HÀ DUY ÊN T ư (Chủ bién)

Phân tích
Hóa học thực phẩm

NFỈÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT

HÀ NÔI - 2009
 M Ụ C LỤC
LỜI NÓI Đ ÀU ........................................................................................................................ 3
CHƯƠNG 1. G IỚ I TH IỆU .......................................................................................... 11
1.1. MỘT SÔ THÀNH PHÀN HÓA HỌC THựC PHÂM ................................................. 12
1.1.1 NUÓC............................................................................................................................... 12
1.1.2. THÀNH PHÂN DINH DƯỠNG CỦA THựC PH Á M ............................................... 12
1.1.3. CÁC THÀNH PHÀN HÓA HỌC KH Á C ................................................................... 14
1. 1.4. MỘT SỐ THÀNH PHÂN GÂY NGỘ Đ ộ c ............................................................... 16
1.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHÂN HÓA HỌC THựC PH ẨM ........................................... 18
1.2.1. LÁY MÃU VÀ BẢO QUẢN M Ẫ U ............................................................................ 18
1.2.2. XỬ LÝ M Ã U ............................................................................................................... 19
1.2.3. LỰA CHỌN KỸ THUẬT PHÂN T ÍC H .....................................................................20
1.2.4. ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍC H ...............................................................20
1.2.5. XỬ LÝ SÓ LIỆU.........................................................................................................24
CHƯƠNG 2. NƯ ỚC ............................................................................................................................ 26
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ HÀM LUỢNG N ước, HOẠT Độ N ư ớc, ĐƯỜNG ĐẢNG
NHIỆT HẤP T H Ụ ......................................... ................. ..................................................26
2.2. Sự CÀN THỈÊT PHẢI XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG N ư ớ c .........................................29
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG N ư ớ c VÀ HOẠT Đ ộ N ư ớ c TRONG
T H Ụ t PHẮM.................................'............ '........................................... ...................... 30
2.3.1. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG N ư ớ c TU Y Ệ T Đ Ó I ........................................30
2.3.2.PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT Đ ộ N ư ớ c CỦA THựC PHÁM .................... 33
2.4. XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG ĐẢNG NHIỆT HẤP THỤ VÀ PHẢN HÁP T H Ụ .................... 35
CHƯƠNG 3. PRO TEIN................................................................................................39
3.1. ĐẠI CƯƠNG VÈ NGHIÊN c ử u CÁU TRÚC PHÂN TỬ PROTEIN........................ 39
3.2. MỘT SỐ TÍNH CHẢT QUAN TRỌNG CỦA PROTEIN.............................................40
3.2.1. KHÓI LƯỢNG VÀ HÌNH DẠNG PHÂN TỬPROTEIN.......................................... 41
3.2.2. TÍNH CHÁT LƯỠNG TÍNH CỦA AXIT AMIN VÀ PROTEIN............................ 44
3.2.3. TÍNH CHÁT DUNG DỊCH KEO PROTEIN, s ự KÉT TỦA PROTEIN.................. 46
3.2.4. KHẢ NĂNG HẨP THỰ TIA TỬNGOẠI CỦA DUNG DỊCH PROTEIN............... 48
3.2.5. CÁC PHẢN ÚÌ^ỈG THƯỜNG DÙNG DỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN
VÀ PROTEIN................................................................... 1...’....................................... „49
3.3.THỤ’C HÀNH................................................................................................................53
CHƯƠNG 4. ENZIM ..................................................................................................................... 64
4.1. GIỚI TH iỆU ..................................................................................................................64
4.2. MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT L ự c E N Z iM ................................... 67
4.2.1. PHƯƠNG PHÁP ĐO Đ ộ NHỚT.............................................................................. 67
4.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN c ự c KÊ............................................................................ 67
4.2.3. PHƯƠNG PHÁP ÁP KÊ........................................................................................... 67
4.2.4. PHƯƠNG PHÁP PHỔ QUANG KÊ..........................................................................68
4.2.5. PHƯƠNG PHÁP CHUÂN Đ ộ LIÊN T Ụ C ...............................................................68
4.2.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC K Ý ........................................................................................ 68
4.2.7. PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC.................................................................................... 69
4.2.8. NHŨÌ^iG ĐIỀU L ư u Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT Đ ộ E N Z IM ................................. 71
4.2.9. CHUÂN BỊ DUNG DỊCH ENZIM ĐẺ XÁC ĐỊNH HOẠT Đ ộ x ú c TÁC.............72
4.3.THỤ'C HÀNH................................................................................................................72
4.3.1. ENZIM PROTEOLITIC............................................................................................ 73
4.3.2. KIỂM TRA HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHÊ PHÂM ENZIM A M ILA 2A TRONG
CÔNG NGHIỆP........ ;........^................................................................................................80
4.3.3. XÁC ĐỊNH HOẠT L ự c ENZIM XENLULAZA.................................................. 94
4.3.4. ENZIM C A T A L A Z A .................................................................................................98
4.3.5. ENZIM PEROXIDAZA............................................................................................ 99
4.3.6. ENZIM L IP A Z A ...................................................................................................... 102
4.3.7 XÁC ĐỊNH HOẠT L ự c ENZ1M TRONG NÂM MEN BÁNH M Ì ........................ 105
CHƯƠNG 5. G L U X IT ..................................................................................................................... 111

5.1. ĐỊNH LƯỢNG GLUXIT BẤNG PHƯƠNG PHÁP s o M À U ....................................111

5.1.1. N G U Y Ê N T Ấ C s o M À U ........................................................................................................... 111

5.1.2. XÁC ĐỊNH CÁC HEXOZA BẢNG PHƯƠNG PHÁP s o M À U ................................. 115

5.2. XÁC ĐỊNH BẤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN c ự c ..................................................117

5.2.1. NGUYÊN T Ấ C ........................................................................................................ 117
5.2.2. THỰC H ÀN H ........................................................................................................... 119
5.3. PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC.......................................................................................125
5.3.1. CHUÂN BỊ NGUYÊN LIỆU TRƯỚC KHI PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐƯỜNG.
................................................................................................................ .. ....... ... 125
5.3.2. T H Ụ t HÀNH............................................................................................................125
5.4. ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUXIT BẢNG PHƯƠNG PHÁP SẮC K Ý ........ 137
5.4.1. SẮC KÝ TRÊN G IÂ Y ..............................................................................................137
5.4.2. SẮC KÝ LỚP MỎNG............................................................................................... 141
5.4.3. SẮC KÝ CỘT............................................................................................................ 141
5.4.4. SẨC KÝ CHẮT LỎNG ÁP L ự c CAO (H P L C )..............................................................142
5.4.5. SẤC KÝ K H Ì.............................................................................................................142
5.5. XÁC ĐỊNH GLUXIT BẰNG PHƯƠNG PHÁP E N Z IM .......................................... 143
5.5.1. ĐỊNH LƯỢNG CÁC O ZA........................................................................................143
CHƯƠNG 6. LIPIT ........................................................................................................................149

6.1. GIỚI THIỆU...............................................................................................................149

6.1.1. THÀNH PHẦN VÀ TÍNH CHẨT CỦA DÂU M Ỡ ..................................................150
6 .1.2. CÔNG NGHỆ SÀN XUÁT DẢU THựC V Ậ T ........................................................ 153

6.1.3. KIẺM TRA CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT DÀU THựC V Ậ T ................................... 155
6.2. PHẦN T H ự C H À N H ................................................................................................ 160
6.2.1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẮT BÉO..................................................................160
6.2.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHÀN CHẤT BÉO................................................................ 164
6.2.3. XÁC ĐỊNH CHẨT LƯỢNG CHẤT BÉO................................................................177
6.3. KIÉM TRA CHÁT LƯỢNG DẢU BÉO SAU QUÁ TRÌNH CÔNG NGHỆ........... 183
CHƯƠNG 7. CHẤT THƠM .................................................................................................... 187

7.1.G1Ớ1 THIỆU................................................................................................................ 187

7.2. NHŨÌMG PHƯƠNG PHÁP CHIÊT CHẤT THƠM..............................................188
7.2.1. PHƯƠNG PHÁP KHÔNG GIAN ĐÀU (PHƯƠNG PHÁP HEAD-SPACE)..........188
7.2.2 PHƯƠNG PHÁP CHIÉT NHŨ^NG CHÁT BAY HƠI TRONG DUNG DỊCH BẰNG
CHU>JG CÁT..................................................................................................... ' ............ 190
7.2.3 PHƯƠNG PHÁP TRÍCH L Y .....................................................................................192
7.2.4. PHƯƠNG PHÁP LlKENS - NICKERSON..............................................................195
7.2.5. CÔ Đ Ặ C ................................................................................................................... 196

8
7.2.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN ĐOẠN VÀ NHẬN BIÉT.................................................197
7.3. PHẦN THỰC H À N H ................................................................................................. 199
CHƯƠNG 8. VITAMIN ..........................................................................................................205

8.1.GIƠ1 THIỆU............................................................................................................... 205

8.2. CAROTEN VÀ VITAM IN A ............................................................................ 206
8.3. N H Ó M V I T A M IN c , BI VÀ B 2 ................................................................................................211

CHƯƠNG 9. A L CAL OI T VÀ PHENOL 222

9.1. CÁC CHÁT A L C A L O IT ........................................................................................222
9.1.2. NGUYÊN TẮC VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIÊT ALCALOIT TÙ' THựC
V Ậ T ................................................................................................................................... 223
9.1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ALC ALO IT............................................. 224
9.1.4. PHÀN THỰC H À N H ..............................................................................................226
9.2. HỢP CHẤT PHENOL THựC V Ậ T ....................................................................... 232
9.2.1. VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA CÙA HỢP CHÂT PHENOL THựC V Ặ T ..................... 232
9.2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT PHENOL.................. 232
9.2.3. PHÀN THỰC H À N H ..............................................................................................233

CHƯƠNG 10. MỘT SỐ CHẤT v ô c ơ GÂY ĐỘC ....................................................241

10.1. U lố l THÌỆU..............................................................................................................241
10.2. THỰC H À N H ...........................................................................................................................245

10.3. XÁC ĐỊNH KIM LOẠI NẶNG BÀNG PHƯƠNG PHÁP c ự c PHÓ................... 264
10.3.1. KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP c ự c PHỔ..................................................... 264
10.3.2. NGUYÊN T Ắ C ....................................................................................................................264
10.3.3. CÁCH TIÊN HÀNH..............................................................................................265
10.3.4. CHUÂN BỊ DUNG DỊCH XÁC ĐỊNH................................................................. 266
CHƯƠNG 11. T ỔN D ư VÀ NHIÊM TẠP ĐỘC T ố ....................................................... 271
11.1.GIỔl TH IỆU ..............................................................................................................271
11.2. D ư LƯỢNG THUÓC BẢO VỆ THựC VẬT...................................................271
11.2.1. GIỚI TH IỆ U ...........................................................................................................271
11.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍC H ............................................................................. 272
11.2.3. THỰC H ÀN H........................................................................................................ 275
11.3. CHÁT KÍCH THÍCH TÃNG TRƯỜNG................................................................ 277
11.3.1. GIỚI TH IỆU........................................................................................................... 277
11.3.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN T ÍC H .............................................................................. 277
11.3.3. THỰC HÀNH......................................................................................................... 277
11.4. CHẤT KHÁNG SINH...............................................................................................279
11.4.1. G iớ i TH IỆU...........................................................................................................279
11.4.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN T ÍC H ..............................................................................280
11.4.3. THỰC HÀNH......................................................................................................... 282
11.5. CHẤT DIỆT KH U ÂN ............................................................................................... 285
11.5.1. GIỚI TH IỆU ................................................................................................ ' ....... 285
11.5.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN T ÍC H .............................................................................. 285
11.5.3. THỰC HÀNH......................................................................................................... 288
11.6. ĐỘC TÓ VI N Á M ..................................................................................................... 293
11.6.1. GIỚI TH IỆU ........................................................................................................... 293
11.6.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN T ÍC H .............................................................................. 293
11.6.3. THỰC HÀNH......................................................................................................... 297
11.7. MỘT SÓ THÀNH PHÂN K H Á C ..............................................................................301
11.7.1. GIÓI TH IỆU........................................................................................................... 301
11.7.2. CHÁT 3-MCPD VÀ M E LA M IN ........................................................................... 302
11.7.3. NITRIT, NITRAT VÀ SO2.....................................................................................302
11.7.4. THỰC HÀNH.........................................................................................................306
TÀI LIỆU T HA M KHẢO .........................................................................................................321

10
 Chươỉìg 1

GIỚI THIỆU

Thực phẩm là sản phẩm có nguồn gốc từ động, thực vật mà con người dùng
để ăn, uống cho nhu cầu sống, vận động và phát triến của cơ thể. Thực phẩm là loại
sản phẩm phố biến nhất liên quan đến hoạt động sống của con người. Hầu hết các
đồ ãn, đổ uống mà con người sử dụng đều có thể gọi là thực phẩm.

Thực phẩm có những thuộc tính đặc Irưng về mặt lý học, hoá học, hoá lý, hoá
sinh, sinh học và cảm quan. Hầu hết các đặc tính này có nguồn gốc từ nguyên liệu
chế biến nhưng cũng có thể được bổ sung vào hay sinh ra hoặc bị nhiễm trong quá
trình trổng trọt, chăn nuôi, chế biến. Ngoài ihành phần dinh dirỡng và một số thành
phần đặc trưng của sản phẩm, các thành phần bổ sung với mục đích lạo cấu trúc và
lính chất cảm quan, thì một số thành phần hóa học bị nhiễm vào thườiig là ỉdìông
mong muốn. V ì vậy việc phân tích toàn diện các ihành phần hóa học và phụ gia
llìực phẩm là rất quan trọng để đánh giá chất lượng một sản phẩm. Quá trình phân
lích này được thực hiện nghiêm ngặt lừ khâu nguyên ỉiệu đến quá trình chế biến,
bảo quản và phân phối sản phẩm tới lay người tiêu (lùng.

Tất cả các Ihuộc tính lý, hoá, sinh của các thành phần thực phấm đều có thế
do được, biểu diễn đirợc dưới dạng các thông số cụ thế. Việc phân tích, đo đạc và
định lượng các ihành phần hóa học thực phấm ngày càng được chú trọng để đảm
bảo chất lượng sản phẩm hoặc nghiên cứu và tạo sản phẩm mới. Cùng với sự phát
triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, các phương pháp phân lích ngày càng
phát triển hơn, hiện đại hơn và có độ chính xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc
kiểm tra chất lượiig và quản lý sản xuất.

11
1.1. MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THỰC PHẨM

Trong khuôn khổ cùa cuốn giáo trình này, chúng tôi giới thiệu các phương
pháp phân tích thôiig dụng để phân tích một sô' thành phần hóa học trong thực
phẩm.

1.1.1 NƯỚC

Nước là thành phần quan trọng trong lioạt động sống của lế bào động và thực
vật. K hi đã được sơ chế hoặc chế biến thành sản phẩm thực phấm. tùy loại thực
phẩm mà hàm lượng nước rất khác nhau. Ngũ cốc từ 10 - 20%, th ịt từ 60 - 70%, rau
quả từ 80 - 95%. Nước không cung cấp năng lượng nhưng giữ vai trò ổn định hàm
lượng nước, ổn định cấu trúc đặc trưng của sản phẩm. Trong thirc phẩm nước ở
dạng liên kết và dạng tự do. Nước tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển và làm
hỏng thực phẩm vì vậy xác định hàm lượng và hoạt độ của nước trong thực phẩm là
rất quan trọng.

1.1.2. THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CỦA THựC PHẨM

Thành phẩn dinh dưỡng trong thực phẩm là các chất trực tiếp tham gia vào sự
sinh trường, phát triển của cơ thế’ và sinh năng lượng trong quá trình tiêu hóa. Con
người tồn tại và phát triển nhờ các chất dinh dưỡng. Các chất dinh dưỡng bao gồm:

• Protein

Protein là thành phần chính cùa thực phẩm nguồn gốc động vật như thịt, cá,
trứng và mộl số thực vật như các loại đậu. l ’heo mức tiêu thụ thực phẩm thông
thường, prolein cung cấp khoảng 10-15% năng lượng. Năng lượng do Ig protein
cung cấp khoảng 4,0 kcal. về cấu tạo, protein là các polime phân tử lớn chủ yếu
bao gồm các axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit. K hối lượng phân tử của
Protein khoảng từ hơn mười nghìn đến hàng trăm nghìn dalton hoặc lớn hơn nữa.
Các phân tử này có dạng hình cầu hoặc dạng hình sợi. Hai dạng phân tử này có
một số tính chất khác nhau, trong đó dạng hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch
muối loãng, rất hoạt động về mặt hoá học, hầu hết nhóm này có hoạt tính xúc tác -
hoạt tính enzim. M ỗi enzim có khả năng xúc tác cho một số phản ứng nhất định.

12
Hoạt động xúc tác cùa enzim được tính thông qua tốc độ chuyên hoá của cơ chất
hoặc tốc độ tích tụ sản phẩm tạo thành. Bàng 1.2a cho hàm lượng protein trong một
số loại thực phẩm.

Báng 1.2a. Hàm lượng protein trong một số thực phẩm

Nhóm thịt, cá, sữa Hàm lượng (%; Nhóm đậu, lương thực Hàm lượng (%)
Thịt bò 21 Đậu tương 36,8
Thịt gà 20 Lạc 24,3
Thịt lợn 1 8 -2 2 Đậu xanh 22
Gan bò 22 Đậu Hà Lan 21,6
Gan lợn 19,8 Bột mì 7 ,8 -8
Cá 1 7 -2 0 Ngô 8 .0 - 10
Trứng 1 3 -1 4 ,8 Gạo nếp 8,2
Sữa bò 3 ,5 - 3 ,9 Gao tẻ 7.6

• G luxit
G lu xit là một trong những thành phần chính trong thực phẩm nguồn gốc thực
vật, thường tồn tại ở dạng monosacarit và polysacarit. G luxit chiếm tới 80-88% chất
khô và là thành phần dinh dưỡng quan trọng và chủ yếu trong khẩu phần ăn. G luxit
cung cấp khoảng 65-70% năng lượng trong khấu phần ăn thông thường, nảng lượng
cung cấp từ Ig là 4 kcal.

G luxit được cấu tạo từ các nguyên tử c, H, o. Các monosacaril (đường đơn)
dễ tan trong nước, có vị ngọl. Bảng 1.2b cho hàm lượng g lu xit trong một số thực
phẩm quan trọng.

Bảng 1.2b. Hàm lượng gluxit tổng số trong một số thực phẩm

Nhóm lương thực Hàm lượng (%) Nhóm đậu, quả Hàm lượng (%)

Gạo nếp 74,9 Đậu Hà Lan 50,0

Gạo tẻ 76,2 Đậu côve 45,0
Ngô 70,0 Đậu xanh 35,6
Sắn tươi 36,4 Chuối tiêu 22,4
Khoai lang 28,5 Gấc 10,5

• L ip it
L ip it hay còn gọi là chất béo là thành phần chính của mỡ động vật, dầu thực
vật và có nhiều trong m ộl số thực phẩm nlur thịt, trứng, sữa, phomat. L ip it là thành

13
phần có giá trị dinh dưỡng cao vì là thức ăn giàu năng lượng, năng lượng cung cấp
bởi một đơn vị khối lượng chất béo lớn gần gấp 2 lần m ộl đơn vị khối lượng tương
đương cỉia g liix it và protein. Ig lip it có thể cung cấp 9 kcal trong khi Ig protein
hoặc Ig g luxit chi cho 4 kcal. về cấu trúc hóa học lip it là hỗn hợp các ester của của
glycerin và các axit béo. Hàm lượng lip it trong một số thực phẩm cho trong bảng
1 .2 c.

Bảng 1.2c. Hàm lượng lipit trong một số thực phẩm

Thịt, cá, sữa Hàm lương % Hat dầu và đâu Hàm lương %
Thịt lợn 21.5 Hướng dương 6 4 ,3 -6 6 ,5
Trứng gà 11.6 Cùi dừa 6 2 ,9 -7 4 ,0
Thịt gà 7.5 Lạc nhân 4 0 ,2 -6 0 ,7
Sữa bò tươi 4,4 Đậu tương 23,5
Thịt bò 3.8 Đậu côve 1,7
Gan lợn 3.6 Đậu Hà Lan 1,3
Cá chép 3.6 Đàu xanh 1,0

1.1.3. CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC KHÁC

• Chất thơm
Chấl thơm là một tổ hợp các chất hóa học có trong sản phẩm thực phẩm, khi
bay hơi thì làm cho khứu giác cảm nhận được mùi. Các chất hóa học đó bao gồm
các hợp chất amin, các hợp chất dị vòng, cacbuahydro, tecpen, rượu, aldehyt, xeton.
Những chất thơm đóng vai trò chủ yếu trong đánh giá chất lượng cảm quan thực
phẩm, chúng có nguồn gốc từ nguyên liệu hoặc sinh ra trong quá trình chế biến
thực phám và cho phép xác định mùi đặc trưng của sản phẩm.

• Vitam in

Vitam in là một nhóm chất hữu cơ có phân tử tương đối nhỏ, rất cần cho cơ
thể sống và sinh trưởng ở liều lượng rất nhỏ. Trong cơ thể, vitam in đóng vai trò như
những chất xúc tác sinh học. Đặc trưng cùa vitam in là không thể thay thế lần nhau
và năng lượng cung cấp bởi vitam in hầu như không đáng kể. Các vitannin có cấu
trúc và tính chất rất khác nhau. Người ta phân vitam in thành hai nhóm, nhóm tan
trong nước và nhóm tan trong chất béo. Vitam in có nhiều trong các loại thịt, cá,
trứng, sữa, lương thực, rau và hoa quả. Hàm lượng một sô' vitam in trong thực phẩm
cho trong bảng 1.3.

14
 Báng 1.3. Hàm lượng vitamin trong một số thực phẩm

Hàm lương vitamin (mg%)

Thực phẩm
Caroten B. B. pp
Thịt lợn 0 0,01 0,53 0,16 2,7 1
Gan lợn 6,0 0,4 2,11 16,2 18
Gan vịt 2,96 0.44 1,28 9,1 7
Trứng gà 0,70 0,16 0,31 0,2 0
Gạo tẻ 0 0,12 0,04 1,9
Gạo nếp 0 J4 0,06 2,4
Cà chua 2,00 0,06 0,04 0,5 40
Cải sen 0,30 0,05 0,10 0,8 51
Đậu xanh 0,06 0,72 0,15 24 4
Hành lá 6,00 0,03 0,10 1,0 60
Cam 0,30 0,08 0,03 0,2 40
Đu đủ chín 1,5 0,02 0,02 54

• A lca lo it và phenol
Hợp chất alcaloit và phenol là các chất kích thích có nhiều trong chè, cà phê,
cacao, côca và thuốc lá. Tính chất đặc trưng cúa hai nhóm chất này là tính kích
thích hệ thần kinh trung ưcoig, ảnh hưởng đến hoạt động của hệ tuần hoàn và hệ hô
hấp.

- Trong phân tử của hợp chất alcaloit có nhân dị vòng, có chứa nitơ và có
mùi, vị đặc trưng. K h i dùng thực pliấm có chứa alcaloit, hệ thần kinh bị kích thích
mạnh, tăng cường hoạt động cỉia tim, của các cơ bắp và lăng cường sự hô hấp.

- Phenol thực vật là một nhóm hợp chất hữu cơ có màu sắc, m ùi, vị đặc trưiig
cho sản phẩm. V ị đắng của hợp chất phenol trong một số sản phẩm có tác dụng
nâng cao giá trị cho sản phẩm. Trong quá trình chế biến hợp chất phenol biến đổi
tạo màu đặc trưng cho một sổ sản phẩm.

• Chất khoáng

Trong thực phẩm, chất khoáng có hàm lượng không lớn nhưng có vai Irò
quan trọng tham gia vào thành phần cấu tạo của một số chất hữu cơ. Trong sô' nhiều
chất khoáng có thể kể đến một số cliất sau:

15
 - Natri là một nguyên tố quan trọng trong xây dựiig cơ thế và chuyển hoá
nhưng hầu hết thực phấm tiêu thụ ở dạng tự nhiên đều chứa rất ít natri (bột, quả,
rau, thịt, cá). Những thực phám đã qua chế biến lại chứa rất nhiều natri vì được bố
sung muối ăn vào trong quá trình chế biến như bánh m ỳ, phomat, giăm bông.

- K ali có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm. Thực phẩm chứa nhiều Na
và K là bánh mì, thịt, sữa, khoai tây, cà chua.

- M a n g ie có nh iề u trong thực p h ẩ m Iiguồn g ố c thực vật n h ư cacao, ngũ

cốc.

- Canxi là chất khoáng có tỷ lệ cao nhất trong cơ thể.

Ngoài các chất vô cơ ở mức đa lượng trên đây trong thực phấm còn chứa
một số chất vô cơ ở mức vi lượng nhimg rất cần thiết cho hoạt động của cơ thể. Các
chất này giúp cho cơ thế có sức khoẻ tốt. Trong khẩu phần thức ăn hàng ngày
thường chứa đù nhóm chất vi lượng. Trong sô' những chất vi lượng quan trọng có
thể kể đến kẽm, đồng, mangan, molipden, iod, flo, kể cả asen, bor và vanadi...

1.1.4. MỘT SỐ THÀNH PHẦN GÃY NGỘ ĐỘC THựC PHẨM

Ngoài những thành phần hóa học cơ bản nêu trên tham gia vào việc cấu
thành nên cấu trúc và đặc trưng của từng loại thực phám, còn có những thành phần
khác không tham gia cấu thành đặc trưng của thực phẩm. Những thành phần này
được tích lũy trong quá trình trồng trọt, chăn nuôi, chế biến, bổ sung và bảo quản,
có khả năng gây độc hại cho con người còn có tồn dư trong sản phẩm trước khi tiêu
thụ. Các thành phần dó là:

• Chất vô cơ gây độc

M ột sô' chất sau đây có trong thực phẩm có thể gây độc cho cơ thể, đó là các
kim loại nặng như; đồng, chì, kẽm, thiếc, các hợp chất chứa asen, các hợp chất chứa
flo ... Nguồn gốc của các chất này có thể do nhiễm tạp từ nguyên liệu khi trổng trọt,
chăn nuôi, do bao bì bảo quản hoặc các thiết bị sản xuất nhiễm vào thực phẩm. Khi
ăn phải các sản phấm chứa chất độc sẽ có triệu chứng nôn mửa, nhức đầu, rối loạn
liêu hoá có thể dẫn đến tử vong.

16
 • Độc lố tự nhiên

lYong thức ăn tự nhiên vốn có các chất gây bệnh mạnh hoặc kinh niên. Mạc
dù người la dán dan đã biết loại irừ những thức ãn có hại. Điểu (ló là do sự tiêu íhụ
với sớ lượng lớn và khồng chọn lọc. Ví dụ khoai làv vốn có nhiéu salanin lạp Iriiii”
ớ \'ỏ củ (cM iig-sê-gây-ta-etóng nliiíc-dáu, tiêu chảy,-aúa là sòì, rối
loạn thán kinh hôn mè và đờ đản). Có một vài loại thức ăn mang đến nậi loạn, hôii
mê như cà độc dược hoặc m ộl sô' loài cá độc. Bảng l A cho ví dụ về các ihực phám
có nguy^cơgây độc. ;
I
B áng 1.4. Một số ioại độc tố tự nhiên trong thực phẩm

Thực phẩm Độc tố Thực phẩm Độc tố 1

Cây họ cải Thiocyanat Sắn Cyanit [

Bắp cải Glucosilonat Chuối HemaggỊutinin
Khoai tây xanh Solanin Các loại rau khác HydroxỊáryptamin
Đâu tằm Vicin catécholBnin

• Thuốc trừ sâu và kháng sinh j

f

l ồện nay lượng thuốc trìr sâu, diệt cỏ, diệt côn trùng dùng irong năng nghiệp
rất lớn. Mặc dù đã thực hiện những quy trình đảm bảo an toàn trong caiệh tác nông
nghiệp ohưng ch ỉ có thể giảm thiểu lượng tồn dir trong sản phẩm Iih^ng đôi khi
lượng tổn dư này vẫn ở mức cao hơn cho phép. Vì vậy phải thường xuyOn kiểm tra
để kiểmfS0 át nghiêm ngặt lượng tồn dư ihuốc trừ sâu, diệt cỏ này.

'I rong chãn nuôi gia súc, gia cầm và nuôi thà thủy sản, việc s ử iụ n g kháng
sinh trị bệnh cho vật nuôi là không thể tránh khỏi. Nhimg việc sử dụng không phù
hợp, để lại lượng tồn dư lớn kháng sinh sẽ gây ra nlũmg nguy cơ tạo ệi các mầm
bệnh ở agười. Ngoài ra lượng kháng sinh tồn dư trong nguyên liệu cònịánli hưởng
clến một sô' quá trình chế biến tiếp theo. V'i vậy xác dịnh lượng tổn dư iTÌ iy cũng rất
cđii tliiê ị

• Thoốc k íd i thích tăng trưởng

'rhuốc kích thích tâng trường đang được sử dụng khá phổ biến thông qua việc
trộn vào thức ăn chăn nuôi đế làm tăng trọng cho vật nuôi nhanh chóng. Khi dùng
thuốc tàng trọng, vật nuôi chóng lớn, nhanh đưa vào giết, mổ và chế biến nên thuốc

17
tăng trưởng chưa kịp phân hủy, lượng tồn dư tuy rất nhỏ nhưng cũng sẽ ảnh hưởng
rất lớn tới sức khỏe khi liêu dùng.

• Độc tô' sinh học

Các độc tố sinh học do nhiễm khuẩn, nhiễm virut, nhiễm nấm trong ihực
phẩm gây ra những hậu quả khôn lường cho người tiêu dùng. Do vậy việc phân tích
và kiểm soát các thành phần độc tố này cũng là một trong những nhiệm vụ quan
trọng của công tác đảm bảo chất lượng và vệ sinh an toàn cho sản phẩm thực phẩm.

• Các loại độc tố khác

Các độc tô' trong thực phẩm còn có nguyên nhân từ phụ gia như phụ gia tạo
màu, tạo vị, các chất bảo quản, các chất tẩy trắng, tẩy rửa, diệt khuẩn, đặc biệt là
các chất sinh ra trong quá trình chế biến hoặc các chất bổ sung để cải thiện một tính
chất nào đó nhưng lại có tính độc (như 3-MCPD, melamin).

1.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC THỰC PHẨM

Lấy mẫu và lựa chọn quy trình phân tích là quan trọng nhất trong phân tích
thực phẩm. Quy trình phân tích thường được tiến hành như sau: lấy mẫu (thu thập,
bảo quản), xử lý mẫu (chiết, làm giàu, tách và làm sạch), phân tích định tính
và/hoặc định lượng (sử dụng các kỹ thuật khác nhau như sắc ký, phổ).

1.2.1. LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU

Bước đầu tiên trong phân tích thực phẩm là lấy mẫu. Mẫu được lấy ngẫu
nhiên hoặc theo hệ thống sao cho mẫu mang lính đại diện, không bị nhiễm bẩn và
được xử lý hợp lý nhằm Ihu được kết quả phàn tích ý nghĩa. Đối với mỗi loại sản
phẩm tùy thuộc vào đặc tính riêng biệt mà có các quy định cho việc lấy mẫu khác
nhau. Lấy mẫu nói chung thường nhằm các mục đích sau;

Kiểm tra quá trình sản xuất

Kiểm tra nghiệm thu

Xác định đặc trưng của lô

18
 Để tiến hành các phép thừ

Đánh giá thị trường

Trong các phân tích với mục đích quản lý chất lượiig thực phẩm, phương
pháp lấy mẫu đúng yêu cầu có kế hoạch cụ thể về địa điểm lấy mẫu, vị trí lấy mẫu
và các kỹ thuật lấy mẫu phù hợp với tính chất của sản phẩm.

Địa điểm lấy mẫu: lấy mẫu tại nơi bảo quản, bốc dỡ hay vận chuyển,
tại từng điểm (hoặc sau lừiig thiết bị) trong quá trình sản xuất, tại các
điểm nhập nguyên liệu và xuất thành phẩm.

Kiểm tra sơ bộ lô sản phẩm: kiểm tra sơ bộ tính đồng nhất của lô
hàng.

V ị trí lấy mẫu: lấy ngẫu nhiên nhưng cần làm sạch để sản phẩm lấy ra
không bị dây bẩn.

Dụng cụ lấy mẫu: đối với các loại sản phẩm khác nhau, hình dáng của
các loại dụng cụ lấy mẫu cũng khác nhau và dựa vào các liêu chuẩn
phù hợp cho từng loại sản phẩm riêng biệt.

Các dạng lấy mẫu: tùy theo loại mặt hàng mà quy định lấy mẫu sao
cho phù hợp, dễ đại diện, dễ phân tích như mảu là chất rắn, chấí lỏng
hoặc chấl khí.

Mẫu không phân lích ngay cần được bảo quản để tránh phân hủy trong điều
kiện nhiệl độ, độ ẩm, oxy và ánh sáng thích hợp. M ột cách bảo quản đơn giản là
mẫu được đựng trong hộp kín và giữ trong tủ lạnh. Dụng cụ chứa mẫu phải khô, tiệt
trùng và không dễ vỡ.

1.2.2. XỬ LÝ MẪU

Mẫu thực phẩm thường được chiết, tách hoặc cô đạc trước khi phân tích. Vì
mẫu Ihực phẩm có thành phần phức tạp, chứa rất nhiều chất khác nhau và không
đồng nhất. Mặt khác, hàm lượng chất phân tích đôi khi quá thấp hoặc không phù
hợp với phân tích trực tiếp nên phải loại bỏ các thành phần có khả nàng ảnh hưởng
tới kết quả. V ì vậy, mẫu cần phải phân lập, tách và làm giàu các hợp phần mẫu cần

19
phân lích. Cần lưu ý tránh nhiềin bẩiì hoặc thav đổi thành phầii máu trong SUỐI quá
trình xử lý và bảo quản lĩìáii, nhất là troĩig trưởng hợp pliân tích hrựng vcì. Các bước
xử lý phổ biến bao gồm: chưng câì, lọc, và kết tủa. Nlìữns mầu phức lạp cần plìãi
được dông hóa, Iighicn hoặc xử lý bằng các phương pháp khác nliaii như: phá mầu,
lọc qua màim lọc, sử dụng chất hấp phụ (trích ly pha rắn), không gian đầu
(headspacẹ).

