Citokemijske reakcije u dijagnostici

hematoloških bolesti

Sunčica Ries
Klinički zavod za patologiju i citologiju KBC Zagreb
Organi krvotvornog sustava

• koštana srž
• slezena
• limfni čvorovi
• timus (involuira nakon 20 godine života)
• sluznični imunosni sustav (gastrointestinalnog i respiratornog
trakta)
• kožni imunosni sustav
Hematološke bolesti

• naslijeđene i stečene
• dobroćudne i zloćudne
• bolesti eritrocita
• bolesti granulocita, monocita/makrofaga i limfocita
• bolesti trombocita
Aspiracijska citodijagnostika krvotvornog sustava

• aspiracijska punkcija koštane srži:

- punktira se prsna kost (sternum)ili zdjelična kost (spina iliaca
posterior, spina iliaca anterior)
- dezinfekcija kože
- primjena lokalnog anestetika (npr. 2% Novocain)
- igla za pukciju koštane srži (s mandrenom)
- štrcaljka-povlačenjem klipa stvara se podtlak
- aspirira se oko 0,5 ml koštane srži; više za dodatne analize
• aspiracijska punkcija koštane srži:
- mjesto punkcije prekrije se sterilnom gazom
- dobivena srž stavi se na satno stakalce
- čestice koštane srži raspoređuju se na predmetna stakalca i razmazuju
staklom preko stakla
- pripremljeni razmazi suše se na zraku i boje standardnim MGG
bojenjem
- citomorfološki se analiziraju pod svjetlosnim mikroskopom
• aspiracijska punkcija limfnih čvorova:
- punkcija se izvodi uz kontrolu UZV-a
- čvor se punktira tankom iglom i štrcaljkom
- smjer igle mijenja se u obliku obrnutog slova”Y”
i aspirira se nekoliko puta
- mali limfni čvorovi mogu se punktirati samo s iglom
mijenjajući smjer bez aspiracije
Citokemija
• grana citologije koja istražuje kemijski sastav, lokalizaciju i dinamiku
različitih tvari u stanici

• citokemijske pretrage - skup specifičnih kemijskih reakcija pomoću kojih

vizualiziramo enzime, ugljikohidrate, masti i druge stanične strukture
pomoću svjetlosnog mikroskopa
• neenzimske i enzimske citokemijske pretrage
• dodatni dijagnostički postupci pomoću kojih postavljamo dijagnozu
hematoloških bolesti npr. akutnih leukemija
Akutne leukemije (AL)
• razlikuju se po:
- morfološkim
- imunofenotipskim
- citogenetičkim
- molekularnim karakteristikama

• Svjetska zdravstvena organizacija (SZO) – 2017g. nova klasifikacija

Akutne leukemije (AL)

• zloćudne klonalne bolesti krvotvornih matičnih stanica

- akutne mijeloične leukemije (AML)

- akutne limfoblastične leukemije (ALL)
- akutne leukemije neodređene loze

• zloćudni klon leukemijskih stanica (blasti)

Citomorfološka dijagnostika AL

• standardno bojenje May-Grünwald Giemsa (MGG)

• ≥ 20 % blasta unutar 500 stanica s jezgrom u koštanoj srži ili 200 stanica s
jezgrom u razmazu periferne krvi
• AML - mijeloblasti, monoblasti/promonociti, megakarioblasti, abnormalni
promijelociti

• ALL - limfoblasti

• morfologija + citokemija = citomorfološka dijagnoza AL

 Neenzimske citokemijske reakcije u AL

• Sudan crno (engl. Sudan Black B):

- boji lipide u stanicama
- lipidi su sastavni dio stanične membrane i endoplazmatske mrežice,
membrane lizosoma, mitohondrija, Golgijeva aparata
- izrazito pozitivan u normalnim stanicama granulocitopoeze, stanice
monocitopoeze su slabije pozitivne
- pozitivna reakcija u AML: sivo-crna zrnca u citoplazmi mijeloblasta
Neenzimske citokemijske reakcije u AL
• PAS (engl.Periodic acid Shiff):
- reakcijom dokazujemo prisutnost staničnih ugljikohidrata i
glikoproteina (unutar membrane i citoplazme)
- oksidacijskim djelovanjem perjodne kiseline oslobađaju se aldehidne skupine
koje se prikažu bojenjem fuksin sumpornom kiselinom (Schiffov reagens)
koja se djelovanjem slobodnih aldehida mijenja iz bezbojnog u obojeni oblik
- PAS pozitivne mogu biti stanice mijeloičnog i limfatičnog porijekla
- PAS pozitivni blasti u ALL sadrže brojna veća crvena
zrnca često smještena poput prstena oko jezgre ili jedno veće
voluminozno u citoplazmi
- u blastima podtipova AML pozitivna reakcija je u obliku sitnih
crvenkastih zrnaca ili slabo obojene ružičaste citoplazme
Neenzimske citokemijske reakcije u AL
• Touidinsko modrilo:
- anilinska boja sa sposobnošću metakromazije
(pojedine tvari boji različito od svog osnovnog tona)
- prisutnost mukopolisaharida u citoplazmi stanica granulocitopoeze
- pozitivan u normalnim bazofilnim granulocitima i mastocitima
- dokazuje se mijeloično porijeklo stanica s bazofilnom
diferencijacijom
- pozitivna reakcija u akutnoj bazofilnoj leukemiji: tamnoljubičasta
zrnca u citoplazmi blasta
Neenzimske citokemijske reakcije u AL

• Uljna crveno O (engl.Oil red O):

- boji lipide i neutralne trigliceride
- primjenjuje se kod sumnje na Burkittovu leukemiju/limfom
- pozitivna reakcija u Burkittovoj leukemiji: crveno obojene lipidne
vakuole u citoplazmi limfoblasta
Reakcija dokazivanja ekstrahemoglobinskog
željeza (berlinskim modrilom)
• neenzimska citokemijska reakcija
• berlinskim modrilom dokazuje se trovalentno željezo (koje nije
ugrađeno u hemoglobin)
• pri reakciji kalij-ferocijanat reagira s feri-ionima (nastaje modro obojeni spoj)
• pozitivna reakcija: zeleno-modra zrnca u citoplazmi stanica eritrocitopoeze (sideroblasti),
eritrocitima (siderociti) i stanicama mononuklearno-fagocitnog sustava
• povećan broj sideroblasta-hemolitičke i megaloblastične anemije
• podtipovi mijelodisplastičnog sindroma- >15% prstenastih sideroblasta u izbrojenim
eritroblastima tj. najmanje 5 zrnaca koja okružuju 2/3 opsega jezgre
Enzimske citokemijske reakcije

