Accelerat ing t he world's research.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Tran Thuy Trieu

Related papers Download a PDF Pack of t he best relat ed papers 

 Đ I H C QU C GIA HÀ N I

TR NGăĐ I H C KHOA H C T NHIÊN

---------------------

CHU TH HƯƠNG LY

NGHIÊNăC U ỨNG DỤNG TINH DẦU NGHỆ KẾT HỢP VỚI CHẾ
PHẨM SINH HỌC NANO CHITOSAN B O QU N THANH LONG

LU NăVĔNăTH CăSƾăKHOAăH C

HƠăN i ậ Nĕmă2015
 Đ I H C QU C GIA HÀ N I

TR NGăĐ I H C KHOA H C T NHIÊN

---------------------

CHU TH HƯƠNG LY

NGHIÊNăC Uă NGăD NGăTINHăD UăNGH ăK TăH PăV IăCH ă

PH MăSINHăH CăNANOăCHITOSANăăB OăQU NăTHANHăLONG

Chuyên ngƠnh: Vi sinh v t h c

Mƣ s : 62 40 41

LU NăVĔNăTH CăSƾăKHOAăH C

Ng ih ng d n khoa h c: PGS.TS. LÊ VĂN CÁT

HƠăN i ậ Nĕmă2015
 M CăL C

DANH M C CÁC Kụ HI U, CH VI T T T. .............................................................. 3

DANH M C CÁC B NG VÀ S Đ .............................................................................. 4
DANH M C CÁC HỊNH V ............................................................................................. 5
M Đ U ............................................................................................................................. 6
Ch ng 1 ậ T NG QUAN ................................................................................................. 8
1.1. Nano chitosan .......................................................................................................... 8
1.1.1. Chitosan ............................................................................................................ 8
1.1.2. Phương pháp điêu chê nano chitosan từ chitosan. .......................................... 9
1.1.3. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật c a chitosan ................................................. 12
1.1.4. ng dụng nano chitosan................................................................................. 13
1.2. Tinh d u ngh ........................................................................................................ 15
1.2.1. Giới thiệu chung về nghệ ................................................................................ 15
1.2.2. Thành phần hóa học ....................................................................................... 15
1.2.3. Hoạt tính sinh học c a tinh dầu nghệ............................................................. 18
1.3. Thanh Long ............................................................................................................ 23
1.̀.1. Thanh long và giá trị kinh tế .......................................................................... 23
1.3.2. Vi sinh vật gây hỏng quả ................................................................................ 26
1.3.3. Biện pháp bảo quản rau hoa quả tươi sau thu hoạch .................................... 28
Ch ng β: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U ........................................ 32
β.1. Nguyên v t li u ...................................................................................................... 32
2.1.1 Đối tượng nghiên c u ...................................................................................... 32
2..1.2. Hóa chất sử dụng........................................................................................... 32
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên c u ................................................... 33
2.2. Ph ng pháp nghiên c u ....................................................................................... 34

1
 2.2.1. Phương pháp đo độ đục định lượng tế bào nấm men .................................... 34
2.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc nấm men .......................................................... 35
2.2.̀. Phương pháp tìm nồng độ diệt tối thiểu (MBC) c a hỗn hợp nano chitosan
và tinh dầu nghệ cho nấm men ................................................................................. 36
2.2.́. Phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc c a chế phẩm tinh dầu
nghệ và nano chitosan .............................................................................................. 37
2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính đối kháng vi sinh vật c a tinh dầu nghệ
và nano chitosan trên quả thanh long ...................................................................... 38
2.2.6 Bảo quản thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng NCS-TDN....... 38
Ch ng γ: K T QU VÀ TH O LU N ........................................................................ 40
γ.1. Đánh giá kh năng đ i kháng n m men c a ch phẩm nano chitosan vƠ tinh d u
ngh in vitro .................................................................................................................. 40
3.2. Đánh giá kh năng đ i kháng n m m c c a ch phẩm nano chitosan vƠ tinh d u
ngh in vitro .................................................................................................................. 43
γ.γ Đánh giá kh năng đ i kháng n m c a nano chitosan-tinh d u ngh in vivo trên
thanh long...................................................................................................................... 46
3.4. Đánh giá kh năng b o qu n thanh long bằng ch phẩm nano chitosan vƠ tinh
d u ngh ........................................................................................................................ 48
3.4.1. Bảo quản thanh long nhiệt độ phòng............................................................... 48
3.4.2. Bảo quản thanh long nhiệt độ lạnh (10 ± 2oC) ................................................ 50
K T LU N VÀ KI N NGH ........................................................................................... 55
TÀI LI U THAM KH O ................................................................................................. 56

2
 DANH M CăCÁCăKÝăHI U, CH VI T T T.

ĐC: Đ i ch ng.

Đ-d: đ ng kính kháng khuẩn.

LDL: Low ậ density Lipoprotein.

MBC: Minimum bactericidal concentration.

MTL2: Cladosporium clasdosporioides de Vries.

MTL4: Cladosporium tenuisimum Cooke.

NCS ậ TDN: Nano chitosan k t h p v i tinh d u ngh .

OD: Optical Density.

TL1: Rhodoturola sp.

3
 DANH M CăCÁCăB NG VẨăS ăĐ

B ng 1.1: Giá tr dinh d ỡng trong 100g qu thanh long.

B ng β.1: Đ chuẩn Mc Farland b c sóng 550nm.

B ng 2.β: S đ thí nghi m xác đ nh tính đ i kháng n m men c a NCS-TDN.

B ng 3.1: K t qu đo OD b c sóng 550nm c a m u TL1.

B ng 3.2: Kh năng c ch sinh tr ng n m men c a NCS-TDN.

B ng 3.3: Ho t tính đ i kháng n m m c c a NCS-TDN.

B ng 3.4: Kh năng c ch n m c a NCS-TDN trên thanh long.

B ng 3.5: K t qu thanh long đ c b o qu n nhi t đ phòng.

B ng 3.6: K t qu thanh long b o qu n l nh 10±β0C.

B ng 3.7: K t qu phơn tích hƠm l ng dinh d ỡng c a thanh long sau khi b o qu n
l nh γ0 ngƠy.

S đ 2.1: Nghiên c u kh năng b o qu n thanh long sau thu ho ch c a ch phẩm

NCS-TDN.

4
 DANH M CăCÁCăHỊNHăVẼ

Hình 1.1: C u trúc hóa h c c a chitosan đ c điều ch từ chitin.

Hình 1.β: Hình thái cơy ngh

Hình 1.γ: C u trúc c a các h p ch t curcumin trong tinh d u ngh .

Hình 1.4: C u trúc c a m t s h p ch t trong tinh d u ngh .

Hình 1.5: V trí vƠ các c ch trong t bƠo vi khuẩn đ c cho lƠ điểm ho t tính c a tinh
d u.

Hình 1.6: Các gi ng qu thanh long.

Hình 1.7: Cladosporium cladospotioides.

Hình 1.8: Cladosporium tenuisimum cooke.

Hình 1.9: Rhodoturola sp.

Hình β.1: Pha loƣng m u theo dƣy th p phơn.

Hình β.β: C y tr i m u vƠo môi tr ng Hansen c ng trên đĩa peptri.

Hình γ.1: Đánh giá ho t tính đ i kháng n m men TL1 c a NCS-TDN.

Hình γ.β: Ho t tính đ i kháng c a NCS-TDN đ i v i MTL2.

Hình γ.γ: Th ho t tính kháng c a NCS-TDN v i MTL4.

Hình γ.4: Thanh long b h ng do nhi m n m.

Hình γ.5: Thanh long đ c b o qu n nhi t đ phòng.

Hình γ.6: Thanh long b o qu n sau 7 ngƠy nhi t đ phòng.

Hình γ.7: Thanh long đ c b o qu n sau 15 ngƠy nhi t đ phòng.

Hình γ.8: Thanh long đ c b o qu n l nh 10±βoC.

Hình γ.9: Thanh long đ c b o l nh sau 15 ngƠy.

Hình γ.10: Thanh long đ c b o l nh sau γ0 ngƠy.

5
 M Đ U

Tinh d u ngh đ c bi t đ n nh lƠ m t ch t có kh năng ch ng oxy hóa vƠ có

tính đ i kháng vi sinh v t t t, nh t lƠ c ch các vi sinh v t có kh năng gơy h ng qu .
Trong khi chitosan lƠ m t lo i polymer carbohydrate tự nhiên đ c t o ra bằng cách
deacetyl hóa chitin, có thể tìm th y trong nhiều loƠi đ ng v t giáp xác, côn trùng vƠ
m t vƠi lo i n m. V i nhiều tính năng nh tính t ng thích sinh h c, phơn h y sinh
h c, bám dính mƠng vƠ không đ c h i nên hi n nay nó tr thƠnh nguyên li u cho nhiều
ng d ng trong d c sinh h c vƠ thực phẩm ch c năng. Vì nh ng tính ch t u vi t c a
nó mƠ trong nh ng năm g n đơy, chitosan đƣ đ c nghiên c u s d ng để t o ra các
h t nano chitosan. Cùng v i tinh d u ngh , nano chitosan lƠ ch t có kh năng kháng
n m vƠ vi khuẩn m nh.

Qu t i vƠ rau r t d b h ng vƠ m n c m đ i v i các b nh sau thu ho ch, h n

ch th i gian b o qu n vƠ đ a chúng ra th tr ng. NgoƠi ra, h h ng sau thu ho ch
gơy th t thu kinh t đáng kể trên toƠn th gi i. Nh đƣ bi t, các lo i thu c di t n m
t ng h p đ c s d ng từ lơu nh ph ng th c chính để kiểm soát các b nh sau thu
ho ch. Nh ng hi n ng i ta lo ng i về nh h ng c a các ch t nƠy đ n s c kh e ng i
tiêu dùng cũng nh sự xu t hi n c a các ngu n b nh kháng thu c. Vì v y c n có các
bi n pháp thay th để kiểm soát ngu n b nh sau thu ho ch có hi u qu , d l ng th p,
ít đ c hoặc không đ c đ i v i c thể không đích.

Trong s n phẩm rau hoa qu c a Vi t Nam, qu Thanh Long đang chi m v trí
quan tr ng trong xu t khẩu, mang l i hi u qu kinh t cao. Vì v y vi c s d ng các
ch t ho t tính sinh h c tự nhiên để b o qu n qu Thanh Long không nh ng có ý nghĩa
kinh t , mƠ còn m ra ph ng pháp m i trong ngƠnh b o qu n sau thu ho ch n c ta.

6
 V i đề tƠi nghiên c u ắ Nghiên c u ứng dụng tinh dầu nghệ kết hợp chế phẩm
sinh học nano chitosan bảo quản Thanh long” s đóng góp thêm m t ph ng pháp
b o qu n rau hoa qu an toƠn vƠ hi u qu .

Mục tiêu c a đề tài:

 Th nghi m in vitro ch phẩm nano chitosan vƠ tinh d u ngh v i vi sinh v t

gơy h ng qu Thanh Long để tìm n ng đ c ch vi sinh v t t i thiểu MBC.
 Th nghi m ch phẩm nano chitosan vƠ tinh d u ngh trên qu để kéo dƠi th i
gian b o qu n thanh long, đ m b o thanh long còn t i, không b vi sinh v t lƠm
h ng qu .

Nội dung nghiên c u:

 Xác đ nh ho t tính đ i kháng n m c a ch phẩm nano chitosan k t h p v i tinh

d u ngh .
 Nghiên c u thăm dò ng d ng nano chitosan k t h p v i tinh d u ngh trong
b o qu n qu thanh long.

7
 Ch ng 1 ậ T NG QUAN

1.1. Nano chitosan

1.1.1. Chitosan

Chitosan, đ c phát hi n b i Rouget năm 1859 [55], lƠ m t lo i polymer

polysaccharide sinh h c quan tr ng. Về mặt hóa h c, đó lƠ m t phơn t có tr ng l ng
phơn t cao, polycationic g m hai monosaccharide, N-acetyl-D-glucosamine vƠ D-
glucosamine, liên k t v i nhau b i c u n i -(1 → 4) glycosidic (Hình 1.1). HƠm l ng
t ng đ i c a hai monosaccharide trong chitosan có thể khác nhau, m i m u các m c
đ khác nhau ph thu c vƠo m c đ deacetyl hóa (75-95%), kh i l ng phơn t (50-
β.000 kDa), đ nh t, giá tr pKa, v.v... [27]. Do đó, chitosan không thể đ c đ nh
nghĩa lƠ m t h p ch t duy nh t, nó ch đ n thu n lƠ h c a các copolymer v i các phơn
s khác nhau c a các đ n v acetyl.