1.24 LỰA CHỌN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH

K ỹ thuật phản tích được lựa chọn dựa trên những tiêu chí sau:
I

klìa nảng liến hành phân tích: cỡ inẫu, hóa chất, ihiếl bị, giá thành,
trạng thái cuối cùng của mảu:

các yêu cầu cơ bản: độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát
hiện, độ lạp lại;
I

-i thao tác; an toàn, đơn giản, riít ngắn thời gian phân tích;

-| tình trạng kỹ thuật: phương pháp chính thức, phương pháp ^hòiig thí
nghiệm.

Các phương pháp chính thức đã được phát triển và nghiên cứu hoàn thiện đê
so sánh giỊía các phòng ih í nghiệm. Các phương pháp chính thức bao gồm các
phương phập tiêu chuán như TC VN , ISO, A O A C , A A C C , và AOCS. Tuy nhiên
nhiổu kỹ thuậi phan tích không phải là các phương pháp tiêu chuẩn vì khá mới và
không áp cỊụng được cho một sô' mẫu nhất định. Trong nhữiig trường hợp này, các
phương phitp phòng thí nghiệm có thể đirợc sử dụng nếu như đã qua kiểm định
1

1 .2 .4. ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH

I

G íc jphircfng pháp phân tích truyền thống như phân tích trọng lirợiig và hóa
học vẩn đ ifỊjt sử dụng trong các phân tích thực phẩm. Tuy nhiên khi phân tích các
hợp chất V(Ề hàm jirợng thấp và cần độ chính xác cao thì các phương pháp ịỊhân tích
bằng công cụ ngày càng chiếm ưu thế. Có nhiều kỹ thuật phân tích thực phấm dựa
trên nguyên lý sắc ký, quang phổ, vật lý và sinh học.

20
 1.2,4.ỉ . Các phuơtỉg pháp phán Ííclì hóa học

Nhóm các phương pháp hỏa học chủ yếu clựa trên các pluiiì ứng hóa học và
những dụng cụ thiết bị đơn gián đế phán tích các chất. Các phương pháp này ra dời
sớm, thường được dùng đế xác dịnh nhimg lượng lớn, iượng vừa và lượng không
quá nhỏ ệẩc chất.

LẬÂ.2, Các kỹ thuật p h ổ

1 ;
• ựv, V iSy huỳnh quang

PhÌỐ cực tím và ánh sáng trông thấy hấp thụ bức xạ và được sử^ụng trong
phòng thjf nghiệm từ nhiều năm nay. Các cấu tử cẩn phân tích trong mẫu lịhực phấin
hấp thụ cíực tím (Ư V ) và ánh sáng trông thấy (Vis) có thể được phân tícỊi tại bước
sóng đặcĩ trưiig trong quang phổ khi không có các chất ảnh hưỏìig. pịìổ huỳnh
quang lìl^ạy hơn phổ UVA^is. Nhiều phân tử hĩai cơ huỳnh quang, bặo gồm vi
khuẩn văị một số dư lượng thuốc bảo vệ thực vật tạo ra phổ huỳnh quang và dây là
cơ sở để phắt hiện chất tạp nhiễm trong thực phẩm. Ị
[
• ữ ồ n g ngoại (infrared)

Nhiều nhóm phân tử hấp thụ ánh sánghồngngoại tại bước sónậ xácđịnh
trong dải hồng ngoại với vùng bước sóng đặc trưiig đần tới khả năng xáệđịnh hợp
chất. K ỹ thuật này đã được phát triển trong nhiều nãm và m ở rộng ứng ểụng trong
những nđm gần đây. Phương pháp phd hồng ngoại FTIR được sử dụngỊtrong dáy
chuyền sản xuất để xác định hàm lượng chất béo, protein, độ ẩm. Đây phương
pháp trực tuyến có ưu điểm lớn so với các kỹ thuật khác vì khống phải xử lý hoặc
phá mẫu trước khi phân tích. <
1

• Phố hấp thụ nguyên tử \

Qiiang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) dựa trên sự hấp thụ bức xạ llV - V is bởi
các hợp Bhất vô cơ đã được nguyên tử hóa, trong đó phổ phát xạ (A E ^) sử dụng
phát xạ Ặ a bức xạ mầu. Mẫu được tro hóa, hòa tan trong nước hoặc axit ịoãng, làm
bay hơi. Trorig ẤAS, mẫu được ngiiyẽn tử hóa bằng nebulizer Hoặc bang lò nung.
Kỹ thuật này được áp dụng để phân tích các hợp chất vô cơ có trong mầu thực
phấm.

21
 • P h ổ khối (MS) 9-

Nguyên tắc của khối phổ là các phân lử đã được ion hóa sẽ phân mảnh thành
các mảnh có cấu trúc khác nhau có thể tách bằng tỷ số giữa khối lượng và điện tích
của chúng (m/z) trên cơ sở từ trường hoặc điện trường. Gác ion có thể tạo ra bằng
cách thêm hay bớt điện tích của chúng (loại bò electron, proton hóa...). Sau đó
chúng được tách theo tỷ số m/z và được phát hiện khi chuyển thành các tín hiệu
điện, từ đó có thể cung cấp thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp
chất,

L 2 .4 3 . Sắc ký

Sắc ký ỉà kỹ thuật tách, phân ly và phân tích các chất dựa vào sự phân bố
khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩiìh. K h i tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hổn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chấl của
chúng (tính hấp phụ, tính tan...). Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha
động mới chuyển động dọc theo hẹ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác
nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ
sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp
phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động
chậm hcrn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ
đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá írình sắc ký.

Các kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng rãi trong phân tích thực phẩm là sắc
ký khí (gas-chromatography, GC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (high períormance
liquid chromalography, HPLC). Chúng đóng vai trò phân tách để chuẩn bị cho quá
irình phân tích khi được kết nối với một thiết bị khác như khối phổ (mass
spectrometry, MS). Sắc ký khí được ứng dụng trong phân lích các chất bay hơi hoặc
bền nhiệt, phù hợp với phân tích các hợp chấl khồng phân cực. Tuy nhiên có thể
dẫn xuất hóa các hợp chất phân cực trước khi đưa vào phân tích bằng sắc ký khí.
Ngược lại HPLC phù hợp với các phân tích axit amin, peptid, đường và vitamin.

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Ngày nay, HPLC là thiết bị phân lích thực phẩm phổ biến nhất trong sô' các
kỹ thuật phân tích hiện đại. HPLC được dùng trong phân tích các cấu tử thực phẩm

22
không bay hơi. Việc phân tích định lích thường được kiểm dịnh Iihờ chất chuẩn
theo thủ tục tiến hành song song; phân tích định lượng thường được liến hành theo
thủ tục cùa phương pháp đường chuẩn với việc đo chiểu cao hoặc diện tích pic sắc
ký. Dựa vào tính chất của pha tĩnh và dung mối, người ta chia ra HPLC thuận pha
và HPLC đảo pha. H PLC thuận pha có pha tĩnh là chất hấp phụ phân cực, pha động
là dung môi không phân cực. HPLC đảo pha được sử dụng phổ biến hơn với pha
tĩnh là không phân cực, pha động là dung môi phân cực như nước hoặc hỗn hợp
nước-dung m ôi hữu cơ, ví dụ hỗn hợp nước-rượu, nước-acetonitryl, nước-
tetrạhidroíuran.

Để tăng khả năng tách các chất trong hỗn hợp người ta dùng chương trình
gradient với tỷ lệ dung m ôi pha động đirợc thay đổi trong quá trình phân tích. V í
dụ, đối với trường hợp pha động là hỗn hợp nước-methanol, quá trình phân tích
bằng HPLC thường bắt đầu với 5% methanol, và tăng tuyến tính tới 50% methanol
trong 25 phút. Chương trình gradient phụ thuộc và mức độ kỵ nước cỉia chất phân
tích, giúp tách hỗn hợp theo ái lực tương đối của chất với thành phần pha động và
pha tĩnh. K h i dùng chircfng trình nồng độ của hỗn hợp dung môi methanol và nước,
các thành phần kỵ nước sẽ thoát ra trước khi dung môi chủ yếu là methanol (pha
động kỵ nước). Thành phần ưa nước hơn sẽ thoát ra trong điều kiện ít
methanol/nhiều nước.

Việc chọn thành phẩn pha tĩnh, pha động, chương trình gradient rất quan
trọng và phụ thuộc vào bản chất của hỗn hợp chất cần phán tích. Để chọn được một
phưcmg pháp phân tích tối ưu, người ta tiến hành nhiều các thí nghiệm với các điều
kiện khác nhau để chọn ra được điều kiện phân tích có khả nãng tách tốt nhất.

• Sắc ký k h í (GC)

Trong sắc ký khí pha động là chất khí hoặc hơi có nhiệm vụ đưa các phân tử
chất phân tích đi qua cột. Các chất khí sử dụng là khí hydro, nitrogen, helium,
argon. Việc chọn khí mang cần để ý đến detector sử dụng, độ tinh khiết của khí
mang và yêu cầu tách, kỹ thuật kết nối khi phối hợp các phương thức khác. Khí
mang được dùng phải không được thay đổi trạng thái lý hóa học khi đi qua máy sắc
ký khí.

23
 Đõ chọn dược quy trình sác ký, cán pliải biết ngiión gôc và tliành phần của
mẫu. đó chọn dươc cột tách với pha tĩnh phù hợp sao clio có độ chọn lọc cao
nhíú, bềii nliiệt, dường kính và chiều dài cột tách tối ưu, chọn detector, k lií mang,
diều kliiếii nliiệl độ cột lách. Đê hạn cliếảnh hưởng của các chất khác trong mẫu tới
kết C|uá pluui4íckrtìguè(i giiUỉ dếii, chimg
cất. chiết 1'ặiig dung môi Iroiig xử lý mẫu trước khi phán tích. Ngoài rii^d ế tãng
hiệu quả lá^h các hợp chất có nhiệt độ bay hơi khác nhau trong một lán píián tích,
người ta diịng chircfng trình nhiệt độ. Phương pháp này có ưu điểm là rút njgán thời
gian phân I^ch và ổn dịnh chiều cao và chiềii rộng pic, có thể áp dụng dể Ịlịliân lích
các mầu hẹlp chất thiên nhiên phức tạp. Các chất sau khi được tách ni khỏỉ cột sắc
ký dược xái; định bằng detector. Hiện nay có gần 30 loại detector khác nhaịi, Iihinig
có 3 loại dttector phố biến nhất là: deteclor dẫn nhiệt (TCD), cietector ion fct')a ngọn
lửa (FID) vầ detector cộng kết điện tử (ECD). Ngoài ra khối phố (MS) đượcỊsử dụng
như một detector dùng trong phân tích định tính, định lượng và xác định pấu trúc
phân tử chắt phân tích. '

Phán tích định tính trong sắc ký khí chi cần pic không bị biến dạiịg nỉúều
nhằm xác cậnh chính xác đinh pic, còn trong phân tích định lượiig thì yẽuị cẩu đạt
cao hơn n h ịlđ ộ lặp lại, độ so sánh, dộ chính xác. Để đáp ứng được yêu cầaị dó, cần
phải dảm l^io sự ổn định đủ lớn các thông số của cietector, độ tuyến Ịính ciia
detector. Đ Ì nhận biết và xác định lượng vết thì độ nhạy của cietector đóiig vai trò
quyết định. !

K ỹ Ihuật sắc ký hoặc liên hợp sắc ký-khối phổ (GC-MS, GC-ịviS/MS,
G C /G C -M Í, LC-MS, LC-M S/M S) được phát triến rất nhanh và cho đến n«y đã trở
nên pliổ b iín irong phân tích thực phẩm. Trong những phần tiếp theo, c h íin | tôi nêu
những ứng ỉụng của kỹ thuật này trong phán tích thực phẩm trên phương diịộii kiểm
soát cliất litU ig thực phẩm và nghiên cứu thành phần hóa học cíia thực phẩid.

1.2.5 .X Ử L Ý SỐ LIỆU

Cho dù sử dụng những phương pháp lấy mẫu tiên tiến đến thế nào đi nữa ihì
mẫu không bao giờ đại diện tuyệt đối cho lô hàng. Mật khác, không bao g iờ chúng
ta có thể tiến hàiih một phép phân tích mà kết quả thu được lại hoàn loàn không

24
mắc sai số, mặc dù mọi cố gắng thực hiện các phép phân tích sao cho sai số nhỏ
nhất. Vì vậy trong phàn tích việc đánh giá các kêì quả là một trong những bước
không ihể ihiếii dược của các quá trinh phân tích.

Xử lý số liệu phân lích cho phép ta loại bỏ được các sai số của phép đo, phép
phân tícli Ịựà thu đ ư ợ c ^á ^ ket q^Liả với độ tin cậy cao. Các chuáa th ô n g ìê so sánh
thường d u ị^ sử dụng rất phổ biến. Hiện nay nhiều phần mềm tính toán đã góp phẩn
vào xứ lý t ố liệu với khối lượng lớn. Trong lài liệu này, tùy từng trường Bợp cụ thể
phần xứ 1) số liệu hoặc tính toán kết quả sẽ được đề cập phù hợp.

25
 Chương 2
NƯỚC

2.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ HÀM LƯỢNG Nước, HOẠT ĐỘ NƯÒC, ĐƯÒNG

đ Ẳ n g n h iê t h ấ p thu

'IVoiig các thực phấm hàm lượng nước rất khác nhau: 10 - 2 0 % trong ngD
coc, 60 - 10% irong thịt, 80 - 90% trong quả và rau tươi và 90 - 93% (rong Iiiiỉii aii.
Nư('íc không phai là hợp chất cung cấp năng liiợng mà ngirợc hũ nước làm cho lliựt-
kém châì lượng Irong thời gian bảo quản, do đó người ta ihườiìỊi lìiiĩi ^ iiiiĩi
liàm iượiig nirớc trong chúng đến mức tối đa.

'IVong thực plìám, nước thường ở dưới hai dạng:

- Nước lự do

- Nước liên kếl, là nước kliông cò n lính chất n h ư nước íự cU), vì c ác phán tứ
nia nó thrợc (líiili VÌU) các chrú cao phân lử bằng lực Vandervan vì\ biitiỊ^ C';ui liydro.
Nươc liên kc( Uiirờng niấl khả năng hoà tan (dung môi) và khòiig (lóng l)ãiig (V!
ỉiang lưựiig licn kôì giữa nước và phân tử các chấi khác cao lìơn nang lượng licn kốl
giữa các phân u’r nước với Iihau).

Các hợp phán như protein, g luxit...trong m ội thực phẩm cũng nlur trong một
(lung cỉỊch cỏ ihể iưưng tác với nước làm nó khó bốc hơi do dó mà sỏ' [)hân tử Iiirớc
ihoát ra tron g inội (lơn vị thời g ia n trên m ộ t d ơ n vị d iệ n líc h bc Iiìiii (llurc phãm

(limg tlịch) sẽ Iihỏ liơn so với nước nguyên chất và cân bằng :

l'hực phám (dung dịch) hơi

26
(lược thiết lậ|) ớ áp suất nhỏ hơn so với nước nguyên chất.

ỉ loại dộ mrức của một thực phẩm là tý lộ giữa áp siiâì riôiìg phan |) cúa liưi
ttưtK' trong mộí lliực pháin và áp siiấl riêng phẩn Pi) của hưi lurớc trong iur(Vc ngtiyCMi
t lial ớ cìing Iiliiẹl clộ
/ \

'ỈVoiig kliỗíig gian kín (khi thực phẩm có bao bì kín) cỏ mội dầng ihức giữa
hoat clộ mrớc: của một ihực phẩm và áp suất hơi nước gây ra bới ilụrc Ịiiỉáiii tló:

Độ ẩm iương đối cân bằng %

-
100

ỉ [oạl dộ nước của một thực phẩm đặt trong không kỉií sẽ bíUìỊ; (lộ áiii (ương
(!òi của không khí dó.

' 1’uy hiii ihiuig dó là lương tự nhau (độ ấm tương dối càn báng dược do lìr 0 -
còn a,, thì lừ 0 - 1 ) nhimg hai thông số này có ý nghĩa vạt lý kliác nlum. 1)(>
ÍHII UKíiig dối củii bằng là so với pha khí, còn lại có liên tỊuan với Ị)h a ngưng !II
c ua lurớc bị liấp ilìỊi bởi thực phẩm.

Ncu thừa nhạn hơi nước là khí với ý nghĩa dầy dủ lliì có ihC' coi Iroriịi niộl
Ihirc ị)ham raii hoặc trong một dung dịch là đổng nhất với tlộ ẩm urưiiị^ (lòi cùa khí
íỊuyèn vốn ciang ở Irạiig thái cân bằng với pha ngưng íụ, khi ú nu)l nlìiẹi độ nhiíl
(lịnỉi.

Nếu bicu diềiì bàng il 6 thị, với irục tung ghi llàĩTi lưựiig lurới' eũa tltực Ịìliáiu
(tínli hang g nước Irên lOOg chất khồ) trục hoành ghi Iiổng clộ liơi nước íỉiuig cAií
liaiig của khí íỊuycn đang cân bằng với sản phấni (dược tính bằng tlộ áni (irơiig (lối
lu)ạc h ã n g lioạt (.lộ iiư ớ c lì^ t r o n g ih ự c p h á m ) ihì đ ư ờ n g c o i i g lliLi cỉirợc' g ọ i là (iư ờ n g

ílaiig nhiệt h;íp (hụ và pliản liấp thụ (hình 2 . la)

27
 Hinh 2.1 a. Dường đảng nhiệt hấp thụ và phản hấp thụ của nước

Nliư vậy dường đáng nhiệl hấp Ihụ {và phản hấp íhụ) cho bict lạ i|iiiộ l Iihiệi
í!ọ lìlìài c^nh (k lii ờ trạng thái can băng) luợng nước dược giữ ỉxVi một Ihực pỉiãni
Lung nluráp suâì của khí nước do nước của một ihực piiám gây ra pliụ tliiióc vào
(. líc dộ ám kliác nhau.

Quịi (lườiiị: (iang nliiệt sẽ giúp cho ta:

1. l icn tloáiì dược hoại dộ nước trong hỗn hợp phức lạ|) (vi cỉụ inộl [ình-
pliani)

2. 'ffố iì cỉoán dược sự "đối xử" của một tlìực phẩm ưoỉìỊỊ c Ịiìa Irình g|a CỎIIO kỳ
lliiiaí c ũ i i l n h ư Iroỉig qiiá trình bá o qu ả n ở trong c á c k h í (Ịưycn c ó c!ộ âiiì í^liác nliau.

\ í ilụ: k lii lái ỉiydrat hoá mội sản phẩm dà sấy khô (khử mrớc) tlù Iliấy; CÙ11[^
IIIỌI liàni ỈLiơng Iiirớc, sán phain dà lái hydrat hoá cỏ hoại clộ IIƯÓX- cai) hơn sán
píiani dã khử nirớc một phđn, Iihàl là Irường hợp các quá và rau là nhứnu Ihực |)lK'ini
ịivdU (lường và muối.

2(S
 3. (loán dược ánh hiròng của nhiệt cỉộ (Ỉếỉì ỉioạt (lộ cùa mróv của niọ[
mau san ịìliain tUrợc hao gói kín (dộ ấm klìỏng dổi). Dỏ (làiiu nhạn lliãy ớ tlộ âm
khoiií: (lòi khi lioat (lộ lurớc lừ 0,4 - 0,5 neu lang nhiệl dộ sè ỉàiii laii^ lu)ạt dộ nước
( liin li 2.1 b), t)‘ lỉuạl tlộ IIước k h ỏ iig dổi, nêii laim Iihịệl dộ sõ k liử Iiưóv cuiỉ san p liiin i
\'ii iiỊíưtíc ụH,--"--- — — —— ---------------------------- - — - --------------------------------------------- --------------

■ Hình 2.1b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoẹi độ nước

i

1. 'I^ÔII (íi)iin (iược lượiìg uirớc bị hấp thụ bới Iiìột sái> phâin thạs," Lìmklio
\ a hin> ^ ú iỊiro iiịi lìiộ i bao IVi Ihấm dirực với hơi nước. I

s lỊièíì tloáii (lược dộ bổn cúa hàng hoá ihực phẩm. 'Hurc |)hain l Iì !l|)ón lO! <lii
klii chi coịlỚỊ) nước dơii Ị)hán nghĩa là khi có hoại độ nước từ 0,1 - 0,2. Ị
I ■ ■ Ị
I ■

2.2. Sự d Ầ N THIẾT PHẢI XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG N ư ớ c

• I • •

liiư ờng dối với m ọi sán pháin thực phám Irirớc tièn ngiiừi I;i cần pỈKÌi
liiò( iiàin lư ợ ii^ Iiirớc của chúng vl Iihững lý do sau:

29
 /. Yèn C(hỉ của câng nghệ: Muốn biết hàm lượng Iiước cic có (Ịiiyèi dịỉili vii
cỏ hiện pháp hợp ỉý về thu hoạch phơi sấy, bảo quản và chế biến công ngliiệp. 1 làm
l ư ợ i ì g n ư ớ c l à c h ỉ s ố c ẩ n l l i i ế t đ ể đ á n h g i á v à l à m c h ủ đ ư ợ c CÍÍC n g u y c ơ g â y lur

lnìiig irong Ihòi gian cất giữ thực phẩm.

2. y ẻ ỉ ỉ c à ỉi cùa việc dánh giá chất lượng: Muốn biêì cụ ihè hàni lirợiig miớc
(hay hàm áni) dể qui các kết quá phàn lích các mặt, các chí liêu vó inộỉ lơ sớ co
ilỊiili là chài khỏ hoặc hàm lượng nước chuẩn.

3. Yéit cáu của thương mại: Các hợp đồng mua và bán lliirờiig cỏ quy dịnli
giới liạii irôn của hàm luợng nước không cho phép trong mộl sản |)ỉuiínì.

4. Yeu cáu Cíia quy chê'. Vì lý do vệ sinh thục pham và Irung (liực lion^
Uiưiíiiị; m ạ i , Iigưừi la ll urừii g q u y đ ị n h h à m l ư ợ n g n ư ớ c g i ớ i hi\n l i o ạ c liiiMi lirợiU’

(.'hâl khỏ lối Ihicii cỉia một thực phẩm.

2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỈNH LƯỢNG NƯÓC VÀ HOẠT ĐỘ

NƯÓC TRONG THỰC PHẨM

2.3.1. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG N ư ớ c TUYỆT ĐÓI

DÓ là nliững phương pháp cho phép có một sự cân bàng íhực ỊAÌữa sán phãiii
và ỈỈÌỘI khí (Ịiiyếii có áp suất hơi nước bằng không. V ớ i các phương pluÍỊ) này eó ihc
gom:

Bài ỉ . Phưong phấp sấy mầu ở nhiệt độ vừa phải

Phương pháị) Iiày có Ihể dùng cho các ihực pháin tlạng ran. 'Hiường sny san
pliani Iioiig lììộl kiií quyển có độ ẩm tương đối bàng không. Nước liirực kéo ni kliói
mAii s;m pliẩiiì tlã dược nghiền nhỏ, để ở nhiệt độ vừa phải (5(y'c - 8 ()'’C’), (lưới á|) siiài
Ihá|ì, nliờ inộl tác nliân liúi ấm có khả nãng lạo ra được mội dộ áni Iiuyiig (lôi hiHig
kliổng ở trong lòiig. Việc cân bằng với khí quyển có áp suất hơi lìirớc bằiig khổng cỏ
tliể lìhận ra dirợc thông qua sự không thay đổi của khối lượng mẩu trong ahữiig giới
han xác đinh.

30
 'riurc lố có Ihế lạo ra áp suấí hơi nước bằng không bảng cíỉch (lùng những cliất
r;il hiu) nước như ỊXMitoxyt pholpho (P2OS), pecloral Mg khan lioặc rây phán lử. Ịỉai
c I k u s a u d c !MÌ siiili n l u n i g c ỏ n h ư ợ c d i ể m ỉ ìơn P 2OS ư c h ỏ k h ỏ i i g i h c ịihiíi lìiọn r;i ( l ư ợ f

h;uig nial giai doạn cuối tức là giai đoạn chúng trư lên vô hiệu cỊuâ. Ngoài ra với
cỏ ihc plìál hiện la clược vếí chất hrrii cơ mà khi có mặt sẽ tạo ra IIIỘÍ niìm lỉr vàng (Icn
lìAii (len.

Việc tạo ra ngay ban đầu một áp suất thấp mà không phải bơin liên lục sẽ Um
giam iigLiy C(í o x y hoá các chất và sẽ làm dể dàng cho sự di ch uyển các phân tử nước
lừ mẩu vật đốn chài liúl nước vốn được đặt Irực liếp với nó.

Khi gia Iihiộl sẽ làm lăng nhanh quá trình nhả nước lừ núu v;)(. 'lìiy Iiíiicn
lìliiọl (tộ tối cla ilurờng ở trong khoảng 45 - SƠ'C có khi dến 1()0“C liiỳ theo SÍIII j>hâni.

Với phương pháp này, người ta thườiig để mẫu vật và ở ỈKii nửa của một
óiig tliLiỷ linh pirex. Nửa chứa mẫu được đặt vào bộ phận hìnli irụ ihích liỢỊ) của tú
say, CÒIÌ nửa clặl bên ngoài tủ sấy ò nhiệt độ tlầựờiig, C(') vòi và khỏa luìl
c hĩin khổng khi bál (lầu sấy.

I^lurưng phíÍỊ) này cho kết quả rất tốt chi có nhược cliein là thời Cịuá tlài co
Ihổ clến 150 giờ.

lỉải 2. Phương pháp Kciĩi rischer

Nguyên tác của phương pháp dựa trên phản ứiig sau:

S 0 2 + ỉ 2+ 2 H 2 0 ^ 2I + 4ir-hSC V '

Phan ứng củii bằng này sẽ cluiyển dịch theo chiổu ihuộn khi cỏ Iiiạl mộl ba/xí
lu’ru ctí như có khả nàng kôì liỢD dáa dẩn với các ị)rolon lạo r;i i!v)iig (ỊUá Iiìiilì
pliáii ứiig.

Ngoài ra piridin và metanol có vai trò là nhCmg dung môi của ioi và SOi. ^riiuốc
lliử Karl Pichcr bao gồm S(32, u, piridin và một rượu (thường là meíanol). Mẫu vạl ơ
li;ing lliái cân bằiig với một mồi trường có áp suất hơi nước bằng khổng, với diều kiện
li) các Ihao lác làm thố Iiào để cho phép nước chứa trong lòng CÍÍC li;i! (lirới (ỈÌIIIỊ:
huyén |)hù kliuốch lán dưa ra ngoài dung dịch iol và SO2. Sự kluiếcli tán này là hoàii
loàn và tức thời với tất cá các sản phẩm hoà tan dược trong mội (lung mồi uanig liỢỊ)

31
\'ới (liiioc ihứ K a ii ỉ-isc licr (v í dụ dường sacaroza cháng hạn). ( ac tlitni kiọn nay ral
klu') (hực liiệii với c'ác saii p h ẩ m thực p h ẩ m m à c ó m ộ t p h á n kíioug iliè (.•hiiyõn iliiiiili
<iung (lịch. 'IVí^ng Irưừng hợp này vai trò của dung môi là phức lạp: là moi inàyng {\c
kluièdì lán pha rán, là mõi (rường để trích ly nước, [à lác nhâiì làm [rirtíiig IIỠ \ii lam
:ìíc r á iU a í c - c a a ^ p L m iừ - Ẩ Ì ẽ ven Iinli
I)Ọ|, các ngũ cốc và các sản pham dẫn xuâì. Thời gian cáii lliiêì đế kỉmốcl láii Iiướr
|)hụ ihuộcỊ và o kí ch ihước c á c hạt và v ào nh iệt độ, Để tă n g nhanii CỊIUI íiìiili Iiị^iroi ta
chỊcl ớ aliiệi (lộ ihấp hưn nhiẹt độ sôi của dung m ôi (lược (I ìiu í ;.

PluịPLtng pháp Karl Pischer có thể dùng khi những plurơiìg |)Ii;íị) klun. klioMị',
íỉiing tlirợc. c ac sân pháiri rán, lỏng cũng như nhữiig sán plìáni có chứa các hợ|> I iiâl
ỉ>ay Ikíì (ít nhiệl dộ ihấp khác với nước đều dùng dược phiUĩiig pluÍỊ) Iiày^ ( tk' clìâì
\rto n , aldịehit chứa Irong các sản phẩm sẽ cạnh Iranh với thiiổc thử. Do hắn chai rát
háo nước ifà rất nhạy với các hiệu ứng quang hoá nên thuốc thử Karl rischdr dỏ
l)ị hiên clêi ílieo Iliời gian. Đe ngan ngừa người ta phải điniị’ Irong cliMÌ llìiiý linh tHt
|;k‘ ilụng Ijgan cán quang hoá cOng như các dụng cụ có lác dụng cách ly ilìiK K- lliư \ (Vi
tlo iiiii ciui khí (Ịuyển. 1’liirờiig thì trước khi dùng phải chuẩn lioá lại lliuỏc llkứ. ( V) lỈK'
ihay ihc nietaiiol bang 2 -meloxy-etanol thì ihuốc thừ bị biến cỉổi chậiìì liơiì.

lỉãi 3. Phương pháp chưng cất

('lìíin iá ii vật vào trong mộl chất iỏng không hoà lần với nirớc, sau (h) lỉưiỉ liõii
liơỊ) ilcii nhiệi lỉộ stVi. Uưi dung môi và hơi nước được chicì la và ciược m IIỈIỜ
Iiiọl on^ siniì lìàn hổi lưu, sau đó thu lại trong một ống chia (iộ, ớ tlày m ul và (luii^ĩ
IIIOĨ klionậ hoà làii nên lự lách ra. Lượiig nước được dọc biiag llìc (k li, mt)i
lỊuùyng (ỉùpg là bcn/en, loluen, xylen.

K ỉ iị kỉiãn chủ yếu Ịà không chiết đirơc nước hoàn loàỉì ở irong mầu.

P lìipiig pháp này có thể áp dụng để xác cỉịnh nước trong b(j, (láu, các s.in phaiii
í ’iìm 1ÌỊ)ÌI p ũ n g íilìir m ộ t s ố g i a vị. ^rhông thirờiìg n g ư ờ i tii c ỉi i áị> ( l ụ i i g |)lu|ưiiỊì ịìliiÌỊ)

(.iiirnp. câí clu) những sản pliám lự khuếch tán được trong chất lung clC' k i‘í) cài.
f> 4.t Plìuơtĩg
ỉỉàì f>f____ z pháp sấy ở nhiệt độ từ 100 đến 130%'
f 5/ìíV'

f)ó là Ị)luRyng pháp dơn giản nhất và nhanh nhất, khá phổ hiến \'à clòi khi rfmg
(.iio kòi c Ịu á Iirơnị’ tir như pliưcmg pháp tuyệi đối.

V2
 Với phiR)‘ng phắp nàv thường phải nghiền mẫu vr. kiổin tra kích ilìirớc hột
njj,hicn lã ciìn iliict cho (lộ chính xác của các kết quả.

lỉài 5. Phương pháp sấy nhanh ở nhiệt độ cao ịioo^c hoặc cao lioỉi)

Sấy trong 2 dến 15 phút, cũng thường được dùng như phương ọhúp kiếm Ira
côiig Iigliiệp. Mầu vật dặt trong lò sấy dưới đèn hồng ngoại, bộ phậiì cân cỉậi phía
Iigoùi lò sấy và có thể dọc trực tiếp hàm lượng nước của sản phẩm.

2.3.2.PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ N ư ớ c CỦA THựC Pl IẨM

ĩỉải 6. Xác ilịnh hoạt độ nước bằng phương pháp ììộỉ SUY

a. Ngitycn tác

ơ phần Irirớc, ta dã có:

Độ ấriì tương đối càn bằng %

100

Độ ẩm lirơng dối cân bàng là độ ẩm mà tại đó mẫu vật không nhận lỉièin ãni
cung như không cho ấm. N ói cách khác, ỏ độ ấm tương dôi cân biUig khòiig tlán
dốiì inội sự thay dổi nào của khối ỉưựng vạt mầu.

h. Tiến liàiilì

X á c dịnh a,,, (là xác dịnh dộ ám tương đối cân bằng) bằng pỉurcyng Ị) h á Ịì nội
suy lừ (lổ (hị dược liến hành như sau: Đạt các mẫu vậí trong C'ik' hình kicni như C'áf
ImiiIì liúl ẩin nliỏ, có chứa các dung dịch muối bào lìoà dò lạo ra tỉộ âm lương (lỏi
CÌUI hang (hay a^, chuẩn khấc nhau), có lắp ihiêì bị khuấy (lung dịclì và (Ịiiạl klìòii^
khí. C'ác bìnli hút ẩm được de ở cùng I nliiệl độ nhải dỊnh (trong lliic l bị (lieii nliiệt
cách llu iỷ chảng hạn) sau m ộl thời gian lừ 2 dến 24 giờ (phụ lluiộc' vào niiiu vậi và
các lác giả) cân trọng lượng các mẩu vật lừ đó biết dược sự biến thiên Irọiig lượiig
cũa inảu. V õ clổ Ih ị vớ i trục y biểu diễn sự biến Ihiên irọng lượng nìầu và Irụ c X h ia i
(lic ii tlộ ấin lương dối cân bằng (y = f(x )). Đ iểm cắt nhau cùa clườĩig tliầỉig với (rục
lỉo ìiiiỉi là dộ íỉin urưng dối cân bằng (h ay a^) của sản phẩm (h ìn h 2 . 3 ,2 )
 Biến thiên

Hinh 2.3.2. Xác định hoạt độ nước của thực phẩm

Với phương pháp này có thể xác định được khi ở nhiệt độ cao. COiìg có
ihể dùng các bình có kíclì ihirớc như hộp Petri nhưng có hai khoang: khoang giữa
dặi mầu vặi dịnlì xác định a,,., khoang ngoài dựng dung dịch muối bão hoà.

