‫تحضير كروموسومات الطور البشري‬

‫قسم علم جينوم السرطان ‪ ،‬فرع علم الوراثة ‪ ،‬المعهد القومي للسرطان‬
‫المعاهد الوطنية للصحة‬
‫الكواشف‬
‫حمض الخليك الجليدي‬

‫مالينكروت ‪ ،‬كات‪V193 .‬‬

‫مضاد حيوي مضاد للفطريات ‪100X‬‬

‫‪ 10000‬وحدة ‪ /‬مل بنسلين ج صوديوم ‪ 10000 ،‬جم ‪ /‬مل كبريتات الستربتومايسين ‪ 25 ،‬جم ‪ /‬مل‬

‫األمفوتريسين ‪B‬‬

‫‪ ، .Invitrogen Corp‬كات‪ 100( 013-15240 .‬مل)‬

‫أو‬
‫البنسلين ‪ /‬الستربتومايسين‬
‫‪ 5000‬وحدة ‪ /‬مل ‪ 5000 /‬جم ‪ /‬مل‬

‫‪ ، .Invitrogen Corp‬كات‪014-15070 .‬‬

‫‪ ، Colcemid‬محلول ‪ 10( KaryoMAX Colcemid‬جم ‪ /‬مل)‬

‫شركة ‪Invitrogen Corp. ، Cat.15210-016‬‬

‫مصل بقري جنيني مؤهل ‪ ،‬غير نشط بالحرارة‬

‫‪ ، .Invitrogen Corp‬كات‪ 500( 022-16140 .‬مل)‬

‫‪ -L‬الجلوتامين ‪ 200‬ملم ‪100X ،‬‬

‫‪ ، .Invitrogen Corp‬كات‪ 100( 016-25030 .‬مل)‬

‫‪Phytohaemagglutinin (PHA)، HA 15‬‬

‫‪ ، .Murex Diagnostics Ltd‬دارتفورد ‪ ،‬إنجلترا ‪DA1 5LR‬‬

‫كحول الميثيل الالمائي‬

‫مالينكروت ‪ ،‬كات‪3016 .‬‬
‫كلوريد البوتاسيوم (بوكل)‬
‫مالينكروت ‪ ،‬كات‪6858 .‬‬

‫‪ RPMI‬متوسط ‪1640‬‬

‫‪ ، .Invitrogen Corp‬كات‪050-21870 .‬‬

‫تحضير‬
 ‫‪ RPMI 1640‬متوسط كامل‬

‫كمية المكونات‬

‫‪ RPMI‬متوسط ‪ 1640500‬مل‬

‫‪ -L‬الجلوتامين ‪ 200‬مم ‪ 100X 5 ،‬مل‬

‫بنسلين ‪ /‬ستربتومايسين ‪ 5000‬وحدة ‪ /‬مل ‪ 5000 /‬جم ‪ /‬مل ‪ 10‬مل‬

‫أو‬

‫مضاد حيوي ‪ -‬مضاد للفطريات ‪ 100X 5 ،‬مل‬

‫مصل بقري جنيني مؤهل ومعطل بالحرارة ‪ 100‬مل‬

‫تحضير كروموسومات الطور البشري ‪2006‬‬
‫الصفحة ‪ 2‬من ‪3‬‬
‫فلتر يعقم وسط كامل بفلتر ‪ 0.22‬ميكرومتر‪.‬‬
‫المتوسط جيد لمدة ‪ 3-2‬أسابيع عند ‪ 4+‬درجة مئوية‪.‬‬
‫محلول منخفض التوتر‪ 0.075 :‬م بوكل‬
‫بوكل ‪ 5.6‬غرام‬
‫ماء مقطر ‪ 1000‬مل‬

‫مثبت‬
‫كحول الميثيل ‪ /‬حمض الخليك الجليدي ‪ ، 1 :3 ،‬الحجم‪ :‬الحجم‬
‫إجراء‬
‫تحضير الخاليا االنقسامية من مزارع الدم قصيرة المدى‪.‬‬
‫‪ .1‬اجمع ‪ 5-3‬مل من الدم الكامل المعالج بالهيبارين (أنبوب تفريغ الهواء األخضر العلوي) ؛ صوديوم‬
‫الهيبارين هو مضاد التخثر الموصى به (انظر المالحظة ‪.)1‬‬

‫‪ .2‬أضف ‪ 0.7‬مل من الدم المعالج بالهيبارين إلى ‪ 10‬مل من ‪ RPMI 1640‬وسط كامل يحتوي على‬

‫‪ 0.2‬مل فيتوهيماجلوتينين في قوارير ‪ ، T-25‬واحتضانها لمدة ‪ 72‬ساعة عند ‪ 37‬درجة مئوية في خلية‬