Hìnhă1.1:ăC uătrúcăhóaăh c c aăchitosanăđ căđiều ch từ chitin. Chitosan

liên k t (1→4) β- amino-2-deoxy- -D-glucan, đ c điều ch từ chitin qua quá trình
th y phơn bằng kiềm nhóm N-acetyl.

8
 Chitosan ch y u đ c s n xu t từ quá trình deacetyl hóa chitin x y ra môi
tr ng kiềm: chitin sôi trong kiềm n ng đ cao vƠi gi (40-45% natri hydroxit, 1β0°C,
1-3 h). Trong điều ki n đó N-deacetyl hóa x y ra không hoƠn toƠn, chitosan đ c xem
nh lƠ m t d n xu t m t ph n N-deacetyl hóa c a chitin.

Chitosan cũng đ c tìm th y trong tự nhiên, chẳng h n nh trong thƠnh t bƠo

c a n m thu c l p Zygomycetes [43], t o xanh Chlorella sp., n m men vƠ đ ng v t
nguyên sinh cũng nh l p biểu bì trong côn trùng [ 47]. G n đơy trong công ngh lên
men cho th y n m (Aspergillus niger) có thể cung c p m t ngu n thay th chitosan.

1.1.2. Phương pháp điêu chê nano chitosan từ chitosan.

Công ngh nano lƠ m t công ngh r t quan tr ng trong khoa h c, ch y u lƠ do

ng d ng r ng rƣi c a nó trong m t ph m vi r ng l n bao g m các ngƠnh kỹ thu t, y
h c, hóa h c vƠ sinh h c. Vi c s d ng các biopolymer nh polysaccharide trong công
ngh nano ngƠy cƠng đ c quan tơm, lƠ tr ng tơm các nghiên c u c a các nhƠ khoa
h c trên toƠn th gi i.

Trong γ0 năm qua, kỹ thu t điều ch nano chitosan đƣ đ c phát triển dựa trên
công ngh chitosan vi h t. Nano chitosan có thể đ c ch t o bằng m t vƠi ph ng
pháp khác nhau. Tr c kia, ng i ta dùng sodium sulphate nh ch t để t a. Năm 1994,
m t s tác gi đƣ s d ng glutaraldehyde nh ch t liên k t để liên k t chéo các nhóm
amino tự do c a chitosan, sau đó nhũ t ng hóa (emulsifier), t o h t 5-fluorouracil (5-
FU) chitosan v i kích th c trung bình 0,8 ± 0,1µm [42]. Ph ng pháp nƠy hi n v n
đ c dùng. Nhìn chung, kỹ thu t ch t o h t nano chitosan đƣ đ c phát triển dựa trên
kỹ thu t vi h t chitosan. Có ít nh t 4 ph ng pháp: sự đông đặc ion hóa (ionotropic
gelation); vi nhũ t ng (microemulsion), khu ch tán dung môi nhũ t ng
(emulsification solvent diffusion) vƠ t h p đa đi n phơn (polyelectrolyte complex).

9
Hai ph ng pháp th ng s d ng lƠ ionotropic gelation vƠ tự l p ráp polyelectrolyte
[50].

Phương pháp Ionotropic gelation

Nano chitosan chuẩn b bằng kỹ thu t gel ionotropic l n đ u tiên đ c Calvo vƠ

c ng sự báo cáo. C ch t o nanochitosan dựa trên t ng tác tĩnh đi n gi a nhóm
amine c a chitosan vƠ nhóm tích đi n ơm c a polyanion nh tripolyphosphate. Ph ng
pháp nƠy đ n gi n, nhẹ nhƠng. Tr c tiên, chitosan có thể hòa tan trong axit axetic, có
hoặc không có ch t n đ nh, sau đó b sung anionic polyme. Khu y nhi t đ phòng
vƠ các h t nano đ c t o thƠnh m t cách tự phát. Có thể thay đ i kích th c vƠ đi n
tích bề mặt c a h t bằng cách thay đ i t l chitosan vƠ ch t n đ nh [7].

Phương pháp Microemulsion

Nano chitosan đ c điều ch bằng kỹ thu t microemulsion l n đ u tiên đ c

phát triển b i Maitra vƠ c ng sự [7]. Kỹ thu t nƠy dựa trên sự hình thƠnh c a nano
chitosan bên trong gi t micellar đ o ng c vƠ sau đó liên k t ngang qua
glutaraldehyde. Trong ph ng pháp nƠy, m t ch t ho t đ ng bề mặt đ c hòa tan trong
N-hexane, sau đó, chitosan trong dung d ch axetic vƠ glutaraldehyde đ c thêm vƠo
ch t có ho t tính bề mặt / h n h p hexane, khu y liên t c nhi t đ phòng. H t nano
đ c hình thƠnh trong sự hi n di n c a ch t ho t đ ng bề mặt. H th ng nƠy đ c
khu y qua đêm để hoƠn thƠnh liên k t ngang, vƠ nhóm amin c a chitosan k t h p v i
glutaraldehyde. Các dung môi h u c đ c l y ra bằng cách bay h i d i áp su t th p.
S nl ng thu đ c lƠ nano chitosan liên k t ngang vƠ ch t ho t đ ng bề mặt d thừa.
Ch t ho t đ ng bề mặt d thừa đ c l y ra bằng cách k t t a v i CaCl2 vƠ sau đó đ c
lo i b bằng ly tơm. Cu i cùng các h t nano đ c thẩm tách vƠ lyophilyzation. Kỹ
thu t nƠy cung c p h t kích th c nh h n 100 nm vƠ kích th c các h t có thể đ c

10
kiểm soát bằng cách thay đ i l ng glutaraldehyde từ đó lƠm thay đ i m c đ liên k t
ngang. Tuy nhiên, ph ng pháp có m t s nh c điểm nh vi c s d ng các dung môi
h u c , quá trình chuẩn b t n th i gian, vƠ sự ph c t p trong b c r a.

Phương pháp khuếch tán dung môi nhũ tương hóa

El-Shabouri báo cáo nano chitosan đ c điều ch bằng ph ng pháp khu ch

tán dung môi nhũ t ng, (Ban đ u đ c phát triển b i Niwa vƠ c ng sự s d ng
PLGA) [7]. Ph ng pháp nƠy đ c dựa trên m t ph n sự tr n l n c a dung môi h u c
bằng n c. Nhũ t ng thu đ c sau khi tr n ch t h u c vƠo dung d ch chitosan có
ch a m t ch t n đ nh (poloxamer) khu y c , ti p theo lƠ đ ng nh t áp su t cao. Nhũ
t ng nƠy sau đó đ c pha loƣng v i m t s l ng l n n c để kh c ph c sự tr n l n
dung môi h u c trong n c. Sự k t t a polymer xu t hi n nh lƠ k t qu c a sự
khu ch tán dung môi h u c vƠo trong n c, d n đ n hình thƠnh c a các h t nano.
Ph ng pháp nƠy phù h p cho các lo i thu c kỵ n c vƠ cho th y tỷ l ng m thu c
cao. Nh ng nh c điểm chính c a ph ng pháp nƠy bao g m điều ki n x lý kh c
nghi t (ví d , vi c s d ng các dung môi h u c ) vƠ lực c t cao đ c s d ng khi điều
ch các h t nano.

Phương pháp polyelectrolyte complex (PEC)

MƠng polyelectrolyte hoặc t p h p nhóm polyelectrolyte lƠ m t thu t ng để mô

t mƠng đ c hình thƠnh bằng cách tự l p ráp c a polyme mang cation vƠ DNA
plasmid. C ch c a PEC hình thƠnh liên quan đ n vi c trung hòa đi n tích gi a cation
polymer vƠ DNA d n phá vỡ phơn t an c. M t s polyme cation (t c lƠ gelatin,
polyethylenimine) cũng có tính ch t nƠy. Nói chung, kỹ thu t nƠy cung c p ph ng
pháp chuẩn b đ n gi n. Các h t nano đ c hình thƠnh m t cách tự nhiên sau khi b

11
sung các DNA vƠo chitosan hòa tan trong dung d ch axit axetic, theo khu y c h c
nhi t đ phòng. Kích th c ph c h p có thể đ c thay đ i từ 50 nm đ n 700 nm. [7]

1.1.3. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật c a chitosan

Kh năng đ i kháng vi sinh v t c a chitosan đ c s d ng r ng rƣi, tuy nhiên,

c ch đ i kháng vi sinh v t chính xác c a nó cho đ n nay v n ch a đ c xác đ nh rõ
rƠng.

M t vƠi c ch tác đ ng kháng khuẩn c a chitosan đƣ đ c đ a ra: (i) t o ph c

v i các nguyên t v t hoặc các ch t dinh d ỡng thi t y u, nh v y c ch sinh tr ng
c a vi khuẩn; (ii) có thể t ng tác v i các nhóm anion trên bề mặt t bƠo vƠ t o ra các
ph c h p đi n phơn v i các h p ch t trên bề mặt vi khuẩn, t o ra m t l p không th m
quanh t bƠo, ngăn c n sự v n chuyển c a các ch t hòa tan c n thi t vƠo trong t bƠo.

Kiểm tra bằng kính hiển vi đi n t c a ch phẩm chitosan c ch vi sinh v t cho

th y, v trí ho t đ ng c a nó lƠ trên bề mặt t bƠo vi sinh v t. Các ch ng Candida
albicans ti p xúc v i chitosan hoặc các d n xu t c a chitosan d i kính hiển vi đi n t
th y t n th ng t bƠo m c đ khác nhau [37].

C ch đ i kháng vi sinh v t c a chitosan đ c cho lƠ do cation c a chitosan t ng tác

vƠ lƠm gián đo n mƠng t bƠo. Có gi đ nh cho rằng b n ch t polycationic c a
chitosan, tích đi n d ng do mang nhóm ậ c a glucosamine, có thể lƠ m t y u t
c b n góp ph n t ng tác v i các thƠnh ph n tích đi n ơm trên mƠng c a nhiều lo i
n m vƠ vi khuẩn, gơy ra thay đ i bề mặt t bƠo, rò r các ch t trong t bƠo, cu i cùng
d n đ n suy gi m các ho t đ ng quan tr ng c a vi sinh v t [19].

Chitosan đ c ch ng minh có ho t tính đ i kháng n m nh Aspergillus niger,

Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Phomopsis asparagi, vƠ Rhizopus stolonifer. Có

12
γ c ch đ c đ a ra cho các cách c ch c a chitosan. (i) mƠng plasma c a n m lƠ
đích chính c a chitosan. Đi n tích d ng c a chitosan t ng tác v i các thƠnh ph n
phospholipid tích đi n ơm c a mƠng n m, điều nƠy lƠm tăng tính th m c a mƠng lƠm
cho các thƠnh ph n trong t bƠo b thoát ra, d n đ n t bƠo b ch t; (ii) chitosan ho t
đ ng nh m t ch t kẹp (chelating) bằng cách g n v i các nguyên t v t, lƠm cho n m
không thể s d ng các ch t dinh d ỡng thi t y u để sinh tr ng bình th ng; vƠ (iii)
chitosan có thể thơm nh p vƠo mƠng t bƠo vƠ g n v i DNA, điều nƠy s c ch t ng
h p mRNA vƠ nh v y nh h ng đ n vi c t o ra các protein vƠ enzyme c n thi t. Mặt
khác, m t s báo cáo cho rằng còn các c ch ho t đ ng khác, nh liên k t v i n c,
lƠm b t ho t enzyme, ch n l c chelation vi l ng khoáng c n thi t cho các enzyme c a
vi khuẩn, có thể sáng t c ch kháng vi sinh v t c a chitosan [33].

Young vƠ c ng sự [45] cho rằng chitosan lƠm cho ion Ca2+ đ c gi i phóng từ
ph c t o n đ nh mƠng t bƠo c a Glycine max, k t qu lƠm m t n đ nh c a mƠng vƠ
gơy rò r các thƠnh ph n t bƠo. Tokura vƠ c ng sự [52], đƣ quan sát th y chitosan
(MW = 9300) x p ch ng lên nhau trên thƠnh t bƠo vƠ c ch sự tăng tr ng c a vi
khuẩn E. coli. H cho rằng ho t tính kháng khuẩn có liên quan đ n vi c kìm hƣm các
ho t đ ng trao đ i ch t c a vi khuẩn bằng cách ngăn chặn cung c p ch t dinh d ỡng
qua mƠng t bƠo [52].