Bảng 2.3.2a. Giá trị hoạt độ nước (ở 25°C) của dung dịch muối bão hoà

a„
Dung dịch m uối bão hoà
VVashburn 1926 R ockland VVeast
LiCI.H^O 0,15 0,12 0,15
KC2H3O2 (axetat) 0,20 0,23 0.20
MgCl2.6H20 2,33 0,33 -
CrƠ 3 0,396 - -
KjC03 - 0,44 0,44
Mg(N 03 ).Hp0 0,55 0,52 0,52
NaCI 0,76 0,75 -
(NH,)2S0, 0,81 0,79 0,81
CdCI - 0,82 -
LÌ2SO 4 - 0,85 -
KãcrO^ 0,88 0,88 0,88
KNO3 0,94 0,94 -
Na^HPO, 0 95 0,98 0,95
K,SO„ 0,97 0,97

34
 Báng 2.3.2b. Độ ẩm tương đối nhận được từ dung dịch H^so.,

H;S 04 (% trọ n g lượng

Độ ẩm tương dối (a^.100) 0“C 25‘’C 50“c 75“c
10 63.1 64.8 66,(3 GO, 3
25 54.3 55.9 57.5 59.0
35 49.4 50.9 52.5 54.0
50 42.1 43.4 44,8 46.2
65 34.8 36,0 37.1 38.3
75 29.4 30.4 31,4 32,-1
90 17.8 18.5 19.2 20.4

2.4. XÁC ĐỈNH ĐƯÒNG đ Ẳ n G nhiệt HẤP thụ v à PHẢN HẤP thụ

Ịỉài 7. Xác (ỉịnh duờnỊỊ dẳng nhiệt hấp thu r« phân hăp Ihụ cứu chè

(I. N í i i i v c i i l ắ c

ỉ) ạ t n iọ t liav nhiều I iiẫ ii ( d e có 8 - 10 d iê m ) sả n ị) iiã n i k i i ỏ ( lia p llu i) lio a c s;iii

pliaiii ướl (p liá ii liâp thụ) có trọ n g lượng dã biết vào trong n iộl d ãv biiih kin cú (lộ

iini lương dối của không k lií tãng dần (hấp thụ) hoặc iiiáni dần (piuiii h;'i|) iliụ) clio
(lòn klii dạt tkrợc cân báng thì do khối lượng nước của các mẩu sản ịiluini tioiig (.-ác
límh kín băn” cách cân. Từ dó sò' liệu thu đưực vẽ clồ thị

w = I(.A„|> = (tộ ain, dộ ám tương dôi của klii (Ịuycii Irong cái' hinli
kin (lim li 2.4a và 2.4b)

f)ò i khi, cũng cần xác dịnh một hệ các dường dáiig nliiệl lại cái.’ Iihiộl (lọ
khác Iiliau dc tínli nliiệt liâị) llui cliáng hạn (hìnli 2.4c)

35
 a b c

Hình 2.4. Các phương pháp để thiết lặp đường đảng nhiệl :

a) Sơ đồ tiến hành với một mẫu sản phẩm;

b) Sơ đổ tiến hành với nhiều mẫu sản phắin;

c) Sơ đồ tiến hành ỏ các nhiệt độ T j, T 2, T ì khác nhau.

b. Hoú chấí \'à dụng cụ

Để thu dộ ẩiĩi tưưng đối cần có của không khí trong các bìnlì kín người la
(iiiiig các dung dịch inuối bão hoà hoặc dung dịch axit sunfuric có nổiig clộ xác (lịiili
(xem hảng 2.3.2a và 2.3.2b).

Có ihể dùng bình hút ẩm chân không có đường kính khoảng 20 - 25cm.

Các dung dịch muối bão hoà (hoặc dung dịch axit ỈI2SO4) dược dổ vào các
bình hút ẩm chân không đến cách ghi sứ Icm , trên ghi sứ đặt cốc cân có (lườiig
kínỉi khoang 6 cm de đựng mẫu. Muốn hệ thống nhanh chóng dại dtrợc tlộ ấm (.'áii
bang, nguừi la dạl các giải giấy lọc có một đầu nhúng ngập t ro n g cỉuiìg dịch Miuổl
bão hoà (lioặc dung dịch H 2SO4) quanh thành bình hút ẩm.

Trường hợp dung dịch bão hoà là õxit crôm thì dùng bôiìg thuỷ linh thay giấy
lọc.

c. Clìuẩn bị ỉnảii

Nói cluing, việc nghiền mảu là cần thiết nếu làm tăng độ xốp lự Iiliiên của
sản phẩm để các phân tử nước di chuyển dẻ dàng do đó làm tăng quá irìn li Irao dổi

36
mà khồng làm thay đổi điểm cân bằng cuối cùng. Nhất là k lii lượỉig nước hấp liiỊ i

Ị)hụ thuộc vào bề mặt tiếp xúc "không khí-sản phẩm" lỉù khảu nghiền mầu sẽ làm
lang diện tích be mặt do đó tăng quá trình cán bằng. Đó là trưừng hợp các sản plìám
dạng linh the thường có kích thước và độ cứiig của các tinh thể vòn ngan cản sự
Ihâin nhập của nước. Trường hợp các sản phấm là dầu hoặc rấi ướt ihì làm lạnh
(lỏng cho dễ nghiền hoặc nghiền lạnh có mạt nitơ lỏng hoặc tuyết cacbonic. 'lYong
ĨIÌỌÌ Iruờng hợp, việc nghiền không được làm nóng sản phẩm để tráiih làm thay dối
lính cliất hấp thụ do nhiệt.

Ngoài ra, đối với trườiig hợp xây dựng đường đẳng nhiệt hấp thụ thì phải cỉưa
mảii sán phẩm đến thuỷ phán dưới 1% hoặc trường hợp xây dựng dáng nhiệl Ịìhan
hấp thụ lại phải (hra sản plìánì đến hàm lượiìg nước bằng hoặc cao hơn mức thuý íối
da.

d. Cách iiếỉi liàỉìlỉ

Có thể đưa sản phấm đến thủy phần dưới 1% bằng cách sấy nhẹ trong tủ sấy
chàii không trong nhiệt độ 50‘’c trong 16 giờ hoặc bằng cách dể máu sản phẩm vào
bìnli hút ẩm clìâiì không có chất hút ấm P2O 5 trong 48 - 72 giừ

Cíin chính xác khoảng Ig mẫu vào cốc cân đã biết trọng lượni;, dàn (lều mầu
thành lớp mỏng rồi đặl vào bình hilt ấm chân khổng có độ ấm tương dối cùa không
khí lang dần. Sau 1, 2, 4, 6 , 8 , 16 giờ để đạt cân bằng (khi trọng luựng liai lầii càn
lièn liếp không chênh lệch quá im g).

Trirờiig hợp phản hấp thụ, có thể lấy các mẫu dã đạt đến càn bàng trong íhí
nghiệiĩi hấp Ihụ ở trên dem giữ ở khí quyển bão hoà hơi nước (clộ ẩm tương đối gần
98%) cho (lên khi hàm ám không vuc;íl quá lần câii irước vài |)hần trãnì {%), Dc niáu
vào cláy bìiili húi ấm chân không có độ ẩm tương đối của không khí giỉìĩn dán trong
Ihời gian từ 2 , 4, 6 , 8 , 16 giờ.

Tiến hành xác định tliuỷ phần các mầu trong bình hút ẩm chân kiiông bầng
phương pháp sấy nhanh hay phương pháp Karl Picher.

Cho lủ sấy ở nhiệt dộ 130"c trong 1,5 giờ, sau đó lấy nắp đậy cốc cân lại và
lấy ra đặt trong bình híit ám chân không để làm nguội trong 30 phút.

37
 larợng ẩm càn hãng (% ) trong các mầu san pliám ở (lộ áni liR ín y tlỏi cuii
không khí khác Iihaii, dược tính iheo còng thức :

N = ^ - ^ ^ x lO O ( % )
G ,-G ,

í rong dó:

G|; khối lirợim của cốc cán không có máii (g);

G ỉ 4- khối lượng sản phấm ở điều kiện cân bang;

G,; G l + khối lương sản phám khô sau khi sấy.

38
 Chưoìig 3
PROTEIN

3.1. Đ Ạ I C Ư O N G VỂ NGHIÊN c ứ u CẤU TRÚC PHÂN TỬ PROTEIN

NghttMi cứu Cấu trúc phân lử proteỉn ihường theo các bước sau:

Thu lìlụip proĩein à (lạng íiiìli sạch: sử dụng các phương pháp kết lũa thuận
nghịch sác kí qua cột trao dổi ion, rây phân lử, phương pháp sác ký ái lực... dc loại
bỏ các prolein ỉạp.

X(k' (lịnh ĩliàỉih pliầỉì a.xiĩ aniiìì cùa proíeiỉỉ, iheo trình lự:

- Thuỷ phân protein thành axit amin, thường dùng lici 6 N ỏ 1l ơ ' c 24h.

- Loại axii khòi dịch thuý phân.

- Tách riêng các axit amin ĩrong (lịch thiiỷ phàn: Có thế dùng phương pháp
sác k í írêMì g iấ y sác k í kết liợp với diện di trên g iấ y sác k í vứi CỘI Erao dổi ion
(thường dùng là polysiilen sưnfonai như Dowe\ 30).

- Phát hiện axit aniiiì bằng pliàn ứng dặc lìiộu. V í dụ với thuốc thừ ninhidrin,
axil amin cho phức chấl màu xanh tím, riêng prolin tạo thành phức màu vàng.
Cường dộ màu li lệ với lượng axit amin.

- Để dịnh tên các axil amin trong dịch thuý phân cần licn hành phân tích
song song 1 mẫu chứa hỗn hợp của axít amin chuẩn. Đối chiếu so sanh sắc kí dổ
nhạn được của mẫu nghiên cứu và mẩu chuẩn sẽ biết dược thành phán tí lệ từng axit
amin trong mẫu nghiên cứii.

- Tính số gốc axil amin trong phân tử.

 Ngày nay nhờ có máy phân lích tự động ihành phần axit amin có thể hoàn
thành việc tách và phân tích dung dịch axit amin trong vòng 2 giờ.

Xác định trình tự sắp xếp các gốc axit amin trong chuỗi polypeptii. Các
phương pháp được dùng từ trước đến nay như phương pháp Sanger, phương pháp
dùng danxil clorua, phươiig pháp Edman. Để xác định trình lự axit amin của mội
chuỗi polypeptit thường theo trình tự:

- Cắt chuỗi polypeptit ở nhữiig vị trí xác định tạo thành các đoạn peptii ngắn.
Để thực hiện điều này thường dùng các enzim phân giải prolein (tripxin,
kem otripxin, clo s tricin ...), các hoá chất đặc biệt (CNBr).

- Dùng phương pháp sắc kí để tách riêng các đoạn peplit này và tinh sạch
chúng.

- Xác định irình tự sắp xếp axil amin của mỗi đoạn peptit đã tinh sạch.

- Đ ối chiếu trình tự axit amin cùa các đoạn peptit khác nhau (chú ý những
đoạn có trình tự axit amin bao phủ lên nhau) để thiết lập trình tự axit amin của toàn
bộ chuỗi polypeptit.
[777:

© - © - © - G K D - ©
FDNB 1 2 3 4 5 6
(hoặc đan xicio ru a)
Đánh dấu

< Â )-© — © - G H E ) - ©
Thủy phân

Hình 3.1. Sơ đổ phản ứng dùng FDNB hoặc danxil clorua.

3.2. MỘT SÓ TÍNH CHẤT QUAN TRỌNG CỦA PROTEIN

Tính chất cùa protein phụ thuộc vào thành phần và trình tự sắp xếp các gốc
axit amin trong phân tử của nó. Do cách kết hợp giữa các axit amin trong phân tử

40
prolciii dễ dàng thấy rằng proiein phải còn mang dấu ấn rõ rệt tính chất các mạch
bôn của các gốc axit amin cấu tạo nên nó. V í dụ: Phản ứng màu đặc trưng, tính
chất điện l i . .. Tuy nhiên, protein có những tính chấi hoàn toàn khác axit amin, đó là
những tính chất phụ thuộc vào liên kết peptit, vào cấu trúc không gian phân lử lớn
của protein.

3.2.1. KHỐI LƯỢNG VÀ HÌNH DẠNG PHÁN TỬ PROTEIN

Protein có khối lượng phân tử (M r) tưcnig đối lớn và thay đổi trong một dải
rộng từ hơn mười nghìn đến hàng trăm nghìn daỉton hoặc lớn lìCfn nữa (bảng 3.2.1).
Các phân tử lớn này có thể có dạng hình cầu ( hình hạt, hình bầu dục) hoặc dạng
sợi. Giữa hai nhóm proiein này có khác nhau về một số tính chất.

Các protein hình cầu (spheroprotein) tan trong nước hoặc dung dịch muối
loãng, rất hoại động về mặt hoá học. Thuộc nhóm này có hầu hêì protein có hoạt
tính xúc tác (enzim): albumin, globulin, m ioglobin, hemoglobin. Tỉ lệ giữa trục dài
và trục ngắn của phân tử bé hơn hoặc bằng 2 0 , ở các protein hình sợi, tỉ lệ này lớii
hơn nhiều. Phản ứng:

0 ,N NHo--- c V a l— G li— lle — P h e — Lys

CH

25°c. pH = 7 - 8

Ọ
II
HF 0?N NH ■c— Val- •Gli— tle — Phe ■Lys

CH
NO

Thuỷ phân bằng HCI 6 N. 110°c

O2N ■CH— c — 0' + Val + Gli + Lvs + Phe + He

< c y ~
CH3
NO2
Dinitrophenyl-alanin
(DNP-alanin)

41
 ọ
H5N- - c c — 0 — 0 — O'
CH

20‘^C. pH = 9

H3C. .CH3
N

NH— C H -C — C — 0 - 0 - 0 + HCI

CH3

Thuỷ phàn bằng HCI 6N 110°c

+ o o
0= s = 0 o
H o
NH - - C c — O'
ĩ
ÓH3

Dần xuất danxyl - axit amnin

Hinh 3.2.1a. Dùng phản ứng thủy phân

Sơ đổ m in h hoa

42
 Phan img:
o
H
N =c=s H 2N — c — c — G ỉi— A s p — V a l — Arg

CH3

0
H
NH— C -N H — c — C -G ỉi-A s p -V a l-A rg

Q^ Phenyltiocacbamoilopeptit

o
H
H N C -O H G l r - A s p “ V a !— Arg

v c \ CH
/
s R
Phenyltiocacbanoil amino axit

Mòi trường axit vưa phải

Phenyltiohiơantoin ~ axit amin

(5-ũlkilo-5-fenilĩo-2tìohiơantoin)

H ỉ n h 3 .2.1 b. D ù n g p h ư ơ n g p h á p E d m a n

V í dụ iropolagen (dưn vị cấu irúc cư sở cua colagen) có chiếu dài 3000Ả,

đườag kính 15Â. Các protcin hlnh sợi (scleroprolein) lương đối irơ về mặl hoá học
chiì yếu có chức năng cơ học. V í dụ: Colagen của da. xương, sụn, gân, răng; keralin
của tóc, lông; íib roin của tơ, miozin của cơ.

43
 Báng 3.2.1. Khối lượng phân tử tương đối (Mr) của một số protein thường gặp

Protein Mr (dalton)
XitocramC 116000
Ribonucleaza 12700
Lizozim (lòng trắng trứng) 14400
Mioglobin 17800
Tripxin 24000
Bromelin 25000
Pepxin 36000
Hemoglobin 64500
Albumin huyết thanh 69000
Hexokinaza 96000
Lactat dehidrogenaza 150000
Ureaza 483000
Miozin 620000

3.2.2. TÍNH CHẤT LƯỠNG TÍNH CỦA AXIT AMIN VÀ PROTEIN

A x it amin và protein có tính chất lưỡng tính, có nghĩa là vừa có tính chất axit
vừa có tính chất bazơ. Theo thuyết Bronsted, một chất có tính chất axit có khả năng
cho proton, phản ứng với bazơ tạo thành muối. Tính chất bazơ thể hiện ở khả năng
nhận proton, kết hợp với axit tạo thành muối.

Phân tử axit amin dồng thời có cả nhóm amin và nhóm cacboxyl. Trong
dung dịch ở pH trung tính, axit annin tồn tại chủ yếu ở dạng ion lưỡiig cực (chỉ 1%
ở dạng trung hoà), ở dạng ion lưỡng cực, nhóm cacboxyl bị phân li, nhóm amin bị
proton hoá. Trạng thái ion hoá của các nhóm này tuỳ thuộc vào pH môi trường.
Trong m õi trường axit (pH = 1) nhóm cacboxyl không ion hoá nhóm amin ở dạng
proton hoá. Ngược lại trong môi trường kiềm (pH = 1 1 ), nhóm cacboxyl io ii hoá,
nhóm amin không ion hoá (hình 3.2.2). Như vậy khi đặt axit amin trong điện trường
tuỳ thuộc pH m ôi trường, nó có thể di chiiyển về catot hoặc anot, ở một pH nào đó,
axit amin không di động trong điện trường, chứng tỏ tổng số điện tích trong phân
tử của nó bằng không, pH này được gọi là pH đẳng điện của axit amin kí hiệu là
pHi.

44
 NHa" NH 3^ NH 2

H— c — C OOH H— c — CO O' H— c — C O O '

+ +
R R R

Dạng ưu thế ở pH=1 Dạng ưu thế ở pH=7 Dạng ưu thế ở pH=11

Hình 3.2.2. Các dạng ton hoá của axit amin ở c á c pH khác nhau

Các axit amin chứa một nhóm a m in , mộl nhóm cacboxyl, mạch bên kliông
phân cực (A la, Val, Leu, lle) có giá trị pHi vào khoảng 6 , axit amin có 2 nhóm
cacboxyl (Asp, G lu) pH i ở vùng axit, ngược lại các axit amin kiềm pHi ở vùng
kiềm (bảng 3.2.2).

Báng 3.2.2. Giá trị pHi của mộí số axit amin

A x it amin pHi
Asp (A) 2,77
Glu (G) 3,22
Cys (C) 5,07
Ser (S) 5 68
Val (V) 5,96
Gly (G) 597
Leu (L) 5,98
Ala (A) 6,02
lle (1) 6,02
Lys (K) 9,74
Arg (R) 10,76

Tương tự như axit amin, protein cũng là chất điện li lưỡĩig tính, vì trong phân
tử protein còn có nhiều nhóm phân cực của mạch bôn (gốc R) của axit amin. V í dụ:
Nhóm cacboxyl ihứ hai của Asp, Glu, nhóm amin của Lys, Guaniđin của Arg,
imidazol của His, hidroxyl của Ser, Thi, T yr... trạng thái tích điện củíf các nhóm
này cũng tuỳ thuộc pH m ôi trường, ờ một pH nào đó mà lổng số điện lích + và điện
tích - của phân tử protein bằng không, phân tử protein không di chuyển trong điện
trường gọi là pH i của protein. Như vậy nếu protein có chứa nhiều Asp, G lu (axit
amin axit), pHi của nó ở vùng axil và ngược lại nếu chứa nhiều axit amin kiềm
(Lys, A rg, His) thì pH i của nó ở vùng kiềm giá irị pHi của một số protein như sau:

45
 Pepxin 1.0 Hemoglobin 6,8
Aỉumin trứng 4.6 Ribonucleaza 7,8
Cazein 4,7 Tripxin 10,5
Albumin huyết thanh 49 Xitocrom c 10 6
Gelatin 4,9 Prolamin 12 0
Globulin sữa 5.2

ơ mòi trường có pH < pfỉì, protein là lĩiộ i da caĩion. số diện tích dương lớii
hơn điện tích âm. ớ pH > pHi phân tử protein the hiện tính axit. cho ion ìrV. do đó
số điện tích âm lớn hưn số điện tích dưưng.

ơ trong mòi trường có pH = pHi. protein dẻ dàng kết UI lại với nhau, có thể
sử dụng tính châì này đế xác định pHi của protein cũng như đế kết tủa prolein.

3.2.3. TÍNH CHẤT DUNG DỊCH KEO PROTEIN, s ự KẾT TỦA PROTEIN

Khi hoà tan. protein tạo thànli dung dịch keo. Các phân tử keo có kích thước
lớn, không đi qua màng bán ihấm. Sử dụng tính chất này có llìế tinh sạch prolein
khỏi các chất phâii lử ihấp bằng phương pháp thẩm tích. Do trẽn bổ mặl phân lứ
proieiii có các Iihóm phâiì cực khi lìoà vào nước, các phân từ nước lường cực được
hấp thụ bởi các nhóm này lạo thành màiig nước bao quanh phân lử prolein gọi là
các lớp vỏ hiđrai. Dùng phương pháp phân tích Rơnghen đã xác định dưực ràng lớp
nước ớ sát bé mặt phân tử proĩein có bề dày 3Ả (đúng bằng kích llìước phân tử
nước) là lớp nước đơn phân lử. Những phân tử nước ở xa hơn sáp xếp iì irặt tự hơn.
Độ bền của dung dịch keo prolein phụ thuộc vào Ii li iểu yếu tố, ví dụ; sự tích diện
cùa phán tử protein, mức độ hiđrat hoá, nhiệt dộ. Khi thay đổi các yếu lố này, ví dụ
làm trung hoà điện phàn tử protein, loại bỏ lớp vò hiđrat, các plìân tử lớn prolein sẽ
kết tụ lại với nhau lạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thường gọi là kết tủa
prolein (hình 3.2.3). Như vậy dế kết lủa protcin có llìể thay dổi pH dung dịch đến
p lỉi của prolein, thêm các muối trung hoà, dung mòi hữu cơ (axetol, etanol) ở nồng
độ cao, tăng nhiệt độ.

Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết lùa, protein lại có
thể tạo thành dung dịch keo bền như trước hoặc mất khả năng này. Trường hợp thứ
nhất gọi là kết liìa thuận nghịch. Khi bị kết tủa không thuận nghịch, protein đã bị

46
mất nhiìng tíiìh chất ban đáu, còn gọi là sự biến tính prolein. Những ihay đổi dẻ
Ihấy nhất là lính tan, hoại lính sinh học (ví dụ: enziin mâì hoạt lính xúc tác) và khá
nàng phán ứng hoá học. N ghiên CL?11 cấu Irííc không gian cho ih ấy khi bị biến lính
phân tử proiein không cuộn chặl như irước mà ihường duồi rii hơn. Kết quả là phá
vỡ cấu hình không gian cần liiiết dê ihực hiện hoạt lính sinh học cíia phàn tử được
lộ ra n g o à i n ê n ỉ à m t à n g k h á n ă n g p h ả n ứim h o á h o c ciia p r o i c i n .

Tóm lai, hai yếu tố bão dam độ bến dung dịch keo proteiii là:

- Sự tích điện cùnơ dấu của các phân lứ proieiii (ở pH ị pHi)

- Lớp vỏ hiđrat bao quanh phân tử protein.

anion protein prolein ỏ pHi cation protein

thèm kiểm thém axit

tàng pH giàm pH

loai nước loai nước loai nước

protein kèt lùa

Hinh 3.2.3. Sơ dồ kết ỉủa protein.

ỨỈỈỊ’ cúc yếu ĩ ố kếí ỉ lia proíciỉi

Các yếu lố kếi tủa ihiiận nghịch proicin dược dùng dè ilìL i nhận chế phám
protein. Đế dạt mục dích này thường dùng muối Irung hoà như (N H 4)S0 4 dung môi
hữu cơ như axeton, ctanol và phái tiến hành ở nhiệi độ ihấp dưới 0"c.
M uoi trung hoà vừa làm trung hoà diện vừa loại bỏ lớp vỏ hiđrat của proiein,
còn dung môi hữu cơ luio nước, phá huỷ lớp vó hidrat rất nhanh chóng. Trong chế
phẩm protein nhận được còn lản các chất dã dùng để kết lùa; cần sử dụng các

47
phương pháp thích hợp để loại bỏ các chất này. V í dụ dùng phương pháp thẩm tích
để loại bỏ, muối (NH 4 )S0 4 .

Các yếu tố kết tủa không thuận nghịch (biến tính) protein được sử dụng để
loại bỏ protein khỏi dung dịch, làm ngìmg phản ứng enzim. Đcm giản hơn cả là đun
sôi dung dịch protein. Các hoá chất thường dùng để làm biến tính protein là: các
loại axit, kiềm ở nồng độ cao. Một sô' axit được dùng phổ biến như: axii
tricloaxetic, axit voníramic, axit picric, axit suníoxalixilic. Ngoài ra, để làm biến
tính protein người ta cũng thường dùng muối của các kim loại nặng như Pb, Hg, Cu,
Fe.

3.2.4. KHẢ NÀNG HẤP THỤ TIA TỬ NGOẠI CỦA DUNG DỊCH PROTEIN

Dung dịch protein có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở hai vùng bước
sóng khác nhau 180-220 nm và 250-300nm.

a) Bước sóng từ ỉ80-220iìiu: đó là vùng hấp thụ của liên kết peptit trong phân
tử protein, cực đại hấp thụ ở 190nm. Do liên kết peptit có nhiều trong phân tử
protein nên độ hấp thụ khá cao, cho phép định lượng tất cả các loại protein với nồng
độ thấp. Tuy nhiên vùng hấp thụ này của các liên kết peptit trong protein có thể bị
địch về phía chính các tạp chất này cung hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước
sóng 180-220nm. V ì vậy trong thực tế khi đo độ hấp thụ của dung dịch protein
thường đo ở bước sóng 220-240nm.

b) Bước sống từ 250-300nnr. đây là vùng hấp thụ của các axit amin thơm
(Phe, Tyr, Trp) có trong phân tử protein, cực đại hấp thụ ở 280 nm. ở bước sóng
này Trp có đô hấp thụ lớn nhất rồi đến Tyr. Có thể sỉr dụng phương pháp đo độ hấp
thụ của dung dịch protein ở bước sóng 280 nm để định tính và định lượng các
protein có chứa axit amin thơm. Hàm lượng các axit amin thcfm trong protein khác
nhau thay đổi khá nhiều, do đó dung dịch cùa các protein, khác nhau có nồng độ
khác nhau về độ hấp thụ ở 280nm. Ngoài ra nhiều chất khác trong dung dịch cũng
ảnh hưởng lớn đến độ hấp thụ của protein.

V ì vậy, các phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại thường
được dùng để định lượng protein đã tinh sạch hoặc sẽ xác định protein trong các
phân đoạn nhân được khi sắc k í tách các protein qua cột.

48
 3.2.5. CÁC PHẢN ỨNG THƯỜNG DÙNG ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXIT
AMIN VÀ PROTEIN

Như trèn dã nói, axit amin là đơii vị cấu tạo cơ sở của protein và peptit. Các
axit am iii kết hợp với nhau qua liên kết peptit (-C O -N IỈ-) tạo thành peplit có chiều
dài mạch khác nhau gọi là polipeptit. Phàn tử protein có thể bao gồm m^t hay nhiều
chuỗi polipeptit. Sau đây là một số phản ứng đặc trưng thường dìing đ ế i|ịn li tính và
định lưtpíng axit amin và protein.

3.2.5.ỉ . Phản ứng biure

I.à phản ứng đặc trưiig của liên kết peptit, tất cả các chất có chứa |ìr 2 liên kết
peptit trở lên đều cho phản ứiig này (axit amin và đipeptit không c6 phản ứng
biiire). Trong m ôi trường kiềm mạnh, liên kết peptit trong phân tỉr proteậii phản ứng
với CUSO4 tạo thành phức chất màu tím hoặc tím dỏ. Công thức cấu fi|o của phức
chất màu như sau:
N R

o. ,C=^N- CH

-N :
'O'
0
\CH—R
R N'
\ /
CH 0 '
/
C = N — CH

0 - ;

Hinh 3.2.5.1. Phản ứng tạo phức chất màu tím

I

Phức chất màu có cực đại hấp thụ ở birớc sóng 540nm. Phản ứng iệày được sử
dụng rộng rãi để phát hiện và định krợng protein. Độ nhạy phản ứiig tăiỉg lên nhiều
lần khi cố tíitiốe tìiử Poiin-Xiocanto ÍPolin-Ciocalteaii). H iện nạy n b iié tác giả đã
cải tiến phương pháp biure làm tâng độ nhậy phản ứng lên hàng chục lần gọi là
phản ứng microbiure.

49
 3 .2 .5 .2 . Phản ứng vói thuốc thứ Poliìì - Xiocanto

lliu ố c ihử Folin~Xiocanlo có chứa axil pholphomolipclic và axil photpho

vonphramic. Các chất này một mặl ỉàm tãng độ nhạy phản ứiig biiire, mạt khác
phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các gốc axit này tham gia trong
quá irình tạo phức chất màu. Phức được lạo thành có màu xanh da trừi, hấp thụ cực
dại ở bước sóng 750nm.

Trong phương pháp Low ry, giai đoạn đầu thực hiện phản img Biiire, sau đó
mới ihêm thuốc thử Foiin-Xiocanto để tạo phức màu xanh. Phương pháp này có dộ
nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ l|.ig /cm \ Vì
vậy phương pháp Low ry được dùng khá phổ biến Irong phân tích protein. Tuy nhiên
cường độ màu phản ứng còn luỳ thuộc nhiều vào loại protein. V í dụ ở cùng một
nồng độ, dung dịch tripxin cho cường độ màu cao gấp 3 lần gelatin: hemogalobin
cho cường độ màu thấp hơn tripxin nhưng cao hơn gelalin.

Ngoài ra nhiều chất khác có thế làm tảng hay giảm cường độ màu phản ứng.
Vì vậv phương pháp này cho kêì quả chính xác khi xác định proiein đã được tinh
sạch ít nhiều.

Các chất làm tăng cường độ màu phản ứng: phenol purin, axit uric, các chất
chứa nhóm -SH , một số ion kim loại (do chúng cùng phản ứng với tlìuốc ihử Folin -
Xiocanto).

Cấc chất làm giảm cường độ màu phản ứiig: etanol, eie ở nồng dộ cao hơn
5%, axeton, Ba(OH )2 ở nồng độ cao hơn 1%: CI;(COOH, HCIO4 triỉng hoà.

3 2 , 5 3 . Phản ứng với ninhyđrin

Phản ứng màu đặc Irimg quan irọiig để định tính và định lượng axit amin.

Tất cả các a -a x il amin của prolein đều phản ứng với ninhidrin tạo thành hợp
châì màu xanh lím» riêng im inoaxit như prolin tạo thành màu vàng. Phản ứng này
rấl nhạy: có thể phát hiện được đến microgam axit amin, vì vậy được dùng nhiều
trong phương pháp định lính và định lượng axit amin (trong các phương pháp sắc kí
và điện li). Cơ chế phản ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất. Có thể
nếu một số phản ứng chính như sau:

50
 - Dưới tác dụiig của ninhidrin ở nhiệl dộ cao, axit amin tạo ihành N lỉ^, CO 2
và alíiclìit iươim ứim có mạch ngán hơn axit amin một cacbon, ninhidrin chuvển
ihành dixeto oxihindriden.

- Dixeto oxihindriden, N H ; mới dược lạo thành, tiếp lục phán ứng với một
phân tử ninhidrin khác tạo thành hợp chất màu xanh lím có còng thức như sau:
o o
H

R - Ọ ---- COOH NH3 + C0^ + RCH0 +

I.
NH2

Dixeto oxihindriden

Hợp chất màu xanh tim

Hình 3.2.5.3. Phản ứng màu với ninhydrin

Đế định lượng axil amin có thế dùng phương pháp so màu đo cường độ màu
phản ihìg hoặc dùng phươiig pháp đo lỉiể tích khí CO2 hoặc N ll, được lạo thành.
Phương pháp so màu được dùng nhiều hơn.

Ngoài axil amin, peptit, protein, muối amon, anioniac..., cũng lạo màu với
thuốc tliử ninhidriii. Vì vạy muốn xác dịnh chính xác axit amin phải loại bỏ các
chất này. Đế xác dịnh axil amin liên kối trong pcplil lioặc protcin phải thuỷ phân
các chất này đế lạo thành axit amin lự do rồi mới ihực hiện phan ứng với ninhydriiL

Các phản ihig màu đặc trưiiíĩ cho một hoặc mội số gốc axit amin và có ihế sử
dụng để phát hiện axit amin, protein trong dung dịch được tóm tát trong bảng
3.2.5.3.

31
 B ả n g 3.2.5.3. Một số phản ứng dùng để phát hiện axit amin, protein

Chất chính tham gia phản ứng- Gốc axit amin tham
TT Phản ứng Màu
Điều kiện chính của phản ứng gia phản ứng
Vàng sau I
i thêm kiềm
Xanị(ẹpnứÊm Trp, ty r, Phe
! chuyển
màu da ca
'■'1
Axit diazobenzosunfonic trong
2 Pauli Tyr, His Đỏ anh đà
môi trường kiềm _______
Kết tủa
3. Millor Thuỷ ngân nitrat trong HNO3 đặc Tyr
màu nàu đ
Dung dịch kiềm của a - naphtol
Xaca(|UBhị Arg Đỏ
yà hipobromi!______
Adampevic Vòng tím ỏ
và H oU in Aaxit giiociỉic H2SO4 đặc Trp ^ ặ t phân
(Hopkỉn- Co) 3 ách
Aỉdehyt íoomic 0,1% và dung
íỊ^
Roeníiem Trp ĩím
bảo hoà

3 .2 j Ị - 4 . P h ả n ứ n g c ủ a n h ó m a - a m i n v ớ i / o r m a l d e h i t

ịP Ì} ÌỊt ứ n g X io r e n ie n )

Đá» là phản ứng quan trọng thường dùng để đánh giá mức độ huỷ phâi
protein. Pormaldehil phản ứng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất metile ì của axi
amin theoị phản ứng sau:

NH3* N=CH2

R— CH + HCHO —► R— CH + HịO
coo- COOH

(D(( nhóm amin đã bị khoá nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl bắng kiềm
từ đó tính được sô' nhóm amin. Phương pháp xác định n itơ amin dựa trên 3hản ứiiị
này gọi là phương pháp chuẩn độ form ol).

3 .2 .5 .5 . P h ả n ứ n g M i l l o n

K h i đun nóng dung dịch protein với một số giọt chỉ thị M illo n thì xuất hiệi
màu đỏ và khi nồng độ protein cao hơn sẽ có kết tủa tách ra. Phản lìng này chủ yếi

52
trong dung dịch chứa nhiều tyrozin. Nên dung dịch chủ yếu iriptophan thì cho dung
dịch màu \ àng.