• Mijeloperoksidaza (MPO):
- lizosomalni enzim
- nalazi se u primarnim zrncima stanica granulocitnog reda
- MPO cijepa vodikov peroksid, oslobađa kisik koji oksidira supstrat
u obojeni kemijski spoj
- izrazito pozitivna u normalnim neutrofilima i eozinofilima
- pozitivna reakcija u AML: žuto-smeđa zrnca (supstrat benzidin) ili smeđe-crna
zrnaca (supstrat 4-chloro-1-naphthol) u citoplazmi mijeloblasta, može biti slabo
pozitivna u monoblastima
Enzimske citokemijske reakcije

• Alfa-naftil-acetat esteraza (ANAE):

- pripada skupini izoenzima esteraza
- nalazi se u lizosomima svih stanica hematocitopoeze
- aktivnost je izražena u monocitima (tijekom reakcije nastaje
obojeni spoj iz supstrata alfa-naftil acetata i otopine pararozanilin-natrijeva
nitrita)
- dodatkom natrijeva fluorida (NF) aktivnost ANAE se blokira samo u
stanicama monocitnog reda
- pozitivna reakcija u AL: crveno–smeđa zrnca ili difuzno crveno-smeđe
obojena citoplazma u monoblastima i promonocitima (AML) ili
jedno veće zrnce u T-ALL
Enzimske citokemijske reakcije

• Naftol-AS-D-klor-acetat esteraza (CAE)

- pripada skupini izoenzima esteraza
- nalazi se u lizosomima stanica
- izrazito pozitivna u stanicama granulocitopoeze
- pozitivna reakcija u AML- crvena zrnca u citoplazmi
mijeloblasta
 Citokemijske reakcije

• citokemijske reakcije izvodi ing. laboratorijske dijagnostike (citotehnolog)

• za svaku AL radi se 6 citokemijskih reakcija i paralelno 6 kontrolnih
reakcija
• razmazi normalne koštane srži koriste se kao kontrolni razmazi za većinu
citokemijskih reakcija
• kontrola kvalitete postupka – provjera da li je citokemijska reakcija točno
izvedena, ako je kontrolna reakcija negativna cijeli postupak se ponavlja
• kontrolni razmazi i dijagnostički razmazi arhiviraju se zajedno
 Citokemijske reakcije

• citokemijske reakcije na razmazima koštane srži analizira i interpretira

citolog
• pod svjetlosnim mikroskopom na velikom povećanju broje se pozitivne
stanice na 200 blasta
Citologija gastrointestinalnog i
pankreatobilijarnog sustava

Sunčica Ries
Klinički zavod za patologiju i citologiju KBC Zagreb
Citološki uzorci u gastrointestinalnom sustavu

• jednjak
• želudac
• dvanaesnik
• kolon i rektum
Uzimanje uzoraka za citološku dijagnostiku
bolesti jednjaka

• uzorak dobiven četkanjem (brushing tehnika) kod

ezofagoskopije
• ispirak (lavat)
• otisak biopsijskog uzorka
Upalne bolesti i tumori jednjaka

• gastroezofagealna refluksna bolest (GERB)

• Barret-ov jednjak je komplikacija dugotrajnog refluksa
• metaplazija pločastog epitela u žljezdani
• metaplastični epitel ima povećanu sklonost zloćudnoj pretvorbi
• dobroćudni i zloćudni tumori
• zloćudni-najčešće karcinomi (pločasti i žljezdani)
Uzimanje uzoraka za citološku dijagnostiku
bolesti želuca

• uzorci dobiveni četkanjem( brushing tehnika) kod gastoskopije

• otisci biopsijskih uzoraka
• punktati (gastroskopski, EUZ)
• uzorak uzet četkicom direktno se razmazuje na predmetna stakla,
fiksira sušenjem na zraku i boja standardnim (MGG) bojenjem
• potreban je nalaz gastroskopije i klinički podaci
Bolesti želuca

• upalne bolesti (gastritisi)

akutni: alkohol, lijekovi
kronični: uzročnik Helicobacter pylori, pušenje, alkohol, lijekovi
• kronični peptički ulkus- defekt sluznice želuca (učinak HCl i pepsina,
povezanost s H. pylori infekcijom)
citološki: upalne stanice, detritus, proliferativni i reparatorni epitel

• displazija-promjene arhitekture epitela, citoloških obilježja i sazrijevanja

stanica (citologija nije pouzdana metoda)
Novotvorine želuca

• dobroćudne i zloćudne
• epitelni tumori
• mezenhimalni tumori
• limfomi

• rak želuca-maligni epitelni tumor

citologija – osjetljiva i pouzdana metoda u dijagnostici karcinoma

• GIST-gastrointestinalni stromalni tumor-citologija +imunocitokemija

• neuroendokrini tumori-citologija +imunocitokemija
Citološki uzorci u pankreatobilijarnom sustavu

• bris četkicom pri endoskopskoj retrogradnoj kolangiopankreatografiji

(ERCP)
• direktno nanošnje uzorka s četkice na staklo odmah u sobi za
endoskopiju uz prisustvo citotehničara ili odrezati četkicu i odmah poslati
u citološki laboratorij
• punkcija vođena endoskopskim ultrazvukom (EUZ) omogućava bolju
vizualizaciju gušterače i okolnih struktura
• transkutana punkcija vođena UZV, CT ili MR (parenhimnih organa ili
slobodne tekućine)
Priprema citološkog uzorka dobivenog uz EUZ

• prisustvo citologa u sali za EUZ

• ROSE (engl. rapid on-site evaluation):

makroskopska procjena kvalitete uzorka

pribor za brzo bojenje, mikroskopska procjena uzorka, ponavljanje punkcije po
potrebi, preliminarna dijagnoza

• u laboratoriju-standardno bojenje (MGG i PAPA), imunocitokemijske

reakcije
• uzimanje uzorka za dodatne analize (biokemija, mikrobiologija, imunofenotipizacija
ili molekularne analize (PCR, FISH))
 Bolesti gušterače
• upalne bolesti gušterače (lat.pancreatitis):
uzrok- najčešće žučni kamenci ili prekomjerna konzumacija alkohola
• citomorfološka slika:
akutni - nekrotične acinarne i duktalne stanice, neutrofilni granulociti,
detritus, pjenušavi makrofagi,mast
kronični- limfociti i plazma stanice, duktalne i acinarne stanice
(rekativne promjene), fibrociti, fibrozni tračci
• organiziranjem nekrotičnog tkiva nastaje lažna cista (tzv. pseudocista)
Tumori gušterače

