:
Dịch sau khi lên men đƣợc tiến hành ly tâm ở thiết bị lên men thể tích lớn
BioFlo 110. Dịch sau khi lên men đƣợc đem đi ly tâm ở thiết bị ly tâm với tốc độ 6000
vòng/phút, ở nhiệt độ 40C trong thời gian 30 phút.
+ Sinh khối tế bào:
Sau khi ly tâm, sinh khối tế bào đƣợc bổ sung chất chống đông để đƣa vào đông
khô sản xuất chế phẩm.
3.2. Xây dựng quy trình đông khô
3.2.1. Xác định quy trình đông khô đối với sinh khối vi khuẩn
Kết quả khảo sát trên máy đông khô Telstar LyoBeta 35 cho thấy nhiệt độ điểm
đông của sinh khối tế bào các chủng probiotic là -120C, nhiệt độ đông toàn phần là
-330C. Nhiệt độ điểm đông thấp này có thể là do hàm lƣợng protein rất cao của sinh
khối tế bào vi khuẩn và thành phần môi trƣờng nuôi cấy trong dịch sau khi ly tâm. Từ
đó, chúng tôi thiết kế nhiệt độ làm khô cấp 1 là -430C, tƣơng ứng với áp suất là 0,09
- 62 -
mBar (Bảng PL.17) để nƣớc trong sinh khối tế bào vi khuẩn sau khi ở trạng thái đông
đƣợc thăng hoa.
Bảng 3.6 Quy trình đông khô sinh khối các chủng probiotic nghiên cứu
Bƣớc Quá trình Nhiệt độ (oC) Áp suất Thời gian
(mBar) (h)
1 Cấp đông Từ 25 đến -45 >10 000 ≈5
2 Tạo chân không 0,09 ≈0,4
5 Làm khô cấp 1 Từ -43 đến 30 0,09 ≈13
6 Làm khô cấp 2 30 ≈0,01 3
7 Kết thúc 25-30 >10 000 0,05
Tổng thời gian (h): ≈21
Hình 2.22 Chế phẩm probiotic trƣớc (a) và sau khi đông khô (b)
Hơn nữa, việc điều chỉnh nhiệt độ và áp suất, thời gian sấy phải đƣợc thiết kế
tối ƣu, vừa tiết kiệm chi phí chạy máy vừa đảm bảo khả năng sống sót cao của các tế
bào vi khuẩn sau khi đông khô. Sinh khối tế bào vi khuẩn đƣợc cho vào các lọ thủy
tinh, mỗi lọ 5 ml sinh khối tế bào vi khuẩn. Các lọ này sau đó đƣợc đặt trên các khay
trong buồng sấy. Quy trình đông khô sinh khối tế bào vi khuẩn các chủng probiotic
đƣợc tóm tắt trong Bảng 3.6 với tổng thời gian chạy máy là khoảng 21 giờ. Sau giai
đoạn làm khô cấp 1, độ ẩm của chế phẩm còn lại là 8 - 12%, và cuối cùng chỉ còn 2 -
5% sau quá trình làm khô cấp 2. Với quy tình đông khô và giữ ở độ ẩm này, sản phẩm
- 63 -
đông khô đảm bảo chất lƣợng tốt, có thể bảo quản lâu dài và có độ an toàn cao khi sử
dụng. Sản phẩm sau khi đông khô ở dạng bột, cấu trúc xốp, mịn và có màu trắng đục.
3.2.2. Chất chống đông
Việc sử dụng chất chống đông để tăng tỷ lệ sống của vi sinh vật sau quá trình
đông khô. Có rất nhiều chất chống đông đƣợc sử dụng cho quá trình đông khô, trong
đó phổ biến là các chất nhƣ: mantodextrin, glycerol, lactose với các nồng độ 1%, 5%,
10% (Hubalek, 2003). Do đó, đề tài tiến hành bổ sung chất chống đông vào sinh khối
tế bào vi khuẩn trƣớc khi đông khô và đánh giá ảnh hƣởng của các chất chống đông
này đến tỷ lệ sống của các chủng probiotic nghiên cứu.
100
90
ng
80
70
60
ệ
50
40
30
20
10
0
C t c ng đông
Hình 3.23 Tỷ lệ sống của chủng B3.10.2 sau đông khô

100
90
80
ng
70
60
50
ệ
40
30
20
10
0
C t c ng đông
Hình 3.24 Tỷ lệ sống của chủng B3.7.4 sau đông khô