Rõ rƠng, các c ch ho t đ ng không lo i trừ l n nhau, kể từ lúc chitosan c ch

ho t đ ng c a vi sinh v t, vƠ cu i cùng có thể d n đ n m t quá trình gi t h i.

1.1.4. ng dụng nano chitosan

Các h t nano chitosan ch y u đ c ng d ng trong y h c nh ch t mang vƠ

phơn ph i thu c. Vi t Nam, đƣ có m t s nghiên c u t o h t nano trên c s
polysacarit, đặc bi t lƠ chitosan. Nói chung, nh ng h t nano nƠy m i ch đ c kh o sát
về tính ch t hóa lý vƠ kh năng mang thu c, đ c ng d ng trong sinh y, c thể lƠ ng

13
d ng d n thu c còn h u nh ch a đ c nghiên c u cho nh ng ng d ng khác (ngo i
trừ nghiên c u về axit glutamic ng d ng cho m c đích lƠm ch t mang thu c paclitaxel
c aVi n Hóa h c, Vi n Khoa h c vƠ Công ngh Vi t Nam) [3].

Trên th gi i đƣ có nhiều công b ng d ng h t nano trong y h c. H t có kích cỡ

nano có thể đ c tiêm tĩnh m ch vì đ ng kính c a mao m ch máu lƠ kho ng 4 nm.
Các h t có đ ng kính l n h n 100 nm nhanh chóng đ c h p th b i h th ng l i
n i mô (RES) trong gan, lá lách, ph i vƠ x ng t y, trong khi các h t có kích cỡ nh
h n có xu h ng l u thông kéo dƠi m t th i gian. T o ra h t nano v i đi n tích bề mặt
an c nh ng trung l p lƠ m t ph ng pháp kh thi để gi m đ i thực bƠo vƠ do đó
nơng cao hi u qu điều tr c a thu c. Thu c h a hẹn nh t đƣ đ c nghiên c u r ng rƣi
lƠ nh ng ch t ch ng ung th . Sau khi tiêm tĩnh m ch, nhiều h t nano chitosan tích t
trong m t s kh i u. Nano chitosan kìm hƣm sự phát triển c a kh i u vƠ nơng cao tỷ l
s ng c a chu t có kh i u sau khi đ c điều tr [6]. NgoƠi ra, h t nano chitosan có kích
th c nh h n 100 nm đ c dùng nh thu c kháng khuẩn, kháng virus, kháng n m vƠ
thu c ch ng ký sinh trùng ...[6].

Có gi thuy t cho rằng các h t nano có thể b o v thu c không b phơn gi i b i

enzyme trong đ ng tiêu hóa. Pan vƠ c ng sự báo cáo rằng tác d ng h đ ng huy t
đƣ đ c quan sát các con chu t m c b nh tiểu đ ng sau khi u ng các h t nano
chitosan [7].

Chitosan lƠ vector chuyển gen h a hẹn l n đ u tiên đ c đề xu t b i Mumper

[17]. Chitosan đ c ch ng minh có hi u qu trong chuyển gen in vitro. H t nano
th ng thể hi n tác d ng b tr đáng kể cho v c-xin. Kích th c siêu nh c a h t nano
cho phép chúng đ c h p th b i các t bƠo M, trong mô b ch huy t niêm m c , kích
ho t các v trí c a ph n ng mi n d ch m nh m [35].

14
 1.2. Tinh d u ngh

1.2.1. Giới thiệu chung về nghệ

Cơy ngh thu c h Zingiberaceae, chi Curcuma, loƠi Longa. Tên khoa h c c a
cơy ngh lƠ: Curcuma longa Linaeus (C. longa L.).

Hìnhă1.2:ăHìnhătháiăcơyăngh

Nghê ̣ đ c tr ng khu vực m áp vƠ có m a nhiều trên th gi i nh Trung

Qu c, n Đ , In-đô-nê-xi-a. T i n Đ , nó đ c ph bi n vƠ đ c g i lƠ Haldi (Ti ng
Hin-ddi). T i Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a vƠ n Đ , ngh đƣ đ c nghiên c u do t m
quan tr ng về kinh t c a nó. Thơn r c a nó lƠ thuôn dƠi, hình tr ng vƠ th ng phơn
nhánh ng n [20].

1.2.2. Thành phần hóa học

ThƠnh ph n trong ngh g m: protein (6,3%), ch t béo (5,1%), khoáng ch t

(3,5%), carbohydrates (69,4%) vƠ đ ẩm (13,1%). Phenolic diketone, curcumin
(diferuloylmethane) (3 - 4%) quy đ nh mƠu vƠng c a ngh , vƠ bao g m curcumin I
(94%), ch t curcumin II (6%) vƠ ch t curcumin III (0,γ%) (Hình 1.3). Phenolic

15
diketones demethoxycurcumin vƠ bis-demethoxycurcumin cũng đƣ đ c phơn l p từ
thơn r Curcuma longa. Sự có mặt c a tumerone (a, b), curdione, curzerenone, mono-
vƠ di-demethoxycurcumin đƣ đ c tìm th y trong thơn r . Tinh d u (5,8%) thu đ c
bằng cách ch ng c t h i n c ph n thơn r có ch a thƠnh ph n phellandrene(1%),
sabinene (0,6%), cineol (1%), borneol (0,5%), zingiberene (β5%) vƠ sesquiterpines
(53% ) [10].

Hìnhă1.3:ăC uătrúcăc aăcácăh p ch t curcumin trong tinh d u ngh

Kelkar vƠ Sanjeev Rao [γβ] báo cáo rằng tinh d u ngh đ c điều ch bằng
ph ng pháp ch ng c t h i n c d bay h i ch y u lƠ m t h n h p c a sesquiterpene
xeton vƠ r u. Malingre [38] báo cáo thƠnh ph n chi t c a C.longa g m p-cymene, b-
sesquiphellandrene, turmerone, ar-turmerone vƠ r u sesquiterpene (Hình 1.4).

16
 Hìnhă1.4:ăC uătrúcăc a m t s h p ch t trong tinh d u ngh

Chen vƠ c ng sự [11] so sánh thƠnh ph n c a các lo i d u d bay h i c a thơn r

vƠ c ngh ngu n g c Trung Qu c C. Longa g m: Turmerone (24%), ar-turmerone
(8,4%) vƠ curdione (11,58%) (Hình 1.4) lƠ các h p ch t quan tr ng trong c hai lo i
d u. Tuy nhiên, ar-curcumene đƣ đ c tìm th y trong d u thơn r lƠ 1β,β%, nh ng nó
đƣ không đ c báo cáo trong d u c . Gopalan vƠ Ratnambal [β1] so sánh các thƠnh

17
ph n chính c a d u ngh s n xu t từ gi ng cơy tr ng khác nhau. Có sự thay đ i đáng
kể trong các thƠnh ph n chính ph thu c vƠo gi ng vƠ ngu n g c s n xu t. D u lá ngh
Vi t Nam ch a ch y u lƠ α-phellandrene (24,5%), 1,8-cineole (15,9%), p-cymene
(1γ,β%) vƠ -pinene (8,9%). Cooray vƠ c ng sự [13] cho bi t các thƠnh ph n chính c a
d u thơn r đ c s n xu t từ m t gi ng ngh duy nh t đ c tr ng Sri Lanka, vƠ nó đƣ
đ c báo cáo rằng ar-turmerone (24,7-48,9%) vƠ turmerone (β0-γ9%) lƠ nh ng h p
ch t chính. McCarron vƠ c ng sự [γ6] đƣ s d ng ph ng pháp phơn tích GC-MS để so
sánh h p ch t monoterpene hydrocarbon c a các lo i d u s n xu t từ lá vƠ r c a C.
longa t i, phát hi n ra rằng hydrocarbon monoterpene c a lá vƠ các lo i d u thơn r
t it ng ng lƠ 9β,9 vƠ 16,3%. D u thơn r c a C. longa ngu n g c Trung Qu c
đ c phơn tích bằng GC-MS [54]. D u nƠy đ c cho lƠ ch a 17 thƠnh ph n hóa h c,
trong đó turmerone (β4%), ar-turmerone (18%) vƠ germacrone (11%) lƠ các h p ch t
chính.

1.2.3. Hoạt tính sinh học c a tinh dầu nghệ

Hoạt tính chống viêm: Tinh d u c a Curcuma longa có hi u qu ch ng viêm vƠ

anti-hyaluronidase [40]. Các tác gi cho rằng hi u qu ch ng oxy hóa c a d u đ c
ch ng minh bằng sự c ch kh năng khu ch tán c a hyaluronidase enzyme. D u từ lá
Curcuma longa cũng cho th y ho t tính ch ng viêm chu t b ch thực nghi m. D ch
chi t thơn r lƠm gi m sự phát triển c a u h t vƠ không đ c đ i v i đ ng v t.

Hoạt tính chống oxy hóa: Scatezzini vƠ c ng sự (β000) đƣ nghiên c u ho t tính

ch ng oxy hóa c a m t s thực v t s d ng trong y h c c truyền c a n Đ . Nghiên
c u nƠy ch ra rằng cơy ngh đ c s d ng nhiều trong quá trình chuẩn b li u pháp
Ayurvedic cách đơy hƠng ngƠn năm [49]. Lee (β006) phát hi n ra thƠnh ph n h y tiểu
c u ar-turmerone có ngu n g c từ thơn r c a cơy ngh Curcuma longa L., n ng đ
c ch 50% (IC50) ar-turmerone c ch sự t o kh i c a tiểu huy t c u do collagen c m

18
 ng (IC50, 14,4 μM) vƠ axit arachidonic (IC50 43,6 μM) [34]. Xác đ nh đ c ho t tính
ch ng oxy hóa c a d ch chi t methanol c a thơn r t i vƠ khô từ 4 dòng ngh
(Curcuma longa L.) nuôi c y in vitro [14]. Đƣ xác đ nh ho t tính ch ng oxy hóa c a
d ch chi t d u ngh đen tr ng Vi t Nam [5].

Tác dụng giảm mỡ: khi s d ng 1mg d ch chi t ngh trong 15 ngƠy, l ng lipid
gi m rõ r t: l ng cholesterol t ng, triglyceride vƠ LDL gi m từ 55-40% đ ng v t thí
nghi m. NgoƠi ra, d ch chi t nƠy còn lƠm gi m nguy c x c ng đ ng m ch. Các tác
gi cho rằng u ng d ch chi t ngh c ch oxy hóa LDL vƠ có hi u qu gi m cholesterol
th thí nghi m [29].

Chống dị ng và làm lành vết thương: d ch chi t thô c a thơn r ngh có ho t

tính c ch cycloxygenase (COX) t t trong th nghi m sinh h c in vitro.