• tumori egzokrinog dijela :

cistične novotvorine: serozne (najčešće dobroćudne)
mucinozne (dobroćudne i zloćudne)
karcinomi gušterače-duktalni adenokarcinom (najčešći-95%)
• citološki uzorci dobiveni uz EUZ su optimalni za dijagnozu
• tumori endokrinog dijela (rijetki):
nastaju iz stanica Langerhansovih otočića i često proizvode hormone
dobroćudni (najčešći inzulinom) i zloćudni
citomorfologija + imunocitokemija
• metastatski tumori gušterače
Obrada – tekući uzorci i tekućinska citologija
• Zaštitna oprema: zaštitne naočale ili vizir te jednokratne rukavice i masku.
• Obrada: centrifuga i citocentrifuga.
• Citocentrifuga : količine sluzi -> potrebno diferenciranje stanica.
• Broj okretaja : ovisi o promjeru rotora centrifuge i citocentrifuge
mogu izračunati formulom i prilagoditi svakom tipu uzorka
ˇˇ
• RCF (relativna centrifugalna sila, g) = 1,118r(RPM/1000)2
• RCF- relativna centrifugalna sila, g; r – radijus (mm); RPM – okretaji rotora po minuti

• konične epruvete s tekućim uzorcima centrifugiraju u centrifugi na 1500 okretaja kroz 5 minuta.
• Supernatant se odlije, a sediment razmaže ezom jednoličnim pokretima, u što tanjem sloju, na dvije trećine predmetnog stakla, ne
dodirujući rubove
• Izljevi i urini se centrifugiraju u citocentrifugi na 1500 okretaja kroz 5 min.
• Izuzetak su bronhoalveolarni lavati(BAL) koji zahtjevaju obradu citocentrifugom na manjem broju okretaja (1000 okretaja).
• Kod uzoraka poput bronhoalveolarnog lavata, koji sadrže nešto više sluzi, a još uvijek zadovoljavaju kriterije za obradu pomoću
citocentrifuge, potrebno je uzorak prethodno profiltrirati. U slučaju uzoraka bronhoalveolarnog lavata dobivenih od
imunokompromitiranih pacijenta (Pneumocystis c. yiroveci, HIV, Hepatitis C) uzorke nije potrebno filtrirati jer ne zahtjeva Punjenje
komorica citocentrifuge.
• Filtriranje bronhoalveolarnog lavata.
• Uzorci bronhoalveolarnog lavata filtriraju se preko svilenog filtera veličine pora 41 µm kako bi se odstranila
sluz.
• Epruveta se prethodno silanizira Silko Spray-em te se na otvor stavi svileni filter kroz koji se uzorak
bronhoalveolarnog lavata nježno protiskuje Pasterovom pipetom.
• Silko Spray omogućuje da se stanice ne lijepe za stijenke epruvete. Dovoljna količina filtriranog uzorka je
≤1 ml. Filtriranim uzorkom se pune komorice citocentrifuge.
• Spremanje nativnih uzoraka
• Nativni uzorci -20°C ili -80°C, a ostatni dijelovi tekućih uzorka ili sedimenata se spremaju u epruveti sa
specijalnom tekućinom za čuvanje stanica (npr. Cytolyt ili Cytolyt Preserve otopinom) na +4°C u svrhu
izrade staničnih blokova.
• Stanični blokovi i stakla s nativnim uzorcima –sobna temperatura.

• Tekućinska citologija

• Tekućinska citologija (eng. Liquid-based cytology) novija je metoda obrade uzoraka za citološku analizu
stanica. Najčešće se primjenjuje u ginekološkoj citologiji kao zamjena ili nadopuna klasičnom Papa testu i u
citološkoj analizi uzoraka urina. Može se primijeniti za obradu i analizu gotovo svih vrsta citoloških uzoraka.
Način prikupljanja uzoraka za tekućinsku citologiju je isti
 Obrada bronhoalveolarnog lavata (BAL-a)
Citocentrifuga i centrifuga

• Zabilježi se makroskopski izgled BAL-a - njegova boja i konzistencija. Filter se postavi preko epruvete za
centrifugu, uzima se uzorak BAL-a Pasterovom pipetom i filtrira. Pripreme se 4 komorice za citocentrifugu po
jednom uzorku. Filtrirani BAL stavlja se pipetom (3 kapi) u komoricu za citocentrifugu i postavlja se u rotor
citocentrifuge. Citocentrifuga se podesi na 1000 ok/ 5 min.

• Nakon vađenja, potrebno je provjeriti da li su komorice prazne, odvoji se staklo s citospinom od komorice, stakla
se označavaju inicijalima.

• Drugi dio uzorka stavlja se u centrifugu na 1500 ok/5 min, epruveta se izvadi, odlije se supernatant, cetrifugirani
dio se lagano uzima plastičnom ezom i razmazuje kružno-elipsastim pokretima po staklu.

• Ako je sloj deblji, s drugom, čvršćom ezom se može sloj stanjiti. Stakla se označavaju i suše u stalku ili na
predviđenoj podlozi.
 Obrada izljeva

• Zabilježi se makroskopski izgled izljeva - boja i konzistencija, te količina. Pripremi se 4 ili više komorica za citocentrifugu po jednom uzorku. Izljev se
stavlja pipetom (3 kapi) u komoricu za citocentrifugu i postavlja se u rotor citocentrifuge. Citocentrifuga se podesi na 1500 ok/ 5 min.

• Nakon vađenja, potrebno je provjeriti da li su komorice prazne, odvoji se staklo s citospinom od komorice, stakla se označavaju inicijalima.

• Drugi dio uzorka stavlja se u centrifugu na 1500 ok/5 min, epruveta se izvadi, odlije se supernatant, cetrifugirani dio se lagano uzima plastičnom ezom i
razmazuje kružno-elipsastim pokretima po staklu (prikazano u obradi BAL-a).
• Ako je sloj deblji, s drugom, čvršćom ezom se može sloj stanjiti. Stakla se označavaju i suše u stalku ili na predviđenoj podlozi (prikazano u obradi BAL-a).
 Predanalitička faza citodijagnostike urina
Uzorak urina uzima se tijekom tri dana: drugi jutarnji urin pohranjuje
se u kemijski čistu posuda;

uzorak je potrebno dostaviti najkasnije 2 sata nakon uzorkovanja;

uzorak se obrađuje u citocentrifugi: instrument namijenjen za prijenos

stanica sa suspenzije preko filtera na predmetno staklo putem
centrifuge
- predmetno staklo označimo brojem protokola
- staklo umetnemo u nosač komorice, potom umetnemo filter i naposlijetku mobilni dio komorice
- uzorak promiješamo da bi se istaložene stanice podigle, pipetom uzmemo oko 0.5ml uzorka i spustimo ga u komoricu na predviđeno
mjesto
- komoricu umetnemo u citocentrifugu; na suprotnu stranu postavimo drugu komoricu (može biti bez uzorka) radi ravnoteže sustava
(tara)
- sustav postavimo na željenu duljinu centrifugiranja, trajanje postupka i započnemo ciklus centrifugiranja
- uzorak urina centrifugira se s 1000 okretaja tijekom pet minuta
- uzorak se posuši na zraku(minimalno 2 sata)
 Predanalitička faza citologije likvora
•Uzorkuje se u bolničkim uvjetima,punkcijom u 3. ili 4.
intervertebralnom prostoru,subokcipitalno iznad prvog kralješka ili iz
katetera;