Dung dịch M illo n chiiấn bị từ thuỷ ngân hoà tan trọng lượng gấp 2 axit
UNO, đậm đặc. Dung dịch lúc đầu pha loãng nguội sau đung nóng. Dung dịch này
đươc phu |o ffig ‘p S l f ô r i l m g nước cất. '
1 Ị
, í
3.Ậ5.6, Phán ứng Xanthoprotein

Njíu đun nóng dung dịch protein với một lượng HNO;, đậm đặc thí xuất hiện
màu vàng sẫm hay kết tủa màu vàng. Màu vàng chuyển thành màu da cam khi
ihêm vào hay biến thành màu da cam khi thêm NH-ị vào hay biến iịhành màu
đỏ nâu kỊũ thêm dung dịch NH4OH kiềm tính. Màu này chủ yếu do phản ứng nitral
hoá của ih â n benzen của tyrozin hay nhóm indol của tryptophan.
I

3.3. THựC HÀNH

Ccíc nguyên liệu và sản phấni của ngành công nghiệp lên men nỗi riêng và
thực pháịm nói chung luôn chứa protit và sản phẩm thủy phàn cỉia nó. E»ây là một
trong n h ^ g chỉ số quan trọng có ảnh hưởng đến quá trình ch ế biến và chất lượng
sản phẩrậ. Trước hết hợp chất nitơ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng ch* nấm men
và nhiềuịvi sinh vật khác. Nếu thiếu nitơ thì lên men rượu sẽ bị kéo dài. ^[ước chấm
chứa ít c^m thì chất lượng sẽ kém. Lượng dạm amin ít sẽ ảnh hưởng quá trình
tạo hươnịg trong sản xuất nirớc chấm và tàng trữ rượu lên men. Ngoài ra ịđạm protit
còn ảnh iiưởng đến độ trong và tính bền của bia cũng như rượu q u ả ...
I

1: X ác định đạm toàn phần và % protein theo phương ph á p líje k la h l

i

CI. 'N guyên tấc

Bịln chất của phưcmg pháp Kjeldhal là khi đun nóng chất hữu cơ trong môi
trường iiịxit sunfuric đậm đặc sẽ giải phóng ra anhydric của axit sunniric (SOO-
Chất n à ỷ .M |fe to l i Ihành so, và giải phóng oxy nguyên tử. O x y giải pịióng ra sẽ
hoá hydro và cacbon của hợp chất hữu cơ để tạo thành CO 2 , H 2 O còn nitơ sẽ tạo
thành N H , V í dụ:

NH2 - CH2COOH + 3 H2SO4 = 2 CO2 + 3 SO2 + 4H2O + NH,,

53
 Khi amoniac tạo thành sẽ kết hợp ngay với axit-suiiíuric dư và tạo thành
suníat amoni:

2NH, + H,SO, = (NH4),S04

Siinfat amoiii sẽ bị phân huỷ trong môi trường kiềm:

(N H J jS 0 4 + 2Na011 = NiụSOa + 2N H , + 2 M2O

Khí amoniac thoát ra khi cất lại được thu \ ’ào bình chứa H 2SO4 đã biết trước
số lưọng. Căn cứ vào lượng H2SO4 dư sau khi cất ta biết được lượiig N H , đã thoát ra
và do đó biết được lượng nitơ chứa trong mẫu phàn tích.

b. Tiến liủiili

Xác dịnh đạm toàn phần trong nước chấm hay dung dịch có lượng đạm 5-
30g/lít. Dùng pipel hút 5ml nước chấm cho vào bình định mức lOOinl rồi théin nước
cất tới ngấn bìiih. Lấc đều rồi lấy lOml cho vào bình Kjeldhal lOOmi. Tiêp tló cho
klioảng 3,5 gam hỏn liợp C 11SO4 + K 2SO4 (theo tỷ lệ 6 :1 hay 10:1 ) dể xúc lác hoậc
cho seleii vào xúc tác. Quá trình vô cơ hoá với 2 ml H 2SO4 đậm đặc (d = 1,835).

Dùng ít nước sạch tráng sạch cố bình Kjeldhal rồi dặt bình vào bếp điện hoặc
đèn cồn dun cho tới khi dung dịch có màu xanh của siiníầt đồng hoặc xitiih vàng là
được.

Đun xong để nguội rồi chuyển toàn bộ dung dịch vào bình cầu ciia máy cất
đạm. Tráng bình Kjeldhal nhiều lần bằng nước cất rồi đổ vào bình cất. Mạt khác
hút 1 5 m l dung dịch I I2SO4 0,1N cho vào bình tam giác 250ml, cộng thêm 5-lOml
nước và 3 giọl m etliyl đỏ hay plienolphtalein rồi đặt bình vào vị trí làm việc. Chuẩn
bị xong ta lấy cho tới khi thử giấy quỳ với nước ngưiig thoát ra khôní; còn phản ứng
kiềm là được bình thường cất tiến hành khoảng 40-50 phút. Cất xong dùng bình tia
rửa sạch axit bám ở ống ngưiig nhúng Irong bình tam giác. Sau đó đem chuẩn lượng
H 2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1 N rồi suy lượng H 2SO 4 đã tác dụng với NH,.

r, Tính kết quả

Hàm lượng Iiitơ trong l l í l nước chím tính theo công thức (tính lượng Iiitơ
toàn phần) bao gồm các loại nitơ có trong dung dịch:

54
 N ,= iíld^l4H Ì,000 (g/n
0.5

= l.4u. /
0.5

irong dó:
a: số m l dung dịch H 2SO4 0 , 1N cho vào bình tam giác;
b: số m l dung dịch NaOM 0,1N tiêu hao khi định phân lượng axil dư;

0,0014: số gam nitơ ứng với Im l dung dịch H 2SO4 0,1N;

0,5; số m l nước chấm chứa trong máu phân tích hoạc số ml dịch đạm đem
phân tích theo phương pháp lấy mảu và pha loãng.

Chú v: Trường hợp xác dịnh đạm trong nguyên liệ u ngỏ, kh oai, sán hay bội
khác thì cân khoang 1 gam bột trên cân phân tích xong chuyến toàn bộ vào bình
Kjeldhal, cộng thêm 20 ml H2SO4 đậm đặc vào 10 gam hồn hợp chài XIÌC tác. Sau
khi vô cơ hoá ta chuyển toàn bộ vào bình định mức lOOml rồi thêm nước cất tới gần
bình. Sau đó lấy 40m l đem câì và tiến hành lương tự như trên, chỉ kliác là lượng
NaOH 30% phải cho nhiều hơn và khoảng 50ml. Hàm lượng protein irong nguyên
liệu lính theo công thức sau (proiein hay đạm toàn phần)

p „= 100x6.25 (?f)
n

trong đó;

n: sô' gam nguyên liệu chứa trong mẫu cleni phân tích;

1 0 0 : tính cho 1 0 0 gam nguyên liệu;

6,25; hệ số chuyển Iiitơ thành protein.

V í dụ; lượng nguyên liệu đem vô cơ lioá là 1,0256 gain. Lượng axit siiníuric
cho vào a=15 in l, khi chuẩn lại ta có b =10inl, vậy
_ 1,0256
n=■ X 40 = 0,4402g
100 ^

Thay vào công thức trên ta có;

IO)xQ.
9 .390/.
0,4402

55
 Bài 2: Xác định đạm amin bằng phương pháp chuẩn (lộ /o n n o ỉ

ư. Nguyên íắc

Cơ sở của phương pháp là khi thêm íbrm aldehit VÌÌO dung dịch chứa axil
amin thì dưới tác dụng cứa fo rm a lịe h ỵt,^á c nhóm amin sẽ bị m ethyl hoá và mất
tính kiềm. Nhờ đó axit am iii trở nên axit mạnh hơn và có thể tác dụng vứi kiềm.
Cãn cứ vàc ỉượng NaOH liêu hao ta tính được lượng axit và do đó biết được lượng
I

nitơ theo sc|f đổ phản ứng sau:

H H
R - - c ~ -COOH + HCHO R-—c - — COOH + H2O

NH2 N--C H 2

H H
R~“ C— -COOH + NaOH —► R~ - c - -COONa + H2O
N— =CH2 N - -C H 2

Phảii ứng xảy ra hoàn loàn ở pH; 9,0 - 9,5. V ì thế khi dùng c ^ ĩ thị là
phenolphta|ein phải chuẩn dung dịch tới màu đỏ sẫm.

h. / / L chất

- Du^g dịch NaOH 0,1 N I

- D in g dịch phenolphtalein 0,5% pha trong rượu 50% rồi trung lioà bằng
dung dịch ía O H đến xuấthiện màu hồng nhạt. Ị

- HỖ n hợp íorm ol: Lấy lOOml dung dịch form ol 40% cho vào cốc khô, sau
đó cho thê n 2ml dung dịch 0,5% phenolphtalein rồi dùng NaOH chuấn Ịlến màu
hổng nhạt. 1

- Dung dịch axetat chi trung tính: Cân 20 gam PbO và 6 gam PbíCHsCOO)
cho vào cốp rót vào lOml nước và đặt trên nồi cách thuỷ cho dến khi dung dịch có
màu trắng hoặc trắng hồng. Sau đó cho thêm 190 ml nước khuấy đều dể cho
lắng và gạiỊ lấy dịch trong. Tiếp theo cho dung dịch vào bình nút nhám để Ị)ảo quản
khỏi tác dụịng của CO;. Ị

- Dung dịch Na2SƠ4 bão hoà.

56
 c. Tiến lìùỉìli

Lấy 5-10 m l nước chấm hay dịch dạm khác nhau từ 8-20g// cho vào bình
định mức lOOml, thèm vào đó mảnh giấv quì rồi trung hoà đến môi irường kiém
yếu. Tiếp theo cho vào lOml dung dịch axeiaí chì rói thém nước tới ngấn bình. Lác
đểu và dem kffi-rồi tấy 20m l cho vào bmh định mức khác có á m ^ lích l-Qtìml. Thêm
vào đó lOml dung dịch Na 2SƠ4 để khử lượng chì dư rồi đổ nước cấi lới ^gắn bình,
lác đều và đem ỉọc. '
Ị :

Lấy lOml dung dịch cho vào bình tam giác 250ml, nhỏ \'à®ị vài giọt
phenolphl^lein rồi trung hoà bàng NaOH 0,1N dến xuấl hiện màu hổng íìhạt. l'iế p
theo cho 5ml hỗn hợp formoU lắc đều rồi đế yên cho phản ứng. Sau 2*phúl đem
chuán hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 0,1N đến xiiàì hiện màu đỏ đậm (co thể màu
xanh tím)ị

d. Tính kết quả

Hàm lượng đạm amin tính theo công thức sau:

í / X 0.0014 /A '
N X 1000 = — (g//) ;
n n '

trong đó:

a: tó mỉ dung dịch NaOH 0,1 N tièu hao khi dịnh phân; i

ị

n: m l nước chấm tham gia Irong mẫu phân tích irong trường i|ơp cụ thế
cùa thí ngịiiệm (hệ số pha loãng): 1

' _ 50 20 , !
11=-— x - ~ x l O = lin l;
100 100

0,0Ỡ14: sô' gam niiơ với 1 Iiil dung dịch NaOl 1 0,1. ;

G /;| cìúr. Có ihể xác dịnh đạm amin bằng phương pháp iod (hợp chaịt đồng).

B à ị. 3; X á c ( l ị n h đ ạ m N I Ỉ Ị ( t r o n g n ư ớ c c h ấ m )
. . . . .

Nưđc chấm cũng như một sổ sản phẩm thực phấm khác thường ;chíra một
lượng NPÍị ở dạng mụối vô cơ hoặc hydroxyd. Hàm lượng cùa chúng tphii b u ộ c quá
trình sản xuất và điều kiện bảo quán. Nếu nước chấm chứa nhiều N H , thì không
những gây m ùi vị khó chịu, làm giảm chất lượng của sản phẩm mà có thể gây độc
hại cho cơ thể. Hạn chế sự tăng hàm lượiig N IỈ, trong sản phẩm là một yêu cầu
quan trọng trong kỹ thuật bảo quản ihực phấm.

57
 Để xác định ta lấy vào bình câì đạm lOml nước chấm sau đó cho thẽni
khoảng 50ml nước cất. Nối bình với hệ thống cất dạm rồi qua phều cho vào lOg
MgO (bảo đảm cho hỗn hợp có tính kiém) và tiến hành cẩt trong 30-40 phút ờ
nhiệt dộ khoảng 40-50“C. N H , bay ra cũng thu vào bình chứa axit siiníuric (tương
tự xác định dạm loàn phần).

Chu Ỷ:

1. Trong các phản ứng trung hoà dung dịch N H ì bay ra, khi phán ứng xác
định lượng H2SO4 dir bàng dung dịch NaOH 0,1N trước đây hay dùng chi thị là
rnethyl đỏ hay bromathymol xanh có pH bước nliảy gần 7, còn phenolphlalein
chuyển màu ở pH 8,2 (hơi kiềm mạnh). Vì vậy hiện nay người la hay dùng chi ihị
hỗn hợp là clìâì chi thị Tashiro có pH chuyển màu chính xác ơ pH = 7 thì màu
chuyển lừ màu tím trong mối trường axit chuyển sang màu xanh lá mạ trong môi
trường kiểm.

Chất chí thị Tashiro được chuẩn bị từ lOOml m ethyl đỏ 0,3% trong cồn +
15ml melhyỉen xanh 1% trong cồn.

2. Các bộ cất đạm dế thu N H , bay ra có thể tự lắp đơn giản nếu các phòng thí
nghiệm không có các bộ cất đạm đầy đù hệ thống từ bộ cất đơn giản, bộ cái phức
tạp có đử các bộ phận, bộ cất đạm tự động cao có cá bộ phận chuẩn và đọc số dịch
đo luôn.

3. Í3ộ vô cơ hoá các clìàì bàng H 2SO4 đạm dạc lừ vỏ cơ hoá đơn giản irêii bép
điện bếp cát, bếp dầu đến bộ vô cơ hoá kín nhiệt dộ cao sẽ rúí ngán được thời gian
vô cơ hoá.

Bải 4: Định lượng nitơcủa axit amiìì trong cỉĩè

A x it amin là thành phần cỉia protit. Bất kỳ Irong quấ trình trao đổi clìấl ở thực
vật hay trong quá trình chế biến chè, axit amin đều là những chất có hoạt tính hoá
sinh cao. Hàm lượng và thành phần của các axit amin có liên quan mật thiếl với
chất lượng của chè. Nói chung, trong chè thành phẩm loại tốt chứa nhiều axit amin
hcfn chè loại xấu. A x it amin góp phần tạo nên hương vị của chè. Do đó nấm vững
phương pháp phân tích axit am iii là một trong nhữiig phương pháp thực nghiệm

58
qua n trọng đ ế ngliiên CỨLI đ á n h giá phấin chất tốt hay xấu c ủ a ch è và tạo điéu kiện
tàng cư ờ n g hay g i ả m lốn ihất lượng axii aiiìin có irong chè,

a. N guvéỉỉ ỉâc

Trong chè có chứa nhiều loại axil ainin, chúng có thể tác dụng với photphal
dồng trong dung dịch đệm natri borat (Na.B^O?) dế lạo thành muối dồng hoà tan có
màu xanh. Sau khi axit amin tác dụng với pholphal-đồng, lọc bộ phận photphal
đổng còn dư, dùng axit axetic đế axit hoà dung dịch tạo đồng axetat, liếp đó cho KI
vào để chúng tác dụng với đổng axetal giải plìóns I 2 tự do. Dùng natri-thiosuníầl
định lượng I 2 sẽ tính ra lượng axit amin.

Sơ dồ phản ứng như sau:

COOH COO'
1
R - - c — NH2 R — Ò- NH3*
1 OH- ,1
H H

coo- c o o — Cu— o o c
Ị
2 R — - c — NH3^ + Cu** R c NH2 H 2N — c — R
1
H H H

c o o — C u -- o o c

R - c NH2 . N C R -»-2 C H ,C O O H —^ Cu(CH-,COO)2

H H

2 C u ( C H 3C O O )2 + 4 KI — 2 Cul -t- I2 + 4CH 3CO O K

I2 + 2Na2S203 — Na^S^Og + 2 Nal

/;. íỉ o á cììcíĩ

1. Dung dịch chì - axetat kiềm tính 5% (Cân lấy 50g pha trong 1 lít nước cấl).

2. Dung dịch natri-sunfat bão hoà (Cân 164g Na.S0 4 . 1 0 H 2 0 / l lít nước cất).

3. Dung dịch dồng-photphal Irong dung dịch dệm Na 2B4 0 7 .

4. Dung dịch CH.COOH 60% (60ml CH.COOH đậm đạc pha 1 lít).

5. K I tinh thể loại A , R hoặc c.p.

59
 6 . Dung dịch hồ tinh bột 0,5%

7. Dung dịch I Ỉ 2SO4 6 N: 16.7 ml H 2SO4 36N pha từ lừ trong 83,3ml nước cấl

8 . Dung dịch muối nalri tetraborat: cãn lấy 57,2 Ig muối natri telraborat

(Na 2B4 0 7 . I OH2O) hoà tan troiTg 1500 ml nước cất, cho ihêm lOOmi MCI IN . dùng
nước cất âiều chinh thành 2000 ml. Ị

9. bung dịch HCl IN (lấy 84 m l HCl 12N pha loãng thành 1000 m l).

10 Dung dịch Na 2S2 0 , 0,05N: cân lấy 12.5g Na 2S2Ơ:t tinh thể ichính xác
0 ,lg ) hoì, tan trong 1 lít nước cất đã đun sôi, sau đó lọc vào bình mấu, cê ốn định
dung dịca mỗi lít dung dịch có thể cho thêm 0 ,lg Na 2S2 0 v Sau đó cất g iir ở chỗ tô l
Cách xác: định nồng độ của như sau: cân lấy 0,05 đến 0,06g k i o , hoặc
KBrO , CỈIO vào bình có dung tích 5CX)mK cho thêm 50m l nước cất, lắc đệu cho tan,
tiếp tục (ĩho thém 100 ml dung dịch có chứa khoảng 3g K I, đồng thờỉ cho thêm
lOml H 2SO4 6 N. Để yên trong 3 phút, cho thêm 50 m l nước cất. Saii dó dùng
Na 2S2 0 ^(Ịã pha chế ở trên để chuẩn độ, trong quá trình chuấn độ: Lúc đậu lìẻn pha
tốc độ 120-130 giọt/ trong một phúl, lắc dều và khi dung dịch có màu vm g sáng thì
ngừng lạ lúc này gần đạl tới điếm cuối, tiếp tục cho ihêm 2 m l dung dịch hồ tinh
bột giảm tốc độ nhỏ giọt cho đến khi mâl hẳn màu xanh thì ihôi. Biêì được
các số 11^1 ta sẽ tính ra n ồn g độ c ủ a d u n g dị ch N íIị S ị O ,
I
c. Ọụiỉg cụ và rliiểt hị
1

- c||n phân tích có độ chính xác 1/ 1 0 0 ;

I

- niáy lắc, máy lọc hút, bình định mức các loại, bình chữ U;
ỉ

- binh tam giác loại: 150mU 250ml, pipel loại: Im l, 5nil, lOml;

- phễu lọc và một số dụng cụ Ihóng thường khác,

d. Tiếỉì lỉàtìli

Cl ìiíẩii bị diiỉìg dịch ĩìú iỉglỉiệm

Cân chíiih xác 2g chè đà nghiền níiỏ cho vào b ìn íĩ tăm giác có dung tích
150ml, cho thêm 30ml dung dịch chì axetat 5% kiềm tính, lại cho thêm 20ml nước
cất, đậy nắp lại, đặt Irong máy lắc, lắc 30 phiíl để kết tủa tạp chất, phân licác axit
amin. Lắc xong dùng máy híil lọc để lọc lấy dung dịch. Sau đó cho thêm lOmldung

60
dịch natri-sunfat bão hoà vào dung dịch đã lọc, khử ion chì còn dư trong dung dịch,
lại lọc qua giấy lọc sang bình định mức, dùng nước cất diềii chinh đến vạch khắc độ
(lOOinl), lắc đều, cất giữ làm dung dịch thí nghiệm.

Xl'ic clịiili t i i t ơ t r o n g a x i t aniiit

Dùiịĩg pipet hut íâý 2ỗmĩ dung dịch thí nghiệm cho vào bình định mức dung
tích 50m ll dùng dung dịch NaOH 0,1N cho từng giọt vào dung dịch A
d ' nghiệm,
dùng giấyi quỳ làm chất chỉ thị, điểu chỉnh sao cho dung dịch có pH: 8 9. Sau đó
cho thêm lOml đồng photphat trong dung dịch đến NajB 4Ơ 7, cho thêm nUPc cất đến
vạch khắc độ, lắc đều và dùng giấy lọc m ịn để lọc. Sau khi lọc xong, dùnậ pipet hút
lấy lOml ềung dịch đã lọc cho vào bình chữ ư , cho thêm Im l dung dịch i x i t axetic
60% cho Ịhêm Ig K I, lấc cho K I tan hết, sau đó cho thêm 5 giọt hồ tinh bột 0,5%
để làm c h ít chỉ thị. Dùng natri thiosunfat 0,005N để chuẩn độ dung dịcặ cho đến
khi mất nr^u. Gọi lượng nalri thiosiinfat đã dùng là V |(m l).

e.T ínli kếl quả

N(V, -v,).28.100
N ita c ủ a axit amin (mg %) =
G.(100-W )/100

trong đó:

N - nồng độ quy về nồng độ đương lượng gam của NaiSaO,;

V 2 -• lượng dư đã dùng để chuẩn độ kiểm chung, ml;

V, f lượng dung dịch natri thiosuníat đã dùng trong thí nghiệm, ml;

G -I trọng lượng của mẫu chè thí nghiệm, g;

w --độ ẩm của chè, %;

s- sô' lần pha loãng dung dịch;

28 - số n itơ của a xit amin tưcmg đương với 1 m l dung dịch natri hiosuníat
0,1 N.

Ghi chít: có thể định lượng các axit amin bằng phương pháp sắc ký giấy hoặc sắc ký
côt.

61
 lìài 5: Phương pháp xác địìiỉi ỉưìni iượtìg (Uìỉiỉỉ tự do (free a-amino
niirogen - FAN)

a. H ó a ciìííĩ

1. Dung dịch màu 3 g ninhydrin

1 0 0 g N a ,H P O „ 12 H ,0
3 g fructoza
6 0 g KH ,P 0 4

Hòa tan trong nước cất, định mức đến 1000 m l. Dung dịch màu này ờ chai
sảm màu trong điều kiện lạnh bảo quản được trong 2 tuần.

2. Dung dịch pha loãng

Hòa tan 2 g K IO , vào 600 m l nước cất và thêm 400 m l cồn 96%.

b. Phương pháp

- Pha locìng mẫu tới nồng độ 1-8 mg a-am ino nitrogen/lít (đối với dich dường
pha loàng 100 lẩn, đối với bia pha loãng 30 lần).

- Lấy 2 m l mầu đã pha loãng chuyển vào ống nghiệm và đạy bằng một hòn bi
thủy tinh để tránh sự mất mát do bay hơi.

- Thêm vào 1 ml dung dịch màu 1 1).

- Đun nóng trong 16 phúi trong nồi nước sôi liên tục, sau đó làm nguội irong
20 phút ở nước lạnh 25"c.

- Cho vào mổi ống nghiệm 5 m l dung dịch pha loãng (2).

- Lắc cán Ihận và đo độ hấp thụ tại 570 nm trong vòng 30 phútsaukhicho
thêm dung dịch ( 2 ) vào.

- Mẫu trắng dược chuẩn bị cũng với các mẫu thí nghiệm ở trên, chí khác là
thay 2 m l dung dịch mẫu bằng 2 ml nirớc cất.

c. Mầu clỉuẩỉì

Hòa tan 107,2 mg glyxin trong 100 ml nước cất. Dung dịch này được bảo
quản ở o o c, m ỗi lần ih í nghiệm pha loãng 100 lần. Dung dịch g lyxin đã pha loãng
chứa 2 mg a-am ino nitrogen/lít. Tiến hành các birớc tương tự như đối với mẩu dịch
đường.

62
 d. Tính toá/i

Hàm iượng a-am ino nitrogen (mg//) được tính như sau;
A, -2-F'
X-

trong đó:

A| - độ hấp thụ của dung ciỊcli thí nghiệm (dung dịch mẫu);

- độ hấp thụ của dung dịch chuân;

F - hệ số pha loãng.

63
 Chương 4
ENZIM

4.1. GIÓI THIỆU

Enzim hay còn gọi là ferment, là những chất men mang tính chất xúc tác các
phản ứng sinh học hay hoá học khác nhau. M ỗi enzim có khả nãng xúc lác cho mộl
sô' phản ứog nhất định. Hoạt động xúc tác của enzim càng mạnh thì l i r ^ g cơ chất
bị chuyển hoá hoặc lượng sản phẩm phản ứng được tạo thành trên một đơn vị tliời
gian và tnong một điều kiện nhất định càng lớn. V ì vậy ta không thể xác định trực
liếp hoạt động của enzim nhưng có thể xác định tốc dộ chuyển hoá của cơ chất
hoặc tốc đ ộ tích tụ sản phẩm tạo thành. Để đạl mục đích này ta có thế dùng nhiều
phương pháp khác nhau như: phương pháp đo độ nhớt, phưcmg pháp phân cực kế,
phương pM p áp kế, phưcfiig pháp quang phố kế, phương pháp chuẩn độ liên tục,
phương pháp sắc ký và phương pháp hoá học. Nhìn chung có thể chia ra hai loại
phương pbáp: phương pháp liên tục và phương pháp gián đoạn. Phương ịpháp liên
tục thường đồi hỏi những máy móc đặc biệt với bộ phận ghi tự động sự biến đối
liên tục cỏa hỗn hợp chất phản ứng trong suốt thời gian enzim hoạt động.

Trong phương p h á p gián đoạn, người ta c h o enzim tá c dụng với C0 chất, sau
những khỉiảng thời gian xác định lấy một ít hỗn hợp phản ứng dể định luiẹiig cơ chất
còn lại hay định lượng sản phấm được tạo thành.

M ột số khái niệm:

64
 Đơn vị hoạt dậ enzìm

- Đơn vị enzim quốc lế (UI) là lượng enzim có khả năng xúc tác chuyến hoá
dược mốt m icrom ol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuán.

Trong những điổu kiện xác clịnlì (bão hoà cơ chất), tốc dộ phản ứng do enzim
XIÌC tác tv lệ \'ới lượng enzim trong hổn hợp phán ứng. Lượng enzim ở dà y không
tính bằng mol hoặc m iligam mà dược biếu diẻn bằng dơn vị enzim ( 11 ); m ili đơn vị
(inU) hoặc k ilo dơn vị (kU).

1 U I =: 1 m icrom ol cơ chất (10-6 moD/phút

Kalal (Kat) là lượng enzim có khả nãng xúc lác chuyến hoá được một mol cơ
chất sau một giây ở điền kiện tiêu chuân.

I Kat = 1 mol cơchâì/giây

ỉỉo a t độ riêng của em ỉm

1 loạt dộ riêng của một chế phấin enzim dặc irirng cho dộ ihuần khiết của chế

phẩm enzìm. I loạt độ riêng được biếu thị bằngsố dơn vị enzim ứng với 1 ml dưng
dịch (nếu là cỉung dịch) hoặc 1 mg proíeiii (nếu là bột khò) cùa chế phẩm. Nếu chế
phám enzim đã tinh sạch, lioạt độ dược biếu ihị bầng số dơn vị enzim trẽn Ị rng
enzim.

lỉo a t dộ phán tử của eìĩiini

lio ạ l dộ phân lử của enzim là số phán từ cơ chấl (hoặc sổ đương lượng các
liên kết bị phân giải) dirực clìuycn hoá bưi ỉ phàn lử enzim sau 1 phút. Hoại độ
phân tử được tính toán lừ hoạt dộ riêng và khối lượng phân tử của enzim.

lỉo ạ t dộ của trung túm xúc tác eniim

I ỉoại d ộ c ủ a t ru n g tâ m XLÌC tác eii/inì là số phân lĩr c ơ c hất (hoặc số đương

lượng các liên kêì bị ph ân g iả i) dược chLiyển lioá trên niội trung l â m hoạt đ ộ n g sau

1 phúi. lỉo ạ l độ của trung lâm xúc tác enzim được línli toán lừ lioạl dộ phân lử và số

trung tâm hoạt động của phàn tử enzim.

Về nguyên tắc có thể chia làm ba nhóm phương plìáp sau :

65
 Đo lượng cơ chất bị mấi di hay lirợiig sản phấrn dược tạo thành trong một
thời gian nhất dịnli ứng với một nồng độ enzim xác định.

Đo thời gian cần ihiết ciể thu được một lượng biến thiên nhấtđịnh của cơ chất
hay sản phẩm i'mg với một nồng độ enzim nhấi dịnh.

Chọn nồng độ enziin như thế Iiào để trong một thời gian nhất định thu được
sự biến thiên nhất định về cơ chất liay sản phẩm.

Đế thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp khác nhau được sử
dụng: phương pháp đo quang phố, phương pháp đo độ phân cực, phương pháp đo áp
suất, phương pháp đo độ nhớt, phương pháp sắc ký và phương pháp hoá học.

Nhữiig điều lưu ý khi xác định hoạt độ enzim

- K hi tiến hành thực nghiệm cần tránh những yếu tố có thể gây biến tính
protein enzim. Các điều kiện phản ứng (pH, nhiệt độ, các cation kim loại...) phải ở
trong giới hạn enzim có thể tồn tại bền vững và giữ được ổn định trong suốt thời
gian phản ứng.

Với nhĩmg enzim cần có chất hoạt hoá hoặc chất làm bền thì phải cho các
chất này vào enzim trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng.

Xác định hoạt độ cần tiến hành ỏ pH thích hợp và cố định. pH thích hợp có
thể thay đổi khá nhiều luỳ thuộc vào cơ chất và thàah phần dung dịch đệm, lực ion
của dung dịch đệm (thường trong phạm vi 0 ,0 1 - 0 , 1 ).

Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzim
để đề phòng tác dụng kìm hãm enzim do nhiệt dộ cao.

- Nồng clộ cơ chất trong phản ímg enzim phải ở trong giới hạn thích hợp clủ
thừa để bão hoà enzim, nhưng không quá cao để đến mức kìm hãm enzim. Sau khi
dừng phản ứng lượng cơ chất bị chuyển hoá nằm trong khoảng 20 - 30%.

- Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 -3 0 phút. Tốt nhất là xác định tốc độ
ban đầu cỉia phản ứng (30-60 giây), vì giai đoạn này tốc độ phản ứng khá ổn định,
sau đó bất đầu giảm. Trong một sô' trường hợp hoạt độ của enzim quá thấp có thể
kéo dài thời gian phản ứng đến 1 giờ hoặc lâu hơn. Trong trường hợp này cán phải

66
cho ihêm vào dung dịch các chấi diệt vi sinh vạt và tránh dùng dung dịch đệm
Ihuạn lợi cho sự phát triển của vi sinh vậi.

- Khi xác định hoạt độ enzim phải làm mẫu kiểm chứng song song với mẫu
thí nghiệm. Trong mẫu kiểm chứng enziiTi đà bị làm vô hoạt trước khi cho vào tiếp
xúc với cơ chất.

- Khi chuẩn bị dung dịch enzim để xác định hoạt dộ, tuỳ theo đạc tính và
mức độ thuẩn khiết của chế phẩm enzim mà tiến hành chuẩn bị để có được dung
dịch eiizim trong suốt.

4.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT Lực ENZIM

4.2.1. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ NHỚT

Phương pháp này thường dùng khi cơ chất của enzim có độ nhớt lớn hơn
sản phẩm thuỷ phân của nó. Sự biến đổi độ nhớt của sản phấrn ứng trước và sau khi
cho enzim tác dụng là thước đo hoạt động enzim. Phương pháp này thường đế đo
hoạt đ ộ n g c ủ a enziĩTi a m il a z a , proieinaza, pectinaza, xen lu la za v.v.

4.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN c ự c KẾ

Phương pháp này thường dùng khi cơ chất của enzim hay san phẩm phân giải
của nó có khả năng làm thay đổi mặt phảng ánh sáng phân cực và góc quay riêng
của chúng khác nhau. Người ía thường dừng phương pháp này dể xác định hoạt dộ
của [3-fructofusanosidaza (saccaraza). Cơ chât cúa enzim là sacaroza có góc quay
riêng là -f66‘’5, sản phấm tliiiỷ phân của nó là glucoza và íVuctoza có góc quay riêng
lương ứng là +32*’5 và -92“5. Khi enzim tác dụng lên saccarozii, góc quay nghiêng
giảm dần và cuối cùng chuyển từ phái sang trái.

4.2.3. PHƯƠNG PHÁP ÁP KỂ

Phương pháp này được dùng khi enzim tác dụng tạo thành hay hấp thụ khí.
V í dụ: các phản ứng oxy hoá, decacboxit hoá, loại amin v.v. Ngoài ra có thể dùng

67
p h ư ơ n g p h á p n à y d ể x á c đ ị n h h o ạ t đ ộ c ủ a c á c e i i z i m m à i r o n g q u á I r ì n h p h á n Lhig

không trực tiếp làm biến đổi những thể tích khí nhưiig thông qua những phản ímg
trung gian tiếp theo có thể lạo thành hay hấp thự khí.

\ dụ: Phản ihig tạo thành axil do men lipaza xúc lác có thể dùng dung dịch
đệm bicacbonal đế tạo thành CO 2 hoặc các phán ứng lạo thành nhóm amin tự do
dưới tác dụng của peptid-hydroxylaza hoả, phán ứng có thê tác dung với axit nitơ và
lạo thành khí nitơ (phương pháp Vanslke). Đế đo sự biến dối thế lích khí thường
tiến hành phản ứiìg trong máy Varburg.

4.2.4. PHƯƠNG PHÁP P H ổ QUANG KẾ

Phương pháp này cần lượng nguyên liệu nghiên cứu rất lì, có độ nhạy cao,
cho phép xác định chính xác, nhanh chóng hoại độ của enzim. Vì vậy phương pháp
này được dùng rộng rãi nhấi trong nghiên cứu enzim. Trong irirờng hợp phán ứng
en zim k h ô n g làm biến đối rõ vết q u a n g p h ổ hấ p phụ cQng có thể sử d ụ n g phưcmg

pháp phố quang kế bàng cách cho ihêm vào hỏn hợp phản ứng một enzim khác có
tác dụng lên sản phẩm phản ứiig dế làm iliay đổi sự hấp phụ.

4.2.5. PHƯƠNG PHÁP CHUẨN đ ộ l iê n t ụ c

Phương pháp này thường dùng để nghiên cứu các phản img enzini mà kêì
quà của nó tạo ihành axit hoạc bazơ. Dùng thiết bị lự động thêm kiểm hay axil vào
để giữ pH môi trường phản ứng cố định, dồng thời ghi đường cong biểu cliẻn lượng
kiềm hay axit đã dùng. Tốc độ thêm kiềm hi\y axit đà dùng vào hỗn hợp phản ứiig
phản ánh tốc độ phản ứng enzim. Phương pháp này còn có thể dùng nghiên cứu các

oxydoreduciazii bằng cách đo thế oxy hoá khử.