‫حاضنة الثقافة‪ .‬يجب أن تقف القوارير منتصبة مع إغالق األغطية‪.‬‬

‫‪ .3‬بعد ‪ 72‬ساعة من المزرعة ‪ ،‬أضيفي ‪ 100‬ميكرولتر من كولسيميد واخلطي جيداً‪ .‬احتضان لمدة ‪ 30‬دقيقة في‬
‫‪ 37‬درجة مئوية‪.‬‬
‫‪ .4‬نقل الثقافة إلى ‪ 15‬مل من أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند ‪ 1200‬دورة في الدقيقة لمدة ‪ 5‬دقائق‪.‬‬
‫قم بإزالة الوسيط تمامًا باستثناء حوالي ‪ 0.5‬مل من المادة الطافية المتبقية‬
‫فوق بيليه الخلية‪.‬‬
 ‫‪ .5‬إعادة تعليق الخاليا في الوسط المتبقي وإضافة حوالي ‪ 2‬مل بعناية‬

‫من درجة حرارة (‪ 37‬درجة مئوية) ‪ ، M KCl 0.075‬قطرة تلو قطرة ‪ ،‬أثناء التحريك برفق‪ .‬إضافة‬

‫‪ 8‬مل إضافية من بوكل ‪ ،‬ليصبح المجموع ‪ 10‬مل ؛ اخلط جيدا‪.‬‬

‫‪ .6‬احتضان لمدة ‪ 15‬دقيقة عند ‪ 37‬درجة مئوية في حمام مائي‪.‬‬
‫‪ .7‬أضف بضع قطرات من المثبت الطازج ‪ ،‬ولف األنبوب ‪ ،‬وعكس المزيج‪.‬‬

‫‪ .8‬الطرد المركزي الخاليا وإزالة المادة طافية كما في الخطوة ‪.3‬‬

‫‪ .9‬إعادة تعليق الخاليا وإصالح الخاليا بإضافة ‪ 10‬مل من المثبت‪ .‬أول ‪ 2‬مل‬
‫يجب إضافته بالتنقيط أثناء التحريك برفق‪.‬‬
‫‪ .10‬بعد ‪ 15-10‬دقيقة في درجة حرارة الغرفة ‪ ،‬والطرد المركزي الخاليا وإزالة‬
‫طاف كما في الخطوة ‪.4‬‬

‫‪ . 11‬كرر إجراء التثبيت مرتين إلى ثالث مرات أخرى (انظر المالحظات)‪ .‬ليست ضرورية‬
‫الحتضان الخاليا بين أجهزة الطرد المركزي‪.‬‬
‫‪ . 12‬بعد آخر طرد مركزي ‪ ،‬قم بإعادة تعليق الخاليا في كمية صغيرة من المثبت و‬
‫إسقاط التعليق على شريحة مجهر نظيفة‪ .‬جودة الطور الفوقي‬
‫يعتمد االنتشار على عدد من العوامل ‪ ،‬بما في ذلك الرطوبة وتدفق الهواء و‬
‫تركيز الخلية‪.‬‬
‫ملحوظات‬

‫‪ .1‬إذا تم استخدام الهيبارين الليثيوم أو ‪ EDTA‬المضاد للتخثر (أنبوب الخزامى العلوي) ‪ ،‬قم بمعالجة‬

‫العينة مع الوثائق المناسبة لهذا الغرض‪ .‬قد يكون المؤشر االنقسامي‬

‫انخفاض‪ .‬يجب أن تبدأ هذه العينات في وسط الثقافة على الفور‬
‫تقلل من تأثير مضادات التخثر‪.‬‬

‫‪ . 2‬يجب تحفيز خاليا الدم البيضاء في الدم المحيطي باستخدام مادة ميتوجين محفزة‬
‫انقسام الخلية كشرط أساسي إلعداد الخاليا في الطور الطوري‪ .‬في االستعدادات‬
‫خاليا الدم البشرية المحيطية ‪ ،‬يتم تحفيز الخاليا اللمفاوية التائية‬

‫‪.phytohemagglutinin‬‬

‫‪ .3‬العالج الخافض للتوتر يسبب تورم في الخاليا‪ .‬الوقت األمثل للعالج‬

‫يختلف باختالف أنواع الخاليا ويجب تحديده تجريبياً‪.‬‬
‫‪ . 4‬خطوات تثبيت إضافية مطلوبة للكريات الملوثة بخاليا الدم الحمراء (‪)RBC‬‬

‫للقضاء على الحطام الذي قد يتعارض مع صنع الشرائح والنطاقات‪.‬‬

‫‪ . 5‬إذا لم يتم عمل الشرائح في نفس يوم الحصاد ‪ ،‬قم بملء األنبوب بالطازجة‬
‫المثبت المحضر ‪ ،‬شد الغطاء ‪ ،‬وقم بتخزين التعليق عند ‪ 20-‬درجة مئوية‪.‬‬