- 64 -
Rót 5 ml dị ch huyền phù tế bào đã đƣợc bổ sung chất chống đ ông với các nồng
độ tƣơng ƣ́ng vào lọ thủy tinh có dung tí ch 10 ml. Tiến hành đông khô bằng máy sấy
đông khô Telstar LyoBeta 35 với quy trì nh đƣợc thể hiện ở Bảng 3.6. Sản phẩm sau
khi đông khô đƣợc tái huyền phù bằng nƣớc muố i sinh lý để kiểm tra tỉ lệ sống của tế
bào vi khuẩn bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc .
Nhận xét
Kết quả từ Hình 3.23 và 3.24 cho thấy việc sử dụng mantodextrin với tỷ lệ 10%
cho tỷ lệ sống cao nhất (≥ 90%), sau đó là lactose 5% (> 60%). Việc không sƣ̉ dụng
chất chống đông (mẫu đối chứng ) hoặc sƣ̉ dụng glycerol cho thấy tỷ lệ sống của các
chủng vi khuẩn sau quá trình đông khô là rất thấp (<15%).
Hình 2.25 Chế phẩm probiotic sau khi đông khô với chất chống đông
mantodextrin 10%
Nhiều nghiên cƣ́u khác cũng cho thấy ảnh hƣởng của việc sƣ̉ dụng chất chống
đông đến tỷ lệ sống của vi khuẩn trong quá trì nh đông khô . Việc sử dụng chất chống
đông là m antodextrin tỷ lệ 10% ( theo khối lƣợng ) cho thấy tỷ lệ sống của tế bào vi
khuẩn sau quá trì nh đông khô là cao nhất , lên tới 91,04% đối với chủng B 3.10.2 và
90,77% với chủng B3.7.4. Do đó chất chống đông đƣợc sƣ̉ dụ ng cho chủng B3.10.2 và
B3.7.4 là mantodextrin với tỷ lệ bổ sung là 10% (theo khối lƣợng).
Sử dụng mantodextrin với tỷ lệ bổ sung là 10% (theo khối lượng) cho quá trình
đông khô sinh khối tế bào chủng B3.10.2.
- 65 -
3.3. Xây dựng quy trình sản xuất và sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic
3.3.1. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic
Sau khi đã nghiên cƣ́u các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trì nh lên men thu sinh
khối tế bào chủng B3.10.2 cũng nhƣ các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình đông khô,
chúng tôi xây dựng quy trì nh sản xuất chế phẩm probiotic (Hình 3.26).
Chủng probiotic
Môi trƣờng TSB

Thời gian: 12 - 14giờ
Nhiệt độ: 340C
Hoạt hóa Tốc độ khuấy đảo: 180
vòng/phút
pH 7,3 ± 0,2
Thời gian: 3giờ

Chuẩn bị dịch lên Nhiệt độ: 340C
Lên men
men Tốc độ khuấy đảo: 180 vòng/phút
pH 8
Tốc độ 6000 vòng/phút

Ly tâm Thời gian 30 phút
Nhiệt độ 40C
Nhiệt độ cấp đông: -450C

Đông khô Nhiệt độ làm khô cấp 1: -430C
Mantodextrin 10% Áp suất chân không: 0,09 mBar
Thời gian: 21h
Bao gói, bảo quản
Chế phẩm probiotic
Hình 3.26 Quy trì nh sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông kh ô
Thuyết minh quy trình
+ Chủng probiotic :
Chủng đƣợc sử dụng làm chế phẩm probiotic là chủng B3.10.2.
+ Hoạt hóa:
Các chủ ng vi khuẩn đƣợc hoạt hóa qua đêm trong môi trƣờng TSB đã đƣợc
khƣ̉ trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút; pH 7,3; nhiệt độ 340C; lắc 180 vòng/phút.
Tỷ lệ bổ sung chủng hoạt hóa 3,3%.
- 66 -
+ Chuẩn bị dị ch lên men :
Môi trƣờng lên men gồm có : 20 g/l pepton; 10 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4; 2,5
g/l rỉ đƣờng . Dịch lên men đƣợc hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút. Môi
trƣờng nuôi cấy đƣợc chỉ nh về pH 8 để chuẩn bị cho quá trình lên men.
+ Lên men:
Chủng vi khuẩn sau khi hoạt hóa đƣợc bổ sung vào dị ch lên men với tỷ lệ 5%
giống; nhiệt độ 340C; pH 8; lắc 180 vòng/phút. Quá trình lên men tiến hành trong thời
gian 3 giờ.
+ Ly tâm:
Sau khi lên men, tiến hành ly tâm thu sinh khối sau thời gian lên men 3 giờ, tiến
hành ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, ở nhiệt độ 40C. Sau khi
ly tâm, sinh khối tế bào đƣợc rƣ̉a bằng nƣớc muối sinh lý và sau đó loại bỏ nƣớc bằng
cách ly tâm lại với điều kiện tƣơng tự.
+ Đông khô:
Sinh khối tế bào tiếp theo đƣ ợc bổ sung chất chống đông mantodextrin với tỉ
lệ 10% (theo khối lƣợng).
Sau khi bổ sung chất chống đông , 5 ml hỗn hợp huyền phù tế bào đƣợc rót vào
các lọ thủy tinh (dung tí ch 10 ml). Sau đó tiền hành đông khô nhƣ Bảng 3.6.
+ Bao gói, bảo quản:
Sau khi đông khô thu đƣợc chế phẩm probiotic , tiến hành đóng gói bằng túi
PE có tráng bạc , bảo quản nơi khô ráo , thoáng mát , tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh
sáng mặt trời.
+ Chế phẩm probiotic:
Sinh khối tế bào sau khi đông khô có màu trắng đục sẽ đƣợc trộn với chất mang
là mantodextrin để có mật độ tế bào vi khuẩn phù hợp với yêu cầu chế phẩm probiotic.
3.3.2. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm
Chúng tôi tiến hành sản xuất thử nghiệm chế phẩm theo quy trình Hình 3.26.
Kết quả sản xuất đƣợc 2 kg chế phẩm (Hình 3.27), trong đó thành phần vi khuẩn
probiotic là chủng Bacillus pumilus B3.10.2 ở mật độ 108 CFU/ml, chất mang đƣợc
sử dụng là mantodextrin.
- 67 -
Hình 3.27 Chế phẩm probiotic Bio – Lobster