•uzorak se stavlja u epruvetu bez antikoagulansa i dostavlja u

laboratorij najkasnije 1 sat nakon uzorkovanja;

•uzorak se obrađuje u citocentrifugi: instrument namijenjen za

prijenos stanica sa suspenzije preko filtera na predmetno staklo
putem centrifuge;
- predmetno staklo označimo brojem protokola
- staklo umetnemo u nosač komorice, potom umetnemo filter i naposlijetku mobilni dio komorice
- uzorak promiješamo da bi se istaložene stanice podigle, pipetom uzmemo oko 0.5ml uzorka i spustimo ga u komoricu na predviđeno
mjesto
- komoricu umetnemo u citocentrifugu; na suprotnu stranu postavimo drugu komoricu (može biti bez uzorka) radi ravnoteže sustava (tara)
- uzorak urina centrifugira se s 800 okretaja tijekom četiri minuta
- uzorak se posuši na zraku(minimalno 2 sata)
Obrada uzoraka – razmazi i otisci
• Uzorci se na predmetna stakla nanose na srednjem dijelu stakla, izbjegavajući rubove kako bi se spriječio gubitak stanica.

• Razmazi se dobivaju ispuhivanjem sadržaja koji je aspiriran na prethodno pripremljena predmetna stakla.

• Razmazi se rade metodom “staklo o staklo” uz lagan pritisak.

• Razmazi briseva, uključujući i otisak brisa bronha četkicom se nanose na predmetna stakla tako da se nježno, kružnim pokretima, sa svih strana
razmazuju po predmetnom staklu
• Otisci se dobivaju valjanjem kirurškog uzorka tkiva po predmetnom staklu jednokratnom sterilnom iglom
• Sa tkivom je potrebno nježno postupati, kako bi se očuvalo za daljnju patohistološku analizu.
• Nakon otisaka, komadić tkiva se uroni u otopinu formalina.
• Iskašljaj se na predmetno staklo prenosi ezom u što tanjem sloju. Uzorak se nanosi jednoličnim kružnim pokretima, na dvije trećine predmetnog
stakla, ne dodirujući rubove. Ciljano se uzimaju dijelovi iskašljaja s makroskopski uočljivim promjenama (krv, gnoj).

• Inducirani iskašljaj: Kompaktni dijelovi induciranog iskašljaja se izdvoje od ostatka sluzi te se odredi njihova masa pomoću analitičke vage.
• Na izvaganu količinu iskašljaja dodaje se dvostruka količina sputulizina tj. reagensa za otapanje sluzi.
• Sve zajedno se zagrijava na 25◦C kroz 30 minuta pomoću termobloka, uz lagano miješanje. Djelovanje sputulizina se zaustavlja dodatkom pufera.
Jedan dio sadržaja se obradi centrifugom te se sediment ezom prenese na predmetno staklo, a drugi dio se profiltrira kroz svileni filter promjera
60 µm te se obradi citocentrifugom.
 ISKAŠLJAJ

• Uzorak je u Petrijevoj posudi, plastičnom ezom se izaberu gušći, kompaktniji, ili krvavi
dijelovi, na dva predmetna stakla se jednoličnim elipsastim pokretima razmazuje po
staklu, na 2/3 stakla, ako je potrebno stanjuje se s tanjom, čvršćom ezom.

• Stakla se označavaju i suše 1,5 h ako se boje MGG bojenjem, odnosno odmah fiksiraju u
alkoholu za bojenje po Papi.
• .
Bronhoskopski uzorci:
KATETER ČETKICA

• Tekući uzorak kateter aspirata se centifugira, 1500/5 min i sediment se razmazuje ezom ili štapićem kao svaki drugi tekući uzorak na 5 stakla.

• Za otisak brisa četkicom pripremi se 3-6 stakala, četkica se izvuče se iz zaštitnog omotača iznad stakla, otiskuje se lagano rotirajući na staklo,
obično na 2/3 stakla, bez dodirivanja rubova.

• Uobičajeno je da se otisak brisa četkicom radi u bronhoskopskom kabinetu, u tijeku bronhoskopije. Stakla se označavaju i suše 1,5 h ako se boje
MGG bojenjem, odnosno odmah fiksiraju u alkoholu za bojenje po Papi.
 EBUS punkcija

• Uzorak se lagano ispuhuje iz igle na prvo predmetno staklo, a citotehničar drži drugom rukom prazno staklo okomito na predmetno staklo i sprečava
raspršivanje i gubitak uzorka.

• Ako je na staklu pregusti sloj, može se prenijeti na drugo prazno staklo. Uzorak se razmazuje tehnikom staklo preko stakla.

• Stakla – razmazi obilježavaju se po matiranom dijelu stakla, najčešće običnom olovkom. Stavljaju se inicijali bolesnika i redni broj punktata.

• Ako se pri punkciju radi brza procjena adekvatnosti na mjestu uzimanja (engl. ROSE), uzima se prvo razmazano staklo i boji brzom metodom bojenja.
Najčešće je to modifikacija bojenja po Romanowskom –Kwik Diff.  Sastoji se od tri posebne boje, koristi se tehnika uranjanja: 5, 3 i 6 urona. Nakon toga
se ispere vodom s nekoliko uranjanja. Obojeno staklo se oprezno obriše staničevinom s poleđine i laganim tupkanjem ukloni suvišak vode. Obojenost
stanica je slična onoj pri brzom, skraćenom MGG bojenju.