Antivenom activity: Phơn đo n có ch a ar-turmerone chi t từ C. longa trung hòa

hi u qu gơy ch t vƠ ho t tính xu t huy t c a n c r n chu t. Trong nghiên c u nƠy,
ar-turmerone có kh năng th tiêu ho t tính xu t huy t c a n c đ c Bothrops vƠ
kho ng 70% hi u qu gơy ch t c a n c đ c Crotalus. Nh ng nghiên c u mi n d ch h c
ch ng minh rằng ar-turmerone c ch sự tăng sinh vƠ ho t tính gi t tự nhiên c a
lyphocytes ng i [18;29]

Hoạt tính kháng khuẩn: Tinh d u ngh đ c th v i các ch ng Staphylococcus

albus, Staphylococcus aureus vƠ Bacillus typhosus, k t qu cho th y sinh tr ng c a
Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus b c ch các n ng đ khác nhau. Đ i
v i vi khuẩn đ ng ru t, sinh tr ng c a lactobacili b c ch b i tinh d u ngh n ng
đ 4,5-90μl/100 ml, D ch chi t alcohol cũng có hi u qu c ch (10ậβ00 mg/ml) nh ng
không bằng tinh d u. M t s tác gi đƣ ch ng minh ho t tính kháng khuẩn c a d u
ngh . Jayaprakasha vƠ cs. (β00β) báo cáo ho t tính kháng khuẩn c a d u ngh đ c

19
tách từ d ch mẹ sau khi đƣ tách l y curcumin [30]. D u ngh đ c phơn đo n bằng
ch ng c t chơn không thu đ c 2 phơn đo n, Các phơn đo n nƠy đ c th v i m t s
ch ng n m nh Aspergillus flavus, A. parasiticus, Fusarium moniliforme vƠ
Penicillium digitatum bằng ph ng pháp n y m m bƠo t . Phơn đo n nh n đ cd i
chơn không 110-1200C có hi u qu h n. K t qu phơn tích GC/MS cho th y trong
phơn đo n nƠy ch y u lƠ turmerone th m, turmerone vƠ curlone cùng v i các h p ch t
oxy hóa khác [8;51]. Theo Dhingra vƠ cs. (β007), tinh d u ngh (Curcuma longa L, )
đ c đ i v i 7 lo i n m h i nông s n trong kho. Ph thu c vƠo lo i n m, sự c ch phát
triển c a chúng dao đ ng từ 36%-77%, Aspergillus flavus, Fusarium semitectum,
Colletotrichum gloeosporioides vƠ C. musae lƠ nh ng lo i m n c m nh t, b c ch sự
phát triển trên 70%, ar-turmerone chi m 87% c a h p ch t d u kháng n m vƠ ar-
turmerone tinh s ch có ho t tính kháng n m t ng tự nh d u thô [16]. Behura vƠ cs.
th y trong 5 ngu n b nh n m lúa đ c x lý v i tinh d u ngh , Rhizotonia solani m n
c m nh t vƠ F. moniliforme kháng m nh nh t v i sự phát triển b gi m t ng ng 81%
vƠ β,5%, [9]. T ng tự, Saju vƠ cs. báo cáo n ng đ 1%-5% tinh d u ngh , sự phát
triển c a C. gloeosporioides, Sphaceloma caradmomi vƠ Pestdlotiopsis palmarum hoƠn
toƠn b c ch , trong khi đó F.solani ch b c ch 79% [46]. Phan Minh Giang, Phan
T ng S n (β000) [44] đƣ tách sesquiterpenoids trong dung môi n-hexan c a c ngh
Curcuma cochinchinensis gagnep đ c 4 phơn đo n curdione (1), curcumol (2),
isocurcumenol (3) vƠ curcumenol (4). Các tác gi đƣ nghiên c u ho t tính kháng vi
sinh v t c a các sesquiterpenoid nƠy. Các h p ch t 1, β vƠ γ tr n v i nhau theo t l
β:1: 4 có kh năng c ch sự phát triển c a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger,
Fusarium oxysporum khác nhau. N ng đ c ch t i thiểu c a h p ch t 1 l n h n γ00
μg/ml đ i v i Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus
niger, Candida albicans m n c m v i h p ch t β+γ vƠ 4 v i n ng đ c ch t i thiểu
lƠ 50 μg/ml [44].

20
 Các tác dụng khác: ch ng ung th , kháng virus, ch ng nhi m trùng, ch a lƠnh
v t th ng vƠ lo i đ c c a ar-turmerone tách chi t từ Curcuma longa đ c ch ng minh
[18]. NgoƠi ra nó còn có tác d ng ch ng nôn, thu c đánh r m vƠ ch ng co th t vƠ lƠm
gi m táo bón.

Phương th c kháng khuẩn c a tinh dầu

Mặc dù có r t nhiều nghiên c u về thƠnh ph n vƠ ho t tính kháng khuẩn c a

tinh d u thực v t, nh ng c ch ho t tính c a chúng ch a đ c nghiên c u t m . Do
tinh d u có r t nhiều nhóm các h p ch t hóa h c khác nhau, nên có l ho t tính kháng
khuẩn c a chúng không do m t c ch đặc bi t nƠo mƠ có m t vƠi đích trong t bƠo
(hình 1.5).

Hìnhă1.5: V tríăvƠăcácăc ăch trong t bƠoăviăkhu n đ căchoălƠăđiểm ho t

tínhăc a tinh d u: phơn h y thƠnh t bƠo; lƠm h h i mƠng t bƠo; lƠm h ng protein
mƠng; các thƠnh ph n t bƠo b rò r ; t a t bƠo ch t; vƠ lực đẩy proton b suy y u [48].

21
 M t đặc điểm quan tr ng c a tinh d u lƠ tính kỵ n c, cho phép chúng phơn c t
lipid c a mƠng t bƠo vi khuẩn vƠ mitochondria, lƠm xáo tr n c u trúc vƠ lƠm chúng d
b thẩm th u h n. Mặc dù m t s l ng ch t nh t đ nh nƠo đó b m t đi nh ng t bƠo
v n không b ch t, nh ng khi m t nhiều hoặc các phơn t quan tr ng vƠ ion b m t đi t
bƠo s b ch t.

Nhìn chung, tinh d u ch a các h p ch t phenol cao nh carvacrol, eugenol vƠ

thymol, có ho t tính kháng ngu n b nh thực phẩm cao. R t có lý cho rằng c ch ho t
tính c a chúng t ng tự nh các phenolics khác đó lƠ lƠm xáo tr n mƠng t bƠo ch t,
gián đo n lực đẩy proton, dòng electron, v n chuyển ch đ ng vƠ lƠm t a các ch t
trong t bƠo.

C u trúc hóa h c c a các thƠnh ph n trong từng lo i tinh d u tác đ ng đ n c

ch ho t đ ng vƠ ho t tính c a chúng. T m quan tr ng c a sự có mặt c a các nhóm
hydroxyl trong các h p ch t phenolic đƣ đ c ch ng minh. Các thƠnh ph n c a tinh
d u cũng tác đ ng lên protein g n trong mƠng t bƠo ch t. Các enzyme nh ATPases
đ c bi t nằm trong mƠng t bƠo ch t vƠ đ c bao quanh b i các phơn t lipid. Các
phơn t lipophilic hydrocacbon có thể tích t trong l p lipid kép vƠ lƠm h ng t ng tác
lipid-protein; ngoƠi ra có thể có sự t ng tác trực ti p c a các h p ch t lipophilic v i
ph n kỵ n c c a protein. M t vƠi tinh d u kích thích sinh tr ng c a pseudomycelia
(m t lo t t bƠo g n v i nhau do sự phơn tách không hoƠn thi n c a các t bƠo m i t o
thƠnh) c a m t s n m men. Điều đó có thể biểu th tác đ ng c a tinh d u lên enzyme
tham gia vƠo quá trình điều hòa năng l ng hoặc t ng h p các thƠnh ph n c u trúc
quan tr ng. Tinh d u dƣ h ng vƠ các thƠnh ph n c a nó đ c ch ng minh c ch axit
amino decarboxylases trong Enterobacter aerogenes. C ch nƠy đ c cho lƠ do g n
v i protein.

22
 G n đơy các nghiên c u cho th y điểm ho t tính c a các hydrocacbon vòng,
g m c terpene hydrocacbon lƠ mƠng t bƠo. -pinene lƠm rò r K+, H+ vƠ nh h ng
đ n hô h p c a n m men. T ng tự, cyclohexane, limonene vƠ -pinene cũng c ch
hô h p vƠ các quá trình ph thu c năng l ng khác liên quan đ n mƠng t bƠo
S.cerevisiae. Các hydrocacbon terpenes nh α-pinene, -pinene, -terpinene vƠ
limonene đ c tìm th y nh h ng t i các đặc điểm c u trúc vƠ ch c năng c a mƠng
nhơn t o, chúng lƠm cho mƠng th m t t h n vƠ ph ng lên. Điều nƠy c ch các enzyme
hô h p, d n đ n pH gradient vƠ đi n th b tr c trặc, mƠ đơy lƠ nh ng y u t then ch t
cho h năng l ng trong t bƠo. Ph n l n các terpenoid c ch quá trình h p thu oxy vƠ
phosphoryl hóa c a vi sinh v t [48;23].

1.3. Thanh Long

1.̀.1. Thanh long và giá trị kinh tế

Thanh long m t loƠi cơy đ c tr ng ch y u để l y qu vƠ cũng lƠ tên c a m t

vƠi chi c a h x ng r ng. Thanh Long lƠ loƠi thực v t b n đ a t i Mexico, các
n c Trung Mỹ vƠ Nam Mỹ. Hi n nay, loƠi cơy nƠy cũng đ c tr ng các n c trong
khu vực Đông Nam Á nh Vi t Nam, Malaysia, Thái Lan, Philippines, Indonesia (đặc
bi t lƠ miền tơy đ o Java); miền nam Trung Qu c, ĐƠi Loan vƠ m t s khu vực khác.

Qu c a thanh long có ba lo i, t t c đều có v gi ng nh da vƠ có m t chút lá.

Chúng có tên g i khoa h c nh sau:

 Hylocereus undatus thu c chi Hylocereus, ru t tr ng v i v h ng hay đ .

 Hylocereus polyrhizus thu c chi Hylocereus, ru t đ v i v h ng hay đ .
 Hylocereus megalanthus, tr c đơy đ c coi lƠ thu c chi Selenicereus, ru t tr ng
v i v vƠng.

23
 a) b)
a)

c)
Hìnhă1.6:ăCácăgi ng qu thanh long.

a) Thanh long ru t tr ng v đ ;
b) Thanh long ru t tr ng v vƠng;
c) Thanh long ru t đ v đ .

Các h t gi ng nh h t vừng đen nằm l n l n trong ru t. L p cùi th t trong ru t

th ng đ c ăn d ng qu t i, có mùi v th m d u, ng t vừa ph i vƠ cung c p ít calo.
H ng v c a nó đôi khi gi ng nh h ng v c a qu kiwi (Actinidia deliciosa). Qu
có thể ch bi n thƠnh n c qu hay r u vang; hoa có thể ăn đ c hay ngơm vƠo n c

24
gi ng nh chè. Mặc dù các h t bé tí xíu c a chúng đ c ăn cùng v i th t c a ru t qu
nh ng chúng không b tiêu hóa.

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng trong 100 g quả thanh long (trong đó có 55 g ăn được)

Th t ThƠnhăph nădinhăd ng Đ năv Giáătr dinhăd ng (g)

1 N c g 80 ậ 90
2 Cacbohydrat g 9 ậ 14

3 Protein g 0,15 - 0,5

4 Ch t béo g 0,1 - 0,6

5 Ch t x g 0,3 - 0,9

6 Tro g 0,4 - 0,7

7 Năng l ng Cal 35 ậ 50

8 Canxi mg 6 ậ 10

9 S t mg 0,3 - 0,7

10 Phospho mg 16 ậ 36
11 Caroten (Vitamin A) D ng v t

12 Thiamin (Vitamin B1) D ng v t

13 Riboflavin (Vitamin B2) D ng v t

14 Niacin (Vitamin B3) mg 0,2 - 0,45

15 Axit ascorbic (Vitamin C) mg 4 ậ 25

Các giá tr nêu trên có thể thay đ i theo gi ng vƠ điều ki n tr ng tr t [57].

Vi t Nam Thanh Long đ c tr ng r ng rƣi Bình Thu n, Long An, Tiền

Giang vƠ m t s t nh khác. Trong đó Bình Thu n lƠ t nh xu t khẩu thanh long l n nh t

25
n c. Bình Thu n hi n có trên 1γ.000ha thanh long, s n l ng hƠng năm đ t kho ng
300.000 t n, giá tr hƠng hóa trên β.000 tỷ đ ng. Thanh Long Bình Thu n hi n tiêu th
trên th tr ng d ng trái t i, trong đó tiêu th n i đ a kho ng 15-β0% vƠ xu t khẩu
kho ng 80-85% [56].

1.3.2. Vi sinh vật gây hỏng quả

Thanh long (Hylocereus tricostatus) ch có n c ta (g n đơy m i lan sang vƠi

n c lơn c n) vƠ m i đ c chú ý nên ch a có k t qu công b về h n m m c trên lo i
qu nƠy [4]. Theo Nguy n Thùy Chơu vƠ c ng sự (2009) [2], thanh long th ng b
nhi m Aspergillus vƠ Rhizopus, v i th ng b Fusarium vƠ Penicillium t n công gơy
th i h ng. Các loƠi n m s i thu c chi Aspergillus gặp v i t n su t cao thanh long vƠ
xoƠi, các loƠi thu c chi Cladosporium gặp xoƠi ít h n thanh long, ng c l i các
loƠi thu c chi Mucor gặp xoƠi nhiều h n so v i thanh long [4]. Các ch ng n m
th ng gặp xoƠi vƠ thanh long lƠ Fusarium dimerum Penzig, Aspergillus nidulans
Wint, Aspergillus fumigatus Fresenius vƠ Aspergillus japonicus Saito[4].