3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic phối trộn với thức ăn tôm hùm
Chế phẩm probiotic đƣợc trộn với thức ăn với tỉ lệ 25 g/ kg thức ăn. Sau đó sử
dụng dầu mực để bao các viên thức ăn lại với các tỉ lệ: 10 ml/ kg thức ăn, 20 ml/ kg
thức ăn, 30 ml/ kg thức ăn. Sau đó đánh giá khả năng hòa tan của thức ăn trong nƣớc.
Kết quả thể hiện ở các Hình 3.28, 3.29 và 3.30.
Hình 3.28 Ảnh hƣởng của tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn bổ sung probiotic đối
với thời gian tan trong môi trƣờng nƣớc biển. a (thức ăn); b (thức ăn + probiotic); c
(thức ăn + probiotic + 10 ml dầu mực); d (thức ăn + probiotic + 20 ml dầu mực); e
(thức ăn + probiotic + 30 ml dầu mực).
- 68 -
Hình 3.29 Thức ăn khi mới cho vào nƣớc biển(A) và sau khi để 8 giờ (B)
Nhận xét
Kết quả quan sát đƣợc sau khi trộn dầu mực ở tỉ lệ 10 ml/ kg thức ăn thì cho
thấy dầu không bao bọc đƣợc hết viên thức ăn. Với tỉ lệ 20 ml/kg thức ăn, dầu có thể
phủ kín trên bề mặt thức ăn. Khi cho viên thức ăn vào nƣớc biển đã đƣợc xử lý dùng
để nuôi tôm cho thấy viên thức ăn ít bị tan và ảnh hƣởng đến độ đục của nƣớc biển.
Mức độ tan của thức ăn trong nƣớc biển đƣợc xác định bằng cách đo mật độ quang
(OD540). Nếu bổ sung dầu mực quá nhiều sẽ tạo váng dầu trong nƣớc gây lãng phí và
gây ôi nhiễm môi trƣờng nƣớc dùng cho việc nuôi tôm (Hình 3. 30).
Hình 3.30 Thức ăn trộn quá nhiều dầu mực