• Najčešće se traga za malignim stanicama, a o nalazu ovisi koliko će se puta punktirati. Prostali razmazi boje se u citološkom laboratoriju standardnim i po
potrebi imunocitokemijskim bojenjima.
 Predanalitička faza citodijagnostike koštane srži
• Koštana srž - medulla ossium nalazi se u plosnatim kostima, u prostorima između koštanih
gredica u spužvastom dijelu kosti;
• u odraslih osoba najčešće se punktira prsna kost -sternum ili se punktira zdjelična kost (spina iliaca
posterior ili spina iliaca anterior), iznimno spinasti nastavak lumbalnih kralježaka; maloj djeci se
punktira proksimalni dio goljenične kosti - tibije odmah ispod tuberositas tibije;
• prsna kost se najčešće punktira u predjelu drugog ili trećeg međurebrenog prostora ili u predjelu
manubrijuma;
• uzorak koštane srži se nakon punkcije nanosi na predmetno staklo, a drugo predmetno staklo se
lagano prisloni na mjesto na kojem je nanesen uzorak i povuče koriseći samo težinu stakla da bi se
napravio tanki sloj uzorka (metoda “staklom preko stakla”);
• standardno se radi 8-10 razmaza koštane srži jer se 2-4 razmaza boje standardnim bojenjem, a
ostali razmazi se mogu bojiti citokemijskim i imunocitokemijskim metodama;
• koštana srž može se pohraniti u epruvetu obloženu antikoagulansom (najbolje EDTA) i nanijeti na
predmetna stakla u laboratoriju, no uzorak je potrebno dostaviti najkasnije 6 sati nakon
uzorkovanja;
- predmetno staklo označimo brojem protokola
- uzorak izlijemo na satno staklo
- potrebno je pronaći male komadiće strome koštane srži (žućkasti partikli); uz pomoć jednog stakla nanose se na predmetno
staklo
- metodom “staklom preko stakla” napravimo tanki sloj uzorka; treba paziti da se koristi samo težina stakla koje lagano
povučemo, uzorak nije potrebno pritiskati
- stanice koštane srži nalaze se u središnjem dijelu uzorka, koji se doima prozirno
- uzorci naneseni na predmetno staklo posuše se na zraku(minimalno 2 sata)
Predanalitička faza citodijagnostike razmaza periferne krvi

Za razmaz periferne krvi uzima se kapilarna krv,najčešće iz prsta direktno na predmetno staklo;

rubom drugog stakla(brušeni rub) kap se pod kutem od 45° prevuče preko predmetnog stakla;

uzorak se može uzeti i iz venskog puta (stavlja se u epruvetu koja sadrži antikoagulans, najbolje EDTA) i dostaviti
u laboratorij u roku 6 sati;
- predmetno staklo označimo brojem protokola
- pipetom uzmemo oko 50µl periferne krvi i kao manje kapljice nanesemo na nekoliko predmetnih stakala bliže jednom rubu stakla
- staklom s brušenim rubom pod kutem od 45° najprije pričekamo da se kap rasporedi ispod brušenog ruba, potom prevučemo kap
preko predmetnog stakla; podmetanje prsta ispod dijela predmetnog stakla suprotno od nanešene kapi može olakšati postupak
- razmaz periferne krvi treba izgledati upravo ovako: početak okomit, završetak izgleda polovice elipse bez viška uzorka izvan tih linija
- uzorci naneseni na predmetno staklo posuše se na zraku(minimalno 2 sata)
MGG BOJENJE APARAT

• U linearni aparat za bojenje postavljaja se držač s dobro posušenim citološkim staklima, u za to predviđenu startnu posudicu. Prethodno je postavljena
posudica s May Grünwald otopinom koja se mijenja ovisno o broju obojenih stakala svaka 2-3 dana.

• Obavezno je na posudici naznačiti datum kad je stavljena nova otopina. Giemsa boja se dodaje u posebnu posudicu pri svakom bojenju, svježe
pripremljena u omjeru 1:20 sa deioniziranom/destiliranom vodom. U trećoj i četvrtoj posudici je deionizirana/destilirana voda.

• U May Grünwald otopini stakla se zadržavaju 4 min, a u Giemsa boji 18 minuta, ispiranje vodom je 3 minute, ukupno 25 minuta. Držač sa staklima se
izvadi, stakla se obrišu alkoholom s poleđine i spreme u mapu ili kutiju.
MGG BOJENJE RUČNO

• Posušena stakla s uzorcima poredaju se na držače, tzv. šine, preliju se May Grünwald otopinom, ostavimo 2,5 min do 3 minute.

• Pripremi se svježa Giemsa otopina, koncentrirana Giemsa razrijedi se s puferom u omjeru 1:10 (npr. oko 3 ml sa 25 ml pufera), promiješa.

• May Grünwald se oprezno ispire deionizironom/destiliranom vodom. Odlije se suvišak vode, nalije se svježe pripremljena Giemsa, ostavi se 18 min.
Ispiranje deioniziranom/destiliranom vodom.

• Obojena stakla obrišu se s poleđine s vatom natopljenom alkoholom, otrese se suvišak vode i spreme se u mapu.
 Specijalna bojenja - Citokemijska bojenja
• Specijalna bojenja : bojenja za dokazivanje prisutnosti različitih tvari u stanici te imunocitokemija kojom se prikazuju specifična antigenska mjesta na
staničnoj membrani, u citoplazmi ili jezgri tumorskih stanica i time dokazuje njihovo porijeklo
• enzimske i neenzimske citokemijske reakcije.
• Rezultati citokemijskih reakciju u hematologiji izražavaju se semikvantitativno brojenjem pozitivnih stanica na 200 stanica pod velikim povećanjem
(1:1000) svjetlosnog mikroskopa.