Phòng Công ngh sinh h c ậ Vi n Hóa sinh biển đƣ phơn l p từ v qu Thanh

Long h ng các ch ng vi sinh v t:

Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries: LƠ ch ng n m m c gơy b nh

các loƠi cơy ngũ c c đặc bi t lƠ lúa mì, vƠ m t s loƠi cơy thơn g [15].

26
 Hìnhă1.7 : Cladosporium cladosporioides

Cladosporium tenuisimum Cooke : LƠ ch ng n m m c đ c báo cáo lƠ tác nhơn

gơy b nh c a b nh th i qu cƠ chua, b nh đ m lá chu i, cháy lá vƠ th i qu d a h u.
Nó cũng đƣ đ c phơn l p nh m t n m ký sinh k t h p v i các lo i n m khác từ l ỡi
lá, bẹ lá vƠ r lúa, th i qu d a chu t [53].

Hìnhă1.8: Clasdosporium tenuisimum cooke

27
 Rhodoturola sp: lƠ ch ng n m men gơy b nh c h i [24].

Hìnhă1.9: Rhodoturola sp

Các ch ng nƠy đ c s d ng cho nh ng nghiên c u c a lu n văn.

1.3.3. Biện pháp bảo quản rau hoa quả tươi sau thu hoạch

Thông th ng có hai ph ng pháp chính để b o qu n rau hoa qu t i sau khi

thu ho ch lƠ: (i): b o qu n tự nhiên; (ii): b o qu n nhơn t o.

- B o qu n tự nhiên:

nhiệt độ thư ng

Đơy lƠ cách b o qu n nhi t đ vƠ đ ẩm không khí tự nhiên. Ph ng pháp nƠy

rau hoa qu gi t i trong th i gian r t ng n, vì v y không phù h p cho s n xu t quy
mô l n.

28
 Xử lý lạnh

B o qu n rau hoa qu nhi t đ th p kho ng 10±βoC. Tuy nhiên, ph ng pháp

nƠy không kh qu n vì sau khi hoa qu t iđ c mang đi tiêu th khó duy trì đ c
nhi t đ th p nên cũng d b vi sinh v t lƠm h ng.

Phương pháp điều chỉnh thành phần không khí

Nguyên t c c a ph ng pháp nƠy lƠ lƠm tăng n ng đ khí cacbonic vƠ gi m

n ng đ oxy trong không khí xung quanh trái để gi m c ng đ hô h p c a rau qu .
Dùng b ch polyetylen có đ c 20 ậ 30 l bằng kim, bao b c rau qu vƠ hƠn kín bao l i.
Kỹ thu t nƠy k t h p v i nhi t đ l nh 50C.Ph ng pháp nƠy rau qu b o qu n đ c
trong th i gian khá dƠi.

Phơi khô

LƠ s d ng năng l ng mặt tr i để ph i khô rau qu . Tuy nhiên ph ng pháp

nƠy s lƠm gi m hoặc m t đi m t s ch t dinh d ỡng trong rau qu .

NgoƠi ra có thể s d ng các l p cách nhi t ánh sáng, không khí để b o qu n

nh ng ph ng pháp nƠy không tri t để vì v n còn t n t i vi sinh v t nên d gơy h ng
qu trong th i gian ng n.

- B o qu n nhơn t o

Xử lý thuốc kích thích

Dùng ch phẩm axit gibberelic (GA3) v i liều β gói b t (m i gói ch a 1g), pha
trong bình x t 1β lít, x t đều quanh trái. X lý tr c khi thu ho ch từ 1 ậ γ ngƠy. Nh ng

29
ph ng pháp nƠy không nên dùng cho rau xanh vì hƠm l ng thu c t n d trong rau
quá cao không t t cho s c kh e ng i tiêu dùng.

Bằng hoá chất ozon

Dùng dung d ch ho t hoá anolyte (hay còn g i lƠ n c ozon), r a s ch trái, sau

đó hong khô, đóng gói, b o qu n trong nhƠ mát ph ng pháp nƠy th ng dùng cho qu
t i sau thu ho ch.

NgoƠi ra còn s d ng các tác nhơn hóa h c khác nh ch t b o qu n, lý h c nh

tia cực tím, phóng x để b o qu n.

Trong nh ng năm g n đơy các c quan nghiên c u khoa h c Nông nghi p

n c ta đƣ nghiên c u ra m t s ch phẩm b o qu n rau qu t iđ c ng d ng trong
thực ti n đƣ mang l i hi u qu cao trong ngƠnh b o qu n rau qu t i n c ta. H u
h t nh ng ph ng pháp nƠy đều có ngu n g c sinh h c, tính an toƠn cao cho con
ng i.

Màng bán thấm BOQ -15

Đơy lƠ s n phẩm do b môn B o qu n sau thu ho ch ( Vi n c đi n Nông

nghi p vƠ Công ngh sau thu ho ch ) nghiên c u, s n xu t. BOQ ậ15 lƠ h n h p dung
môi h u c vƠ thu c ch ng n m đ c k t h p v i nhau d i d ng m t dung d ch l ng
dùng để b o qu n các lo i qu thu c h Citrus ( cam, chanh, quít, b i) vƠ m t s lo i
rau ăn qu nh cƠ chua [58].

Sử dụng màng Chitosan

Đơy lƠ s n phẩm vƠ quy trình công ngh do các cán b khoa h c c a Vi n

nghiên c u cơy ăn qu miền Nam vƠ Vi n nghiên c u vƠ Phát triển Công ngh Sinh

30
h c (Tr ng Đ i h c C n Th ) nghiên c u thƠnh công trong vi c b o qu n các lo i qu
t i sau thu ho ch [58].

Màng bao – BQE 15

Vi n C đi n nông nghi p vƠ công ngh sau thu ho ch Vi t Nam, đƣ triển khai

đề tƠi "Nghiên c u ng d ng công ngh b o qu n hoa qu bằng mƠng costing - BQE
15 vƠ Retain - AVG" vƠ đ a vƠo ng d ng m t s t nh nh H ng Yên, HƠ Giang.

BQE 15 lƠ ch phẩm sinh h c đ c chi t su t từ sáp ong, c ầ thƠnh ph n chính

lƠ keo BE có mƠu nơu vƠng nh t thể l ng vƠ ch t ch th Anionic. BQE 15 đ cs
d ng để t o ra m t l p mƠng bán th m r t m ng bao b c quanh v hoa qu nh : Cam,
quýt, b iầ nhằm ngăn chặn oxy tác đ ng vƠo v qu , lƠm ch m quá trình hô h p,
ngăn chặn vi khuẩn t n công, nên gi m thiểu tỷ l th i r a c a hoa qu khi b o qu n.
Hoa qu b o qu n bằng "mƠng costing", qu luôn t i, bóng đẹp h p d n khách hƠng
[59].

Sự h h ng c a nông s n sau thu ho ch trong các kho lƠ m t v n đề th ng

xuyên xẩy ra trong các vùng có khí h u nhi t đ i do nhi t đ vƠ đ ẩm cao. Vì v y mƠ
các lo i h t, thực phẩm b các loƠi Aspergillus khác nhau lƠm h ng, m t s t o
mycotoxin vƠ sự h h ng c a ngũ c c t i do Fusarium semitectum vƠ các loƠi
Colletotrichum lƠm m t mát đáng kể [4]. Hi n không có ph ng pháp h u hi u, thi t
thực, an toƠn cao để lƠm s ch các kho ch a, gi m t n công c a vi sinh v t. Vì v y, r t
c n nghiên c u vƠ phát triển các ch t không đ c có thể gi m t c đ h h i, kéo dƠi th i
gian b o qu n.

Dung d ch nanochitosan ậ tinh d u ngh có thể lƠ ch t thay th có tiềm năng cho

các lo i hóa ch t đ c h i di t n m hi n đang đ c l u hƠnh trong b o qu n sau thu
ho ch rau qu t i hi n nay n c ta.

31
Ch ngă2:ăV T LI UăVẨăPH NGăPHÁPăNGHIÊNăC U

2.1.ăNguyênăv t li u

2.1.1 Đối tượng nghiên c u

Các ch ng n m m c vƠ n m men gơy h ng qu thanh long đ c phơn l p t i

phòng Công ngh sinh h c ậ Vi n Hóa sinh biển.

Ch phẩm tinh d u ngh vƠng k t h p v i nano chitosan đ c điều ch t i Vi n

Hóa h c ậ Vi n Khoa h c vƠ Công ngh Vi t Nam.

Qu thanh long Bình Thu n đ c thí nghi m t i, đ t đ chín kỹ thu t, không

có thu c trừ sơu vƠ ch t b o qu n.

2..1.2. Hóa chất sử dụng

Hóa chất

Hóa ch t dùng cho nuôi c y vi sinh v t: Agar ( Vi t Nam), peptone (Đ c) vƠ các

vi l ng mu i khác.

Các hóa ch t dùng cho thí ngh m khác đều đ t tiêu chuẩn phơn tích.

Môi trường

Môi tr ng 1: Môi tr ng nuôi c y n m men (môi tr ng Hansen)

ThƠnhăph nămôiătr ng g/l

Glucose 50
Pepton 10
KH2PO4 3

32
 MgSO4.7H2O 3
Agar 16

(Môi tr ng Hansen l ng không b sung agar).

Môi tr ng β: Môi tr ng nuôi c y n m m c (Môi tr ng Crapek-Dox);

pH = 6,5

ThƠnhăph nămôiătr ng g/l

NaNO3 3
K2HPO4 1
MgSO4.7H2O 0,5
KCl 0,5
FeSO4 0,01
Saccarose 20
Agar 16

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên c u

T m (Friocell, Đ c).

T l nh (Toshiba).

Pipetman các lo i (Gilson, Pháp).

Lò vi sóng (Electrolux, Th y Điển).

Máy khu y từ (Roto Lab, OSI).

T c y vô trùng (Sanyo).

33
 N i kh trùng (Nh t B n).

Cơn đi n t 10-2g ( Mettler Toledo).

Máy đo OD ậ SP 3000 nano (optima - USA)

NgoƠi ra các thí nghi m còn s d ng m t s d ng c th y tinh vƠ các trang thi t

b khác t i phòng thí nghi m Công ngh sinh h c ậ Vi n hóa sinh biển vƠ phòng thí
nghi m tr ng điểm Công ngh gen - Vi n Công ngh sinh h c.

2.2. Ph ngăphápănghiênăc u

2.2.1. Phương pháp đo độ đục định lượng tế bào nấm men

Dựa trên nguyên t c t bƠo n m men có kh năng h p th ánh sáng b c sóng

550nm. Dựa vƠo thang chuẩn Mc Farland để đ nh l ng t bƠo n m men.

Bảng 2.1 : Độ chuẩn Mc Farland ở bước sóng 550nm [ 22]

Đ chu n T ngă ng
Mc Farland N ngăđ t bƠoă(t bƠo/ml) B căsóngăODă550nm
0,5 150 x 106 0,125
1 300 x 106 0,25
2 600 x 106 0,50
3 900 x 106 0,75
4 1200 x 106 1,00
5 1500 x 106 1,25

Các b c ti n hƠnh:

N m men đ c nuôi môi tr ng Hansen l ng qua đêm 300C.

34
 Chuẩn b 2 cuvet s ch. Hút 1ml d ch n m men trên vƠo 1 cuvet.

M t cuvet ch a 1ml n c c t vô trùng dùng lƠm blank. Đ a vƠo máy so mƠu

OD.

K t qu OD đ c so v i thang chuẩn Mc Farland để tính l ng n m men đ c

nuôi môi tr ng Hansen l ng lƠ bao nhiêu.

2.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc nấm men

Chuẩn b d ch pha loƣng m u (n c vô trùng). Chuẩn b chu i pha loƣng m u

(hình 2.1). N m men sau khi ho t hóa đ c pha loƣng theo mũ 10. C y tr i m u đƣ pha
loƣng lên đĩa peptri ch a môi tr ng Hansen c ng (hình β.β). Nuôi m u 30oC trong
24 ậ 48h. Đ m s khuẩn l c hình thƠnh.

Hìnhă2.1:ăPhaăloƣngăm uătheoădƣyăth păphơn.