4.2.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Phương pháp sắc ký trên giấy thường đùng để xác định hoạt độ các enzim
phân giải hoặc chuyển hoá các axit amin (gluiam ai cacbonxylaza. alamin
aminolransferaza...). Sau khi cho enzim tác dụng với cơ chất một ihời gian, lấy mộl

6R
ít hỗn hợp pliản inig chấm lên giấy sắc ký \’à tiến hành sãc ký theo phương pháp
thông thường, hoặc cho hồn hợp lẽn ináy axit amin tự động. Kết qua dịnh tính và
định lirợng axit am iii còn lại hay mới lạo ihành trong phan ứng cho phép xác dịnh
lioạt dộ của enzim. Phương pháp sắc ký đòi liò i thời gian dài hơn (vài giờ nhưng có
lliế cho kết quả cụ thể tẽn \'à lirợng của các sản phấm được lạo thành, \'ì vậy thường
được clùiig trong nghiên cứu enzim).

4.2.7. PHƯƠNG PHÁP HOÁ HỌC

Phương pháp Iiày Uiường dìing các phan ứng hoá học khác Iihau đế dịnh
lircíng các chất bị mất di hay tạo thành trong dung dịch dưới tác dụng của enzim.
Các phản únig được tạo thành thường là các phán ứng màu đặc trưng như phản ứng
biiire, phản ứng với thuốc thử fo lin của protein. Ngoài ra có thể dùng các phản ímg
kliống đặc tiamg như phản ứng của đường khử với thuốc thứ íelling, phán ứng của
axit \’ới bazơ.
Nhìn chung đế xác địiih hoạt dộng cúa một enzim nào đó thường sử dụiig
một trong các phương pháp kể trẽn, theo dõi hoặc xác định sự biến đối lượng cơ
chất lioặc sản phám phản ứng sau klioảng thời gian xác dịnh dưới tác dụng inột
lượng enzim nhất định. Tuy nhiên trong một số trườiig liợp cũng có thể tiến hành
theo cách khác; ví dụ xác d ịn li thời gian cần ihiêì để tạo nôn mộl sự biến đối xác
định cỉia cơ cliấi hoặc sàn phẩm phán i'mg dưới tác dụiig ciia một lượng enziin nhất
định, hoặc ngược lại giữ tliờ i gian phản ứng cổ' dinh chọn nồng clộ enzim cần thiết
để thu được một sự biến đổi xác clịiih của cơ chất hoặc sản phẩm phản ứiig. Tuỳ

theo yêu cầu và diều kiện thí nghiệm cần lựa chọn phương pháp thích hợp và sử

dụng IIÓ liợp lý ciể xác clịnh hoạt độ enzirn.

Mírc độ hoạt động của enzim trong một chế phẩm là một thông tin quan
trọng về lượng enzim trong đối iưựiig nghiên cứu, vì ràng trong những điều kiện

nhất định, tốc độ phản lìmg do eiizim xúc tác tỷ lệ với lượng enzim có trong hỗn hợp
phản ứng. Lượng eiư im ở đây không tính bằng mol hay m iligam mà dược biểu diễn
bằng dơn vị hoạt độ enzim (U). Theo quy ước quốc tế, đơn vị tiêu chuẩn của enzim

69
là lượng enzim có khả năng xúc tác chuyển hoá một m icrom ol cơ chất sau 1 phút ở
những điều kiện xác định cho trước.
ITiông thường tiến hành xác định hoạt độ ở 30"c, với pH và nồng độ cơ
chất thích hợp đổi với từng loại enzim nghiên ciru.

Clìú ý:

a. Trong trường hợp enzim phân giải mộl số liên kết của phân tử cơ chất, ví
dụ proteinaza, amilaza với cơ chất linh bột thì đơn vị tiêu chuẩn của enzim không
tính theo m icrom ol cơ chất bị chuyển hoá mà tính bằng micromol đương lượng của
các nhóm tương ứng được tạo thành. Nói cách khác là không tính theo lirợng cơ
chất bị chuyển hoá mà tính theo số liên kết (peptit hoặc glucozil) bị phân giải.

b. Trong trường hợp phản ứng giữa hai phân tử theo kiểu A + B = c + D, thì
đơn vị enzim xúc tác chuyển hoá 1 micromol cơ chất A hoặc một micromol cơ chất
B, hoặc 2 micromol cơ chất A (hoặc B) nếu A =B sau một phút.

c. K h i xác định hoạt độ enzim trong dịch ihể thì tính đơn vị enzim trên
lOOOml dịch thể.

d. Có thể dùng các ước và bội số thập phân của đơn vị để biểu diễn hoạt độ
của enzim, ví dụ m ili đơn vị (m ư ), kilo đơn vị (kU).

Nhờ có quy lắc thống nhất về đơn vị enzim mà ta có thể so sánh hoạt độ của
các enzim khác nhau hoặc các chế phẩm khác nhau của cùng một enzim. Đ ố i với
m ỗi chế phẩm enzim, ngoài việc xác định mức độ hoạt động của nó cần phải đánh
giá độ sạch của chế phẩm. Hoạt lực riêng là đơn vị đặc trưng cho độ sạch của
enzim. Hoạt lực riêng đều đánh giá hay biểu diễn bằng số đơn vị enzim irên Im g
protein. Ngoài ra nếu biết chính xác trọng lượng phân tử của enzim có thể lính được
hoạt độ phân tử của nó. Hoạt độ phân tử của enzim là số phàn tử cơ chất (hoặc số
đircmg lượng của nhóm tương ứng) bị chuyển hoá dưới tác dụng một phân tử enzim
sau một phút. Nếu biết được số trung tâm hoạt động độ trung tâm xúc lác. Nó là
phân lử cơ chấi bị chuyển hoá sau một phút tính trên một trung tâm xúc tác. Nếu
phân tử enzim chỉ có một trung tâm xúc tác thì đại lượng này irùng với hoạt độ
phân tử enzim.

70
 Nồng độ enzim trong dung dịch thường được bicu diễn băng số dơn vị hoạt
động trên ỉm l dung dịch.

4.2.8. NHỬNG ĐỈỀU Lưu Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZIM

Bản chất hoá học của enzim là protein nên enzim không bền vừng rất nhạy
cảm với lác nhân lý hoá học. Vì vậy khi làm thí nghiệm \'ới enzim cần tránh các
yếu tố có thể gây biến tính protein như nhiệt độ cao, pH quá axii hay kiềm, các kim
loại nạng hay muối của chúng. Ngoài ra cần tránh tạo bọt trong dung dịch Vỉ m ội số
enzim có thể bị kìm hãm trên bể inặl phàn cách. Để đảm bảo chính xác hoạt động
enzim cần bảo đảm các điều kiện sau;

a. Các diều kiện ỊDhản ứng (pH, nhiệt độ) phải ờ Irong giới hạn enzim có thể
tồn tại bền vữiig và được giữ cố định trong suốt thời gian phản ứng trong dung dịch
đệm với pH xác định, binh hỗn hợp phản ứng đặt trong máy siêu ổn nhiệt. Dung
dịch cơ chất và enzim phải đạl đến nhiệt độ cần thiết trước khi cho vào phản ứng.
Đối với các phản ứng lạo thành axit cẩn ước lượng dung dịch đệm ihế nào đế cho
pH không bị thay đối nhiều.

b. Phản ứng enzim được tiến hành trong điều kiện thừa cơ chất và coíactơ
(nếu enzim cần thiết coíactơ). Cần tính trước lượng cơ chất thế nào dể sau khi kêì
thúc phản ứng, cơ chất bị chuyển hoá không quá 2 0 % lượng bán đầu. tuy nhiên
cũng cần chú ý rằng nồng độ cơ chất hay cofactơ quá lớn có thể kìm hàm enzim.
Để xác dịnh nồng độ thích hợp cho phản ứng enzim có thể làm như sau: Xác dịnh
tốc độ phản ứng với 1 nồng độ enzim xác định, sau đó tăng lượng enzim lên gấp
đôi, nếu tốc độ phản ứng cũng lăng lên gấp hai lần có nghĩa là nồng độ cơ chất đã
thích hợp và nồng độ phản ímg chi phụ thuộc vào lượng enzim. Kết quả xác định
hoạt độ phản ánh đúng hoạt động xúc tác thực của enzim.

c. Thời gian xác định hoạt dộ thường không quá lâu, thường là 5-30phiíl, lốt
nhất là xác định tốc độ ban đầu của phản ứng (30-60 giảy) vì ở thời gian đầu phản
ứng tốc độ iưưng đối ổn định sau đó bắt đầu giảm. Điều này do nhiều nguyên nhàn
khác nhau như do sự giảm nồng độ cơ chất, do tác dụng kìm hãm của các sản phấm
được tạo thành hoặc do enzim bị phá huỷ trong quá trình phản ứiig.

Trong một số trường hợp, hoạt độ của enzim quá thấp có thể kéo dài thời
gian ủ enzim lên đến 1 giờ hoậc lâu hơn nữa.

71
 K lii xác dịiih hoạt độ enzim bên cạnh mảii thí nghiệm (enzim tác dụng với cơ
chất) cần làm mẫu kiểm Ira. trong đó enzim đã bị mất hoạt dộng trước kh i tiếp xúc
với cơ chất, bàng cách đun sôi dung dịch enzim trước khi cho vào hỏn hợp phàn
i'mg. Hoạt độ cũa enzim được tính bằng hiệu sỏ' lượng cơ chất hoặc lượng sản phám
phản ứng... giữa mầu thí nghiệm và kiểm tra.

4.2.9. CHUẨN BỊ DUNG DỊCH ENZIM ĐỂ x á c đ ịn h h o ạ t đ ộ x ú c t á c

Dung dịch enzim cần được loại hết tế bào vi sinh vậy hay cơ chất nuôi cấy
nó, chứa nó thường có hai loại:

Enzim ngoại bào: nếu vi sinh vật nuôi trong m ôi trường lỏng, sau khi nuôi
cấy ly tâm lạnh môi trường ở 500-600 vòng/phút để nhận được dung dịch trong
suốt.

Nếu vi sinh vật nuôi bằng phương pháp bề mặt sau khi nuôi cấy, cân 10-20g
môi trường, chiết rút bằng dung dịch đệm tương ứng pH xác định dê enzim có tliê
tồn tại bền vững. Lượng dung dịch đệm dùng để chiết rút gấp 10-20 lần đối trọng
(khoảng 200ml). Lọc dịch nhận được qua giấy lọc xếp được ly tâm để nhận được
dung dịch trong suốt.

Enzim nội bào: Trước hết cần phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Để phá vỡ
màng tế bào có thế dùng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp cơ học
dùng siêu âm hoặc dùng enzim. Tuy nhiên cần chọn phương pháp thích hợp sao cho
không ảnh hưởng đến hoạt động của enzim nghiên cứu. Tiếp theo chiết n it và lọc để
nhận được dung dịch trong suốt.

4.3. THỰC HÀNH

Enzim rất đa dạng về chủng loại và được ứng dụng rộng rãi trong công
nghiệp nên số lượng các bài thực hành vể xác định hoạt độ enzim rất phong phú.
Những thí nghiệm đại cương về enzim hay chuyên sâu có thể tìm thấy ở các tài liệu
Thí nghiệm Hoá sinh rông nghiệp hay Thí nghiệm chuyên ngành công nghiệp lên
men. Trong khuôn khổ giáo trình này chúng tôi chi nêu một số bài thí nghiệm hay

72
dùĩig đế kiêm tra chất lượng cua bán íliành pliâm hay thành plìấm Irong còng
nghiệp chế hiến ihực phám.

4.3.1. ENZIM PROTEOLITIC

Vé nguyên tác, enziin proteolitic xúc lác cho phán ứng ihủy phân các lièn kết
peptit;
R -C ll-C O -N H -C H R ' + H .o ^ R C Il-C O O H + H ,N -C 1 IR ’

Nói chung các cnzim thuộc nhóm nàv có lính clìuvến hoá cao đến vị trí của
liên kết pcplil, bản chất các axil amin iham gia trong ỉién kết peptil, nhiều enzim
proteolitic còn có thế xúc lác phán ứng thiiý pháii liên kết este, liên kếl amit và
phản ứng chuyển vị gốc axii ainin. Vì vậy để xác định hoạt độ nhiều enzim
proteolilic có thế dùng nhiều loại cơ châì khác nhau; các prolein hoặc peptit tư
nhiên hoặc tổng hợp, các esle và axil cùa axii amiiì. T iiy từng loại enzim cán chọn
cư châì thích hợp. Sau dáy là nìộl so plurơng pháp Ihirờng dùng đế xác định hoạt dộ
mội số enzim proteolitic.
Bài I : Xác dịnh hoạt độ phân giải protein bànị* phương pháp chuẩn độ
Fonìiol

a. N ^u yè n ĩắ c

Theo mức dộ thủy phân prolein, nhóm cacboxvl và amin (NH 2 ) tự do trong
dung dịch tăng lên dán, do đó có thế dựa vào sự tang một trong các nhóm này dế
xác dịnh hoạt độ enzim.

Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng tbrmol bao Vày nhóm amin và chuấn
dộ nhóm cacboxyl bàng dung dịch kiềm có nồng dộ xác clịnh. Từ lượng kiềm đã
dùng dế chuán độ lưựng m iligam dạm amin tưưng ứng. Phản ứng chủ yếu:
H H
R— c — COOH + HCHO R— c- •COOH + H,0

NH2 N=CH2

H H
R— c COOH + NaOH R— c — COONa + H^O
N=CH2 N=CH2

73
 Hoạt động enziin ở đây được tính bằng m iligam đạm amin được tạo thành
sau 1 giờ ở điểu kiện nhiệt độ và pH xác định, cũng có thể tính bằng đơn vị hoạt
động enzim. M ột đơn vị hoạt động là lượng enzim mà sau 1 giờ ở 4 0 "c và pH thích
hợp có thể phân giải proteiii tạo thành 1 mg đạm amin

b. Hoá chất:

- Dung dịch đệm có pH thích hợp cho từng loại enzim.

- Dung dịch gelatin 2%: càn 2g gelalin sạch, ngâm trong cốc thuỷ tinh với
15-20ml nước cất trong 30phiìt, sau đó cho 25-40ml dung dịch đệm và đun cách
thiiỷ ở 70-80"C khuấy đều bằng đOa thuỷ tinh cho đến khi hoà tan hoàn toàn, thêm
dung dịch đệm vào lOOml. Dung dịch có thế giữ trong tủ lạnh 2-3 ngày. Trước khi
dùng đun nóng đến nồi cách thuỷ cho đến 40"c

- Dung dịch thymolphtalein 1% trong cồn 50%

- Hỗn hợp íormol: Cho Im l dung dịch thym olphtalein vào 50 m l dung dịch
íorm ol 40% cho vài giọt dung dịch NaOH 0,1N đến khi có màu xanh nhạt.

c. Tiến liâiìli

Chuẩn bị 2 bình tam giác lOOml.

Bước 1 (thí nghiệm) cho vào lOOml dung dịch gelatin 2% trong dung dịch
đệm có pH thích hợp cho hoạt động tìmg loại enzim, thêm 5ml dung dịch
proteinaza, lắc đều giữ ở nhiệt độ 40"c trong Igiờ. Sau 1 giờ lấy bình ra khỏi tủ ấm,
thêm lOml hỗn hợp form ol và chuấn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất
hiện màu xanh da trời.

Bình 2 (kiểm tra) cũng làm như trên nhưng cho dung dịch íorm ol vào với
gelatin, lắc đều rồi mới cho dung dịch enzim vào ở diều kiện này enzim bị kìm hãm
hoàn toàn, sau đó cũng tiến hành chuẩn độ song song với bình thí nghiệm cho đến
khi có màu xanh giống ở màu của binh thí nghiệm.

d. Tíiili kết quả

Hoạt độ phân giải protein của Im l dung dịch nghiên cứu là:

Hdp = (a - b).l,42 .f/(t.v) đơii vị

74
trong đó:

a: sô' ml dung dịch NaOH O.IN dìing đế chuẩn dộ bình thí nghiệm;

b: số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng chuẩn bình kiểm tra;

f: hệ số chỉnh lượng dung dịch NaOH 0, IN;

l: thời gian enziin tác dụng (giờ) ;

v: thể tích dung dịch enzim đã dùng (m l) ;

1,42: Là số mg đạm amin tương ihig với 1 ml dung dịch NaOH 0, IN.

Dựa trên nguyên tắc của phương pháp nêu trên, hiện nay các chế phấm enzim
hay gặp thường được xác định theo một số phương pháp đơn giản hơn và có cải
tiến.

Chế phẩm enzim proteaza dùng trong sán xuấl, từ nấm mốc theo phương
pháp bề mặt.

Hoạt độ proteaza (Hđp) là khả nâng xúc tác thủy phân protein đến peptit và
axit amin. Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định hoạt độ proteaza của các
chế phẩm enzim. Sau đây chúng tôi xin giới tliiệii vài phương pháp hiện được áp
dụng nhiều ở nước ta.

lỉài 2: Xác định hoạt độ phán giải protein hằng phương pháp Vintette và
Vanxmit

íi. Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên cơ sở xác định nhóm cacboxyl của peptit và axit amin
được tạo Ihành do thuỷ phân protein. Theo phương pháp này, một đơn vị hoạt độ
proteza là lượng enzim có khả nàng xúc tác thuỷ phủn protein để tạo ra Im l đạm
amin trong Ig iờ ở điều kiện 4 0 "c và pH thích hợp (7,38 hoặc 4,49)

b. Hoá chất

Chuẩn bị dung dịch đệm từ các dung dịch sau dây:

- Dung dịch Na 2HP 0 4 : Cân 1 1,876 gam rồi hoà tan thành llí t

- Dung dịch K H 2PO 4: Cân 9,087 gam rồi hoà tan th à n h l l i t

75
 ' Muốn có dung dịch đệm pH = 7,38 ta lấy 8 ihế tích dung dịch NÌI2HPO 4 hoà
lẫn 2 the tích dung dịch K H 2PO4.

- Muốn có dung dịch dệm pH 4,49 ta lấy một thế lích dung dịch jNa2HP (34
hoà lẫn \'ới 9 ihể tích dung dịch Na 2FỈP0 ^

- Dung dịch gelatin 5%: Cân 5 gam gelatin vào cốc nhò rói làm t r ư ơ n g với
15-20ml nước trong khoang 15phút. Sau đó thêm vào 20-25 m l dung dịch dệm có
pH thích hợp (với nước chấm lấy dung dịch có pH = 7,38) rồi dun tới 70-80"C.
Khuấy cho tan rồi rói vào bình định mức lOOinl. Tiếp theo lại cho dung dịch đệm
vào phần chưa lan và làm lương tự cho đến khi geỉatin tan hoàn toàn. 'ĩấ t cả chuyến
\'ào bình định mức lOOml làm nguội tới 20”c rồi ihêm dung dịch đệm đến ngấn
bình. Dung dịch này có thể bảo quản 2-3 ngày ở nhiệt độ 2-5‘t

“ Dung dịch thimolphtalein ì% trong cón 90%

- Dung dịch NaOH OAN

- Dung dịch chiếl enzim; cân 10 gam chế phám nấm mốc, nghiền nhó trong
cối sứ hoặc ih iiỷ tinh với ít cát và 5ml nước. Tiếp theo cho iOml dung dịch đệm
chuyến vào cốc thêm 85 ml nước (tổng cộng ỈOOrnl) và giữ ở nhiệt dộ 30''c trong
nửa giờ và đem lọc*

c. Tiến lià iỉli

Dùng pipet lấy 10 ml cÌLing dịch gelalin cho vào ống nghiệm, xong dặl vào
nồi cách thuỷ có nhiệt dộ 40"c. Sau 10 phút ta cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch
chiết enzim, lắc đều và lấy ngay 1 ml hỗn hợp cho vào bình tam giác lOOml dã
chứa sẩn 20ml cồn 96% và 6 giọt thiinolphlalein. Lắc dều rồi clìLián độ bằng dung
dịch NaOH 0,19í dến xuất hiện màu xanh da trời. l ỉỏn hợp còn lại giữ thôm 3 giờ ờ
nliiệl dộ 40"c. Sau đó lấy ra Im l cho vào bình tam giác chứa sẩn 20ml cồn 96% và
6 giọl thimolphtalein. Tiếp theo đem chuán bằng (lung dịch NaOH 0,1% đến xuất

hiện màu xanh da trời.

d. Tínlì kết quả

Hoại độ proleaza tính theo cồng thức:

Hđp = (a-a„).v.l,4/(l.n.), đơii vị/g

76
irong dó:

a, Uí,: số ml dung dịch N aO lỉ 0,1N tiêu hao trong ih í nghiệm trước và sau
ohàn img men;

\'; thể tích hồn hợp phan ứng { 12 ml);

1,4; sổ ing dạm amin tương ứng với Im l dung dịch NaOH 0 ,lN ;

t: thời g ia n phả n ứng ;

n: số gam chế phám men tham gia trong phản ứng ;

n = 1 0 .2 / 1 0 0 = 0 ,2 gam.

Nếu ih í nghiệm liến hành \'ới những dicLi kiệỉi cụ thế trôn thì la cớ hoạt độ
proteaza

Help == (a-a„) .12.1,4/(3.0,2) = 28 (a-Uo), đơn vị/g

Bùi 3: Xác dịnh dộ làm dóng sửa

(ỉ. N,iĩiiycti ỉác

Eìn/.im proteolelic có khả nũng làm dòng sữa inạnh nhấl là renin có trong dạ
dày bê con dã biết từ lâu. Tuy Iilìiên Iigiiỵẻn liệu nay không du cung cáp enzim cho
kỹ n g h ệ làm p h o m a t. Vì vậy m a y chục năm gán dá y người ta ngh iên cứu d ù n g CÍÍC
proleinaziì thực vật \'à vi sinh vặi dế thay thế reiìiii. Ẩiì Độ dang dùng các proleiiuiza
thực vật đặc biệt là enzim cứa Piciis-carica ĩrong sán xiiảì íbniat. 'l\iỵ nhiên khi
dùng proteinaza của thực vật, phomal thường có \'Ị dắiìg vì vậy hiện nay người la
chiì ý nghiên cứu sứ dụng proleinaza vi sinh vật, Irong dó proteinaza lừ Miicoì'
pusilus Liỉiílí có lìoại dộng làm dông sữa khá niạnlì nên còn gọi là Miicor reiỉiiì.

Xác dịnh hoạt độ làm dòng sừa cần ihiết vào thời gian cần thiết đế làm đòng
dung dịch sữa dã loại mỡ, có nồng dộ xác dịnh. Để so sánh hoạt dộ làm đông sữa
của các chế phẩm khác nhau dùng lích số lượng enzim (E) và thời gian (t). Lượng
enzim tính bàng m iligam , ihời gian líntì bằng phúi hay giây. Tích số Et càng lớn,
hoại động càng yếu.

h. líoâ chất

Dung dịch bột sữa đà loại mỡ 10% trong CaCl2 0,01 M

77
 c. Tiến hành

Cho 0,5 ml dung dịch enzim vào ống nghiệm dung tích 25 m l, thèm 5ml
dung dịch sữa 10% trong CaCỈỊ 0,0 IM . Tất cả các dung dịch phải đạt 35"c truớc
khi trộn vào nhau. Tiếp tục giữ ở 35"c, ghi thời gian tạo thành kết tủa protein của
sữa. Dung dịch enzim cần pha loãng thế nào để thời gian làm đông sữa vào khoảng
5 phút.

d. T í n h k ế t c/uả

Đơn vị hoạt độ là lượng enzim mà trong điều kiện thí nghiệm này làm đông
dung dịch sữa trong 1 phút tương đương 400 đơn vị.

Hoạt độ riêng là số đơn vị trên m iligam protein.

Chú ý

a. Để xác định được chính xác thường làm 3 ống nghiệm song song, thêm
renin vào mỗi ống nghiệm cách nhau 1 phút, lắc cấn thận, quan sát ống nghiệm vào
theo dõi đồng hồ bấm giây để ghi thời gian. Thời gian làm đông sữa ở 3 ống
nghiệm phải cách nhau không quá vài giây.

b. Trước khi làm thí nghiệm phải làm thí nghiệm sơ bộ để tìm độ pha loãng
thích hợp của dung dịch enzim sao cho thời gian làm đông sữa vào khoảng 5 phút.

c. Để dễ quan sát, chuẩn bị ống nghiệm nhỏ hơn và đimg mực đỏ pha loãng
đặt vào ống nghiệm lớn hơn và ghi thời gian từ khi cho dung dịch enzim vào đến
khi xuất hiện kết tủa trên nền đỏ.

1. Hoạt độ các chế phẩm proteaza có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn thường
được xác định ở các trị số pH sau:

pH = 2,5 ± 0,2 đối với proteinaza axit

pH = 5,5 ± 0,2 đối với proteinaza hơi axit

pH = 7,2 ± 0,2 đối với proteinaza trung tính

pH = 9,5 ± 0,2 đối với proteinaza kiểm

2. Dung dịch enzim

2a - Đ ối với proteinaza axit: (pH của hỗn hợp phàn ứng là 2,5 ± 0,2): cân Ig
chế phẩm phản ứng trên cân phân tích, chà cẩn thận chế phẩm bàng que thuỷ tinh

78
trong cốc nhỏ với một một ít dung dịch clệm vạn năng 0,1 M pH 2,5. Sau đó chuyển
toàn bộ vào bình định mức dung dịch 1 0 0 ml và thêm đung dịch đệm này đến vạch
mức. Nếu muốn pha loãng dung dịch enzim thì cũng dung dịch dệm vạn năng
0,1M , pH 2,5 để pha loãng.

2b. Đ ối với loại proteinaza hơi axit: (pH hỗn hợp phản ứng là 5,5 ± 0,2): cân
0,1 - Ig chế phẩm nghiên cứu trên cân phân tích, chà tiếp chế phẩm trong cốc nhỏ

bằng que thiiỷ tinh với một lượng nhỏ dung dịch đệm vạn năng 0,1 M, pH 5,5. Sau
đó chuyển toàn bộ vào bình định mức 100 ml \ à dùng dung dịch đệm này pha đến
vạch 1 0 0 ml.

2c. Đối với loại proteinazíi trung tính; (pH cỉia hỗn hợp phản ứng là 7,2±0,2).
Cân 0 ,1 -lg chế phẩm nghiên cứii và chà kỹ trong cốc nhỏ bằng que thuỷ tinh với
một ít dung dịch đệm vạn năng 0,1 M , pH 7,2±0,2 . Chuyển toàn bộ vào bình định
mức 100 ml rồi pha dung dịch đệm này đến vạch mức. Pha loãng dung dịch enzim
tiếp bằng dung dịch đệm vạn năng 0,1 M , pH 7,2.

2d. Đ ối với proteinaza kiềm tính: (pH của hỗii hợp phản ứiig 9,5±0,2). Cân
0 , 1- lg a m chế phẩm nghiên cứu và chà cẩn thận trong cốc nhỏ bằiig đũa thuỷ tinh

và cho ít dung dịch đệm vạn năng 0,1 M , pH = 9,5 chuyển toàn bộ dung dịch sang
bình định mức 100 m l rồi thêm dung dịch đệm đến pH 9,5 tới vạch mức. Pha loãng
tiếp theo dung dịch enzim cũng bằng dung dịch đệm vạn năng này.

3. Dung dịch cazeinatnatri (pH = 2.5)

3a. Đ ối với proteinaza axit (pH = 2,5): cân 2g cazeinatnatri khô và hoà tan
trong 90ml dung dịch đệm 0,01 M pH = 5,5. Sau dó đưa pH của dung dịch xuống
2,5 bằng cách thêm vào 3,0-3,5 H C l 1 N. Khi Iixit lìoá dung dịch cazeinatnalri bằng
axit clohyđric xuống thấp hơn 5,1 (pH< 5,1) thì dung (lịch bị vẩn đục chút ít (tạo
thành các váng nhỏ), còn ở pH = 4,8 sẽ có các váng lớn lắng xuống và hỗn hợp
phân thành 2 pha kết tủa và dung môi. K hi axit hoá tiếp tục, dung dịch cazeinatnatri
bằng HCl cho tới pH = 3,1-3,2 thì các váng lắng bị hoà tan dần và ở pH = 3,05-
3,00 lại thu được dung dịch đồng nhất và khi pH = 2,5 hoặc pH < 2,5 ta vẫn được
dung dịch đồng nhất.

79
 Vì vậy phải tliè'm HCl ihại nhanh cho tới pH = 3 và kliuấy mạnh liên lục
dung dịch, tiếp đó thêm lừng giọt dung dịch cho tới khi dung dịch có pl 1 = 2,5.
Cuối cùng chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức dung tích lOOinl và dung
dịch đệm vạn năng 0,1 M pH 2,5 cho tới \’ach mức.

3b. Đối với proteinaza liơi axit (pH = 5.5)

Hoà tan 2 g cazeinatnatri khô trong 90 m l dung dịcli đệm van nâng 0,1 M có
pH = 5,5. Thêm một vài giọt dung dịch HCl 1 N dể đưa pH của dung dịch cơ chấl
về 5,5. Sau đó chuyên toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml \’à thêm dung
dịch đệm 0.1 M pH 5,5 cho đến vạch.

3c. Đối với proteinaza trung tính (pH -- 7,2)

Hoà lan 2g cazeinatnatri khô vào 90ml dung dịch dệm \'ạn nàng 0,1M có
pH = 7,2. Nếu pH của cơ chất < 7, thì thêm từng giọt NaOH IN cho tới pH = 9,5.
Chuyển dung dịch sang bình định mức lOOml và thêm dung dịch đệm O.IM pH 9,5
đến vạch. Để rút ngắn thời gian hoà tan c;izeinatiiatri người ta plia duiig dịch cơ
chất ở 70"c irêii máy khuấy từ. 'rhời gian bảo quản dung dịch cazeiiialnatri 2%
trong tủ lạnh không quá 2 ngày.

4.3.2. KIỂM TRA HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHẾ PHẨM ENZIM AM ILAZA
TRONG CÒNG NGHIỆP

Bài 4: C h ế phẩm nấm mốc dùng trong sản xiiăt rượu

a. N ị^iiyc^ii tắc

Trong sản xuất rượu người ta thường đánh giá c h ít lượng của các chế phẩm
nấm mốc theo các chỉ số sau: hoạt độ amilaza, malt;iza, gliicoamilaza, và
dcxtriiuiza. ở ta hiện nay chỉ đánh giá theo hệ số Linơ. Chi số này có thè dùng dể
so sánh chấl lượng của chế phẩm sản xuất ra trong tìmg ihời kỳ và ở các nơi khác
nhau nhưng chưa phản ánh đầy ciủ bản chất của liệ enziin dường hoá tinh bộl.
Phương pháp xác định chi số Linơ còn nhiều chỗ chưa hợp lý và chưa có quy định
thống nhất, vì thế trong tương lai gẩn cần cải tiến \'à dùng các phương pháp phù hợp
chính xác hơn.

80
 lio ạ t độ amilaza có thê đánh giá theo một irong hai phương pháp so màu sau
đây.

So màu hằng nuìt thường

1 'heo phương pháp này người ta dánh giá hoại độ amilaza theo khả nãng ihuý

phàn tinh bột của enzim chứa trong Ig chế phám đến sán phâiĩi không cho màu với
iod \ ’à biếu diễn bàng đơn vị.

Đơn vị hoạt động amilaza là lượng men có khả năng phân giải Ig tinh bột tan
thành siìh phám không cho màu với iod trong thời gian 1 g iờ và ở điều kiện nhiệt độ
30'’c , pH = 4,7-4,8. I

b. Hóa clỉấỉ

Pha dung dịch đệm axetat natri 1

' Dung dịch axii axeiic IN : lấy 57,25 ml (hoặc 60,12g) axit axetil' tinh khiết
Ị

rồi pha thành Hít. I

“ Dung dịch axetat natri IN : Cân 82,09g axetat natri rồi hoà thànlì 1 lít dung
í

dịch. ị
1
- Dung dịch đêm pH 4,7-4 ,8 nhận được khi pha 2 dung dịch trên lệ 1:1

- Dung dịch đêm pH = 6 nhận được khi pha một thể tích axit assetic với ỉ 6
ih ể tích a x e ta t nalri. Ị
I

DUng dịch tinh bột 1%. Cân l , lg tinh bột vào cốc, sau đó cho ml nước
lạnh và lắc đều rồ i cộng thêm khoảng 30ml nirớc nóng 50"c. Khuấy đềulrồi đặt vào
đun cách th iiỷ cho đến khi tan hoàn toàn. Để nguội rồi chuyển toàn tịộ vào bình
định mức lOOml sau đó cộng thêm lO iĩil dung dịch đệm axetat có pH =14,7-4,8 rồi
dổ dầy nước cất đến ngấn bình (trường hợp xác dịnh hoạt độ amilaza c ỉiị chế phấm
vi khuẩn thì lấy 1 0 m l dung dịch đệin có pH = 6 ). I

Dung dịch iod: cán 4,4g K i và l,4g I 2 tinh thể. Sau đó cho tất c|i \’ào lọ và
cộng thôm 20-40m l, khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi címyểB l ^ - l ỉ ộ vào bình
định mức lOOml và thêm nước cất tới ngấn bình. Dung dịch này được gọi là dung
dịcli iod cơ bản, cần dược bảo quản trong bình mầu nâu và đặt vào chỗ tối. Dung
dịch có thể bảo quán và dìing trong 3 tháng. Dung dịch iod phãn tích dược chiiấn bị

81
từ dung dịch cơ bản trước khi đem dùng. Lấy 20ml dung dịch cơ bản cho vào cốc
đà chứa sẵn 4,4g K I hoà cho tan hết rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức lOOml.
sau đó thêm nước cất tới ngấn binh. Dung dịch có thể sử dụng trong 15 ngày.

c. Tiêíì lỉàỉìlì

Chuấn bị dung dịch enzim: cân 5g chế phẩm nấm mốc rồi dem nghiền nhỏ
với cál hoặc thuỷ tinh liếp theo hoà với lOml dung dịch đệm và 90 m l dung dịch
nước. Chuyển toàn bộ vào cốc hoặc bình lam giác và giữ ở nhiệt độ 30“c trong 30
phút. Tiếp theo đem lọc qua giấy, nước trong thu vào cốc khô và dùng nó để xác
định hoạt độ amilaza.

Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch tinh bột cho vào bình tam giác lOOmK sau
đó cộng thêm 20ml nước cất và 5m! dịch men amilaza. Lăc dều và giữ ớ nhiệt độ
30“c (trước khi tiến hành cần giữ nhiệl độ của tấl cả các dung dịch ớ 30'’C). Sau 10
phiil la bắt đầu thử màu với iod bằng cách lấy 1 giọt dung dịch ihuỷ phân cho vào
tấm sứ tráng rồi nhỏ dung dịch iod vào. Ta làm liên tục thừ màu như vậy cho đến
khi dung dịch thuỷ phân không làm đổi màu của dung dịch iod. Đánh dấu ihời gian
từ khi cho dịch amilaza vào cho đến khi thuý phân đến sản phám không cho màu
với iod. Thời gian này phải trong khoảng từ 10-20 phúl. Nếu nằm ngoài giới hạn
trên thì cần ihay đổi số m l dịch men cho phìi hợp và làm lại thí nghiệm. Chú ý là
lượng nước cất cộng với dịch amilaza phải luôn bằng 25, còn thể tích dịch ihuỷ
phân phải bằng 50ml.

Hoạt độ amilaza sẽ tính theo công thức sau:

aXX aX T

trong đó:

0,25: lượng tinh bột chứa Irong 25 ml dung dịch (gam);

a: lượng chế phẩm nấm mốc tương đương với số dịch amilaza đưa vào (gam);

x: thời gian thuỷ phàn (phút);

60: hệ số chuyển thành giờ.

82
 \ / (lụ\ Lấy 25inl dung dịch linh bộl cộng với 20 ml nước cất và 5ml dịch
ainiỉaza (tương dương 0,25 gam chế pliáin nấm mốc). 7‘hời gian (huỷ phân 20 phút.
Như vậy hoại dộ amylaza sẽ bảng:

^ _ 0 ,2 5 x 6 0
HdA = - - = 3 dơn V /g
2 0 x (U 5

Sau dó cần nhân với 100/( IOO-\V) đế quy về Ig chất khô luyệi đối (W là độ
ám cLÌa c h í phẩm nấm mốc).

Phương p h á p so m à u b à n g mắ t llurờng có ƯLI diể m đơ n giản nhimg ké m chính

xác. VI thế hiện nay ít dùng cho nghiên cứu nhưng dùng so sánh, xác định sơ bộ
hoạt lực nhanh hơn.

Phương p h á p so màu bằng diện qiưing sắc ké

a. Nguyên tàc

'ĩheo phương pháp này thì inột đơn vị hoại dộ amylaza dược biểu diẻn bàng
lượng men có khá năng xức tác thuý phàn Ig tinh bột irong 1 giừ ờ diều kiện nhiệt
độ 30"c và pH 4,7-4, 8 . Đồng ihời phải dám bao tý lệ giữa enzim và đối chất sao
cho sau 10 phút lượng tinh bột đirợc thuý phân vào khoảng từ 20-70% .

b. Hoủ clỉấĩ

- Dung dịch amylaza, dịch tinh bột vù dung dịch đệm chuán bị lương tự như
trong phưưng pháp so sánh màu bàng lĩiat thường.

- Dung dịch iod: cân 0,25g iod và 2»5g K I cho vào cốc lOOml. Sau đó cho ùr
từ 5-lOm l càì khuấy cho tan hê't rổi chuyên toàn bộ vào bình định mức lOOml và
thê m nước cất tới n g ấ n bình. D u n g dịch cần dược bà o cỊuản trong binh m à u nâu và
bao quản chỗ tổi.

Trước khi làm thí nghiệm ta chuấn bị dung dịch iod phân tích bằng cách lấy
2 ml dung dịch cơ bản pha thành lOOml. Dung dịch này khi do trèn máy so màu
quang diện phủi có mật độ quang học vào khoảng D = 0,160±0,01 (với chiều dày
CLivct = Ic in, k ín h lọc s á n g c ó bước sóng = 4 53 nm).

-D u n g dịch HCl 0,1 N

83
 c. Tiếỉì IỉòiìIì:

Lấy 2 ống nghiệm (cỡ 18x180) khô và cho vào mỗi ống lOml dung dịch tinh
bột 1%. Đặt cả 2 ống vào máy điều nhiệt và giữ ở nhiệt dộ 3()"c khoang 10 phút,
sau đó dùng pipel, cho vào ống nghiệm (1) 5ml nước cất (mẳu kiếm chimg), ống
nghiệm (2 )ị-^ t--d ịc h umilaza (máu ihí nghiệm). Khuấy idiaiìb và lOphút.
Tiếp theo lỊíy Im l của mẫu kiểm chứng cho vào ống nghiệm (3) chứa sẵn itoinl HCl
0 J N. Tirơrịg iư cũng lấy 1 m l của mảu thí nghiêm cho vào ống nghiệm (4) ichứa sẩn
10 ml dunậ địch HCl 0,1N. M ục đích là để ngừng hoạt động của enzim ậ iữ đúng
thời gian pạản ứiig là 10 phút. Khuấy đều dung dịch trong ống nghiệm (3) ị ầ (4) rồi
từ đó mỗi ặng lấy ra Im l cho vào các ống nghiệm (5) ( 6 ) đà chứa sẵn lOml dung
dịch iod phân tích (chú ý pipet phải riéng biệt đế tránh sai số). Lắc đều rổỊ dem đo
mạt độ quíiịttg học trêm máy so màu với chiều dài lớp chất lỏng là 1 cm và kính lọc
sóng có bư(fc sóng X = 656nm. i

Mậl ịlô quang học của dung dịch kiểm chứng ứng với lượng tinh bột Ịban dầu,
còn mật đệj quang học của dung dịch thí nghiệm sẽ ứng với lượng tinh b^t còn lại
sau khi ihuỳ phân. Hiệu số mật độ quang học giĩra dung dịch kiểm chứiigỊvà dung
dịch thí ngậiệm sẽ tương ứng với lượng tiiih bột đà chịu tác dụng của amyl|^za.

d. T íhìỉ kết quả Ị

I !
LượỊig tinh bột đã được thuỷ phân sẽ tính theo công thức: ị

' D,-D,
c =
D

trong đó:
!

D ị’. ĩitót độ quang học của dung dịch kiểm chứng;

D^: nfật độ quang học cùa dung dịch thí nghiệm;

0 , 1 : lUỢng gam tinh bột chứa trong 10 m l dung dịch 1 %.

Hoạt độ amilaza được tính theo công thức:

H d A .li2 5 4 x C - 0 ^ ^ ^

trong đó:

n: lượng chế phẩm nấm mốc tương ứng với 5ml dịch amylaza (gam).

84
 1 / dụ: khi phân tích ta cân 5 gain chế phám nấm mốc có dộ ấm 44% và pha
thành lOOml. Sau dó lấy 2m l dịch lọc pha thành 50ml. Như vậy troiig ĩ> ml sẽ chứa:
3
- - X 5 -O .O lg
00 50

Kbi xác định mật độ quang học trên máy so rnấii ta nhận dược = 0,702,
= 0 ,3 i2

Da đó

0.1 =0,04694
0,720
)

Hiịỉạt độ amylaza sẽ bằng;

_ 7,264x0,04694x0,03766 ,
H dA = ---------------- — ----------------- = 30,33 đv/g
0.01

NỊếu tính theo chất khô tuyệt đối thì:

100
H dA = 30.33 X = 54,I6đv/g
1 0 0 -4 4
I

BiỊiig thực nghiệm người ta đã tính được rằng H dA theo phươn|| pháp này
thường hơn khoảng lừ 4,5-5 lần so với hoạt độ amylaza nhận được tlteo phương
pháp so k à u bằng mắt thường.

Zíệi 5 ; X ác định hệ s ố LŨIƠ ịLineur)

a.'Nguyên rắc 'ị

lệ ệ n nay irên các nhà máy rượu của ta chi dánh giá chất lượng chế pliấm
nấm m ố Ì theo hệ số Linơ. Dưới đây cliúng tôi xin giới thiệu phưcmg xác định
hệ sô' L iiỊơ mà chúng ta đang thực hiện nhưiig có cải tiến đôi chỗ. Ị
b.lH oáchẩi
í
D|ung dịch tinh bột 2%: cân 2,2g tinh bột (có trừ bớt độ ẩm 10%j trong cốc
khô, xong~cTl0 v?io ít nước lạnh khuấy đổu rồi đổ thêm khoảng 50ml nước nóng và
đun cách thuỷ (có tliể trên bếp diện) cho đến hoà tan hoàn toàn. Tiếp đó làm nguội
rồi chuyển hết vào bình định mức lOOml, tráng cốc 2-3 lần bằng nước cất tới ngấn
bình (hiện nay ở các nhà máy không cho dung dịch đệm).

85
 Dịch chiết men: cân 5g chế phẩm nấm mốc, xong nghiền nhò với ÍI th iiỷ tinh
vụn rổi chuyến toàn bộ vào bình định mức lOOmK Iráng sạch cốc nhiếii ỉấn và dố
vào bình. Tiếp theo cho vào lOml dung dịch độrn axetat natri rồi llìêm nước cất lới
ngần bình. Đậy núi rồi đặt vào nồi cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 5 5 "c trong 30 phút.
Sau dó đem lọc vào cốc khò và dùng để thuỷ phân linh bội.

- Dung dịch KO H hoặc NaOH 2,5N

- Dung dịch methylen xanh 1%

-D u n g dịch HCl ỈN

- Dung dịch íerixyanua kali: cân 12 gam K^Fe(CN)f, và hoà ihànli 1 hì.

Trước khi sử dụng ta cần chuẩn lại nồng độ, của dung dịch và làm như sau:
Lấy 20 inl dung dịch íerixyanua 1,2% cho vào bình tam giác 250ml. Tiếp dó dùng
ống đong cho vào bình khoảng từ 5-6 m l K O H hoặc NaOH 2.5N và 2-3 giọt
methvlen xanh. Trước đó cần chuấn bị dung dịch đường glucoza hoãc frucioza
0,5%. Dung dịch này dùng làm chuán nên phải pha từ đường linh khiêì hoá học và
cản chínlì xác 0,5000g xong pha thành 100 ml trong bình định mức.

Đặt binh lam giác (có chứa các hoá chất kế trên) lên bếp diện, đun sao cho
sau 2-3 phút thì sôi. Khi dung dịch bát đầu sôi ta dùng buret hoặc pipet nhò dịch
đường 0,5% cho vào đến khi lĩiấ i màu của methylen xanh và dung dịch irở nén
màu vàng nhạt. Nếu kếl llulc phản ứng mà lượng dịch đường tiêu hao là 5,00ml thì
ta bảo 20ml lerixyanua kali urơng ứng với 5x5=25 mg glucoza. Nếu sổ dung dịch
đường khác 5ml thì cần tính cho hệ số sai lệch để đưa vào công thức xác định hệ số
Linơ.

c. T iế ỉì l i à ỉ i l i

Dùng pipel hút 20ml dung dịch linh bột 2% cho vào bình lam giác ỈOOml
(không nên dùng bình lớn hơn) sau đó đạt bình vào nổi cách thuỷ và giữ ở nhiệi dộ
56*’c sau 10 phút ta dùng pipet cho vào bình 2ml dịch amylaza, lắc nhẹ và n ili kín
rồi giữ hổn hợp ở nhiệt độ 55“c trong 30 phút cho ai-nylaza hoạt động. Đổng thời
cần chuẩn bị nước sôi bên cạnh và sau phiít thứ 30 ta nhúng bình vào nước dang sôi
10-15 phút để ngừng hoạt động amylaza. Tiếp đó đem làm nguội bình và dung dịch
thuỷ phân này để chuẩn 2 0 ml kali íerixyanua (làm tương tự khi chiiấn dịch đường ở
trên). Mặt khác ta làm thí nghiêm kiểm chứng để irừ bớt lượiig chất khử chứa trong
dịch amylaza. Để xác định ta cũng lấy 20ml íerixyaniia kali vào bình tam giác

86
250ml xong thêm 5-6ml KO H và 2 đến 3 íĩiọt mcthylen xanh. Đạt bình trên bếp
điện và đun sôi, tiếp theo nhỏ dịch thiiỷ phân hoặc dịch amylaza phản ihig cho đến
khi mất màu xanh của meihylen xanh.

cl. Tính kết quà

í lệ số L in ơ tính iheo công thức:

. 1.. ,
Hs = — X— xO.Ỉ
X >

trong đó;

x: số ml dịch thuỷ phân liêu hao khi chuấn 2 0 ml ferixyaiiua kali;

y: số ml dịch amilaza tiêu hao khi chuấn íerixyaniia kali;

0 , 1 : tỷ số pha loãng dịch amylaza trong thí nghiệm thực 2 / 2 0 = 0 , 1 .

Chú ỷ:

Nếu hệ số F ^ 1 thi cần nhân với F đế biết được hệ số L in ơ thực, tiếp theo
cần nhân với iOOA 100 - W ) để quy về chất khỏ tuyệt đối.

W: độ ám của nấm mốc cẩn xác định song song với hệ số Linơ.

V’/ dụ: Số m l dịch thuỷ phân tiêu hao khi chuán 20ml ferixyar.ua là 6,2. Số ml
dịch amylaza tiêu hao là 8,3 . Hộ số F = 1,03. Độ ẩm của chế phẩm là 40%

H ê số Linơ = — X — X 0,1 = 14,9

6,2 8,3

Hệ số L in ơ thực và sau khi quy về chất khô tuyệt đối

Hê SỐ L in ơ = * 1 0 0 = 25,5
100-40

Bài 6: C h ế phẩm am ylata dùng trong sản xuất bia

Năng lực đường hoá của thóc malt

a. Nguyên tắc

Trong sản xuất bia nãng lực đường hoá đựơc biểu diễn bằng mg maltoza tạo
thành do tác dụng của enzim chứa trong 0 ,lg malt sau 30 phút ở điều kiện 30"c và
pH = 4,7 ^ 4,8

87
 Đối với malt vàng năng lực đường hoá (CÒII gọi là lực (liastaza, ký hiệu là
DC) dược đánh giá như sau:

DC < ỉ 00 rál xấu DC - 200 - 250 lõi

D C = 100^150 xấu DC > 250 râi tối

DC 150 -í-2()0 trung bình

h. H )ú
)CỈ chất
cluĩĩ
1
D unkdịch tinh bột 2% (chuấn bị tương tự như khi xác định hệ số Lirịư)

Dunặ dịch thiosuníat natri 0,1N Dung dịch NaOH IN

Dung dịch iod 0,1N Dung dịchHỊSO a IN

r. Tith hành

Cân 1 0 - 2 0 gain malt đã nghiền nhỏ trong cốc đã biết trước trọng luiẠng xong
cho thèm 450ml nước nóng 40"c rồi khuấy đểu và giữ ở nhiệt dộ 40‘’c trơng 1 giờ.
Sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Lau khô phía ngoài cốc rồi đem cận và đổ
thêm inrớc cất tới 520g tiếp theo đem lọc vào cốc khô và dùng để đường ihoá tinh
bột. Hoặc r,ghiền pha loãng vào bình định mức 500ml. '
Ị [

Lấy J25 m l dịch linh bộl 2% cho vào bình định mức 250ml và đạl vào nồi
cách tliiiỷ j0"C . Sau 10-15 phút ta cho vào 12,5ml dịch chiết men của ma!lt và giữ
30 phút satiđó cho thêm 3ml dung dịch NaOH IN dể ngừng hoạt động củaỊamyiaza
rồi đổ nước cất tới ngấn bình và đem lọc được dịch thuỷ phân trong. ,

Đê’ )íác định lượng maltaza tạo thành ta lấy 50ml dịch thuý phân cho vào
bình tam gịác 250 rnl SIUI dó cho 25 ml dung dịch 0,1N iod và 3ml N aO Ịl IN và
chiiẩii lư ợ n | iod dư bằng dung dịch 0,1 N thiosunfii natri, lượng iod tiêu iiao phái
vào khoảnỄ 5-15ml. Nếu ngoài giới hạn trên thì cần làm lại thí nghiệm vàịhay đối
í
lirợng malt cho phù hợp.

Song song với thí nghiêm chính ta cần làm thí nghiệm kiểm ch ứ iiỊ để biết
lượng iod tb u hao cTiolỉĩĩâĩT^ữiĩg^^vổrđỊch^cTĩi^lÌTralrva n ĩĩli bội; í ă lấ ỹ ĩS ml dịch
chiết malt cho vào bình tam giác 250ml và cộiig thèm 25-30ml Iiước cất, xong cho
vào 25 m l dung dịch iod 0,1N, 3ml NaOH IN rồi cìing để yên 5 phút. Tiếp iheo cho
vào 4,5ml dung dịch H2SO4 rồi chuán lượng iod dư bằng thio siin fit natri 0,1N với

88
chi thị là dung dịch tinh bột 1%. Tiếp theo ta lấv 25 mi (lung dịch tinh bột 2% vào
bình tam giác 250ml, cộng thêm 25 inl nước cất, 10 nil dung dịch iod O.IN. 3ml
dung dịch NaOH IN và dế 5 phúi. Sau dó cũim cho 4,5inl I Ỉ 2SO4 IN và chuàn
lưựiig iod còn lại bằng ih io siin tit nalri O.IN

(/. T iT ĩĩi ]cẽĩ q i u ì

I loạt lực diastaza xác clịnh theo công thức

ỉ b
DC = a - +c .K.17,1

trong dó:

a, b, c: lượng iod O .IN tiêu hao trong thí nghiệm chính, dịch chiếi malt và
tinh bột ;

17,1: số mg maItoza Tmg với 1 mi dung dịch thiosuníit natri O.IN;

K: hệ số pha loãng phụ thuộc lượng mali. Trong trường hợp của thí nghiệm
K = 1. Néu lấy 10 gani inalt thì phái pha thành 510 gam hay 500ml và lúc đó K - 2.

\ / d iỊ\ lirợiig dịch 0,1N iod tiêu hao trong tlií nghiệm c h ín h là 25 - 11,2 =
13,8 m l, tiêu hao trong 20 m l dịch chiết malt là 25 - 20.3 = 4,7 ml và tiêu hao do
kối liợp với 25 m l dịch tinh bột là 10 - 9,5 = 0.5 ml.

r4 ,7
DC = 1 3 .8 - - 0 .5 .1.17,1 = 219.4 đơn vị
10

B à ì\ 7; X á c đ ị n h h o ạ t đ ộ d ư ờ n g ì i o á c ủ a n i a l t b à n g p h ư ơ n g p h á p c h u ẩ n
\ \ 'i n d i s c h - K o l b a c h ( W K )

a . N g u y ê n tắ c

Plurơng pháp dựa trên cơ sớ thiiý phân linh bột bởi enzim có trong ciiing dịch
chế [)háin m alt nghiên cứu. Xác định lượng đường khử tạo thành thông qua lượiig
iod tạo phức với tinh bột sẽ tính được hoạt dộ enzim DP ( Diastatic Power) theo chi
số W K.

Đưn vị hoại độ đường hoá là lượng mg maltoza được tạo thành bởi enzim có
troiig 100 gam m ali ở diều kiện tiêu chuán pH = 4,3 và nhiệt độ 40"c

89
 b.ỉlo á chất và dung dịch eniim

- Dung dịch đệm axetat pH = 4,3 (±0,1) : cho 30 g axit axetic băng \'ào bình
định mức 1000 m l. bổ sung nước cất tới vạch mức. Hoà tan 34 g axetai nairi
(N a Q H , 0 2 .3 H 7 0 ) với nước cất, cho vào bình định mức 300 m l, bổ sung nước cấi
rới vạch mức. Phoi irộn hai dung dịch trên, nhận được 1.5 lít dung dịch đệm. Kiếm
tra lại trên máy pH met;

- Dung dịch axit clohvdric 0, IN ;

- Dung dịch iot 0,11VI;

- Dung dịch hvposLinfit natri 0,1N: Hoà tan 24,82 gam Na 2S.0 v 5 H 2 0 và 7,6
gam Na2B4 0 7 . 1 0 I Ỉ 2 0 irong 300 - 400 ml nước cất, cho yiio bình định mức 1000 ml.
bổ sung nước câì lới ngấn bình;

- Dung dịch hydroxyt natri IN ;

- Dung dịch axit siiníuric 0,5M: Hoà tan 24,82 gam Na 2S2 0 v 5 H 2 0 và 7,6
gam Na 2B4 0 7 . 1 0 1 Ỉ 2 0 trong 300 ml;

- Dung dịch ihymolphtalein 5 g//: Hoà tan 0,5 gam thym olphtalein trong 100
mỉ dung dịch etanol 96% (v/v);

- Dung dịch tinh bột 20 g//.

- Chiết rút enzim:

Cân 20 gam malt vàng, 40,0 gam malt den hay 10,0 gam chế phẩm mall đà
được nghiề n nhó c h o vào cớc thuỷ tinh, bổ suiig 4 8 0 iTil nước cất (dà loại đổng).
Khuấy irộn nhưng Iránh đế tạo thành grumeaux, sau đó đặl Irên máy khuấy lừ ớ
nhiệt độ 40*'c trong thời gian 1 giờ. Cuối cùng sấy khô bên ngoài cốc và bổ sung
nước câì đế đạt 520 g; 540 g hay 510 g lương ứng với các loại m all sử dựng trong
nghiên cứu. Khuấy trộn đều và liến hành lọc. Bỏ 200 m l dịch lọc đầu liên, lấy 50
ml dịch lọc liếp theo để phân tích.

c\ Tiến hành

Mẫu thí nghiệm: HÚI 100 m l dung dịch tinh bội 20 g/1 cho vào bình định
mức 200 ml. Bổ sung 5 ml dung dịch đệm axetat, sau đó đật vào trong máy điều
nhiệt ở nhiệt độ 20"c và giừ nguyên ở nhiệt độ này trong thời gian 20 phúl. Bổ sung
5 ml dung dịch enzim, khuấy đều và đặt lại vào máy điều nhiệt và đê thêm chính

90
xác 30 phút nữa. Bổ sung 4 m l dunR dịch NaOH 0,1N để vô hoạt enzim. Đinh mức
tới vạch ngấn bằng nước cất và khuấy trộn (ĩều. Kiếm tra dộ kiểm của dung dịch
bàng cách bổ sung m ội giọt thymolphtalein. dung dịch phải có màu xanh.

Mảu kiếm chiìnig:

Hút 100 m l dung dịch tinh bột 20 g/! cho vào bình địỉih mức 200 ml. Bổ sung
2,35 ml dung dịch NaOH 0,1N, khiiấv trộn dểu. Ỉ3Ổ sung 5 ml dung dịch enzim.
Đ ịnh mức tới vạch ngấn bằng nước câì và khuấy trộn đều. Kiếm tra độ kiềm của
dung dịch bầng cách bổ sung mội giọi thymolphtalein, dung dịch phái có màu
xanh.

Định lượng đườiig khử bàng cluiân dộ iod:

Hút chính xác 50 m l dung dịch trong bình định mức cho vào binh tam giác
nút mài 150 ml. Bổ sung 25 m l dung dịch ioci, 3 mỉ dung dịch NaOH, k lìu íy irộn
kỹ. Đậy bình để tránh tốn thất iod và giữ nguyên trong thời gian 15 phút. Bố sung
4,5 ml dung dịch H 2SO4 và chuẩn độ lượng iod dir bằng dung dịch hyposunĩit natri
cho tới khi mất màu xanh.

Lượng dung dịch iod dùng đế clìLián dộ phải nàm trong khoảng 6 và 12iĩil.
Nếu không, làm lại thí nghiệm bằng cách sử dụng nhiều hoặc lì mali hơn.

d. Tính toán kết quả

Lượng maltoza tạo thành trong quá trình tlìLiỷ plìân tính theo công thức :

DPI = F ( V T r - V T n )

trong dó:

D P I: Mức độ đường hoá của 100 gam nialt, đơn vị \Vindisch-

Kolbach (W K );

DP2: Mức độ đường hoá cúa 100 gam m all khô tuyệt đối, đcm vị
\Vindisch-Kolbach (W K );

V T r: lượng dung dịch Na2S2()tdùng để chuẩn mầu tráng, ml;

V T iiilư ợng dung dịch Nci2S2 0 ì dùng để chuẩn mẫu thí nghiệm, ml;

91
 F: hệ số chuyển đổi đối với 100 gam malt : F10g = 68,4; F20g =
34,2 hay F40g = 1 7 ,1 ;

\V: độ ẩm của mall, %:

W K > 250 inalt rất tốt; W K = 100 ^ 150 mak kém;

w k = 200 ^ 25l)^maĩĩtot7 '... ' “W K < ĩo ò mãũ"rấĨ iỊé m .

150 + 2 0 0 m alt trung bình;

Hcịạt độ amilaza của chế phám enzim nguồn gốc vi khuẩn tính the© đv’/g :

m
i
i

l(k t độ amilaza của chế phẩm enzim nguồn gốc nấm mốc tính thíD đv/g :
7,264.c - 0,03766.,^ ^ ^
m

HdỆt độ amilaza của chế phẩm enzim của malt lính theo đv/g :

„ ^ ^ ^ 6 . 8 8 9 .C - 0 .0 2 9 3 8 8 , , ^ ^ ^
m

trong đó:

m: lượng chế phẩm nghiên cứu, mg

C: lượng tinh bột bị thuỷ phân, gam.

1 0 0 0 : hệ sô' chuyển mg thành gam.

5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766; 6,889; 0,029388 là cá hệ sô' của

í^hươiìg trình tính hoạt độ, thu đirợc bằng phương pháp xử lý tèán học sô'
ệu thực nghiệm \ ’ề sự phụ thuộc của lượng tinh bộl bị thuỷ phân vào lượng
nzim lấy để thí nghiệm. Trong các hệ sô' này đã có đưa vào tỊiìra số tính
huyển ra 1 g iờ tác dụng của enzim.

Bc i 8: N âng lực đường hoá cửa c h ế phẩm nấm m ốc

a. Nguyêiì tác

Trong sản xuất bia người ta không đánh giá chất lượng của chế phẩm nấm
mốc theo các chi số như trong sản xuất rượu mà theo năng lực đưừng hoá. Năng lực

92
đư ờ ng hóa dặc trưng ch o khả năng của am yiaza xlI c tác t h u y p h â n li n h bôl đ ế n

d ư ờ n g k h ử và tí n h i h e o m a l l o z a . M ộ ĩ d o iì y ị lỉo ạ Ị (lộ (Ịirờíii^ l ì ó a d ư ợ c XCỈỈỈ l ù l ư ợ n ^

ỉ u e / i đ ủ k í u i Ị ì á ì ì g p l u ì ỉ ì l y ì g o ì ì i ỉiỉili l ) ộ í ỉl ì ùi il i n u i i ĩ ( ì z a s a i ỉ I í^i ở (Ỷ t l i ê i i k i ệ i ì l ỉ l i i ệ t

clộ 3Ơ 'C p l l 4 ,7 - 4 ,8 vã ỉiiứ r clộ tliu ỷ phân k lió n ^ (ỊIỈÚ 3()7c.

Năng iực dtièfng hoá (H dĐ) biéu dién theo dơn vị irêii cytt-ichô hoặc
đv/m l d ịc li men. Cơ sỡ của phương pháp dựa vào thuỷ phân tinh bộl tịăng dịch
am ylaza rcli sau đó xác định hàm lượiig chấtkhử theo phương pháp iod. I
‘ 1
h. lểpá chất: I

- DÌỉiig dịch 0,1N thiosuníit natri: cân 25 gam N cIị S.íO , tinh khiếtIrồi dùng
i ■ !
nước căt kliông chứa CO 2 pha thành 1 lít, sau đó đem bảo quán trong bình ịnàii nâu.
Ị í

- Diing dịch 0. IN iodxân 25 gíim K I và 12.7 gam ụ tinh khiết rồi hl)à tan và
pha thành ^lít. Dung dịch cần bảo quản trong bình mầu nâu.

- Dùng dịch NaOH hoặc KOH 0,1N

- Dụng dịch H C l IN ị
- Diing dịch H 2SO4 ( 1 :4) lấy 1 thể tích axit siiníuric đạm đặc pha Ịv'ới 4 thể
tích nước dất. 1

- D iiiig dịch tin li bột 1% vàdịch chiết amylaza (xemphần xácđ ịii|i hoạt độ
amylaza). ■ i

í'. Tiụ'n hành

Lây 1 bình cầu hoặc tam giác lOOml đem sấy khô, xong cho vào 2èml dung
dịch linh blột đặt vào nồi cách thiiý có nhiệt độ 31"c. Siiu klioũng 10-15 p l út ta cho
vào bình Iđến lOml dịch amylaza khuấy đến và giữ ở nhiệt độ 30"c trong 10
phút, 'rhể |tích chung của hỗn hợp phải bằng 30ml vì thê' trường hợp ịciio dịch
amylaza ít |hơn lOm l thì sau khi cho dịch tinh bội, cần thêm nước cất ílé' sa I khi cho
dịcli a in y l^ a thể tích chung là 30ml. Sau 10 phút thuỷ phân ta cho vào liỗn hợp
phản ứng ỉ m l H C l để ngìmg hoạt động của enzim. Để xác định đường khử theo
phương ph^ẩp rón’ ta drayển toàn bộ hỗn hợp phản ứng vào b ìT iừ tam -pác 250 -
3 OO1Ĩ 1 I (tráng nhiều lần bàng 60 - 8 O1Ĩ 1 I nước cất). Tiếp theo cho vào đó 20ml dung
dịch iod O.IN và 60 m l dung dịch NaOH 0,1N lác dểu và đế yên 15 phút. Sau dó

93
cho vào 2ml H2SO4 (1:4) rồi chiiấn lượng iod dư bằng dung dịch 0,1N thiosiiníai
natri đến đổi màu.

Song song với thí nghiệm chính kế trên ta làm thí nghiệm kiềm tra tương tự,
chi khác là cho 2 m l HCl 0.1 N trước khi cho dịch amylaza và không giữ để thuỷ
phân.

Hiệu số giữa lượng NhsSịO, tiêu hao troiig thí nghiệm kiếm tra và thí nghiệm
chính sẽ cho ta lượiig dung dịch iod 0 , 1N để kết hợp \'ới đưừiig khử tạo thành do tác
dụng của amylaza. Đem số iod tiêu hao nhân với 17,1 ta sẽ được lượng maltoza tạo
thành.

d. Tính kết qud

Hoạt động dường hoá sẽ tính theo công thức sau:

trong đó:

g: lượng chế phẩm enzim tham gia trong phản ứng thuỷ phân tính theo gam:

k: hằng số tốc độ phản LÍiig theo công thức;

1 a 2,303 a
K - _ In — = ..Ig
t a- X t a- X

a: lượng tinh bột tối đa có thể tạo thành maltoza trong điều kiện thuỷ phân,
tức là 0,2.75% = 0,15 gam hay 150 mg (20 m l dịch tinh bộl 1%).

4.3.3. XÁC ĐỊNH HOẠT L ự c ENZ1M XENLULAZA

Xenlulaza là các enzim xúc tác quá trình chuyển hoá xenliiloza thành các sản
phẩm hoà tan. Hiện nay còn có nhiéii ý kiến khác nhau về phức hệ enzim này và cơ
chế tác dụng của chúng trong quá trình phân hiiỷ xeiiluloza. Nói chung các tài liệu
nói đến hai enzim chính của phức hệ enzim này là enzim C| và enzim Q .

Enzim C| có khả năng phàn giải (phân huỷ) sợi xenlulaza tự nhiên có tính
đặc hiệu không rõ ràng do đó cũng chưa xác định được tên hệ thống của nó.

94
 Enzim c , có hai loại: loại ihứ nhất exo p-l,4-elucaiioza xúc tác cho pháii ứiig
cắt đirt gốc glucoza từ đầ'.i không khứ của c h u ồ i ,\enliiloza. Loại thứ hai là endo
P-l,4-gliicanoza hoạt động tuv tiện liơn nhimg nói chúng nó xúc tác cho phản ứng
thuỷ phân các liên kết bên trong phân tư mạnh hơn các liẽn kết ở dầu tận cùng ciíc
chuỗi xenkilaza.

Để xác định hoạt dộ của xenliilaza có thể dùng nhiều cơ chất khác nhau như;
Sợi bông, giấy, bột xenlulaza các dần xuất của xenlulaza... Cơ chất thích hợp nhất
cùa enzim C| là sợi bống.

Để xác định hoạt độ xenlulaza có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau.
Các phương pháp thường dựa vào inột troiig các nguyên tắc sau đây:

a: Xác định sự giảm trọng lượng của cơ chất xenliilaza không hoà tan.

b. Xác định sự giảm tính chất của các sợi hoặc các màng mỏng.

c. Xác định sự thay đổi dộ đục của dung dịch cơ chất.

e. Xác định sự giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất.

g. Xác định sự tăng các nhóm khử tận cùng.

h. Dùng phương pháp so màu đế xác định sản phẩm hoà tan của xenlulaza.

i. Xác định bán kính vòng tliiiỷ phân trên môi trường thạch xenliilaza.

Nồng độ enzim trong dịch môi trường thường được biểu diễn bàng đơn v ị/ ml
hay dơn v ị/g ...

lĩài 9. Xác định hoạt độ xenliilam bằng cách do đường kính vòng thiiỷ phán

a. Ngityên tắc

Cho enzim tác dụng lên cơ chất xenlulaza trong môi trường thạch, cơ chất bị
phân hiiỷ, độ đục của môi trường bị giảm, mỏi trường trở nên trong suốt. Độ lớn
cùa phần m ôi trường trong suốt phản ánh hoạt động của enzim.

b. Tiến hành

Chuẩn bị môi trường có chứa 2% thạch, 0,5% Na-CM-xenlulaza irong dung

dịch đệm xitrat photpliat pH 5,0 đổ vào hộp Petri. Sau khi ihạch đông, khoét nhữiig
lỗ nhỏ trên mặt thạch, cho vào 0,1 - 0,5 ml dung dịch eiư im , giữ ở 40"c sau 24 giờ
đo đường kính phần m ôi trường trong suốt ở chỗ eiizim tác dụng.