• 1. Neenzimske citokemijske reakcije

• PAS reakcijom (engl. Periodic acid Shiff) prisustvo ugljikohidrata i složenih spojeva u kojima se nalaze ugljikohidrati kao sastavni dijelovi staničnih
membrana, citoskeleta ili se nalaze u citoplazmatskim zrncima stanica granulocitopoeze.
• Pomoću PAS rekacije dokazuje se glikogen (polisaharid) u citoplazmatskim vakolama stanica različitog porijekla.
• Oksidacijskim djelovanjem perjodne kiseline oslobađaju se aldehidne skupine koje se zatim prikažu bojenjem fuksin sumpornom kiselinom (Schiffov
reagens) koja se djelovanjem slobodnih aldehida mijenja iz bezbojnog u obojeni oblik. Pozitivna PAS reakcija je obliku crvenih zrnaca u citoplazmi
stanica ili difuzno obojene ružičasto-crvene citoplazme.
• Normalne stanice granulocitopoeze i monocitopoeze su PAS pozitivne.
• Limfatične stanice stanice mogu biti PAS pozitivne i negativne.
• PAS pozitivni mogu biti blasti u akutnim mijeloičnim leukemijama (AML) u obliku sitnih crvenkastih zrnaca u citoplazmi ili nježno ružičaste difuzno
obojene citoplazme.
• Sudan crno reakcija (engl. Sudan Black B) temelji se na svojstvu lipida da se boje određenim bojama. Pozitivna reakcija je vidljiva u obliku sivo-crnih
zrnaca u citoplazmama normalnih stanica granulocitopoeze i slabijeg je inteziteta u stanicama monocitopoeze. U AML blasti su Sudan pozitivni, a u
ALL su negativni.
• Uljna crveno O reakcija (engl. Oil red O) boji lipide, neutralne trigliceride te određene lipoproteine, a još je poznata pod nazivom Sudan crveno (engl.
Sudan red). Pozitivna reakcija je u Burkittovoj leukemiji/limfomu gdje se vide crveno obojene lipidne vakuole u citoplazmi limfoblasta
• Toluidinsko modrilo : dokazujemo prisutnost mukopolisaharida u citoplazmi stanica granulocitopoeze (bazofilnim granulocitima) i mastocitima. Toluidinsko modrilo je anilinska boja sa sposobnošću
metakromazije
• Koristi se za dokazivanje mijeloičnog porijekla stanica s bazofilnom diferencijacijom. Pozitivna reakciju su tamnoljubičasta zrnca u citoplazmi blasta u akutnoj bazofilnoj leukemiji.

• Reakcija ekstrahemoglobinskog željeza berlinskim modrilom : dokazuje se prisutnost željeza koje nije ugrađeno u hemoglobin je u trovalentnom (feri) obliku i može se naći u citoplazmi stanica
eritrocitopoeze (sideroblasti) i eritrocita (siderociti) u obliku siderotičnih zrnaca te u stanicama mononuklerno-makrofagnog sustava kao rezervno željezo.
• U reakciji dokazivanja ekstrahemogolobinskog željeza kalij-ferocijanat reagira s feri-ionima i nastaje modro-zeleni obojeni spoj. Pozitivna reakcija su modro-zelena zrnca u citoplazmi eritroblasta ili
eritrocita i izražava se semikvantitativno. Povećan broj sideroblasta nalazimo u poremećajima iskorištavanja željeza (anemije) te u mijelodisplastičnom sindromu s prstenastim sideroblastima

• 2. Enzimske citokemijske reakcije

• Reakcija dokazivanja mijeloperoksidaze. Mijeloperoksidaza (MPO) je lizosomalni enzim koji se nalazi u primarnim zrncima stanica granulocitnog reda.
• svojstvo mijeloperoksidaze je da cijepa vodikov peroksid i oslobađa kisik koji oksidira određeni supstrat u obojeni kemijski spoj. Reakcija je pozitivna u obliku žuto-smeđih zrnaca (supstrat
benzidin) ili smeđe-crnih zrnaca (supstrat 4-chloro-1-naphthol). Pozitivne su normalne stanice granulocitopoeze, rijetko monocitopoeze.
• Reakcija alfa-naftil-acetat esteraze. Alfa-naftil-acetat esteraza (ANAE) pripada skupini izoenzima esteraza i nalazi se u lizosomima stanica.
• Ima sposobnost hidrolize alifatskih i aromatskihestrera. Premda je prisutna u lizosomima svih stanica hematocitopoeze njezina aktivnost je izraženija u monocitima. Tijekom rekacije nastaje obojeni
spoj iz suspstrata alfa-naftil-acetata i otopine pararozanilin-natrijeva nitrita. Dodatkom Na-fluorida (NF) aktivnost ANAE se blokira samo u stanicama monocitnog reda.
• Reakcija je pozitivna u obliku crveno-smeđih zrnaca ili difuzno obojene crveno-smeđe citoplazme, pozitivne mogu biti sve stanice hematocitopoeze (različiti inteziteti reakcije). U akutnim mijeloičnim
leukemija se vide crveno-smeđa zrnca ili difuzno obojena crveno-smeđa citoplazma u monoblastima i promonocitima. U akutnim limfoblastičnim leukemijama ponekad se vidi pozitivitet u obliku većeg
smeđeg zrnca što ukazuje na T-stanično porijeklo. B

• Reakcija naftol-AS-D-klor-acetat esteraze. Naftol-AS-D-klor-acetat esteraza (CAE) pripada grupi izoenzima esteraza, nalazi se u lizosomima stanica i izrazo je pozitivna u stanicama granulocitopoeze.
Djelovanjem CAE nastaje obojeni spoj iz naftol-AS-D-klor-acetata i pararozanilin-natrijeva nitrita. Pozitivna reakcija je u obliku crvenih zrnaca u citoplazmi zrelijih stanica granulocitopoeze. U
podtipovima AML vide se pozitivni blasti (Slika 8)

• Reakcija alkalne fosfataze. Leukocitna alkalna fosfataza (APLc) je izoenzim koji se nalazi u neutrofilnim granulocitima i u alkalnim uvjetima otcjepljuje fosfate iz ortofosfatnih monoestera. Citokemijski
„score“ vrijednosti APLc izražava se semikvantitativno prema uputama proizvođača, izražava se na 100 stanica ocjenom intenziteta bojanja (od 0 do 5) u citoplazmi neutrofilnih granulocita. Broj stanica
određenog intenziteta se množi sa stupnjem intenziteta reakcije u tim stanicama te se dobiveni rezlutati zbroje i daju vrijednost „scora“ APLc. Snižene vrijednosti APLc nalaze se npr. u kroničnoj
mijeloičnoj leukemiji.
 Specijalna bojenja - Imunocitokemija
• Imunocitokemija je metoda bojenja koja se temelji na reakciji vezanja antigena i ciljno usmjerenih protutijela unutar stanice ili na stanici
• Protutijela čine bazični reagens u imunocitokemijskoj obradi uzoraka.
• Protutijela pripadaju skupini proteina koji se nazivaju imunoglobulini, a prisutni su u krvi imuniziranih životinja. Najčešće se radi o mišjim ili zečjim
protutijelima tipa IgG i IgM.
• Razlikujemo poliklonalna od monoklonalnih protutijela. Poliklonalna protutijela su produkt različitih vrsta stanica što za posljedicu ima nedovoljnu
specifičnost u odnosu na monoklonalna protutijela. Monoklonalna protutijela su produkt jednog klona stanica i reagiraju s istim specifičnim antigenom
protiv kojeg su usmjerena.
• Imunocitokemijske metode
• Standard današnje imunocitokemije i najčešće korištene tehnike su LSAB + (Labeled StreptAvidin Biotin) metoda i metoda bazirana na polimerima (npr.
EnVisionTM) .
• Kod LSAB + metode primarno se protutijelo veže na ciljni antigen, a sekundarno protutijelo obilježeno biotinom je poveznica između primarnog
protutijela i enzima – streptavidin kompleksa. Jedno protutijelo je povezano s mnogo molekula peroksidaze i upravo velik omjer enzmskih molekula u
odnosu na protutijelo omogućuje visoku osjetljivost metode.
• Pohrana uzoraka za imunocitokemijsku obradu
• Radi bolje očuvanosti uzoraka i morfoloških struktura stanica, predmetna stakla s nativnim, neobojenim citološkim uzorcima namijenjena
imunocitokemijskoj obradi pohranjuju se na -20˚C i - 80˚C. Mogu se pohraniti u za to predviđenim kartonskim kutijama ili zamotana u prozirnu foliju. U
izvanrednim slučajevima dozvoljena je kratkotrajna pohrana u trajanju 3 – 5 dana na sobnoj temperaturi. Predmetna stakla s uzorcima staničnog bloka se
pohranjuju na sobnoj temperaturi.