Kết quả từ Hình 3.28 cho thấy sử dụng dầu mực để bọc thức ăn có trộn chế
phẩm probiotic giúp tránh đƣợc việc tổn thất chế phẩm ra môi trƣờng nƣớc. Do đó, sẽ
giúp nâng cao hiệu quả sử dụng chế phẩm khi dùng. Tỉ lệ sử dụng dầu mực là từ 10 ml
đến 20 ml/kg thức ăn, kết quả này cũng phù hợp với tỉ lệ dầu mực mà tác giả Bùi
Quang Tề (2009), sử dụng để bao bọc thức ăn và thuốc nhằm tránh tan nhanh trong
nƣớc, tạo mùi vị hấp dẫn kích thích tôm bắt mồi.
- 69 -
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN
Từ các nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận sau:
1) Đã nghiên cứu quy trình nuôi cấy vi khuẩn và thu sinh khối từ canh trƣờng
nuôi:
a) Đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính probiotic của 4 chủng nghiên cứu và
cho thấy chủng B3.10.2 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với Vibrio
owensii DY05 và chủng B3.7.4 có khả năng sinh protease có hoạt tính
mạnh nhất.
b) Đã định danh chủng B3.10.2 là Bacillus pumilus, loài vi khuẩn đƣợc công
nhận là an toàn cho sản xuất chế phẩm sinh học.
c) Đã xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trƣởng của 4
chủng nghiên cứu trong môi trƣờng TSB cải tiến chƣ́a rỉ đƣờng là nguồn
cacbon, pepton là nguồn nitơ, nồng độ muối 1-3%, pH 8, và ở nhiệt độ 34-
370C.
d) Đã tiến hành lên men chủng B 3.10.2 trong thiết bị lên men BioFlo 110 và
xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình lên men là pH 8, nhiệt
độ 340C, thời gian nuôi là 3 giờ sau khi nuôi.
2) Đã tiến hành nghiên cứu và xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình
đông khô, trong đó đã xác định điểm đông là -120C, nhiệt độ đông toàn phần -330C,
nhiệt độ làm khô cấp 1 là -430C tƣơng ứng với áp suất chân không 0,09 mBar, nhiệt độ
làm khô cấp 2 là 300C, thời gian đông khô khoảng 21 giờ. Tỷ lệ vi khuẩn sống sau khi
đông khô đạt trên 90% với chất chống đông thích hợp là 10% mantodextrin (theo khối
lƣợng).
3) Đã sản xuất thử nghiệm 2 kg chế phẩm probiotic đông khô Bio - Lobster với
mật độ vi khuẩn Bacillus pumilus B3.10.2 là 108 CFU/ ml và chất mang là
mantodextrin.
4) Đã thử nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic phối trộn với thức ăn tôm hùm,
trong đó xác định đƣợc tỉ lệ dầu mực sử dụng để bao bọc thức ăn trộn chế phẩm
probiotic là 10 ml đến 20 ml/ kg thức ăn.
- 70 -
2. KIẾN NGHỊ
1) Tiếp tục nghiên cƣ́u các cơ chế khángVibrio của các chủng probiotic nghiên cứu.
2) Thƣ̉ nghiệm chế phẩm probioticBio – Lobster trên đối tƣợng tôm hùm nuôi lồng
.
3) Tiếp tục hoàn thiện quy trì nh sản xuất chế phẩm probiotic và th ƣơng mại hóa
sản xuất chế phẩm cho tôm hùm nuôi lồng ở giai đoạn giống và nuôi thƣơng
phẩm.
- 71 -
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Trần Vũ Đình Nguyên, Nguyễn Văn Duy, Vũ Ngọc Bội, 2013. Xác định hoạt tí nh
probiotic và điều kiện nuôi cấy thí ch hợp của các chủng Bacillus phân lập tƣ̀ tôm hùm
bông, Tạp chí Khoa học công nghệ thủy sản (đã gửi).
2. Nguyễn Văn Duy, Trần Vũ Đình Nguyên, 2013. Sản xuất chế phẩm probiotic đông
khô từ Bacillus nhằm bổ sung vào thức ăn nuôi hải sản. Tạp chí Công nghệ sinh học
(đã gửi).
72
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2012. Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch
6 tháng năm 2012 ngành Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
2. Bùi Quang Tề, 2009. Nuôi thâm canh tôm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm theo
mô hình gaqp, Trung tâm Khuyến nông khuyến ngƣ quốc gia, Bộ Nông nghiệp và
phát triển nông thôn.
3. Đặng Tố Vân Cầm , 2009. Sƣ̉ dụng các dòng vi khuẩn có đặc tí nh Quorum Sensing
và có khả năng tích lũy Poly -β-Hydroxybutyrate trong ƣơng nuôi ấu trùng tôm -cá
biển. Viện nghiên cƣ́u nuôi trồng thủy sản II. Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản.
4. Đỗ Thị Hòa , Bùi Quang Tề , Nguyễn Hƣ̃u Dũng và Nguyễn Thị Muội , 2004, Bệnh
học thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh.
5. Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, 2004. Kỹ thuật nuôi tôm hùm
lồng.
6. Lại Văn Hùng, 2007. Nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng để sản xuất thức ăn dạng viên
nuôi tôm hùm Panulirus ornatus bằng lồng từ giai đoạn giống đến cỡ thương phẩm tại
vùng biển Khánh Hòa, Báo cáo tổng kết đề tài trọng điểm cấp Bộ.
7. Lƣơng Đức Phẩm, 1998, Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
8. Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phƣơng, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị
Giang, 2008. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn
thành phố Hà Nội. Tạp chí Khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội 24, 221-226.
9. Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm, 2004. Sổ tay kiểm nghiệm vi
sinh thực phẩm thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
10. Nguyễn Thị Bí ch Thúy , 1998. Nghiên cứu đặc điểm sinh học nhằm góp phần bảo
vệ nguồn lợi tôm hùm ở vùng ven biển miền Trung Việt Nam, Luận án tiến sĩ khoa học
Sinh học, Viện Hải dƣơng học, Nha Trang.
12. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành, 2007. Công nghệ sinh học, tập5: Công nghệ vi
sinh và môi trƣờng, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội trang 129 – 146.
13. Tổng cục T hủy sản , 2012. Báo cáo tóm tắt quy hoạch tổng thể phát triển ngành
thủy sản Việt Nam đến năm 2020, tầm nhì n 2030.
73
14. Trung tâm khuyến nông quốc gia, 2010, Nuôi tôm hùm thương phẩm và một số
biện pháp phòng trị bệnh ở tôm nuôi (phần 4).
15. Võ Văn Nha, 2003. Một số đặc điểm sinh học của tôm hùm bông. Tạp chí Khoa
Học Công Nghệ Thủy Sản số 2/2003.
Tài liệu tiếng Anh:

16. AOAC, 1990. Ofﬁcial Method of Analysis, 15th ed. Arlington, VA: Association of
ofﬁcial analytical chemists, 70.
17. Balca´zar J.L, 2003. Evaluation of probiotic bacterial strains in Litopenaeus
vannamei. Final Report, National Center for Marine and Aquaculture Research,
Guayaquil, Ecuador.
18. Balca´zar S.J, Blas I.D, Ruiz-Zarzuela I, Cunningham D, Vendrell D, Muzquiz J.L,
2006. The role of probiotics in aquaculture. Laboratory of Fish Pathology, University
of Zaragoza, Miguel Servet 177, 50013 Zaragoza, Spain. Veterinary Microbiology
114(3-4): 173-186.
19. Bourne D, Hoj L, Webster N, Payne M, Skindersoe M, Givskov M, Hall M, 2007.
Microbiological aspects of phyllosoma rearing of the ornate rock lobster Panulirus
ornatus. Aquaculture 268(1-4): 274-287.
20. Chatterjee and Haldar, 2012. Vibrio Related Diseases in Aquaculture and
Development of Rapid and Accurate Identification Methods. Journal Marine Science
Research & Development 2012, S1:002. doi:10.4172/2155-9910.S1-002.
21. Chythanya R., Karunasagar I, Karunasagar I, 2002. Inhibition of shrimp
pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture 208: 1–10.
22. Dean D, 2011. Aquaculture in Vietnam: from small-scale integration to intensive
production, Brown University Library.
23. EPA (United States Environmental Protection Agency), 2003. Bacillus pumilus
strain GB 34 (006493) “Fact Sheet”.
http://www.epa.gov/oppbppd1/biopesticides/ingredients/factsheets/factsheet_006493.htm.
24. Farzanfar A, 2006, The use of probiotics in shrimp aquaculture. FEMS Immunol
Med Microbiol 48(2): 149-58
25. Fuller R, 1992. History And Development Of Probiotics, in: Roy Fuller (Ed.)
Probiotics: The Scientific Basis, 1-8, chapman &Hall, London.
74
26. Garriques D and Arevalo G, 1995. An evaluation of the production and use of a
live bacterial isolate to manipulate the microbial flora in the commercial production
of Penaeus vannzamei postlarvae in Ecuador. In: Browdy C.L and Hopkins J.S,
editors. Swimming through troubled water, proceedings of the special session on
shrimp farming. World Aquaculture Society P 53-59.
27. Gibson L.F, Woodworth J, George A.M, 1998. Probiotic activity of Aeromonas
media on the Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii.
Aquaculture 169: 111–120.
28. Gullian M, Thompson F, Rodrı´guez J, 2004. Selection of probiotic bacteria and study
of their immunostimulatory effect in Penaeus vannamei. Aquaculture 233: 1–14.
29. Gopal S, Otta SK, Kumar S, Karunasagar, Nishibuchi M, Karunasagar L, 2005.
The occurrence of Vibrio species in tropical shrimp culture environments; implications
for food safety. International Journal of Food Microbiology 102(2): 151-9.
30. Hansen G.H, 2000. Use of probiotics in marine aquaculture. Feed Mix 8: 4.
31. Hubalek Z, 2003. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms.
Cryobiology 46: 205–229.
32. Hill, J E; Baiano, J C F, Barnes, A C (2009). Isolation of a novel strain of Bacillus
pumilus from penaeid shrimp that is inhibitory against marine pathogens. Journal of
Fish Diseases 32 (12): 1007–1016.
33. Irianto A & Austin B, 2002. Probiotics in aquaculture. Journal of Fish Diseases
25: 633–642.
34. Jans. D. 2005. Probiotics in animal nutrition, Booklet.WWW.Fefana.org.pp 4-18.
35. Jingjin C, Meili D and Wenlin S, 1997. The application of the Photosynthetic
bacteria in the production of the shrimp larva culture. Journal of Ocean University of
Qingdao.
36. Jiravanichpaisal P, Chuaychuwong P and Menasveta P, 1997. The use
of Lactobacillus sp. as the probiotic bacteria in the giant tiger shrimp (Penaeus
monodon Fabricius). Poster session of the 2nd Asia-Pacific marine biotechnology
conference and 3rd Asia-pacific conference on algal biotechnology, Phuket, Thailand.
37. Khachatourions GG, 1998. Agricultural use of antibiotics and the evolution and
transfer of antibiotic-resistant bacteria. Canadian Medcical Association journal 159:
1129–1136.
75
38. Kosin B, Rakshit S.K, 2006. Microbial and Processing Criteria for Production of
Probiotics. Food Technol Biotechnol 44 (3): 371–379.
39. Kesarcodi-Watson A, Kaspar H, Lategan M. J, Gibson L, 2008. Probiotics in
aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes.
Aquaculture 274: 1 – 14.
40. Lai Van Hung and Le Anh Tuan (2008), Lobster seacage culture in Viet Nam. In:
Spiny lobster aquaculture in the Asia-Pacific region (Ed: Kevin C. Williams), pp 10-
17, Proceedings of an international symposium held at Nha Trang, Vietnam.
41. Lara-Flores M, Miguel A, Olvera- Novoa, Beatriz E, Guzman-Mendez, Lopez-
Madriet W, 2003. Use of the bacteria Streptococcus faecium and Lactobacillus
acidophilus, and the yeast Saccharomyces cerevisiae as growth promoters in Nile
tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 216: 193–201.
42. Maeda M, and Liao I.C, 1992. Effect of bacterial population on the growth of a
prawn larva, Penaeus monodon. Aquaculture 21: (25-29).
43. Maeda M, and Liao I.C, 1994. Microbial processes in aquaculture environment and
their importance for increasing crustacean production. Japan Agricultural Research
Quarterly 28(4): 283-288.
44. Maqsood S, Prabjeet Singh, Munir Hassan Samoon and Gohar Bilal Wani, 2010.
Probiotics and its applications in aquaculture. Aquafind.
http://aquafind.com/articles/probiotics_in_aquaculture.php
45. Moriarty DJW, 1999. Disease control in shrimp aquaculture with probiotic
bacteria. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology.
Atlantic Canada Society for Microbial Ecology, Halifax, Canada. pp 237–243.
46. Ngo Van Hai, Fotedar R, Buller N, 2007. Selection of probiotics by various
inhibition test methods for use in the culture of western king prawns, Penaeus
latisulcatus (Kishinouye). Aquaculure 272 (1-4), 231-239.
47. Nogami K and Meada M, 1992. Bacteria as biocontrol agents for rearing larvae of
the Crab Portunus trituber Culatus. Canadian Journal of fisheries and aquatic
sciences 4.9: 2373-2376.
48. Prabhu NM, Nazar AR, Rajagopal S, Ajmal Khan S, 1999. Use of probiotics in
water quality management during shrimp culture. Journal Aquaculture in the Tropics
14: 227–236.
76
49. Rattanachuay P, Kantachote D, Tantirungkij M , Nitoda T , Kanzaki H, 2010

Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular compounds from a proteolytic
bacterium Pseudomonas sp. W3. Electronic Journal of Biotechnology.
50. Ravi A.V, Musthafa K.S, Jegathammbal G, Kathiresan K, Pandian S.K, 2007.
Screening and evaluation of probiotics as a biocontrol agent against pathogenic
Vibrios in marine aquaculture. Letters in Applied Microbiology 45 (2): 219-223.
51. Rengpipat S, Tunyanun A, Fast AW, Puyatiratitivorakul S, Menasveta P, 2003.
Enhanced growth and resistance to vibrio challenge in pond-reared black tiger shrimp
Penaeus monodon fed a Bacillus probiotic. Diseases Of Aquatic Organisms 55: 169–173.
52. Rengpipat S, Rukpratanporn S, Piyatiratitivorakul S, Menasaveta P, 2000.
Immunity enhancement in black tiger shrimp (Penaeus monodon) by a probiont
bacterium (Bacillus S11). Aquaculture, 191: 271–288.
53. Siaterlis A, Deepika G and Charalampopoulos D, 2009. Effect of culture medium
and cryoprotectants on the growth and survival of probiotic Lactobacilli during freeze
drying. Department of Food Biosciences, The University of Reading, Berkshire,
Reading, UK. Letters in Applied Microbiology 48 (3): 295-301.
54. Shields J D, 2011. Diseases of spiny lobsters: A review. Journal of Invertebrate
Pathology 106, page 79–91.
55. Sihag R Cvà Sharma P, 2012, The New Ecofriendly Alternative Measures of
Disease Control for Sustainable Aquaculture. Journal of Fisheries and Aquatic
Science Volume 7, Number 2, 72-103.
56. Thompson F L, Iida Tand Swings J, 2004. Biodiversity of Vibrios, Microbiology
and Molecular Biology Reviews, page 403-431.
57. Vaseeharan B and Ramasamy P, 2003. Control of pathogenic Vibrio spp. by
Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus
monodon. Letters in Applied Microbiology 36: 83–87.
58. Vine N G, Winston D. Leukes and Horst Kaiser, 2006. Probiotics in marine
larviculture. Federation of European Microbiogical Societies Microbiology Reviews,
Volume 30, Issue 3, pages 404–427.
59. Zhoujia L, Qing Z and Huaquan Y, 1997. The affect of the probiotics to the shrimp
ponds. Aquaculture of China 5: 30-31.
77
PHỤ LỤC
Bảng PL.1. Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1 của các chủng probiotic
nghiên cứu theo thời gian.
STT Kí hiệu chủng 1giờ 2giờ 3giờ 4giờ 5giờ
1 B3.7.4 11 11 12 13 7
2 B3.10.2 7 8 11 11 7
3 B3.7.1 - 6 9 8 6
4 B3.10.1 - 7 13 11 8
(-) không có hoạt tính kháng khuẩn
Bảng PL.2. Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V3.3 của các chủng nghiên cứu
theo thời gian.
STT Kí hiệu chủng 1giờ 2giờ 3giờ 4giờ 5giờ
1 B3.7.4 8 9 9 12 5
2 B3.10.2 9 11 15 12 3
3 B3.7.1 7 7 12 13 7
4 B3.10.1 8 10 11 13 5
Bảng PL.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.1 trên môi trƣờng
TSB và LB
Thời gian (h) TSB LB
0 0,0698 0,0700
1 0,3156 0,3564
2 0,7446 0,7400
3 1,4513 1,7009
4 1,6984 1,9426
5 1,8631 2,0599
6 1,9378 2,0981
7 2,0523 2,1186
78
Bảng PL.4. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.2 trên môi trƣờng TSB và LB
Thời gian (h) TSB LB
0 0,0704 0,0691
1 0,4243 0,4869
2 0,9142 1,0982
3 1,6428 1,8042
4 1,8375 1,9179
5 1,9155 1,9705
6 1,9778 2,0189
7 2,0173 2,0724
Thời gian(h) TSB LB
0 0,0685 0,0693
1 0,4201 0,4802
2 0,9474 1,1436
3 1,5888 1,8015
4 1,7987 1,9245
5 1,9299 2,0120
6 1,9926 2,0620
7 2,0853 2,1180
Thời gian (h) TSB LB
0 0,0697 0,0682
1 0,3668 0,3958
2 0,8395 0,8714
3 1,5221 1,7492
4 1,7925 1,9713
5 1,8872 2,1061
6 1,9631 2,1951
7 2,0456 2,2049
79
Bảng PL.7. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Tinh bột sắn Tinh bột bắp Rỉ đƣờng Glucose
B3.7.1 0,1090 0,6345 1,1380 1,3098
B3.7.4 0,1217 0,7066 1,2369 0,8968
B3.10.1 0,2273 0,7819 1,8201 1,3680
B3.10.2 0,2001 0,8188 1,6732 1,3350
Bảng PL.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến các chủng nghiên cứu
Đậu nành Amoni sulfat Pepton
B3.7.1 0,0874 0,4366 1,3071
B3.7.4 0,1514 0,9164 0,9013
B3.10.1 0,1451 0,6782 1,3601
B3.10.2 0,0907 0,7107 1,3427
Bảng PL.9. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
0% 1% 2% 3% 4% 5%
B3.10.1 1,6788 1,9654 1,9527 1,7242 1,4187 1,0229
B3.7.4 0,9439 1,8871 1,8455 1,6587 1,0913 0,6429
B3.7.1 1,1773 1,8604 1,8089 1,5920 1,2147 0,7132
B3.10.2 1,1105 1,8672 1,8160 1,5542 1,1141 0,6886
Bảng PL.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9
B3.7.1 0,3714 1,5602 1,8553 1,9411 1,8040
B3.7.4 0,3502 1,2999 1,8237 1,9237 1,8308
B3.10.1 0,3749 1,4320 1,8841 1,9513 1,7960
B3.10.2 0,3665 1,4224 1,7311 1,8186 1,6582
80
Bảng PL.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Kí hiệu chủng Tốc độ sinh trƣởng OD540
Nhiệt độ phòng B3.10.2 1,8172
(28-310C) B3.7.4 1,7292
B3.10.1 1,8049
B3.7.1 1,8017
310C B3.10.2 1,9927
B3.7.4 1,8667
B3.10.1 2,0263
B3.7.1 1,9264
340C B3.10.2 2,1073
B3.7.4 2,0461
B3.10.1 2,2794
B3.7.1 2,2067
370C B3.10.2 2,0051
B3.7.4 2,1860
B3.10.1 2,2018
B3.7.1 1,9208
400C B3.10.2 1,8246
B3.7.4 1,8891
B3.10.1 1,9389
B3.7.1 1,8364
Bảng PL.12. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình lên men bằng thiết bị BioFlo 110
Kí hiệu chủng pH Tốc độ sinh trƣởng OD540
6 1,5089
7 1,7925
B3.10.2
8 1,9508
9 1,6471
81
Bảng PL.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình lên men bằng thiết bị
BioFlo 110
Kí hiệu chủng pH Tốc độ sinh trƣởng OD540
280C 1,9147
310C 2,0869
B3.10.2 340C 2,2352
370C 2,1559
400C 1,9077
Bảng PL.14. Tỷ lệ sống của chủng B3.7.4 sau khi đông khô
Chất chống đông Tỷ lệ sống sót
Lactose 1% 4,31
Lactose 5% 63,08
Lactose 10% 53,85
Mantodextrin 1% 4,77
Glycerol 1% 6,46
Glycerol 5% 8,77
Glycerol 10% 11,38
Mẫu đối chứng 15,08
Bảng PL.15. Tỷ lệ sống của chủng B3.10.2 sau khi đông khô
Chất chống đông Tỷ lệ sống sót
Lactose 1% 4,48
Lactose 5% 74,63
Lactose 10% 49,25
Glycerol 1% 4,63
Glycerol 5% 6,42
Glycerol 10% 7,76
Mẫu đối chứng 18,66
82
Bảng PL.16. Ảnh hƣởng của dầu mực vào thức ăn bổ sung probiotic đối với thời
gian tan trong môi trƣờng nƣớc biển
Thời gian Thức ăn Thức ăn + Thức ăn + Thức ăn + Thức ăn +
(giờ) probiotic probiotic + probiotic + probiotic +
10ml dầu 20ml dầu 30ml dầu
0 0,049 0,098 0,092 0,088 0,080
2 0,059 0,164 0,149 0,197 0,206
4 0,070 0,218 0,168 0,205 0,201
6 0,081 0,266 0,187 0,210 0,211
8 0,091 0,278 0,196 0,218 0,223
Bảng PL.17. Áp suất bay hơi theo nhiệt độ

