Machine Translated by Google

Oxford Immunotec - bí mật

Oxford Immunotec - Giao thức phân lập PBMCs để sử dụng trong các
xét nghiệm tế bào T.
___________________________________________________
Quy trình A: Phân lập tế bào gradient mật độ từ máu toàn phần

1. Trước khi bắt đầu khảo nghiệm, đặt môi trường RPMI và AIM-V vào nồi cách thủy tối thiểu là 30
phút (37 ° C).

2. Trộn mẫu máu bằng cách đảo ngược, 8 - 10 lần.

3. Chuyển 6 mL máu toàn phần vào ống 15 mL được dán nhãn. Kiểm tra ID mẫu máu tương ứng
vào ống có nhãn.

4. Nếu máu trong khoảng 8-32 giờ sau khi chọc dò, thêm thuốc thử T-Cell Xtend với 25 µL / mL máu toàn phần
(đối với 6 mL, thêm 150 µL, các lượng cho các thể tích máu khác trong Bảng 1). Trộn 8-10 lần bằng
cách đảo đều sau đó ủ ở RT trong 20 phút. Máu> 32 giờ sau khi chọc dò không nên sử dụng trong xét
nghiệm này.

5. Sau khi hoàn thành quá trình ủ T-Cell Xtend , pha loãng máu bằng cách sử dụng tỷ lệ RPMI: máu = 3: 5. Đối
với 6 mL máu, thêm 3,6 mL RPMI bằng cách sử dụng pipet huyết thanh 5 mL (đối với các dung dịch pha
loãng thể tích máu khác, tham khảo Bảng 2).

6. Trộn bằng cách đảo ngược và đổ hỗn hợp máu vào ống Leucosep (đảm bảo ficoll dưới frit trước khi
thêm hỗn hợp máu, nếu ficoll trên frit, ly tâm ống ở 350 xg trong 1 phút).

7. Cho vào máy ly tâm. Quay bằng các cài đặt sau: Tắt phanh (tăng tốc 9, giảm tốc 3), 1000 xg trong 10
phút, RT.

8. Đổ 6 mL RPMI ấm vào một ống 15 mL mới, có dán nhãn và thêm chất nhão vô trùng
pipet bên trong ống.

9. Trích xuất lớp PBMC bằng cách sử dụng pipet pasteur và thêm vào đúng ống RPMI.

10. Trộn ống bằng cách đảo ngược và ly tâm: 600 xg trong 7 phút ở RT, Phanh (tăng tốc 9,
giảm tốc 9).

11. Loại bỏ chất nổi trên mặt theo quy trình khử nhiễm của các viện.

12. Đổ lại viên tế bào vào thể tích môi trường còn lại bằng cách sử dụng pipet P1000 đặt ở 500 µL. Sử
dụng một đầu mới cho mỗi mẫu.

13. Đổ đầy ống chứa mẫu đến 10 mL bằng RPMI ấm.

14. Thay đổi đầu pipet nếu tiếp xúc với ống để tránh nhiễm chéo.

15. Trộn ống bằng cách đảo ngược và ly tâm: 350 xg trong 7 phút ở RT, phanh trên (tăng tốc 9,
giảm tốc 9).

16. Loại bỏ chất nổi trên bề mặt theo quy trình khử nhiễm của các viện.

17. Dành lại viên tế bào trong môi trường AIM-V 500 µL bằng cách sử dụng pipet P1000. Sử dụng một mẹo mới
cho mỗi mẫu.
Machine Translated by Google

Oxford Immunotec - bí mật

18. Các ô đã sẵn sàng để đếm.

19. Đếm bằng phương pháp đã được kiểm chứng và pha loãng thành 2,5 x 10 ^ 6 tế bào / mL để mạ trong xét nghiệm

20. Nếu tế bào đang được bảo quản lạnh, khả năng sống sót của tế bào cũng nên được tính toán, sau đó làm theo
quy trình bảo quản lạnh được nêu dưới đây.

Thể tích máu (mL) 0 to≤1 Thể tích của T-Cell Xtend để thêm (µL)
25

> 1 đến ≤2 50

> 2 đến ≤3 75

> 3 đến ≤4 100

> 4 đến ≤5 125

> 5 đến ≤6 150

> 6 đến ≤7 175

> 7 đến ≤8 200

> 8 đến ≤9 225

Bảng 1: thể tích thuốc thử T-Cell Xtend để thêm vào máu toàn phần

Thể tích máu (mL) 3.0 Thể tích RPMI (mL) 1,8 Tổng thể tích (mL)
4.8

3.5 2.1 5,6

4.0 2,4 6.4

4,5 2,7 7.2

5.0 3.0 8.0

5.5 3,3 8.8

6.0 3.6 9,6

6,5 3,9 10.4

7.0 4.2 11,2

7,5 4,5 12.0

8.0 4.8 12,8

Bảng 2: thể tích RPMI để thêm vào máu toàn phần theo tỷ lệ 3: 5
Machine Translated by Google

Oxford Immunotec - bí mật

Quy trình B: Giao thức đông lạnh tế bào

Cần có 2 loại phương tiện làm đông lạnh cho quá trình này, việc chuẩn bị được nêu dưới đây:

Chuẩn bị môi trường đông lạnh tôi (500 ml)

1. Sử dụng que thử vô trùng dùng một lần, thêm 300 mL FBS và 200 mL RPMI vào hộp đựng vô trùng,
trộn bằng cách nghịch đảo.

2. Phương tiện lọc vô trùng qua bộ lọc 0,2 µM. Bảo quản đến 1 tháng ở nhiệt độ 2-8 độ C, tối.

Chuẩn bị môi trường đông lạnh II (500 ml)

1. Sử dụng que thử vô trùng dùng một lần, thêm 100 mL DMSO và 400 mL FBS vào hộp chứa vô trùng, trộn
bằng cách đảo ngược.
2. Phương tiện lọc vô trùng qua bộ lọc 0,2 µM. Bảo quản đến 1 tháng ở nhiệt độ 2-8 độ C, tối.

Quy trình bảo quản lạnh

1. Ly tâm mẫu ở 350 xg trong 7 phút tại RT, bật phanh (tăng tốc 9, giảm tốc 9).
Đảm bảo rằng tất cả chất nổi phía trên được loại bỏ trước khi hoạt động trở lại, một pipet có thể được sử dụng để làm điều này

2. Sử dụng lại viên trong môi trường đông lạnh I để có nồng độ 20 x106 tế bào / mL, sau đó sẽ thêm
một thể tích tương đương của môi trường đông lạnh II để có nồng độ 10 x106
tế bào / mL, chuẩn bị 0,5 mL hoặc 1,0 mL định lượng tùy thuộc vào tổng thể tích. Lưu ý: Các ô
Không nên tiếp xúc với Môi trường đông lạnh II lâu hơn hai phút, do đó Môi trường Đông lạnh II
nên được phân phối vào hộp đông lạnh theo lô không quá 10 lọ cùng một lúc.

3. Không nên để các tế bào tiếp xúc với Môi trường đông lạnh II lâu hơn hai phút, do đó Môi trường
làm lạnh II nên được phân phối vào các thùng đông lạnh theo lô không quá 10 lọ cùng một lúc.

4. Bảo quản ngay các ngăn lạnh trong tủ đông -80 ° C bằng Hộp chứa CoolCell / MrFrosty / Polystyrene.

5. Sau tối thiểu 24 giờ ở -80 ° C, chuyển cyrovials sang Nitrogen lỏng.