Odabir pozitivnih i negativnih kontrolnih stakala

• Pozitivna kontrolna stakla čine ona citološka stakla s uzorcima kojima je citološki, patohistološki ili ranije učinjenom imunocitokemijskom obradom
potvrđena dijagnoza tj. određen tip i podtip tumora. Kao pozitivne kontrole mogu se koristiti i stanice u kulturi tzv. stanične linije. To su stanice s
mutacijom koja im omogućava izbjegavanje apoptoze ili su transformirane kemijskim ili virusnim agensima koji izazivaju tumore. Negativna kontrolna
stakla služe za usporedbu kako bi se mogla odrediti negativnost imunocitokemijskog bojenja. Negativna kontrolna stakla čine citološka stakla s uzorcima
koja su nakon rutinskog MGG bojenja interpretirana kao negativna, odnosno sadrže normalne stanice.
• Fiksacija
• Brza i odgovarajuća fiksacija metanolom, acetonom, hladnom mješavinom metanola i acetona, ili parama 10% puferiranog formalina
omogućuje očuvanje morfoloških struktura stanica. Neodgovarajuća i preduga fiksacija može značajno umanjiti sposobnost protutijela da
se veže za odgovarajući antigen. Vrijeme fiksacije ovisi o vrsti uzorka i o vrsti fiksacijskog sredstva i može trajati od 1-10 minuta.

• Razotkrivanje antigena
• potrebno je razotkriti antigen (engl. Target Retrival).
• Za razotkrivanje antigena najčešće se koristi enzimatska digestija ili razotkrivanje epitopa pomoću topline
• (Otopina za kuhanje odgovarajućeg pH sastava se odabire prema vrsti monoklonalnog protutijela i vrsti uzorka (razmaz ili stanični blok)
kod kojeg se primjenjuje metoda razotkrivanja antigena.
• Preparati uronjeni u otopinu za kuhanje se inkubiraju u vodenoj kupelji u mikrovalnoj pećnici kroz 5 minuta na 648 W, a zatim 15 minuta
na 288 W.
• Nakon hlađenja učini se ispiranje puferom 3 puta kroz 5 minuta. Do odljepljivanja uzorka s citološkog stakla, najčešće dolazi tijekom
postupka razotkrivanja antigena. Kako bi se to spriječilo važno je odabrati uzorke nanesene na citološka stakla u što tanjem sloju.

• Monoklonalna protutijela
• Monoklonalna protutijela je potrebno razrijediti odgovarajućim reagensom u točno propisanom omjeru prema uputama proizvođača.
Nedostatna koncentracija monoklonalnog protutijela uzrokuje odsustvo imunocitokemijske reakcije. Za pojačavanje imunocitokemijske
reakcije kod određenih monoklonalnih protutijela, može se primijeniti pojačivač (npr. Dako Linker).
• Reagensi
• Reagense je potrebno čuvati na + 4˚C i prije izvođenja same analize temperirati na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta. Otopinu
kromogena kod imunocitokemijske metode bazirane na alkalnoj fosfatazi je potrebno pripremiti neposredno prije ukapavanja na staklo.
Stajanjem dulje od 20 minuta, otopina kromogena kod ove metode gubi reaktivnost i rezultira odsustvom imunocitokemijskog obojenja i
nemogućnosti postavljanja dijagnoze. Radna otopina kromogena kod polimer metode radi se prije pokretanja aparata u rad.
Imunocitokemija fiksiranje i „kuhanje”

• Izvade se stakla za imunocitokemiju iz frizera ili pohranjena na sobnoj temperaturi.

• Fiksiraju se ovisno o fiksativu, ovdje u mješavini hladnog acetoa i metanola, u omjeru 1/1. Stakla se označe
posebnom olovkom (flomasterom), obilježi se dio stakla sa slojem stanica da se reagensi što bolje
rasporede. Izvade se i potrebni reagensi iz hladnjaka, da se temperiraju na sobnoj temperaturi.

• Stakla se označavaju i stavljaju u fiksativ, najčešće 10 min. Za to vrijeme priprema se otopina za

razotkrivanje antigena („kuhanje”): pipetom se uzme 2ml otopine za razotkrivanje antigena u posudicu, u
menzuru 60 ml deionizirane vode i promiješaju u posudici. Nakon 10 minuta fiksirana stakla se prebacuju u
posudicu s puferom, na 2 min. Za to vrijeme pripremamo vodenu kupelj. U mikrovalnu smo stavili vodenu
kupelj i tikvice s jednakom razinom vode.

• Stakla se prebacuju iz posudice s puferom u posudicu s otopinom za razotkrivanje antigena (za kuhanje),
staviti posudicu u mikrovalnu pećnicu u vodenu kupelj, namjestiti jačinu i duljinu „kuhanja“ (ovisno o vrsti
pufera).
• Izvaditi iz mikrovalne, stakla se prvo hlade na sobnoj tempereturi, prije nego se prebace u pufer.
Imunocitokemija programiranje i punjenje aparata

• Na početku programiranja obavezno unijeti datum, odabere se odgovarajući vizualizacijski protokol ovisno o tome koja su protutijela zadana.

• Odabire se vrsta protutijela, upisuje broj stakala, svako posebno. Odabire se da li će se nakapati reagensi na cijelo staklo ili samo određeni dio (postoje 3
zone).