35
 Hìnhă2.2:ăC y tr i m uăvƠoămôiătr ng Hansen c ngătrênăđƿaăpeptri.

2.2.̀. Phương pháp tìm nồng độ diệt tối thiểu (MBC) c a hỗn hợp NCS-TDN
cho nấm men

Chuẩn bị ch ng nấm men cho thử nghiệm:

L y n m men đ c ho t hóa qua đêm từ đĩa sang ng nghi m ch a n c c t vô

trùng, vortex để đ ng nh t dung d ch n m men. Hút 1ml để đo đ đ c, dựa vƠo đ đ c
chuẩn Mc Farland để xác đ nh n ng đ n m men.

Xác định hoạt tính đối kháng nấm men c a nano chitosan-tinh dầu nghệ

B trí thí nghi m xác đ nh ho t tính đ i kháng n m men c a nano chitosan vƠ

tinh d u ngh v i các n ng đ khác nhau (B ng 2.2).

36
 Bảng 2.2: Sơ đồ thí nghiệm

Lô thí nghi m N ng đ NCS-TDN (%)

Đ i ch ng Không có NCS-TDN
2 0,1
3 0,08
4 0,06
5 0,04
6 0,02

D ch n m men đ c b sung vƠo m i ng nghi m đƣ đ c xác đ nh n ng đ

bằng ph ng pháp đo đ đ c, sao cho n ng đ cu i cùng c a n m men đ t: 105 t
bƠo/ml.

Nuôi 300C trong 24h. Pha loƣng d ch nuôi c y n m men, c y tr i 100µl từ m t

s đ pha loƣng lên môi tr ng Hansen r n. Ti p t c nuôi 30oC. Quan sát sự phát
triển c a n m men sau β4h nuôi c y. N ng đ NCS-TDN th p nh t mƠ sinh tr ng c a
n m men b c ch hoƠn toƠn g i lƠ n ng đ di t t i thiểu (MBC).

2.2.́. Phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc c a chế phẩm
nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ.

S d ng ph ng pháp ắ Khu ch tán trên đĩa th ch”.

Chuẩn b các đĩa th ch có ch a môi tr ng Czapek-Dox. L y bƠo t n m m c

đƣ đ c ho t hóa ng th ch nghiêng sang ng eppendorf ch a dung d ch mu i sinh lý
(0,9%), vortex. Hút dung d ch n m m c vƠo đĩa th ch đƣ chuẩn b trên. Trang đều
trên bề mặt đĩa đ n khi khô mặt th ch. Đ c các l xung quanh đĩa th ch vƠ 1 l gi a
lƠm l đ i ch ng. Nh dung d ch nanochitosan vƠ tinh d u ngh (từ l 1 đ n h t).

37
 L đ i ch ng nh dung d ch mu i sinh lý. Để trong t l nh 15 phút cho dung
d ch khu ch tán vƠo trong th ch. Nuôi 30oC trong 72 gi . Kiểm tra k t qu .

2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính đối kháng vi sinh vật c a NCS-
TDN trên quả thanh long

Thanh long miền nam mua về đ c r a bằng n c s ch, để khô tự nhiên.

Các b c ti n hƠnh thí nghi m nh sau:

Ho t hóa các ch ng vi sinh v t gơy h ng qu thanh long trên môi tr ng đặc.

M i qu đ c gơy x c 5 điểm. Nh β0 µl dung d ch n m s i m t đ 104 bƠo t /ml vƠo
từng v t khía. Để khô tự nhiên, sau đó nh β0 µl NCS-TDN vƠo các v t khía. Để khô
tự nhiên, gi trong thùng gi y, đ m b o đ ẩm 80-85% cho qu .

2.2.6. Bảo quản thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng NCS-
TDN.

Thanh long sau khi r a nhẹ nhƠng bằng n c, để khô t i nhi t đ phòng. Các
qu thí nghi m đ c phun dung d ch nano chitosan 0,2% k t h p v i tinh d u ngh
0,2%. M u qu đ i ch ng: ch r a bằng n c s ch để khô tự nhiên, sau đó đ cb o
qu n (S đ 2.1).

Đánh giá hi u qu x lý thanh long bằng nano chitosan-tinh d u ngh dựa trên
các tiêu chí: Tr ng thái (c ng, nhũn); MƠu s c; Mùi; V (n u có).

38
 Sơ đồ 2.1: Nghiên c u khả năng bảo quản quả thanh long sau thu hoạch c a
chế phẩm NCS-TDN

Qu thanh long sau thu ho ch

Qu phun ch phẩm nano

Qu đ i ch ng
chitosan vƠ tinh d u ngh

B o qu n

B o qu n l nh B o qu n nhi t
10 ± βoC đ phòng

Đánh giá k t qu trên cùng m t tiêu chí

39
Ch ng γ: K T QU VÀ TH O LU N

3.1.ăĐánhăgiáăkh nĕngăđ iăkhángăn m men c a ch ph m NCS-TDN in vitro

Ch ng n m men Rhodoturola sp. (TL1) đ c phòng Công ngh sinh h c ậ Vi n

Hóa sinh biển phơn l p từ v qu Thanh Long b h ng vƠ đ c đ nh danh dựa trên hình
thái. Ch ng n m men đ c ho t hóa tr c khi lƠm thí nghi m trên đĩa th ch petri có
môi tr ng Hansen, nuôi 30oC trong 48h. Ti n hƠnh c y chuyển n m men từ đĩa petri
sang ng nghi m ch a môi tr ng Hansen l ng (βml). Nuôi qua đêm 30oC. Pha
loƣng vƠ đo OD.

Bảng 3.1: Kết quả đo OD ở bước sóng 550nm c a mẫu TL1

Tên m u K t qu OD T bƠo/ml
B(n c c t vô trùng) 0,000 0
1(TL1) 1,188 1350 x 106

ODTL1= 1,188 nằm gi a đ chuẩn Mc Farland 4 vƠ 5, t ng ng v i hằng s

OD lƠ 1,00 vƠ 1,β5. Vì v y, n ng đ t bƠo c a TL1 lƠ tỷ s trung bình c a đ chuẩn 4
vƠ 5. Theo b ng 2.1:

N ng đ t bƠo TL1= (1200 x 106 + 1500 x 106) / 2 = 1350 x 106 T bƠo/ml

Nh v y n ng đ d ch n m men TL1 pha loƣng 10-1 lƠ 1350 x 106 t bƠo/ml nên

n ng đ g c lƠ: 1γ50 x 107 t bƠo/ml = 1,γ5 x 1010 t bƠo/ml. Pha loƣng d ch n m men
g c đ pha loƣng 10-4 sao cho đ c d ch n m men v i n ng đ lƠ kho ng 106 t
bƠo/ml. B sung 200μl d ch n m men v i n ng đ 106 t bƠo/ml vƠo m i ng nghi m
(6 ng) đƣ có 1,8ml môi tr ng Hansen cùng v i nano chitosan - tinh d u ngh , đ c
đánh d u từ 1 đ n 6, t ng ng v i n ng đ nano chitosan k t h p v i tinh d u ngh

40
đ c b sung vƠo m i l lƠ 0%; 0,1%; 0,08%; 0,06%; 0,04%; 0,0β%. Nuôi 30oC
trong 24h. C y tr i d ch nuôi lên môi tr ng Hansen đặc. K t qu trên b ng 3.2.

Bảng 3.2: Khả năng c chế sinh trưởng nấm men c a NCS-TDN.

N ng đ NCS-TDN CFU trung Đánh giá m c đ i

(%) bình/100μl kháng n m men (%)
0 1,1 x 108 0
0,1 0 100
0,08 0 100
0,06 364 90 - 99
0,04 Phát triển t t 40 ậ 50
0,02 Phát triển r t t t D i 20

Ghi chú: CFU: Đơn vị tạo khuẩn lạc

41
 a) b)

c) d)

Hìnhă3.1:ăĐánhăgiáăho tătínhăđ iăkhángăn m

men TL1 c a NCS-TDN. a) Đĩa đ i ch ng;
b) NCS-TDN 0,08%; c) NCS-TDN 0,06%;
d) NCS-TDN 0,04% ; e) NCS-TDN 0,02%.

e)

B ng γ.β vƠ hình γ.1 cho th y, n ng đ 0,04%, NCS-TDN h u nh không c

ch sinh tr ng c a ch ng n m men nghiên c u. Tăng n ng đ lên 0,06%, sinh tr ng
c a ch ng TL1 g n nh b c ch hoƠn toƠn. N ng đ NCS-TDN 0,08% c ch 100%
sinh tr ng c a ch ng TL1 sau 24 gi x lý. Nh v y MBC c a NCS-TDN đ i v i
ch ng TL1 lƠ 0,08%.

Theo m t s tác gi , các ch ng n m men có tính kháng khá t t đ i v i tinh d u

ngh . N ng đ TDN 10% nh n đ c bằng ph ng pháp lôi cu n h i n c t o vòng đ i

42
kháng ch ng TL1 kho ng 1,β cm (ph ng pháp khu ch tán trên đĩa th ch) [1]. Có thể
th y, nanochitosan vƠ TDN có kh năng h tr l n nhau, lƠm tăng ho t tính đ i kháng
n m men c a chúng.

3.2. Đánhăgiáăkh nĕngăđ iă khángăn m m c c a ch ph mănanoăchitosanăvƠă

tinh d u ngh in vitro

Ch ng n m m c Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries (MTL2),

Cladosporium tenuisimum Cooke (MTL4) đ c ho t hóa trên đĩa th ch petri ch a môi
tr ng Czapex ậ Dox. Vortex dung d ch bƠo t n m trong dung d ch n c mu i sinh
lý (0,9% NaCl) để đ ng nh t. C y tr i 200 μl huyền d ch lên môi tr ng r n. Đ c các
l trên m i đĩa, nh 100 μl dung d ch NCS-TDN n ng đ khác nhau vƠo m i l . N ng
đ NCS trong t t c các thí nghi m lƠ 0,β%; n ng đ TDN thay đ i từ 0,1-1,0%. Nuôi
30oC trong 72h. K t qu trên b ng 3.3.

Bảng 3.3: Hoạt tính đối kháng nấm mốc c a NCS-TD; (D-d) mm

Lô thí N ng đ N ng đ TDN C.cladosporioides C. tenuisimum

nghi m NCS (%) (%) (mm) (mm)
ĐC 0 0 0 0
1 0,2 0,1 0,5 2,0
2 0,2 0,2 0,5 3,0
3 0,2 0,3 4,5 7
4 0,2 0,4 4,5 7
5 0,2 0,5 6 9
6 0,2 1,0 12 18

43
 Hìnhă3.2:ăHo tătínhăđ iăkhángăc a NCS-TDN đ i v i MTL2.

B ng 3.3 cho th y ch ng C. tenuisimum m n c m h n so v i ch ng C.

cladosporioides. cùng n ng đ tinh d u ngh nghiên c u, ch ng C. tenuisimum có
vòng c ch sinh tr ng l n h n ch ng C. cladosporioides từ 1,5 đ n 4 l n, nh t lƠ
n ng đ TDN th p (0,1-0,2%).

Chitosan đ c ch ng minh có ho t tính đ i kháng n m nh Aspergillus niger,

Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Phomopsis asparagi, vƠ Rhizopus stolonifer vƠ
ho t tính nƠy lƠ do b n ch t polycatonic c a chitosan. Các nghiên c u ch ra rằng, hi u
qu c ch n m c a chitosan ph thu c không nh ng vƠo công th c chitosan, mƠ c
vƠo lo i n m. Ng i ta đƣ ch ng minh rằng chitosan lƠm gi m ho t tính H+-ATPase
trên mƠng nguyên sinh ch t c a R. stolonifer, gơy ra sự tích lũy proton trong t bƠo, k t
qu c ch sự v n chuyển chemiosotic mƠ sự v n chuyển nƠy cho phép trao đ i ion
H+/K+. Bằng quá trình ph thu c năng l ng, chitosan nhanh chóng thơm nh p vƠo
conidia c a F.oxysporum (ít h n 15 phút), vƠ lƠm thay đ i c u trúc t bƠo nh phá ho i
t bƠo ch t, co rút mƠng plasma vƠ lƠm m t các h p ch t trong t bƠo. Các nghiên c u

44
khác v i các lo i n m gơy b nh cho thực v t khẳng đ nh chitosan thơm nh p qua mƠng
t bƠo vƠ g n v i axit nucleic [25].

Ho t tính đ i kháng n m c a nano chitosan đ c m t s nhƠ khoa h c báo cáo.