0 0 0 0
C mBar C mBar C mBar C mBar
0 6,110 -20 1,030 -40 0,120 -60 0,0110
-1 5,620 -21 0,940 -41 0,110 -61 0,0090
-2 5,170 -22 0,850 -42 0,100 -62 0,0080
-3 4,760 -23 0,770 -43 0,090 -63 0,0070
-4 4,370 -24 0,700 -44 0,080 -64 0,0060
-5 4,020 -25 0,630 -45 0,070 -65 0,0054
-6 3,690 -26 0,570 -46 0,060 -66 0,0047
-7 3,380 -27 0,520 -47 0,055 -67 0,0041
-8 3,010 -28 0,470 -48 0,050 -68 0,0035
-9 2,840 -29 0,420 -49 0,045 -69 0,0030
-10 2,560 -30 0,370 -50 0,040 -70 0,0026
-11 2,380 -31 0,340 -51 0,035 -71 0,0023
-12 2,170 -32 0,310 -52 0,030 -72 0,0019
-13 1,980 -33 0,280 -53 0,025 -73 0,0017
-14 1,810 -34 0,250 -54 0,024 -74 0,0014
-15 1,650 -35 0,220 -55 0,021 -75 0,0012
-16 1,510 -36 0,200 -56 0,018 -76 0,0010
-17 1,370 -37 0,180 -57 0,016
-18 1,250 -38 0,160 -58 0,014
-19 1,140 -39 0,140 -59 0,012