95
 Biếu diễn hoạt dộ eiizim bằng m ilim el đường kính vòng thuv phân.

Bài 10: Xác định hoạt dộ pectinazci ịlIdPc)

a. Ngiivêii rắc

Phương pháp dựa trên cơ sở xác dịab-các-enziffl-xhuỷ 4 ) h â a c h â ì là

pectiii. Đori vị hoạt động pectinaza là lượng enzim xúc tác sự thuý phân Ị] g pecnn
tới các sảậ phẩm không bị kết tủa bởi ZnSOj khi tiến hành thuỷ phân iroỊiig những
diều kiện nhất định: nhiệt độ 30''c, thời gian thuỷ phán 1 giờ, pH = 4.0, Hoạt độ
pectinaza biểu thị bằng số đơn vị hoạt độ trên 1 gam chế phắm. T ỷ lệ giữa enzim và
cơ chất titìng m ôi trường phải đảm bảo cho 30% pectin bị phân giải. lỊượng sản
phẩm của'.sự thiiỷ phân pectin không bị kết tủa bới ZnS0 4 được xác địnhịtrên giao
thoa kế UỊRP-2

h. tặoá chất vù dịch enzinì

D iỊiig dịch enzim gốc:

- T& các chế phám đặc: cân o .lg chế phẩm enzim nghiên cứu trẽnìcâii pliãn
tích cho \|io cốc nhỏ dung tích 25-30ml chà máu với 1 iirợng nhỏ nước cật. Sau đó
chuyến tcệo bộ vào bình định mức 50ml, trộn đều, thêm nước cất đến iạch. Lọc
dung dịch qua giấy lọc, dùng nước lọc để thử nghiệm. T iiỳ thuộc và® hoạt độ
p cclin aza m à lấy m ột lượng d u n g d ịch cần thiết. Ị

- Tệí canh trường nấm mốc: cân 1 gam canh trường khô đã nghiổaị nhỏ trên
cân kỹ Ihitậl và chuyến sang cốc 250ml, thêm vào đó 100 m l nước câì và ậiữ ở 30"c
trong vònặ 1 giờ, ihinh thoảng khuấy đều.

Lọ(Ị dịch qua giấy lọc. Xác định hoạt độ pectinaza trong dịch lọc.
ì

- Dịmg dịch pectin 1% (cơ chất): cân một Iưựng mẫu, cân chất pectiỊi với tính
toán sao c^ho trong 250ml dung dịch có 2,5 gam pectin linh khiết (theo sc liệu thử
nghiệm) ơho từ từ mẩu cân vào bình nón dung tích 30ml đã có sẩn khaing 30ml
nước cất. Ịchú ý khi cho pectin vào nước phải khuấy liên tục. Sau khi clỊiiyến hết
mảu càn \^ õ 'T iiĩh con ĩc h u ẳ y iĩq n ĩ) pHĩH và'^đe y e ĩ ĩ l glơ ơ nHIệt dọ phòng. Khi hêt
giờ thêm vào đấy một lượng xác định dung dịch amoíiiac đậm đặc (vừa thèm vừa
khuấy) để đưa về pH 4,0. Tiếp đến thêm nước cất clio đủ 250m l. Khuấy trộn cẩn
thận và lọc qua 2 - 3 lớp vải màn. Plia dung dịch pectin 2 - 3 g iờ trước liic tiến hành

96
ihử nghiệm. Màu cũa cÌLing dịch cơ cliất phai xáin sáng.Cấí giữ dung (iịch này ở tủ
Ịạnh có ihế dùng trong 4 ngày.

Chú ỷ\ Pectin không được chứa các ion kim loại nặng, có thế cho phcp pcclin
chứa inộl lượng nhỏ các ion da trị như canxi. m agie... Đẽ diều chế cơ chất, người la
dùng pectin củ cải đ ư ờ n g có hàm lượng p e c t i n > 70% và mức độ meioxy! hoá cúa
nó khống lì hơn 3 5 *vr.

- Dung dịch ZnSƠ 4 hoà tan 15g ZnS0 4 trong lOOm! nước

K ié Ị Ị ì ĩr c ỉ iịia o t h o a k é ịÌ Ị ì í e r f e r o ì ì ie t v e ì

Dùng dưng dịch saccaroza 0,259f ngãn phai của cốc đo (cuvet) của giao thoa
kế (\ớ i chiều dài ciia cạnh là 4 cm) đựng nước cất. còn ngãn trái cốc đo dựng dung
dịch saccaroza

'Tính hệ số hiệu chinh K theo công thức K = X /X |

trong đó:

X: chi số của máy phải bàng 780:

X,; độ lệch khỏi số cúa máy.

c. T i ê n ỉìíUìii

Lấy số ống nghiêm (2cm X 18cm) vừa bàng số mảu thử cần xác định và cho
vào mồi ống 2 0 m l dung dịch cơ chất rồi đặt chúng vào máy điều nhiệt hay nổi cách
ihuỷ với nhiệt độ không đổi 30" ± 0,2‘*c. Giữ các ống nghiệm ở nhiệi dộ này 10
phúl sau dó đế nguyên ớ nổi giữ nhiệt và cho vào mỗi ổng lOml dung dịch enzim.
K lìu íy trộn đều và giữ ở 30"c trong vòng 1 giờ dế ihuỷ phàn pectin. lỉế t giờ nhấc
các ống nghiệin ra và tlìêin vào hổn hợp phản ứng 2 nìl dung dịch ZiìS 0 4 13% dế vô
hoại enzim và kết lua các sản phấm thiiỷ phân của pectin. Khuấy trộn thật dều hỗn
hợp dựng trong ống nghiệm và lọc qua giấy lọc. Nếu dịch lọc vẩn đục ihì phải lọc
qua 2 Ìây đó dến khi nhận dược dung dịch trong suổt. Dung dịch này là dung dịch
nghiên cứu.

Tiến lìành đặt một thí nghiệm kiểm chứng song song. Muốn vậy cho vào ống
nghiệm 2ml ZnS 0 4 15%, lOml dung dịch enzim nghiên cứu và 20ml cơ clìấl.
KhuAy đều hỏn hợp trong 2 - 3 phút, sau dó đem lọc.

97
 Đổ dung dịch nghiên cứu vào ngãn trái của cốc đo còn dung dịch kiểm chứng
vào ngãn phải rồi đo trị số chuyển dịch của các giải giao thoa sự chênh lệch các chỉ
số khúc xạ của dung dịch kiểm chứng và dung dịch thí nghiệm tạo nên. T rị sô' chuyển
dịch này đọc trên thang chia độ (n) của giao thoa kế. Để đảm bảo độ chính .xác phải
pha loãng enzim sao cho nhận được trị sô' của n nầm trong vùng từ 4(X) - 1250.

d. Tính kết quả

Hoạt độ pectinaza (HdPc) tính theo đơn v ị/ gam bằng công thírc:
0,06425.11 + 19,62
HdPc = ------------- --------------
m. 1 0 0

trong đó:

n: số chỉ của giao thoa kế đối với thí nghiệm đã cho;

m: lượng chế phẩm enzim chứa trong 10 m l dung dịch enzim lấy để xác định
(gam).

0,06425; 19,62; 1000 các số liệu hệ số thực nghiệm thu được bằng phương
pháp xử lý toán học, các sô' liệu đo được khi nghiên cứu về sự phụ thuộc giữa các
sản phẩm thủy phân pectin tạo thành trong những điểu kiện của phương pháp và
lượng đơn vị hoạt động enzim lấy để phân tích.

Ghi chú: - Trong trường hợp có sự sai lệch về chỉ số (x) của máy, phải thay
đổi chỉ số nhận được (n) của máy bằng đại lượng n.k vào công thức tính hoạt độ
pectinaza.

4.3.4. ENZIM C ATALA2A

Bài 11: Xác định hoạt độ eniiin cataỉaia

a. Nguyện tắc

Catalaza: H 2O 2 oxydoreductaza phổ biến rộng rãi trong tế bào động vật, thực
vật và có trong tế bào các vi sinh, vật hiếu khí. Calalaza xúc tác phản ứng phân giải
H 2O 2 ihành nước và oxy phân tử, ngoài ra nó còn oxy hoá các rượu và một số hợp
chất khác làm thay đổi thành phần axit va một sô' chất khác. V ì vậy nếu hàm lượng
catalaza cao trong một sô' chế phẩm hay nguyên liệu thì nó xúc tiến quá trình oxy

98
hoá mạnh hơn. Để biết và xác địnli nó, tìm ra một số nguyên nhân hư hỏng thực
phấm hay so sánh hoạt lực catalaza có thể dựa vào lượng oxy phân tử được tạo
thành (phương pháp áp kế) hoặc lượiig H 2O 2 bị phân lìuỷ (phương pháp chuán độ
bằng K M n 0 4 ).

b. Phươnỉị plìáp chuẩn độ hằtìiỉ KMnO^

Chuán bị hai bình tam giác dung tích lOOml cho vào mỗi bình 5ml dung dịch
chiết có enzim. Thêm vào bình ihứ nhất (xem nhir bình kiểm ira) 3 ml dung dịch
H 2SO4 10%. Sau đó cho vào mỗi bình lOml dung dịch H 2O 2 0,1%. Đặt hai bình vào
tủ ấm 30"c trong 30phúl. l ’hêm vào bình thứ hai (bình thí nghiệm) 3ml dung dịch
II2SO4 10%. Chuấn đồng thời hai bình bầng dung dịch K M 11O 4 0,1N Im l dung dịch
K M 11O 4 0 ,iN lương ứng với K7mg H 2O 2 .

c. Tính k ế t cỊiiã

Hoạt độ catalaza được tính bằng mg H 2O 2 bị phân giải (C)

C = ( A - B ) . 1,7

trong dó:

A: số m l dung dịch K M n 0 4 0,1N dùng chuấn độ mảu kiểm tra;

B: số m l dung dịch K M n Ơ 4 0,1N dùng chuán dộ mẫu thí nghiệm.

4.3.5. ENZIM PEROXIDAZA

Peroxidaza râì phổ biến trong ihực vậi \'à đóng vai Irò quan trọng trong các
quá trình oxy hoá. Peroxidaza làm hoại hoá các peroxit đặc biệt là H 2O 2.
Peroxidaza xúc tác các phản img oxi hoá nhiều poliphenol và am iii thơm tạo thành
các phẩm vật khác nhau.

B ài 12, Xác định hoạt độ của enzùn peroxidaia

a. Nguyên ỉắc

Trong thực tiễn phương pháp xác định hoạt độ peroxidaza phổ biến là
phương pháp dựa trên sự oxy hoá pirogalol thành purpurogalin khi có H 2O 2 . Phản
ứng xảy ra theo sơ đồ sau:

99
 Purpurogalin lạo ihàỉih dưới dạng kếi lủa màu nâu không taiì trong nước,
nhưng râì dẻ tan trong eĩe \'à H 2SO4 đậm đặc. Tuỳ thuộc \'ào cơ chất dược chọn
dùng pH tối thích mỏi peroxidaza có thay đổi chút ít. Đa sò trường hợp thí nghiệm
dược liến hành trong môi trường kiềm yếu hoạc irung lính ơ nlìiột dộ Ihường 20“c.
Độ nhạy với nhiệt cúa peroxidaza rất cao, nó có thế bị vô hoạt ngay sau khi sôi rất
ngắn. Độ nhạy của nó đối với sự dư 1Ỉ 2O 2 cũng rấi lớn, do dó liến hành xác định
hoại độ pcroxidaza trong những ihế tích lớn. pha thật loàng.

Lượng purpiirogalin tạo thành có thể xác định bằng hai cách.

- Kết tủa purpurogalin sau khi lọc và rửa sạch, hoà tan bằng H 2SO4 80% đem
chuẩn bằng KMnO^ 0,1N

- Kếl lúa purpuogalin rửa sạch, hoà tan trực liếp bàng ele và đem xác định
bằng phương pháp so màu, đối chiếu với ptirpuogalin lin h khiêì tan irong eie.

Cììíi ý: Khi xác định hoạt độ peroxidaza bằng phương pháp dùng piroganol
làm cơ chất cần chú ý là pirogalol và H 2O 2 dùng trong thí nghiệm có ảnh hưởng râì
lớn đến hoạt độ cíia nó, do đó lượng dùng trong ih í nghiệm không dược quá một
giới hạn xác định. Ngoài ra phài luân theo mộl cách nghiêm ngặt các trật tự quv
định khi trộn lần ihuốc ihử và dịch chiết enzim vào dung dịch H 2O 2 khi chưa thêm
pirogalol.

h. Hoá cluít

Dung dịch H A 1%

Dung dịch pirogalol 1% pha trước khi dùng

H,S0 4 đậm dặc (d=: U84); I Ỉ 2SO4 80%

K M Ĩ 1O 4 0,1N

Ele elylic

Purpurogalin tinh kliiếl

Dung dịch đệm photphaí pH = 8 9

100
 c. Tiến Ììàỉih

Chuấn bị dịch chiết peroxidaza: Cân lấy vào cối sứ 2 - 3 gam nguyén liẹu
(lá, rẻ. h ạt t h í n g h i ệ i n . . . ) , n g h i ề n thật c á n t h ậ n với 2 0 m l d u n g d ị c h đ ệ m p h o t p h a t

pH = 8 T 9, có thêm 4 giọt toluen hoăc cloroform và bột tlìuý tinh hoặc cát sạch
(khòng có Fe). Chuyến loàn bộ hỏn hợp vào bình định mức 100 ml báng dung dịch
đệm và sau đó thêin dung dịch đêm clìo đếii \'ạch. Lọc, nước ih ii được dùng đế xác
định hoạt dộng của ptM'oxidaza.

Cho vào bình tam giác 250ml, dung dịch pirogalol 1% mới pha và thêm Im l
H 2O 2 1% giữ ở nhiệt độ như vậy (20 - 25‘'C). Hồn hợp cho vào trong máy điều nhiệi
hay trên nổi cách thuỷ ử 25"c và đế yên trong 1 khoảng thời gian xác định (15 phút
- 2 0 giờ) luỳ thuộc vào hoạt lực của en/im.

Song song với thí nghiệm kiếm chứng: lấy vào bình tam giác 250ml, 40ml
dung dịch enzim đun sôi 10 phúi với ống sinh hàn thu hồi. Làm nguội và cho ihêm
10 inl pirogalol 1 %, m l H 2O 2 1 % như ở mẫu thí nghiệm.

Trong thời gian phản ứng purpurogalin được tạo thành ở dạng kết tủa mầu
nâu. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 1-2 ml Ĩ I 2SO4 đậm đạc. Lọc kêì tủa purpurogalin
irong mầu thí nghiệm cũng như kiểm chứng qua phẻu ihuỷ tinh xốp (G-2). Rửa kết
tiìa bàng nước cất cho đến khi nước rửa không còn khử KMnO^. Sau đó hoà tan kết
tủa trực liếp trên phều lọc bằng H2SO4 80% (10 - 20ml). Rửa phều lọc bằng nước
cấi (lượng nước rứa gấp 7 - 2 0 lần lượng axil đem dừng), Nếu pha loãng không dủ
nước, địnli phân sẽ khó, trái lại pha loãng quá mức sẻ làm kết lủa purpurogalin trở
lại.

Đun nóng dung dịch thu dược tứi 50" - 60'‘c và chuán bàng dung dịch
KM1ÌO4 0,1N cho tới khi dung dịch có mầu hổng bổn irong 30 giây (theo mức dộ
thêm KMnO^ mầu của dung dịch chuyển lừ máu nâu sang màu thầm rồi xanh nhại
và cuối cùng sang màu hồng khi có dư 1 giọt K M n () 4).

d . Tính k ế t cỊitả

Độ hoạt động của peroxidaza được biểu thị bằng số ml KM11O4 0 , 1N ứng với
Igam phẩm vật nghiên cứii khô sau 15 phút tác dụng. Hoạt độ peroxidaza (HdPer)
có thể lính theo công thức;

101
 HdPer = í^ — y
m

irong đó:

a, b - s ố ml K M n 04 0,1 N d ù n g định phân m ẩ u thí nghiệm và k iể m chihig;

m - trọng lượng mẫu thí nghiệm tương ứiig 40ml dịch chiết enzim đem phân
tích.

4.3.6. ENZIM LIPAZA

Bài 8. Xác định hoạt lục enzỉm lipaia

a. Nguyên tấc

Enzim lipaza thuộc nhóm esteraza xúc tác thuỷ phân chất béo, giải phóng
axit béo tự do theo nguyên tắc:

H2C— o —CO—R Q H2C— OH

CH—0 —CO—R + HoO —► C H -O H + RCOOH

H2Ó— o — C O -R ^2° H2Ò— OH

Nếu trong các loại nguyên liệu có nhiều lipaza thì lượng axit béo tạo thành
nhiều và nó dễ bị oxy hoá gây nên hiện tượng ôi của chất béo dễ dàng.

Thông thưừng hoạt độ lipazii phụ thuộc và pH môi trường cho từiig loại enzim.

Upaza của thực vật pF*i = 4,7 5,0

Lipaza pancreatic pH = 7,0 8,0

Đvín vị hoạt lực lipaza biểu Ihị bằng số m ililit dung dịch N aO n 0,1N dùng dế
trung hoà lirợng axit béo tự do giải phóng ra do tác (lụng của lipaza trong thời gian
24 giừ ở nhiệt độ 30"C.

b. Hoá chất và cơ chất

Hoá chất

- Dung dịch đệm axetat: pH = 4,7: .rộn 250 ml CH,COOH IN và 250ml

CH,COONa và cho nước cất đến 1 lít.

102
 - Dung dịch đệm photphat: 7-7,5 3ml 0,066M K H 2PO4 (9,079g/l) + lOml
0,066M Na 2HP 0 , ( 1 7 .8 7 g N a 2HP 0 4 .7 H 2 0 trong 1 lít)

- Dung dịch NaOH 0,05N - 0.2N (không có cacbonat) trong etanol ( Ig - 4g

NaOH hoà tan trong lượng nước cất ít nhất và đổ cồn đến 500ml) hoặc KOH.

- Dung dịch th im olp h talein trong cồn (1%), 1 gam thimolphtalein/lOOml

etanol 50%

Cơ chất

Nguồn gốc lipazii từ thực vật, vi sinh vật có thể thu được từ các cách sau:

- Dung dịch huyền phù dầu hướng dương tinh khiết trong dung dịch đệm
axetat; 1 ml dầu sạch + 5 ml dung dịch đệm axetat + 5 m l nước cất một vài giọt
toluen, lắc đều tan huyền phù mịn.

- Nhũ tương o liii: 73 m l nước cất, 0,2g benzoatnat, 7g gamarbic trộn đều. Sau
đó cho thêm dần dần 93 ml dầu oliu, nhũ lioá 1 0 - 1 5 phút trong máy đổng hoá
(emiilgateur). Nhũ tương có thể bảo quàn được 6 tháng ở nhiệt độ 10"- 14‘’c . Trước
khi dùng thì trộn đều.

- Từ dầu lạc, đậu; nếu dầu chưa có loại tinh khiết thì có thể tạo ra nó bằng
cách lấy dầu như trên cộng 5 ml NaOH 1% và rửa bằng nước nhiều lần tách hết
phần nước và sau đó rửa sạch hết NaOH thử bằng dung dịch phenolphtalein 0,5%.
Sấy khô dầu theo phương pháp huyền phù dầu hướng dương được dầu tinh khiết.

c. Cách xúc dịiili

Dựa dung dịch huyền phù trên, ta có hai cách làm cụ thể:

Lấy dung dịch huyền phù dầu hướng dương trên cho vào bình tam giác 100
m l, tráng sạch bình bằng 5m l nước cất, và cho vào Im l dịch chiết enzim (lượng dịch
chất enzim từ 1 - 5ml tuỳ theo hoạt động lipaza mạnh hay yếu). Lắc đều và để ở
máy điều nhiệt ở 30"c trong 24 giờ, sau thời gian đó rót qua bình 50ml hổn hợp
etanol và ete (tỷ lệ pha 4:1), cho thêm 5 giọt thimolphtalein, khuấy đều và chuẩn
bằng dung dịch NaOH (0,05 - 0,2N) tuỳ theo lượng axit béo giải phóng ra nhiều
hay ít chọn NaO H cho thích hợp . Có thể giai đoạn đầu dùng NaOH 0,1 - 0,2N, giai
đoạn sau dùng 0,05N để cho kết quả chính xác hơn. Bên cạnh đó ta làm mẫu trắng.

103
Làm urơng lự như trên nhưng không cho \'ào tú ấni mà cho Iigav \'ào 50ĩnl hỏn hợp
etanol và ete (4:1). Chuấn bảng dung dịch NaOH 0.05. 'lư thế tích NaOH quv dối
ra thế tích dung dịch NaOH 0,1N.

d. Tíìììì k ế ĩ c Ịiid

Từ số ml NaO IỈ 0,1N của mảu thí nghiệm irừ di số ml N aO Il 0, IN của mảu

irãng (sau khi quy đổi \'é) là biết được số ml NaOH Ơ,IN trung hoà lượng axil béo
tự do tạo ihành (lo hoat lực cùa enzim lipaza có trong số ml dịch chiết inen cho vào.
Từ dấy tính loán biếu thị ra số inl NaO IỈ O.IN cấn thiết dế irtiiig hoà lương axil béo
tự do giải phóng ra do lượng enzim lipaza chièì ra từ 1 hoặc 10 gam nguyên liệu ihí
nghiệm, thường khoảnc 1 - 2 ml.

Phươnịi plìủp dùnỉị Iiliù tươn^ dcìỉi oliit

Lấy 0,25ml H 2O 2, 0,3ml nhn tưưiìg dầu olÌLi, 0,1 m l dung dịch dệm phophat
và 0 ,ỉm l dịch chứa pilaza, khuấy đéii trong ổng nghiệm, sau đó gÌL~r 6 giờ ở Irong tú
ấm hay nồi cách ilìLiỷ ở 37"c. Sau đó thêm 0.3ml etanol 959Ỉ và 1 giọi chi ihị màu
Ihimolphtalein. Khuấy đều và chuấn dộ bãng dung dịch NaOM 0,0í^N. Song song
llií ngliiệm kicm ira ta ỉàm thí nghiệin mảu tráiìg bàng cách thay 0 ,1 rnl dung dịch
lipa/.a băng a l a i i o l .

Hoại dộ lipaza lính iheo còng thức:

/0

trong đó:

a, b - số ml dung dịch NaOH 0,05N chuấn mẫu ih í nghiệm và mảu iráng;

10 - quy tính cho Im l dịcỉi chiếi enzim lipaza;

2 - quy đổi NaOH 0,05 ra NaOH 0 ,1 và số inl.

Từ số đưn vị hoại dộng này trên Im l (lịch chic't men lipaza có ihể suy ra cho
1 gain chế phấm hay 10 gam chế phắm baii đầu ihco phưưng pliáp chiêì và pha
loãng dịch inen của các loại chế phẩm khác nhau và theo từng loại ilìí nghiệm, từng
hoạt lực lipaza khác nhau mà pha loãng, chiết cho phù hợp. Đế chiết chế phấm
enzim lipaza lừ cơ chất ta vẩn có thể làm như các loại enzim khác nhimg enzim
ỉipaza chịu nhiệt tốt hơn, có ihể chiết ở nhiệl độ 40" - 50"c và sau đó làm nguội để

104
chuyển sang bình định mức pha loãng. Tuy vạy tronu quy dịnh chuán chung nên
chiết và ngâm chiết ờ nhiệt dộ trung bình 30"c cho các loại nguyên liệu khác nhau
đế dẻ so sánh và lốt nhất nên ngâm chiết Irong dung dịch đệm llìích hợp từng loại
ciư.im.

4.3.7 XÁC ĐỊNH H O ẠT L ự c ENZIM TRONG NẤM MEN BÁNH MỈ

Đó dánh giá chất lượng của men bánh mì ngoài xác định hoại ỉực các enz.im
c h u n g n ế u c á n t h i ế í I i h ư t r ê n , n ế u k h ồ n g . t h ư ờ n g t r o n g s á n XLiâì d á n h g i á m ộ t s ố c h i

tiêu quan irọng đế đánh giá chái lượng của men bánh niì và dịnỉi lượng nó cho sán
xuàì nha; hoạt lực enzim zimaza, maltaza. do dộ nớ của bột theo thời gian và nhiệt
dộ cùng lượng men như nhau, xác dịnh dộ UỊO váng ... Sau dây giới ihiệii cụ thế
thêm các phương pháp.

Bùi 14. H oạt lực zimaza hay malicaa

a. Níỉiiyé/I tắc

Hoạt lực ziinaza hay mallaza biếu ihị băng ihời giaii cẳn ihiết đế lách ra dược
lOml khí CO 2 khi sử dụng 20inl dung dịch dường .saccaiT0 2 a, glucoza hay maltoza
cùng với một lượng men ép cố định, ơ dây thế hiện lốc độ lên men đường glucoza,
maltoza, hay saccaroza. Tliống thường hoạt lực zimaza nằm trong khoảng 30 - 40
pluil là men tôì, và hoạt lực mallaza không quá 80 - 90 pliút là men lôì.

Cách xác định: Dùng hệ thống inicromanomelre của Elesco (hình 4.3.7). Cùn
lượng inen ép khoảng 0,5g hay men klìỏ dà hoạt hoá khoảng 0,2 - 0,3 cho vào cốc
nhỏ cỉia hệ thống. Đổ vào cốc lOinl nước câì 35'*c và khuấy cán thận ihậl đều dược
dung dịch huyền phù nấm men, cho ihẻm vào cốc lOnil. Dung dịch dường glucoza,
saccaroza liay malioza 10% \'à dậy Iiáp irên kín vào ngay và chuyển van 3 ngã từ vị
trí A sang vị trí dể cân bàng áp suấi bên troiig với khí qiiycn, sau đó van này chuyển
vào vị trí B và đặl cốc điều nhiệt ờ 35"c. Đánh dấu thời gian lừ lúc khuấy huyền
phù nấm men với dung dịch đường cho vào và quan sát sự tăng dần của dung dịch
NaCl trong ống do áp kế và xác dịnh thời gian khi châì lỏng đó đã nâng lên được
lOml. Thời gian này chính là đơn vị đo lốc dộ lên men của đườiig này hoặc hoạt lực
enzim của nấm men. G íc chủng nấm men khác nhau sử dụng trong sản xuất thường

105
hoạt lực zimaza thay đổi trong khoảng 40-60 phúl, còn hoạt lực rnaltaza sẽ từ 70
80 đến 160 phút.

Hình 4.3.7. Hệ thống micromanometre:

1. cốc nhỏi
2. nút kín;
3. ống đo áp suất: o
to
4. ống dẫn;
5. van ba ngã. A
50

Chu ý:

Sau khi phân tích xong sẽ đố dung dịch ra bàng cáchvặn van về vị trí mở lấp
ra và đố dung dịch lừ cốc ra, rửa cốc sạch, lau khô.

Trước khi tiến hành xác định cần chuẩn bị:

Rót dung dịch NaCl bão hoà với dung dịch methylen xanh vào lắp của ống
đo áp kế. Dung dịch rót từ đáy của ống đo và đánh dấu của mức đó là mức 0.

VỊ trí xoay van phải đánh dấu bầng vazơlin ống đo được khác độ với độ
chính xác Im l = 2 0 mm.

Ghi cliír. Có thể xác định nhanh bằng phương pháp tạo váng. Đây là phương
pháp hay dùng để đánh giá nhanh sơ bộ chất lương của men ép hay men khô của
men bánh mỳ. Thường lấy 5g men ép hay l-2 g men khô, cho vào cốc nhỏ và 50ml
nước thường (hoặc cho thêm 2,5-5g đườiig). Hoà men vào cốc và quan sát bể mặt
khi men nổi lổn sau Iphút. Nếu đê’ lâu hơn 5 phút mà men chưa tạo váng là men
chưa được tốt. Từ đó đánh giá các phương pháp lực nở để xác định lượng men cho
vào bột cho thích hợp.

106
 Bài 15, Xác (lịnh lực nở của men

a. Nguycỉì ĩắc

Dùng hộp nhôm hay tôn có kích Ihirớc xác định thông thường có cấu lạo:

Mạl trên của khuôn : ]4,3 và 9.2cm hav 150xl00mm

Mật dưới : 12,6 và 8,5cm hay 140x90mm

Chiều cao : 8,5cm hav 84mm

Dùng thanh gỗ đặt ngang qua bột và đặt lên ihành hộp, đặt cao K5cm. Để
tính ihời gian bột nở đến thanh gỗ đạt ngang trên bề mặt bột.

b. C ckii .\tk' cíịiilt

L.ấy 280g bột mì chất lượng lốt cho vào tíi ổn nhiệt trong 2 giờ ờ nhiệt độ
30"c. Cùng thừi eian đó cân 5 gam men ép (cân chính xác dến 0,01g) và cho vào tủ
ấm ờ nhiệt độ 35“c cùng với lỏOml nước muối 2,3%. Lấy 10 - 20ml cÌLing dịch
nước muối cho vào chén có mcn, ]ảc đểu cho tới khi khõng vón cục, rồi đem dổ vào
bình nhào bột cQa phòng hoá nghiệm, nhào với tổc dộ 135 vòng/phút. Dung dịch
inuối còn lại đổ nốt vào thùng, rắc ít bột khỏ lèn trên rồi nhào lại trong vòng 5 phút.
Nếu trong phòng hoá nghiệm khòng có máy nhào có iliê nhào bàng tay, nlìimg phải
nhào kỹ đúng theo chế độ quy định.

Bộl nhào xong nạn thành hình bánh mì dài và dế vào khuôn sái đã xoa dấu
(khuôn ở trên). Dùng thanh gổ để ngang qua bột, đật cao l,5cm và cho vào lủ ấm
35‘'c. Tính thời gian cho bột vào khuôn đến khi thấy bột nở đến ngang thanh gổ
trong khuòn. Đó là thời gian nở của bột, hay qua đó clánh giá chất lượng men tôì
hay xấu.

Đ ối với men khô: lấy 2,5 garn mcn hoà với 30ml niróc ihường và đưa vào tủ
ổn nhiệt để 30"c trong 30 phúi. Sau đó trộn với 15 gam bộl và lại cho vào tủ ốn
nhiệl trong 2 giờ ở nhiệt độ trên. Đổng ihời cho vào tỉi ấm 35"c, 265g bột (đà lấy 15
gam ở irên). Sau đó cho men vào với 130 ml dung ciịch muối 2,5% và cho vào lủ
ấm 30 - 35“c. Nhào bột 5 phút và để xác định thời gian nở giống như men ép ở trên.

Quan sát khi bột nờ lên đến bề mặl thanh gổ, đánh giá thời gian đó là thời
gian hay lực nở của men.

107
 Chất lượng của nìcn bánh mì bán trên ihị trường được đánh giá iheo bang
4.3.7.

Bàng 4.3.7. Đánh giá chất ỉượng men bánh mi

Loai men Thời gian nở hay lưc nở (phút)

Men rất tốt ị 65-80
Men tốt 80-90
Men yếu >100
Men rất yếu >120
Ngoài ra người la còn đánh giá thời gian (độ bền vững) ciia men. Trạng thái
bị cháy xệ, xẫm mầu hay hình dạng bề ngoài để dánh giá chất lượng men chính xác
hcín.

lỉáỉ 16. Xác địỉìh dộ bén vừng của men khi bảo quản

Dừng phương pháp xác định lực nở của men ở trên sau 10 ngày báo quản I
lần. Nếu hệ men của nấm ineiì bển vữiig thì lực nớ trong hoặc sau 10 ngày bào quàn
chi lảng lén 1 - 2 phúl.

Nếu hệ men khồng bển vCmg thì lực nở kém, thời gian nớ kéo dài thêm 5 - 1 0
phút sau 10 ngày bảo quản lấy mẫu phàn tích.

Bài 17. Xác định hoạt íìộ của eniỉni P-gliicosidazci

Nguyên tắc của phương pháp là cho cnzini x ik lác phảnứngirong một thời
gian xác dịnh, sau khi dìmg phản ihig đo lượng cơ chất mất đi haylượng sản phám
sinh ra để xác định được hoạt độ của chế phẩm eiưim .

Một dơn vỊ hoạt độ P-glucosidaza (U I) được định nghĩa là lượng enzim có

dược trong ch ế phẩm dùng để XIÌC tác ih iiỷ phân cư chất và g iải phóng ra 1
micromol san phám irong thừi gian 1 phút ớ pM 4,8 và nhiệt dộ 50"c.

ớ dây cơ chất là p-NPCỉ (pani-nitrophenylglucoza), sản phẩm tạo ra là p-NP

(para-nitrophenol)

a. Ngnyêềi tắc

San phám của phán img ihuỷ phân cơ chấl p-NPG bởi enzim P-glucosicỉaza là
p-NP sẽ chuyển màu vàng trong môi trường kicm và có dộ hấp thụ quang cực dại
tại bước sóng 405nm. Phương trình thuỷ phân p-NPCi bời P-gliicosidaza như sau:

108
 p-glucosidaza
-g!ucoza ------------- ^--------- ► O^N-( ( ) )-♦-ịì-D-glucoza
■HH p ^____
P-NPG P-NP

Lượng p -N P trong các mẫu phán ứng dược suy ra lừ đường chuấn. Đường
chuán này dược ihiếl lập bàng cách xày dựne mối quan hệ giữa nổng độ dà biết của
các mẫu có nồng dộ /> N F khác nhau với dộ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm
(O D 40s)- Tìr đó có thể dẻ dàng suy ra được lượng cơ châì lính theo m i c r o m o l p-NP
giải phóng ra do lác dụng cùa enzim [3-glucosidaza.

h. Phương pháp Ịiến Ììảììỉĩ

+ CliLiân bị ống nghiệm chứa Im l dung dịch Qơ chất /7-NPG lOmM (được pha
trong dung dịch đệm axelat pH 4,8) dược đun nóng irong bể ổn nhiệl (t = 50“C) với
thời gian 3 phút.

+ Hút 0,2 ml dung dịch enzim cần xác định hoạt độ (đã được pha loãng tới
nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm trên.

+ Lác đ ề u , g iữ c h o ph ản ứng diễn ra Iroiig 15 phút ờ nhiệt dộ 5(y’C.

+ Dìing Im l Na 2CO, IM lạnh đế dừng phán ứng và tạo môi trường kiềm.

+ M ảii kiểm chimg được thực lìiộn tương tự nhưng bao gồm : 0,2 ml dịch
enzim bị vò hoạt ngay bằng 1 ml Na^COi IM , bổ sung thêm vào hổn hợp này 1 ml
cơ chất và cũng giữ trong 15 phút.

+ llà m lượng p-N P giải phóng ra được đo trên niđy so màu quang điện ở
bước sóng 405 nm so với mẫu kiếm chứng.

c. Công íliửc íínlỉ đơn vị hoạt dộ f}-gliicosỉdaza

HDE - — ^ •n
0,2-15

troiìg đó:

HDE: hoạt độ enzim P-glucosidaza (U l/m l);

a: nồng độ p-N P giải phóng ra (tra theo dồ thị đường chuấiì);

0,2: thể lích dịch e iư in i tham gia vào phản LÌììg, nil;

109
 15; thời gian tiến hành phản ứng, phút;

n; hệ số pha loãng dịch enzim.