Nano chitosan polycationic có đi n tích bề mặt l n t ng tác hi u qu v i n m vƠ có ái
lực cao g n v i t bƠo vi n m [31]. Nano chitosan có n ng đ c ch t i thiểu (di t
90% n m) đ i v i C. albicans vƠ A. niger lƠ 0,00β mg/ml vƠ cho F. solani lƠ 0,0β
mg/ml [28]. Khi các thƠnh ph n c a tinh d u (eugenol vƠ carvacrol) đ c g n vƠo nano
chitosan, ho t tính kháng khuẩn c a ph c h p bằng hoặc l n h n c a nano chitosan.
NgoƠi ra, các h t nano chitosan mang tinh d u ít đ c h n cho t bƠo đ ng v t so v i
tinh d u [12].

Các k t qu nh n đ c cho th y NCS-TDN n ng đ nghiên c u có kh năng

c ch vƠ tiêu di t n m men/n m m c hi u qu . Đặc điểm nƠy c a ph c h p lƠm cho
chúng có tiềm năng ng d ng trong b o qu n thực phẩm cũng nh trong nông nghi p
(pesticides sinh h c để kiểm soát ngu n b nh thực v t).

Hìnhă3.3:ăTh ho tătínhăkhángăc a NCS-TDN v i MTL4

45
 3.3ăĐánhăgiáăkh nĕngăđ iăkhángăn m c a nano chitosan-tinh d u ngh in vivo
trênăthanhălong

Bằng ph ng pháp mô t , thanh long đ c nhi m hai ch ng n m, Cladosporium

cladosporioides vƠ Rhodoturola sp. B o qu n nhi t đ phòng. Sau các kho ng th i
gian nh t đ nh, kiểm tra các v t nhi m n m đ c x lý NCS-TDN 0,2% vƠ không đ c
x lý. K t qu đ c trình bƠy trên b ng 3.4.

Bảng ̀.́: Khả năng c chế nấm c a NCS-TDN trên thanh long

Sau 5 ngƠy Sau 8 ngƠy Sau 1β ngƠy

Lô thí nghi m M c M c M c
Mô t Mô t Mô t
h ng h ng h ng
100% s qu Qu còn l i

Đ i ch ng da vƠ tai héo. m c đ u, Qu còn l i

67% s qu b + cu ng. Da ++ b nhũn. Da +++
(Để không) m c đ u vƠ qu có đ m vƠ tai vƠng
cu ng. vƠng
100% s v t
Nhi m MTL2
khía có m c. 100% qu b
Cladosporium ++ +++
50% s qu b th i
cladosporioides
th i do m c
Các qu tai
vƠng vƠ có 40% v t khía 60% s v t
Cladosporium
đ m trên da. b t đ u có sự có sự phát
cladosporioides ± + ++
Các v t x lý phát triển c a triển c a
NCS-TDN 0,2%
ch a có hi n m c m c
t ng n m

46
 Tai héo vƠng,
Nhi m TL1
n m lan r ng
++ 100% b th i +++
ra ngoƠi. 50%
Rhodoturola sp.
qu b th i
Rhodoturola sp. 100% qu da
50% s v t 80% s v t
vƠ tai vƠng.
+ NCS-TDN + khía đƣ b ++ khía b +++
V t x lý ch a
th i h ng
0,2% có n m m c
Ghi chú: ± : bắt đầu có hiện tượng hỏng.
+ : hỏng một phần trên quả.
++: hỏng khoảng 50%.
+++: Đã hỏng hết

K t qu nh n đ c cho th y NCS-TDN có kh năng ngăn c n sự phát triển c a

n m men vƠ n m m c trên qu thanh long.

a) b)

Hìnhă3.4:ăThanhălongăb hỏng do nhi m n m a) Thanh long nhi m n m men;

b) Thanh long nhi m n m m c

47
 3.4. Đánhăgiáăkh nĕngăb o qu n thanh long b ng ch ph m nanoăchitosanăvƠă
tinh d u ngh

Hoa qu sau thu ho ch th ng b h ng do nhiều nguyên nhơn: h h i trong quá

trình thu ho ch vƠ v n chuyển, m t n c, do nhi m các ngu n b nh thực v t trên đ ng
ru ng vƠ trong quá trình b o qu n. Vì v y, để h n ch qu b h ng trong quá trình b o
qu n b i vi sinh v t, c n áp d ng các bi n pháp b o qu n nh phun thu c di t n m,
xông l u huỳnh hoặc b c qu trong các lo i mƠng sinh h c. Nhằm khai thác ho t tính
đ i kháng n m c a ph c h p nano chitosan ậ tinh d u ngh , ph c h p nƠy đƣ đ c th
nghi m b o qu n thanh long trong điều ki n phòng thí nghi m.

3.4.1. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ phòng

Thí nghi m đ c ti n hƠnh nh mô t ph n ph ng pháp. Thanh long sau khi

r a s ch nhẹ nhƠng, để khô nhi t đ phòng, sau đó đ c phun nano chitosan-tinh d u
ngh 0,β%. Để khô vƠ x p vƠo thùng cacton.

Hìnhă3.5:ăThanhălongăđ c b o qu n ở nhi tăđ phòng

48
 Bảng 3.5: Kết quả thanh long bảo quản ở nhiệt độ phòng

LôăTN 7ăngƠy 15ăăngƠy 20ăngƠy

ĐC 100% tai qu héo, úa 100% m c đ u vƠ 100% qu th i h ng
vƠng. V qu có hi n cu ng. 60% qu th i
t ng thơm nám. h ng.
NCS-TDN 90% tai qu ng vƠng. 50% héo cu ng. 20% 50% qu th i h ng.
V qu đ t i. qu th i h ng. Còn l i Còn l i tai qu héo,
v qu t iđ . v qu đ t i.
Ghi chú: ĐC: đối ch ng
TN: thí nghiệm

a) b)

Hìnhă3.6: Thanh long b o qu n ở nhi tăđ phòng sauă7ăngƠy;ăa) M u thanh

long đ c phun ch phẩm nano chitosan vƠ tinh d u ngh 0,2%; b) M u đ i ch ng

49
 a) b)

Hìnhă3.7: Thanh long b o qu n ở nhi tăđ phòngăsauă15ăngƠy;ăa) thanh long

đ c phun nano chitosan vƠ tinh d u ngh 0,β%; b)Thanh long đ i ch ng.

K t qu thí nghi m cho th y m u qu thanh long đ c phun ch phẩm nano

chitosan vƠ tinh d u ngh 0,2% gi đ c v t i vƠ lơu h ng h n so v i m u đ i
ch ng.

3.4.2. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ lạnh (10 ± 2oC)

M u qu thanh long đ c đem r a bằng n c s ch, để ráo n c tự nhiên. Các

m u qu đ c s d ng lƠm đ i ch ng vƠ m u qu đ c phun ch phẩm nano chitosan
0,β% vƠ tinh d u ngh 0,β% đ c b o qu n trong ngăn l nh có nhi t đ 10 ± βoC.

Hìnhă3.8:ăB o qu n thanh long ở nhi tăđ l nhă10ă±ă2oC

50
 Bảng 3.6: Kết quả thanh long bảo quản nhiệt độ lạnh 10 ± 2oC

Lô TN 10 ngƠy β0 ngƠy γ0 ngƠy

ĐC 100% t iđ 50% tai qu héo, ng vƠng. 100% tai qu vƠng,
Còn l i tai qu ng vƠng. héo.Còn l i v qu s m
V qu mƠu thơm nám. mƠu, không còn đ bóng.
NCS-TDN 100% t iđ 100% tai qu ng vƠng. V 100% tai ng vƠng. V
qu mƠu đ s m. qu đ s m, căng. Không
có hi n t ng h h ng
Ghi chú: ĐC: đối ch ng
TN: thí nghiệm

a) b)

Hìnhă3.9: Thanh long b o qu n l nhăsauă15ăngƠy.ăa) M u đ i ch ng. b) M u

phun ch phẩm nano chitosan vƠ tinh d u ngh 0,2%.

51
 a) b)

Hìnhă3.10: Thanh long b o qu n l nhăsauă30ăngƠy.ăa) M u đ i ch ng. b) M u qu

phun ch phẩm nanochitosan vƠ tinh d u ngh 0,2%.

Nh v y qua thí nghi m b o qu n nhi t đ th p m t l n n a cho k t qu

nh ng m u qu đ c phun ch phẩm nano chitosan vƠ tinh d u ngh 0,2% b o qu n
đ c lơu h ng h n m u đ i ch ng.

Vì v y mƠ t i n ng đ nano chitosan vƠ tinh d u ngh 0,2% phù h p cho b o

qu thanh long.

K t qu th hƠmă l ngă dinhă d ng c a thanh long b o qu n ở nhi tă đ

th păsauă30ăngƠy:

Qu thanh long b o qu n l nh sau γ0 ngƠy đ c g i t i Trung tơm phơn tích vƠ

giám đ nh thực phẩm Qu c gia ậ Vi n công nghi p thực phẩm để phơn tích hƠm l ng
dinh d ỡng.

52
 Bảng 3.7: Kết quả phân tích hàm lượng dinh dưỡng c a thanh long sau khi
bảo quản lạnh ̀0 ngày.

K t qu m u K t qu m u
STT Tênăch tiêu Đ năv tính
ĐC NC
1 HƠm l ng vitamin C mg/100g 13,2 12,56
2 HƠm l ng đ ng kh % 5,31 6,3
3 V t ch t khô % 14,2 13,87
Ghi chú: ĐC: đối ch ng
NC: nghiên c u

Qu thanh long đ c b o qu n bằng ch phẩm nano chitosan vƠ tinh d u ngh

0,β% có hƠm l ng vitamin C th p h n m u đ i ch ng vƠ hƠm l ng đ ng kh cao
h n m u đ i ch ng. Ch ng t , thanh long đ c b o qu n bằng ch phẩm h n ch đ c
quá trình lên men h n m u đ i ch ng.

Hoa vƠ c ng sự (2006) [26] x lý nhi t thanh long Bình Thu n để b o qu n qu

sau thu ho ch 5oC trong túi polypropylene. Hình th c c a thanh long điều ki n nƠy
b nh h ng, mặc dù ch t l ng v n ch p nh n đ c. Theo m t s tác gi , thanh long
b o qu n t i đa đ c 14 ngƠy 10oC. Marisa vƠ cs (β008) [39] khuy n cáo b o qu n
thanh long đ c chi u tia X 10oC t i đa lƠ 14 ngƠy để đ m b o giá tr s d ng. Thanh
long ph thu c vƠo loƠi vƠ ch đ chăm sóc, khi đ c thu ho ch th i điểm mƠu qu
g n phát triển hoƠn toƠn, có thể gi đ c ch t l ng th ng phẩm c a thanh long trong
2 tu n 14oC vƠ 1 tu n 20oC [41].

K t qu nh n đ c cho th y NCS-TDN có kh năng kéo dƠi th i gian b o qu n

c a thanh long. nhi t đ phòng, sau 15 ngƠy thanh long v n không b h ng, mặc dù

53
hình th c không đ ct i nh ngƠy đ u tiên. nhi t đ l nh, có thể b o qu n thanh
long đ n γ0 ngƠy bằng NCS-TDN mƠ không lƠm nh h ng t i ch t l ng c a qu .

54
 K T LU N VÀ KI N NGH

 K t lu n

1. Xác đ nh đ c MBC c a nano chitosan k t h p v i tinh d u ngh cho ch ng

n m men Rhodoturola sp. lƠ 0,08%

2. Nano chitosan k t h p v i tinh d u ngh có kh năng c ch sinh tr ng c a

2 ch ng n m m c C.cladosporioides vƠ C. tenuisimum in vitro. Ho t tính c ch ph
thu c vƠo n ng đ nghiên c u

3. Th nghi m in vivo cho th y nano chitosan k t h p v i tinh d u ngh c ch

sinh tr ng c a n m trên thanh long

4. Thanh long b o qu n bằng nano chitosan k t h p v i tinh d u ngh 0,2%

đ c đ n 15 ngƠy nhi t đ th ng vƠ γ0 ngƠy nhi t đ 10oC± β v n đ m b o ch t
l ng qu

 Ki n ngh

Ti p t c nghiên c u kh năng b o qu n thanh long bằng nano chitosan k t h p

v i tinh d u ngh qui mô l n h n vƠ có thể áp d ng đ i v i các đ i t ng qu khác.