(123doc) Nghien Cuu Quy Trinh San Xuat Che Pham Probiotic Nham Bo Sung Vao Thuc An Cho Tom Hum Nuoi Long

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

(123doc) Nghien Cuu Quy Trinh San Xuat Che Pham Probiotic Nham Bo Sung Vao Thuc An Cho Tom Hum Nuoi Long

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN VŨ ĐÌNH NGUYÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Nha Trang - 2013

TRẦN VŨ ĐÌNH NGUYÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

Nha Trang – 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả luận văn

Trần Vũ Đình Nguyên

Để hoàn thành Đồ án này.

LỜI CAM ĐOAN………………………. .....................................................................i

DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT

OD : Optical Density (Mật độ quang)

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

V. alginolyticus P. monodon (Tôm sú) Bệnh vỏ

V. parahaemolyticus P. monodon (Tôm sú) Bệnh đỏ đuôi, tử

V. vulnificus Oreochromis niloticus Vibriosis

(Chatterjee and Haldar, 2012)

1.2.4.2. Trong nuôi trồng thủy sản

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

a) Môi trƣờng tăng sinh APW (Alkaline Peptone Water)

b) Môi trƣờng nuôi cấy TSB (Trypton Soy Broth)

Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton: 3 g

NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g

Glucose: 2,5 g Nƣớc cất: 1 l

d) Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật LB (Lauria Broth)

Trypton: 10 g; Cao nấm men: 5 g;

Natri clorua (NaCl): 30 g; Nƣớc cất: 1 l

- Máy lắc vòng (GFL 3005, Đức).

- Máy lắc ngang (Labkorea, Hàn Quốc).

- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha).

- Tủ sấy (Binder, Đức).

- Lò vi sóng (Panasonic, Hàn Quốc).

- Thiết bị lên men BioFlo 110.

- Máy đông khô Telstar LyoBeta 35.

Sinh khối vi khuẩn probiotic

Xác định các thông

Xác định tỷ lệ sống

Glycerol Lactose Maltodextrin

Xác định tỷ lệ sống

2.2.13. Khảo sát tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

STT Kí hiệu chủng Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D-d,mm)

Mật độ quang (OD540 )

+ Về kết quả nhuộm Gram

C c c ủng ng iên cứu

Mật độ quang (OD540 )

Môi trƣờng TSB cải tiến

Thu dịch lên men

Tốc độ ly tâm: 6000 vòng/phút

Sinh khối tế bào

Hình 3.21 Sơ đồ quy trì nh lên men

2 Tạo chân không 0,09 ≈0,4

5 Làm khô cấp 1 Từ -43 đến 30 0,09 ≈13

6 Làm khô cấp 2 30 ≈0,01 3