• Slijedi ispiranje pufera i to 2-3x u tijeku 5 minuta. Stakla vadimo i lijepimo isprintane, odgovarajuće naljepnice na matirani dio svakog stakla.
Imunocitokemija razrjeđivanje protutijela

• Dio protutijela se mora razrijediti, praktično je napisati na bočici koliko se razrjeđuje.

• Originalne prazne bočice od 5 ml jedine mogu u aparat jer ima svaka svoj jedinstveni broj, označene su barkodom.
1. Prvo uzimamo diluent odgovarajućom pipetom i nastavkom, paziti da smo sve prenijeli u novu bočicu.
2. Uzimamo novu, odgovarajuću pipetu i novi mali nastavak jer se radi o maloj količini, uđemo do dna bočice i ispratimo pogledom.
3. Ispustimo sadržaj do kraja, promiješamo i zatvorenu bočicu okrenemo nekoliko puta.
4. Registriramo barkod bočice i u kompjuter unesemo sve podatke. Obavezno se mora naznačiti do kada vrijedi razrijeđeno protutijelo, max. 2 mj. Nalijepiti
naljepnicu i staviti bočicu u aparat, u prostor desno od stakala. Barkod bočice okrenuti desno, jer s te strane aparata očitava.
Imunocitokemija priprema kromogena

• U aparat smo dodali sve bočice reagensa osim kromogena (sve bočice su otvorene!), spustili poklopac i startali program aparata.

• Za vizualizaciju kromogenom u metodi baziranoj na alkalnoj fosfatazi uređaj alarmom signalizira kad dodajemo otopinu kromogena.

• Uzima se zasebna bočica s barkodom, u nju se kapa sadržaj iz 3 bočice kromogena, iz svake 1 do nekoliko kapi i to posebnom pipetom za
svaku od 3 bočice. Bočica s pripremljenim kromogenom se zatvori, promiješa se sadržaj, očita se barkod i upisuje u program.

• Ovako svježe pripremljeni kromogen valjan je samo 30 min.

• Isprinta se naljepnica i označena, otvorena bočica doda u aparat, na bilo koje slobodno mjesto prostora na desno. Spustimo poklopac i
pokrenemo aparat.
Imunocitokemija kontrastno bojenje i uklapanje

• stakla –preliju se otopinom za kontrastno bojenje – hematoksilinom. Stakla bi trebala biti potpuno uronjenja u otopinu i to 2 min. Boja se izlije i
stakla u posudici se dobro isperu vodom, sve dok ne nestanu tragovi boje, „plaventnila”.

• Stakla se prekrivaju pokrovnicom – uklapaju, ovisno o metodi bojenja. Ljepilo bazirano na vodi nanosi se odmah, po tri kapi, stavlja se pokrovnica
i pažljivo ukloni zrak i tragovi ljepila s površine.

• Za ljepilo bazirno na ksilolu mora se prije ljepljenja stakla provući kroz rastuće koncentracije alkohola (96% 4 min, 100% 4 min i 2,5 min) i kroz
ksilol (2,5 min i 1 min). Postupak nanošenja ljepila i pokrivanja pokrovnicom je isti kao i za ljepilo bazirano na vodi.
Obrada uzoraka – stanični blokovi

• Svi tekući uzorci, ostatni dijelovi sedimenta tekućih uzoraka čuvani u posebnoj otopini ili otopini 10% puferiranog formalina, ispirci punktata, četkica i u rijeđim slučajevima skarifikata mogu se
upotrijebiti za izradu staničnih blokova ukoliko zadovoljavaju kriterije adekvatne celularnosti
• Agar metoda
I. 4% agar
II. svježe pripremljen ili prethodno pripremljen i pohranjen na +4°C.
III. Ukoliko je agar pripremljen neposredno prije izrade staničnog bloka potrebno ga je ohladiti na maksimalnu temperaturu od 60°C.
IV. Nakon centrifugiranja uzoraka na 2000 okretaja kroz 10 minuta, pažljivo se odlije supernatant, a na sediment se dolije 2-4 ml agara
V. Agar i sediment se lagano promješaju te se epruveta stavi u hladnjak na +4°C kroz 30 minuta.
VI. Nakon što se stvori čvrsti koagulum stanični blok se prebacuje u histološke kazete, između spužvica, i fiksira u 10%-om puferiranom formalinu kroz 24 sata. Dalje se obrađuje patohistološki
poput uzorka tkiva dobivenog malom biopsijom.
• Plazma trombin metoda.
• Za izradu staničnih blokova metodom plazma trombin potrebno je uzorkovati plazmu u biokemijskom laboratoriju i upotrijebiti komercijalni trombin koji se razrijedi do minimalno 200 jedinica
jakosti.
• Uzorak se centrifugira na 2000 okretaja kroz 10 min, a dvije kapi sedimenta se prenesu u krio tubu volumena 2,5 ml. Na izdvojenu količinu sedimenta se upipetira 200 µL plazme te se kratkotrajno
izmješa vorteksom. Nakon miješanja dodaje se 50 µL trombina i sve se još jednom izmješa na isti način.
• Da bi se stvorio koagulum potrebno je vrijeme inkubacije između 5 i 20 minuta. Stanični blok se prebacuje u histološke kazete, između spužvica, i fiksira u 10% puferiranom formalinu kroz 24 sata.
Dalje se obrađuje patohistološki poput uzorka tkiva dobivenog malom biopsijom.
• HistoGel metoda je jedna od jednostavnijih metoda izrade staničnih blokova. Zahtjeva primjenu komercijalnog histogela. Uzorak se centrifugira na 2000 okretaja kroz 10 min, nakon čega se pažljivo
odlije supernatanat, a na sediment se doda nekoliko kapi histogela. Nakon laganog miješanja uzorak se stavlja na +4°C kroz 5-10 minuta kako bi se stvorio koagulum. Zatim se stanični blok prebacuje u
histološke kazete, između spužvica, i fiksira u 10%-om puferiranom formalinu kroz 24 sata. Dalje se obrađuje patohistološki poput uzorka tkiva dobivenog malom biopsijom. Nedostatak ove metode
je cijena komercijalog histogela.

• Metoda spontanog ugruška je najjednostavnija metoda izrade staničnih blokova.

• Pogodna je za hemoragične uzorke punktata
• hemoragične tekuće uzorketvo.
• tvaranju fibrinskog ugruška tako da se uzorak ostavi na sobnoj temperaturi do pojave koaguluma, 5-7 minuta.
• Koagulum se izdvoji te prebacuje u histološke kazete, između spužvica i fiksira u 10%-om puferiranom formalinu kroz 24 sata. Dalje se obrađuje patohistološki poput uzorka tkiva dobivenog malom
biopsijom.
•