55
 TÀI LI U THAM KH O

Tài liệu tiếng việt:

1. Nguy n Th Kim Cúc vƠ c ng sự., (2010), Báo cáo đề tƠi Đ c l p, mƣ s

ĐTĐL.β008T/16

2. Nguy n Thùy Chơu vƠ c ng sự. (2009), Báo cáo Đề tƠi KHCN c p B giai
đo n 2006-2009: Nghiên c u sản xuất một số chế phẩm sinh học, hóa học trong bảo
quản rau, quả, hoa tươi.

3. Ph m Gia Điền vƠ c ng sự, (2010), Nghiên c u chế tạo polime sinh học
chitosan cấu trúc nanô ng dụng làm chất mang thuốc.

4. Đặng Vũ Miên, Chơu Ng c H i, Lê Th B o Trúc (β008), ắNghiên c u xác

đ nh h n m m c trên m t s trái cơy Vi t nam”, tạp chí Sinh học, 10 ậ 2008.

5. Tr n Th Vi t Hoa, Tr n Th Ph ng Th o, Vũ Th Thanh Tơm (2007),

ắThƠnh ph n hóa h c vƠ tính kháng oxy hóa c a ngh đen Curcuma zedoaria Berg.
tr ng Vi t Nam”, tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, 10(4):37-47

Tài liệu tiếng Anh:

6. Allemann, ER Gurny and E Doelker. Eur J Pharm Biopharm (1993), 39:

173-191.

7. A Krishna Sailaja, P Amareshwar, P Chakravarty, (β010), ắChitosan

nanoparticles as a drug delivery system”, Biological and Chemical Sciences ,Volume
1, Issue 3: 477-480.

56
 8. Apisariyakul A, N Vanittanakom, D Buddhasukh (1995), ắAntifungal activity
of turmeric oil extracted from Curcuma longa (Zingiberaceae)”.J.Ethnopharmacol..49:
163-169.

9. Behura S, S. Sahoo, V. K. Srivastava (2002), ắMajor constituents in leaf

essential oils of Curcuma longa L. and Curcuma aromatica Salisb.,Ằ Curr Sci. 83 (11):
1312-1313

10. Bernard GT, Esteban P, Christopher JS, Turmerones (198β), ắ Isolation

from Turmeric and their Structure Determination”, Chem Commun, 6, 363.

11. Chen, Y. H., Yu, J. G., & Fangy, H. J. (198γ), ắStudies on Chinese curcuma
III. Comparison of the volatile oil and phenolic constituents from the rhizome and
tuber of Curcuma longa”, Zhongyao Tongbao, 81, 27ậ29.

12. Chen Fei, Zhilong Shi, K.G. Neoh, E.T. Kang (2009), ắAntioxidant and
Antibacterial Activities of Eugenol and Carvacrol-Grafted Chitosan Nanoparticles
Biotechnol”, Bioeng.104: 30ậ39

13. Cooray, N. F., Jansz, E. R., Ranatunga, J., & Wimalasena, S. (1988). ắEffect
of maturity on some chemical constituents of turmeric (Curcuma longa L.)”, Journal of
the National Science Council of Sri Lanka, 16, 39ậ51.

14. Cousins M., J. Adelberg, F. Chen and J (2007). Rieck Antioxidant capacity
of fresh and dried rhizomes from four clones of turmeric (Curcuma longa L.) grown in-
vitro. Industrial Crops and Products, 25(2):129-135.

15. Domsch K. H., Gams W., Anderson T. (1980), ắCompendium of soil fungi”,
Acad. Press. London-New York-Toronto-Sydney-San Francisco.

57
 16. Dhingra OD, Jham GN, Barcelos RC, Mendonça FA, Ghiviriga I (2007),
Isolation and Identification of the Principal Fungitoxic Component of Turmeric
Essential Oil. J Essential Oil Res 19(4): 387-391.

17. Erbacher P, S Zou, AM Steffan, and JS Remy.(1998), Pharm Res; 15: 1332-
1339.

18. Ferreira L.A., O.B. Henriques, A.A. Andreoni, G.R. Vital, M.M. Campos,
G.C. Habermehl and V.L. de Moraes (1992). ắAntivenom and biological effects of ar-
turmerone isolated from Curcuma longa (Zingiberaceae)”. Toxicon 30 (10): 1211-8

19. Fang, S. W., C. F. Li, and D. Y. C. Shih. (1994), ắ Antifungal activity

of chitosan and its preservative effect on low ậ sugar candied kumquat.j.” Food
Protect.57:136-140.

20. G.K. Jayaprakasha, L. Jagan Mohan Rao and K.K. Sakariah, (2005),
ắChemistry and biological activities of C. Longa”, Food Science & Technology 16.
533ậ548.

β1. Gopalan, A., & Ratnambal, M. J. (1987). ắGas chromatographic evaluation

of turmeric essential oil”, Indian Perfumer, 31,245ậ248.

22. Grantbio, Densitometer, DEN-1, (β01β), ắoperating instructions”, Version

1.02, pp: 5

23. Griffin Shane G., S. Grant Wyllie, Julie L. Markham and David N. (1999),
Leach The role of structure and molecular properties of terpenoids in determining
their antimicrobial activity Flavour Fragr. J., 14, γββ±γγβ .

58
 β4. Hazen KC.(1995), ắNew and emerging yeast pathogens”. Clin Microbiol
Rev; 8: 462-478.

25. Hernández-Lauzardo AN, Miguel Gerardo Velázquez-del Valle and

María Guadalupe Guerra-Sánchez. (2011), Current status of action mode and effect of
chitosan against phytopathogens fungi African J Microbiol Res 5(25): 4243-4247.

26. T.T. Hoa, C.J. Clark, B.C. Waddell and A.B. (β006), ắWool Postharvest
quality of Dragon fruit (Hylocereus undatus) following disinfesting hot air treatments”.
Postharvest Biology and Technology 41 (1): 62-69, 2006

β7. Illum, L.1998. ắChitosan and its use as a pharmaceutical excipient”. Pharm.
Res. 15: 1326-1331.

28. Ing L Y, NoraziahMohamad Zin, Atif Sarwar, and Haliza Katas. (2012),
ắAntifungal Activity of Chitosan Nanoparticles and Correlation with Their Physical”
Properties International J Biomaterials, Article ID 632698, 9 pages doi :10.
1155/2012/632698.

29. Jain S, Satyaendra Shrivastava, Satish Nayak, S. Sumbhate (2007), ắPlant

Review Recent trends in Curcuma longa Linn”. Pharmacognosy Reviews 1 (1): 119-
128.

30. Jayaprakasha GK, Bhabani S. Jena, Pradeep S. Negi and Kunnumpurath

K. (2002), Sakariah Evaluation of Antioxidant Activities and Antimutagenicity of
Turmeric Oil: A Byproduct from Curcumin Production Z. Naturforsch. 57c. 828-835.
31. Kaur P, Rajesh Thakur and Ashok Choudhary. (β01β), ắAn In Vitro
Study of The Antifungal Activity of Silver/Chitosan Nanoformulations Against
Important Seed Borne Pathogens”. Intern J Sci Technol Res, 1(6): 83-86

59
 32. Kelkar, N. C., & Sanjeev Rao, B. (19γγ). ắStudies in Indian essential
oils: From Curcuma longa”. Journal of the Indian Institute of Science, 17A, 7ậ10.
33. Liu, X. F., Y. L. Guan, D. Z. Yang, Z. Li, and K. De Yao.( 2001),
ắAntibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan”. J. Appl. Polym. Sci.
79:1324‐13
34. Lee H.S. (2006), ắAntiplatelet property of Curcuma longa L. rhizome-
derived ar-turmerone”. Bioresource Tech. 97(12): 1372-6.

35. Lonso MJ, Sanchez A. (2003), J Pharm Pharmacol;55:1451-1463.

36. McCarron, M., Mills, A. J., Whittaker, D., Sunny, T. P., & Verghese, J.
(1995), ắ Comparison of the monoterpenes derived from green leaves and fresh
rhizomes of Curcuma longa L. from India”. Flavour and Fragrance Journal, 10, 355ậ
357.

37. Muzzarelli, R, R. Tarsi, O. Filippini, E, Giovanetti, G. Biagini, and P.E.

Varolo. (1990), Antimicrobial properties of N carboxybutyl chitosan. Antimicro.
Agents Chenmother. 34: 2019-2023.

γ8. Malingre, T. R. (1975), ắCurcuma xanthorrhiza roxb., temoe lawak, als plant
met galdrijrende werking”. Pharmaceutisch Weekblad, 110, 601ậ606.

39. Marisa M. Wall, Shakil A. Khan Postharvest. (2008), Quality of Dragon

Fruit (Hylocereus spp.) after X-ray Irradiation Quarantine Treatment HortScience
43(7): 2115-2119.
40. Mishra N. and S.S. Gupta.(1997), ắAnti-Inflammatory and Anti-
hyaluronidase activity of volatile oil of Curcuma longa”. J. Res. Ayur. Siddha 1-2 (18):
56-62.

60
 41. Nerd, A., F. Gutman and Y. Mizrahi. (1999), ắRipening and postharvest
behaviour of fruits of two Hylocereus species (Cactaceae)”. Postharv. Biol. Technol.
17:39-45.
42. Ohya Y., Shiratani M., Kobayashi H. and Ouchi T. (1994), ắ Release
behavior of 5-fluorouracil from chitosan-gel nanospheres immobilizing 5- fluorouracil
coated with polysaccharides and their cell specific cytotoxicity”. Pure Appl. Chem., 31,
629-642 .

43.Pochanavanich, P. and W. Suntornsuk. (2002), ắFungal chitosan

production and its characterization”. Lett. Appl. Microbiol. 35:17‐21.

44. Phan Minh Giang, Van Ngoc Huong, Phan Tong Son (2000) ắAntimicrobial
activity of sesquiterpene constituents from some curcuma species of Vietnam”. J.
Chem., 38(1):91-94.

45. Rosenberg, M., D. Gutnick, and E. Rosenberg (1980), ắ Adherence of

bacteria to hydrocarbons: A simple method for measuring cell-surface
hydrophobicity”. FEMS Microbiol. Lett.9: 29-33.

46. Saju M.N.V and M.J. Mathew. (1998), ắActivities of essential oil of
turmeric (Curcuma longa L)”. Current Sci.. 75. 660-662.

47. Singla, A. K. and M. Chawla. 2001. ắChitosan: Some pharmaceutical and bi

ological aspects”. ‐ an update J. Pharm. Pharmacol. 53:1047‐1067.

48. Sara Burt. (β004), ắEssential oil: their antibacterial properties and potential
applications in foods” -a review Inter J food Microbiol., 94:223-253.

49. Scartezzini P, and Speroni E (2000), ắReview on some plants of Indian

traditional medicine with antioxidant activity”. J. Ethnopharmacology 71: 23-43.

61
 50. Tiyaboonchai Waree. (β00γ), ắ Chitosan Nanoparticles : A Promising
System for Drug Delivery”. Naresuan University J; 11(3): 51-66

51. Tripathi P, NK Dubey, R Banerji and JPN Chansouria. (β004), ắ Evaluation

of some essential oils as botanical fungitoxicants in management of post-haverst rotting
of citrus fruits”. World J Microbiol. Biotechnol., 20:317-321.

52. Tokura, S., K. Ueno, S. Miyazaki, and N. Nishi. (1997), ắ Molecular weight
dependent antimicrobial activity by chitosan”. Macromol. Symp. 121-9.

53. Y.A. Batta, (2004), Cladosporium tenuissimum Cooke (Deuteromycotina:

Hyphomycetes) as a causal organism of new disease on cucumber fruits.

54. Zhu, L. F., Li, Y. H., Li, B. L., Ju, B. Y., & Zhang, W. L. (1995). ắAromatic
plants and essential constituents” (Suppl. 1): South China Institute of Botany, Chinese
Academy of Sciences, HaiFeng Publ. Co. Distributed by Peace Book Co., Ltd. Hong
Kong.

Tài liệu tiếng Pháp:

55. Rouget M.C. (1859), ắ Des substances amylacéé dans les tisus des animaux,
spécialement des articulés (chitine)”, Comp. Rend. 48: 792-795.

Website:
56. http://www.rigonfruit.com/vn
57. http://vi.wikipedia.org/wiki/Thanh_long
58. http://elib.hcmuaf.edu.vn
59. http://www.rauhoaquavietnam.vn

62
 PH L C

63
64