Đồ thị dưừng chuiiìn

1.2 :

Ip -M M

110
 Chương 5
GLUXIT

G liix it là một trong những thành phần chính tạo nên thực phẩm. Trong thực
phẩm nguồn gốc thực vật, tinh bột và gluxit chiếm từ 80-88% chất khô. Chúng còn
có nhiều trong các phụ gia dùng trong công nghiệp thực phẩm như chất kết dính và
chất keo gelaiin (tinh bột biến tính). G lu xil biến đối trong quá trình chế biến do
chịu nhiều tác động, ví dụ; hiện tượng tổn thất tinh bột lìoạc thay đổi thành phần
các loại đường...

Phân lích và kiểm tra thành phần g luxit của nguyên liệu, sự thay dổi của
chúng trong các quá trình công nghệ và cuối cùng là kiểm tra chất lượng cùa các
chỉ tiêu về hàm lượng các chất gluxit đóng một vai trò quan trọng. Hầu hết các qui
trình sản xuất ihực phẩm đểu cần kiểm tra và phân tích thành phần gluxit, có thể kể
đến các quá trình chế biến lươiig thực, sản xuất tinh bộl, san xuất dường mía, đường
glucoza, mantoza, fructoza, sản xuất rượu cồn, sản xuâì bia và các sản phấm lèn
men khác hoặc trong công nghiệp sản xuất thuốc lá ...

Các phương pháp phân tích và kiếm tra giới ihiệu trong phần này còn được áp
dụng dể phân lích thành phần g liix it irong các thức ăn kicng, trong công nghiệp sản
xuấi các dược phẩm, m ỹ phẩm, trong chế biến gỗ và bao b ì...

5.1. ĐỈNH LƯỢNG GLUXIT BẲNG p h ư ơ n g p h á p s o m à u

5.1.1. NGUYÊN TẮC s o MÀU

Nguyên tắc của phương pháp so màu trên máy là đo mật độ quang của dung
dịch rồi suy ra nồng độ, dựa vào định luật hấp phụ ánh sáng của Lambert - Beer;

111
 Ig ^ - k . c . b - D
í

trong đó:

D : mậl dộ quang;

ỉ„ : cường dộ áiih sáng ban đáu;

I : cường độ ánh sáng khi đi qua dung dịch;

K : hãng số;

b : chieu dày lớp dung dịch (cm);

c ; nồng độ dung dịch (g//).

K h i phân líc h g lu x it, mật độ quang của dung d ịch CÌLÍỢC so sánh với dung
dịch chuẩn là nước cất. Có nhiều loại máy so màu, khi phân lích dịnh lượng gluxit
la có ihể sử dụng các loại mấy so màu có sẩn trong phòng thí nghiệm. Dù loại máy
nào, dế tiến hành phép do cẩn thực hiện các bước sau đáy:

C ììiiấ iì b ị (liỉỉiịỊ dịch so ììiùit

Dung dịch so màu phái trong suốt để tránh sai số cho phép đo, vì vậv Irước
khi đo mật độ quang dung dịch phải được lọc kỹ. lốt nhất là sỉr dụng chất trợ lọc
diatomit

C h ọi ì kínlì lọ c súỉig lìuy c h iê u dù i hước s ó n g (ỊĩiUỉìỉị p h ố p h ù h ợ p vài d t m g

dịch

Muốn thế ta xây dựng dồ thị sự phụ thuộc giữa mại độ quang (D) và chicLi
dài bước sóng ( X). 'n n i diểm cực dại của D dể lìm bước sóng nhàn) Iránh sai số
cùa phép do. Ngoài ra còn thực hiện ih í nghiệm với dung dịch cỉùng dế tạo màu, lìm
sự dóng dạng cua hàm so D = f (Ằ.) cúa dung dịch hoá chấl lạo màu và (lung dịch
thực phẩm. Nếu không tìm ihấy sự đồng dạng thì chất tạo màu không sử dụng dược.
Trên hình 5.1.1 biếu diền sự phụ thuộc của mật độ quang vào bước sóng CLUI dung
dịch ferrocyanua làm châì tạo màu và dung dịch đường khử trong phương pháp xác
định đường khử trên máy cực phổ Cộ- 4.

112
 0 Ạ

Hinh 5.1.1. Sự phụ thuộc D = f(>.)

Đở thị trên cho cho thấy các đường biểu dién đồng dạng \'à chl) dicm cực
dại ớ 2 giấ trị X - 32()nm và Ằ ~ 420nm . N lìư vậy d iiiig d ịc h feiTocyaiuiệi chọn làm
chát tạoỉmàu ià phù hợp và dế xác định đườĩig khử tii chọn bước sóng 420iiin vì
nó ch o tíiểm cự c dại cao nhất. ^

'ỉ'rên các máy so màu có thế ghi rõ bước sóng hoác số kính lọc fiđng (lừ 1-
10). Trong Inròmg hợp dó ta cần ira cứu sự liên hệ giữa so kính lọc sứĩig và birớc'
sóiig liiv thuộc vào các lơại mấv trong các bán lý lịch máy kèm theo. Njzoài ra còn
có ihế dựa vào màu clLiĩig d ịc h đ ế c h ọ n màu kính lọc sáiig, báng 5.1.1. Ị

B ảng 5,1.1. Màu dung dịch và kinh lọc màu phù hỢp

Màu d u n g dịch Màu kính lọe

Tím Xanh lá cây
Xanh Vàng
Xanh lá cây hơi đâm Da cam
Xãnh đâm’ t.
!i Đo
Xanh hơi vàng Đỏ đậm 1
Vàng da cam Xanh
Đỏ Xanh hơi lá cây

13
 Chọn côc do ịC iiv e t)

Sau khi đã chọn được bước sóng cẩn chọn cốc đo, trong đó dựng dung dịch,
để giá trị của mật độ quang (D ) nằm trong vùng ổii dịnlì và khõng ra ngoài bảng
chia độ. Thực tế cho thấy giá Irị mật độ quang nằm trong khoáng 0,2-0 ,8 phép đo ít
sai số nhất. Nếu giá irị của D > 0,8 cần pha loãng dung dịch. Đê định lượng gluxit
thường dùng cốc đo có chiêu dàv Icm

Xảy dựng đường chuẩn CÌIO ìììồi lo ạ i ỈÌÌÚỴ vù ỉììổỉ lo ạ i (lung dịcìì

Đường chuẩn liên hệ D = f(C) phải nằm trong khoảng liên hệ tuyến tính mới
có giá trị. Sau khi có đường chuẩn ta xác định nồng độ dung dịch nằm trong vùng
đó. Lấy ví dụ xây dựng dường chuán để xác định hàm lượng đường khử bãng
phương pháp so màu với íerrocyanua: lấy hàiig loại bình tam giác lOOml, dùng
pipel cho vào m ổi bình 20ml dung dịch ferrocyanua ( lOg/1); lOml K O H l,25N , sau
đó cho vào m ồi bình lần lượt 5.0; 5.5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0ml dung dịch đường khử
tiêu chuán, thêm nước cất vào các bình để chúng đều có thể tích v= 40ml.
Đặt lần lượt các bình lên bếp điện đun sôi đúng 1 phút, làm nguội dưới vòi
nước và đo mật độ quang D (cuvei Icm ; 420nm). Lấy kết quả và lặp dường
chuấn D = f(C). Sử dụng đoạn có phụ thuộc tuyến tính của đổ thị để xác định nổng
độ dung dịch theo D.

Đo mậi độ quang D của dung dịch

Sau khi đã chuẩn bi xong dung dịch và máy (nên bật máy trước khi thao tác 5
phút để có trạng thái ốn định). Cho dung dịch cần đo và dung dịch chuẩn vào cuvel
và tiến hành đo D. T im điểm 0 của máy (với dung dịch chuẩn D=0). tuỳ loại máy,
giá trị cùa D sẽ được thể hiện trên các bảng chia độ hoặc được hiện lên các bảng sổ.

Trong thực tế, dối với m ỗi loại nguyên liệu cần phân tích đều cho san giá trị
bước sóng được sử dụng trong các tài liệu iham khảo. V ì vậy người thao lác không
cần mất nhiều thời gian chuẩn bị. Điều quan trọng là phải chọn đúng và linh hoạt
xử lý trong thực tế, nếu không làm được như vậy kếl quả sẽ kém tin cậy.

114
 5.1.2. X ÁC ĐỊNH CÁC H EXO ZA BẰN G PHƯƠNG PH ÁP s o MÀU

Bàỉ L Phương ph áp anthrone

a. Nguyêỉỉ ĩắ c

Phương pháp định lượng hexoza bằng anthrone (9 ,1 0 -d ih y d rO '9 -o xo a n tra ce n )

ra đời từ năm 1946. Ngày nay đã có nhiều cải biên, chủ yếu là về nồng dộ anthrone
và nồng độ axit, nhiệt dộ phản ứng và thời gian phản ứng. về nguyên tác cũng
giống phương pháp trên, lợi dụng phản ứng lạo màu giữa các đường và anthrone
trong axit sunturic.

h. Hoá chất

Dung dịch anthrone tinh khiết 0,2% trong axit suníuric (tránh nitrat). Duiig
dịch chuẩn trước khi phân tích ít nhất 4 giờ và sử dụng trong ngày.

c. Tiểỉi ìiàỉih

Cho vào các ống thí nghiệm sạch 2ml dung dịch cần phân lích (chứa =
200mg oza lổng số). Làm lạnh sơ bộ dung dịch trong nước đá 15 phút, thêm 4ml
dung dịch anthrone. Lắc bàng máy lác ống (Vortex), đậy ống bằng lìáp tròn thuỷ
tinh, cho vào nồi cách ihuỷ 80^’c trong 8 phút, sau đó làm nguội nhanh các ống
irong ihùng chứa đá, dể mẫu trong bóng tối 30 phút rồi đo D ớ 585nm.

cl. Tỉnìì k ế í (ỊIU Ỉ

Khả năng hấp phụ của các hexoza khác nhau. So với galactoza» hệ số hấp phụ
như sau:

maniioza 83% fucoza 200%

glucoza 193% friictoza 162%

xyloza 30%

Làm thí nghiệm kiểm chimg với các oza chuẩn giống như phương pháp trên.
Mặc dìi khả năng hấp phụ các hexoza cực đại ở 620nm nhưng so màu ở 585nm để
tránh ảnh hưởngcủa các protein với số lượng hơn nhiều so với phương pháp trên.

115
 lỉài 2. Phương phápfericyanua

a. Nguyớìi tắc

Đirừng khứ trước khi dun nóng với dung dịch kiéin cùa ícricyanua sẽ khử IIÓ
thành íerocyanua, bản lliân chuyến ihành axit dưừng, cỉuiig dịch mất màu.

CH 2 0 H(C H 0 H),C + 6 K ,[F e(C N ),] + 6 K O H -

(CH 0 H ),(C 0 0 H )2 + 6 K JF e (C N ),] + 4H.,0
a.xit íỉitờiiíỊ

h. H aề chất

- K,[l*e(CN), iOg/l

- K O ụ 1.25N 70g K O H //

-C ác chất lắng trong để tách protein

r. Ticii hành □

Chuá I bị dung dịch mẫu (lắng protein bàng các chất làm trong dung clịch).
pha loãng ư ẫu dể hàm lưựng đường khử chứa 0,2g/100ml. Lấy 5-8m l dung dịch lọc
thêm 20ml íericyanua + lOml KO H và nước cất dến v= 40m l. Đun sôi Iroiig 1
phút, làm nạuội so màu với nirớc cất Ở420nm.

(ỉ. T úBi kểl qiuì

Dựa 'ào mật dộ quang D theo đường chiian tính đirợc hàm lượng dining khử
trong nguyên liệu:

trong đó:

a : lư M g RS trong dung dịch đo D, xác định bằng đường chuấn;

m: lưij||g nguyên liệu tương dương với sò m l dung dịch mầu dùng đế io I);

k :: hệ
hẹ sô
số ph^ụ^tlniộc
I hăm lượng đường khử trong ciiing dịch dừợc thể hiẹn
trong bảng 5.1.2.

I 1^
 Báng 5.1.2. Hàm lương dường khứ vá hé số k tương ứng

Hàm lượng RS so với đường chung Ị Hẻ sò k

1-5% 0,9
5-10% 0,91
lQ-15% 0.93
15-20% J 0,94

5.2. XẨC ĐỊNH BẲNG p h ư ơ n g p h á p p h â n c ự c

5.2.1. NGUYÊN TẮC

XỊấc định g liix il bàng phương pháp phân cực dựa trên tính chất :ơ bản của
g lu xii làịkhả năng phân cực ánh sáng.

Ánh sáng chia làm hai loại: áiili sáng tự nhiên và ánh sáng phân cực. Ánh
sáng tự àhiên dao động trong nhiều mặt phắng thảng góc với tia. còn á|dj sáng phíln
cực chi liio động trong một mạt pháng vuông góc với tia.

a) b)

H inh 5.2.1. Dao động của tia sảng: a- tựnhiền; b- phản cực

G ịiix it là một trong những hợp chất hữu cơ có khả náng phân CỊ» ánh sáng.
K lii ánh! sáng đi qua dung dịch chứa g liix it sẽ tạo thành một góc quay cực. T rị số
góc quaý cực phụ thuộc vào nồng clộ của chúng trong dung dịch. Ta sử dụng phân
cực kế hi0 ặc kế để phân tích.

Góc quay mặt phắng phân cực a ti lệ \'ới chiều dài ánh sáiig đi qua, với nồng
độ chất có hoạt độ quang học trong cÌLing dịch và góc quay cực riêng phán của chẫt
dó.

117
 a = [a].l.c/100
trong đó:
/: chiều dài ống phân cực;

c: nồng độ g/lOOml. Nếu nồng độ tính bằng % trọng lượng thì c=p.d

p% (g/lOOg dd);

d : ti trọng dung dịch;

[a ]: góc quay cực riêng đặc trưng cho các gluxit.

T rị sô' [a ],/" của một số gluxit được thể hiện ở bảng 5.2.1

Biết được góc quay cực a; [a ] và 1 biết được nồng độ dung dịch:

a. i oo
g/ 1 0 0 cm-’
a
hoặc:

a. i oo
c= r g/ 1 0 0 g dung dịch (%)
a l.d

Bảng 5.2.1. [a]o^“ của một số loại gluxit (*)

Các chất [a]n^“

Saccaroza + 66,5°
Đường khử
Glucoza-fructoza 1;1 - 19,45
__ Mantqza .... 138,3..
Glucoza + 52^5
Fructoza -91,3
Dextrin + 194,8
Tinh bột các loại (*) +
Khoai tảy 194,5
Gạo 185.9
......Ngô....... ....................... ...... 184,6
Lúa mach 184,0
Lúa mì 182.7
Đại mach 181,5
Kiều mach 181,3
(*) theo Evers

18
 5.2.2. THựC HÀNH

Bài 3. Xác định đường saccuroia

u. Nguyên tắc

Làm trong dung dịch trirớc khi phân cực để tránh ảnh hưởng của các chất có
góc quay cực khác và loại bỏ các chất màu ảnh hưởng đến kết quả đo. Gíc chất làm
trong thường sử dụng là:

Axetat chì trung tính Pb(CH,C 0 0 )2.3 H 2 0 và axetat chì kiềm tính
2 Pb(CH^COO) 2-Pb(OH )2 ở dạng bột hoặc dung dịch. Axetat chì lắng hàng loạt các

chất như axit oxalic, o xit axit protein, sapoiiin, các chất màu, các chất pectin, các
chất màu m elanoidin... Chú ý là không dùng quá lượng axetat chì vì một sớ kết lủa
có khả năng hoà tan khi dư axetat chì như các protein.

N itrat chì là chất làm trong mạnh hơn, đó là một hỗn hợp gồm hai dung dịch
Pb(N 0 ,) 2 và NaOH. 340g Pb(NO 0 2 -/l/; 32g NaOH/1/ dùng lượng bằng nhau
(5-lO m l). K h i sử dụng cho nitrat chì trước, NaOH sau.

Clìíi ý: Lượng chì dư trong dung dịch có thể loại bỏ bằng dung dịch NaH 2P0 j
hoặc 1 giọt axit axetic đậm đặc.

Thước đo độ đường: theo qui định thirớc đo độ đường trong đường kế chỉ
100"s khi ta hoà tan 26g đường saccaroza tinh khiết trong lOOml nước cất và phân
cực trong ống 2 0 0 mm ở 2 0 "c . 26g gọi là lượng cân tiêu chuẩn, 2 0 0 mm là ống phân
cực tiêu chuán. K h i cân mẫu với lượng căn chuẩn và phan cực kế bằng ống tiêu
chuẩn, số chỉ trên thước đo cho la biết % đường trong mẫu. Trong thực tế phân tích
ta có Ihể lấy bội sô' hoặc ước số của ehúiig. V í dụ; nếu lấy 13g pha trong lOOml
phân cự c trong ốn g 2 0 0 m m thì thành phần đường sẽ là Px2, trong đó: p - s ố đọc
trên máy. Hoặc pha 26g mẫu trong lOOml phân cực bằng ống lOOmm thì thành
phần đường cũng bằng Px2.

b. Dụng cụ và lioá cliđl

- Đường kế

- Chiết quang kế

119
 - Bếp đun cách thuỷ

- Các bình định mức V50, 100, 200, 250 m

- Các cốc đựng dung dịcli

- Phẻii lọc và giấv lọc ________

- Cá' ỉ loại ống hút

- Dung dịch axetat chì trung tính: 250gPb(CH,COO)2.3H2O + 50ml ịiước cất,
khuấy đều, lọc. Nước lọc trung hoà bằng axit yếu. Pha nước cất đến khấc llịít.

- Dung dich axetat chì kiềm tính: lOOg oxit chì (PbO) + 230g axil éhì trung
tính + 5 0 ư | nước cất. Đun sôi trong 1/2 giờ để thuỷ phân oxit. Để nguội,ịlọc, pha
bàng nước Bất đến l l i t (54Bx)

- DuỊíg dịch nitrat chì: 340g Pb(NO,) trong llít

32g NaOH trong 1 lít.

- HCl 24,85Bx: 510,57ml HCl dậm đặc trong 1 lít

- Na 3 : 231,5g N a Q trong 1 lít

- Thim hoạt tính 5g/100tĩil

- A x it axetic đậm đặc

- Ete etylic

- Bộị kẽm.

c.TiỴn hành j

Xík )ặnh hàm lượng saccaroza trong đườiìg kính !

Cân 26g đường bằng cân phân tích vào 1 cốc khô có miệng rót (đã eiâii trọng
lượng cốc) Hoà tan đường trong cốc bằng khoảng 40-50ml nước cất đã điin Iióng,
dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho đường tan hết. Rót toàn bộ dung dịch đuỊrng sang
bình định sạch đuờng trong cốc, que th u ỷ tinh và phễu bằng mộỊ ít nước
cất, chuyển tất cả vào bình định mức. Thêm nirớc cất đến gần vạch định mức, để
yên khoảng 15-20 phút cho nhiệt độ dung dịch đường gần bằng nhiệt độ trong
phòng. Thêm nước cất đến vạch bình định mức, đậy nút bình lắc đều, để yên 1-2

120
phứt 1'ổi lọc. K h i lọc nhớ đậy phễu, lọc bằng k íiih ihuý tinh đế iránh IIƯỚC bay hơi
làm thay đối nồng độ. Mé lọc đầii dổ di. Nirớc lọc pliải trong suốt. Rót dung dịch
vào ống phân cự 2 0 0 mm; nhớ tráng ống bãng dung dịch nước lọc 1-2 lầii và rót
dung dịch vào inép ống đế tránh tạo bọt. Đậy nắp ống pliân cực bàng nắp thuý tinh
bàng c á d ị diíỵ xiiig náp ưùu rái-vạj^ 4 ú lixa osu vàQ-giiệiìg ống.
Lau khô Bíii dầu ống bằng một miếng giấy lọc. Đira ống ra ánh sáng q u iii sát. ống
phải được; nhìn thông suốt và không có bọt, nếu có bắt buộc phải làm laị. Đạt ốiig
pliân cực irào máy, bật điện và bắl đđu đo. Ghi kết quả và ghi nhiệt độ t.

c/. iV/í/; kếí quả

Hàm lirợiig đường saccaroza tính theo %\ X

X = P t[ 1+0,0003(1-20)]

trong đó;

Pt: hàm lượng đường đọc được trên máy;

t: im iệt độ.

Bù !4. X ác định hàm lượng tinh bột (phương pháp Everse)

a. ỉỉgiiyêii tắc

T h iiỳ phân tinh bột bằng axit HCl loãng, sau đó đo góc quay cực của dung
dịch thuỷ phân, tính ra nồng độ dung dịch khi đã biết góc quay cực riêng phần của
loại tinh lộ lđ ó .

h. lìụiìg cụ vù lioủ chất

- pkan cực kế hoặc đườiig kế;

- Binh định mức lOOml;

- Ống đong 50-100ml;

- n Sì cách thuỷ;

- Phễu lọc và các ổng dựĩíg đủìig dĩcĩi; đùã thnỹ“tTiĩh; ~

- Hoá chất; HCl 1,125%; 30ml HCl đậm đạc/lOOml;

ZnS 0 4 30%: 30g/100ml;

121
 K^PeíCN), 15%: 15g/100ml;

Molipdat amonium.

Tiến lìàiili

Lấy 2-3g tinh bột (nếu các sản phẩm hạt lấy 5g sản phẩm đã nghiền nhỏ) càn
bằng cân phân tích vào cốc cân bằng thuỷ tinh, chuyển lượng cân vào bình định
mức lOOml qua phễu nhỏ, thêm vào bình định mức 50ml HCl nồng độ 1,124%
(tìmg ít một để tráng được lớp bột dính quanh cổ bình). Lắc đều, cho bình vào nồi
cách tliLiỷ đã đun sôi. Trong 3 phút đầu lắc nhẹ bình đều đận và thường xuyên, chú
ý không để bột dính vào thành bình và mức nước trong bình cách thuỷ phải cao hơn
mức dung dịch trong bình. Sau 15 phút lấy bình ra, thêm nước cất đến thể tích
chung 80-90mI rồi làm nguội bình đến 200C. Làm trong dung dịch và kết tủa protit
bằng 4ml dung dịch molipdat amoni (riêng với bột lúa mạch lấy 6 m l). Cũng có thể
làm trong dịch lắng protit dung dịch bằng 0,5-2ml dung dịch axit vonữamic 4%,
hoặc 0 ,5 -Im l dung dịch axit pioric 1% hay bằng Im l ZnS0 4 30% và dung dịch
íerrocyanua K 4Fe(ơ^)fi 15%. Sau khi lắng protit, cho thêm nước cất đến khấc độ,
lắc đều, lọc. Mẻ đầu đổ đi và phân cực trong ống 200ml.

ci. Tínlì kết quả

Hàm lượng tinh bột g/100 trong 5g mẫu được tính theo công thức:
a . 100.0,3462
a

trong đó:

a: góc quay cực do được;

/: chiều dài ống phân cực, dm;

[a]o^": góc quay cực riêng (tra bảng);

0,3462: hệ sô' chuyển đổi từ phân cực kế sang đường kế.

Everse đã chuyển đổi thành hệ sô' K cho các loại tinh bột theo các hệ sô' sau
để nhận kết quả đọc được bằng đường kế, bảng 5.2.2.

122
 B ảng 5.2.2. Tinh bột và hệ số K tương ứng

Loai tinh bôt Hê sô' K

Khoai tây 1,755
Gao 1,866
Ngô 1,879
Lúa mạch 1,885
Lúa mỳ 1 898
Đại mạch 1,912
Kiều mạch 1,914
K ê ...... ' 1,818
Đậu tẩm (vica sativa) 'IJ 4 7
Sắn (*) 1,780
S ố liệu có ĩhể tham khảo

Như vậy nếu dùng đường kế: 5g/pha trong lOOml/phân cực ống 200/đo được
p. Hàm lượiig tinh bột = PxK

Nếu lấy lượng cân khác 5g hoặc pha loãng và dùng ống phân cực bằng các
bội số của chúng thì phải tính kết quả theo các hệ sổ cần thiết. Nếu dùng phân cực
kế Ihì kết quả đọc được nhân với hệ số 5,12 cho các loại tinh bột. ưu điểm lớn nhất
của phương pháp xác định linh bột bằng phân cực kế là tiến hành thí nghiệm nhanh
chóng, có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất. Nhược điểm: hệ số góc quay cực quay
riêng phần của tinh bột có thể thay đổi, phụ thuộc vào điều kiện sản xuất và giống
cây trổng, đặc biệt thấy rõ khi phân tích nguyên liêu đà bị hư hỏng. Ngoài ra trong
quá trình thao tác, khi đun nóng với HCl ngoài tinh bột, một phần hemicelluloza và
các hợp chất khác có ảnh hưởng đến góc quay cực

Bài 5. Xác định hàm lượng dextrin

a. Nguyên tắc

Dựa trên tính quay cực của các đường hoà tan và dextrin có trong dung dịch,
đồng thời dựa trên tính kết tủa của dextrin trong cồn.

123
 b. Tiên lìàỉìlỉ ỉlỉí nglìiệỉìì

Lấv 23in! dung dịch mẫu cho vào bình dịnh mức VỈOOml; thèm 30ml nước
cất và 2ml dung dịch axetat chì, lắc đều. Thèm 2ml dung dịch Na.HP 0 4 , cho nước
đến khấc, lọc. Phán cực iroiig ống 100 được a l .

l i y 5ml dung dịch mẫu cho vào bình định mức 50ml, cỉổ^đầy cồn 96*’ đến
khấc, lắc dều, lọc. Phân cực trong ống 100 được a2.

Hám lượng dexlrin có trong lOOml dung dịch mầu (ví dụ dịch ẹường hoá)
được línlp theo công Ihức:

_ 4 .a ,- 1 0 .a . 0,82
D ( g / 1 0 0 m l) = ------' X 0 ,3 4 6 g
3,26

trong đó

4: hệ số pha loãng dung dịch lần 1 ;

IC : hệ số pha loãng hỗn hợp đường rượu;

0 ,1 2 : hệ sô' điều chinh khả năng quay cực của các chất hoà tan khậc có trong

dung dịcỊc

3,16: góc quay cùa dextrin, được xác định bằng thực nghiệm;

0, j 46: hệ số chuyển đổi.

H im lượng dextrin tính theo % khối lượng:

D.IOO
D% =
B.,.d

Gm chú'. Theo thực nghiệm dối với dịch đường hoá thì tinh bột không cần
thiết dùng axetat chì dể làm trong mà chỉ cần lọc trong suốt dung dịch, Tuy nhiên
để chính xác cần làm ihử với mẫu cụ thể.

124
5.3. PHƯƠNG PHÁP HOÁ HỌC

5.3.1. CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU TRƯỚC KHI PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN
ĐƯỜNG

T iiỳ đối tirựng phân tích các sản phẩm mà cácii chuaĩrbỊ diirĩg dịcii iịiầ u dùng
để địiih lirỢBig đường có khác nhau nhimg nguyên tắc chung là có thê’ đ|ing nước
hoặc dùng cồn để chiết dường.

C liiề đường bằng nước

K lii; nguyên liệu thí nghiệm không chứa nhiều tinh bột hoặc in ii in, dùng
nước để cl^iết; Cân và cho vào cối sứ l-2g mẫu nguyên liệu đã nghiền u ỏ và sấy
khô với cá^ loại hạt và thực vật khô; cân 5-lOg nếu là nguyên liệu tươi nghiền nhỏ.
Thêm 30ití1 nước cất nóng 70-80"C. Chuyển toàn bộ hổn hợp vào bình Ểịnh mức
lOOml, đuà cách thuỷ ở nhiệt độ 75-80"C trong 30-40 phút. Loại protit b in g dung
dịch axetaệchì hoặc nitrat chì dư bằng dung dịch bão hoà Na 2 SƠ 4 thì đun cách thuỷ
10 phút ở (SOPC, còn dùng Na 2PƠ4 thì để yên hỗn hợp 10 phút. Sau đó thêníi| nước cất
đến vạch c|iia độ, lắc lọc. Dịch lọc dùng đế phân tích đường.

C ììiằ đường bảng rượií

ị
T rư ặ ig hợp nguyên liệu chứa nhiểu tinh bột và inulin như các lo ^ củ... ta
chiết đườnj| bằng rượu 70-80‘'C. Đun cách thiiỷ hỗn hợp trong bình có lắp ống sinh
hàn khí. Tlniteg hợp này không phài kết tủa proiein bằng axetat chì Iil^ ir trên vì
lirợng protệin chuyển vào dung dịch rất ít. I

Ghi ịp/;íí: Đối với các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ (ví dụ các loại quả)
trong quá tịrình đun chiết, đường saccaroza có Ihé bị Ihuỷ phân một phàn, ềo đó khi
xác định rỊêng đường saccaroza hoặc đường khử, trước khi đun cách thu^ hỗn hợp
cần trung lỊoà axit bằng dung dịch Nu2C0 i bão hoà đến pH 6,5 - 7,0.

5 .3 .Ì THỰC HÀNH
]

Bài ặ. X ác định đường khử bằng phương pháp Bectran

a. Ngiỉvèỉì íắc

Troiig môi Irường kiềm các đường khử (glucoza, friicloza, mantoza...) khử
oxit đồng (2 ) thành o xit đồng (1 ) (Cu"^ -> C u "'). Đ ổ đ ịn h lượng đường khử dùng

125
thuốc th ử Peh ling : d u n g dịch sLiiìíai đ ổ n g (P elin g I) và d u n g d ịc h m u ố i xecnhet:
muối kali-nairi lactrat kép (Pehling II) hoặc gọi là Pehling A và Pelìling B, theo tí lệ
1:1. K hi trộn Pehliiìg I và Pehling II, đầu tiên tạo thành C u(O H )2 có màu xanh da
trời.

HO c COONa o c COONa
C u (0 H )2 ^ - - - ■ ^ Cu + H 2O
HO c COOK o c COOK
H H

Như vậy muối xecnhet giữ cho ion Cu^ trong m ôi trường kiềm không bị kết
tủa dưới dạng Cu(OH) 2. M uối phức này không bền, vì vậy các đường có chứa nhóm
andehyt hoặc xeton dễ dàng khử thành Cu^ tạo ra kết tủa o xit đồng (CU2O) có
màu đỏ, bản thân đường bị oxy hoá khi tác dụng với dung dịch Pehling.

CHO J_| coon II

(CHOH), + Cu ° + H jO -> (CHOH), + "O ^ + C u .O ịđ ỏ
C H p .l o s COOK MO c COOR

Để định lượng oxit đổng I được tạo thành trước hết oxi hoá nó bằng SLinfat
sắt 3 hoặc sunfat kép sắt amon trong môi trường axit suníuric, Cu* sẽ bị oxi hoá trở
lại thành Cu^^ còn bị khử thành

CU2 O + Pe^íSO,), + 2 II2 SO 4 = 2 CuSƠ 4 + FeSƠ 4 + H 2 O

Tiếp đó lượng tạo thành được xác định bằng cách oxi hoá nó bằng dung
dịch KM 1 1 O 4 chuẩn độ trong môi trường axit

10 FeS0 4 + 2 K M n 0 4 + 8112804 = SPe^lSO^), + 2 M 11SO4+ K 2SO4+ H 2O

Dựa vào lượng KM 1 1 O 4 tiêu tốn người ta lập bảng tỉ lệ giữa lượng KM nƠ 4
1/30N và lượng đường khử (bảng 5.3.2) để dễ sử dụng.

b.Dụng cự

- Phễu lọc đường (xốp) chuyên dùng để xác định thành phần đường.
- Bình Bunzen nối chân không
- Bơm chân không
- Bình tam giác lOOml, bình định mức 50ml, lOOml, cốc và phều lọc.

126
 r. Hoủ chát
- Pehling I : 40g CUSO4.5 H 2O /Ilít

- P e h lin g II : 200g muối xecnhet+!50g NaOH/ llít

- Dung dịch Fe 2(S0 4 ), Irong axit sLinfiiric: 50g FC2(S0 4 ), +200ml H 2SO4 đậm
đặc (d = l,4 )/lil

Hoặc dung dịch sunfat kép sất amoni.

8 6 g (N H 4) 2S0 4 .Fe,(S 0 4 ),. 2 4 H 2 0 + 2 0 0 g (108,7ml) H.SO 4 d = l,8 4 //

K M n Ơ 4 1/30N; l,06g K M n 0 4 / l l í t nước cất đun sôi. Nồng độ K M n Ơ 4 được

xác định bằng oxalat amoni hoặc axit oxalic một ngày sau khi pha

Bảng 5.3.2. Bảng thực nghiệm của Luxisun

KMnO^ Glucoza Fructoza KMnƠ4 Glucoza Fructoza

1/30N (mi) (mg) (^ g ) 1/30N (ml) (0 ^ .ÌT M l,
0.2 ......0 ,0 ..... 0.0 18 19.2 20,1

A . . .
0.8 0,85 19 20^3 ] 21^.2 ''

V .. 1,8 „ 20 21.5 I 22. 4..

3 .2,8'... . 2.90 21 22.7 23j Z...
4 ... 4,10 22 _ , 23,8 . 2 4 .9 ] ] '
5 z . ' 5 .0 ... 5,30 23 25,0 26,2
1..6,1... 24 26.2 ^ 27.5
7 .... L 2 .... 1 7.70 25 27 A 28.8
8 8.3 8.90 26 28,6 30 2
9 ' 9 .3 .... 10.0 27 299 31.7
10 10,4 .... 11,1 28 3 1 ,2 ] 33.1
11 ......1.1.5.. ' J 2.2 29 32,5 ...34,5

12.. 13,3 33.8 35.5

11 ...
14.5 31 37.1
14 15.6 32 36,3 38.6
15 15,9 16. 7 .. 33
16 17. 0. ..... 17.8 34 38.9
17 18.1 18,9 35 4 0 I2

127
 d. Tiếìi liùnli

Dung dịch mầu sau khi đã được chuấn bị (xem ở trên) được lấy lOml (0,8-
40mg đường) cho vào bình tam giác VlOOml, thêm 5ml Pelìling 1 và 5ml Pehling
II. Đun sôi hỗn hợp trong 3 phút tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu liên. Sau khi đun
sôi dung (^ịch vẫn giữ màu xanh biếc đạc trưng. Nếu dung dịch mất màu chứng tỏ
lượng Pebling cho vào không đủ. Lúc đó phải làm lại thí nghiệm hoặc cho thêm
lượng Penling hoặc giảm lượng mẫu. Đế yên, lọc bằng phễu lọc đường lG -4) vào
bình lọc cHồn khòng benzen. Rửa bình và phều lọc bằng nước cất nóng 3-4 lần.

Chí ý giữ phần lớn lượng oxit đồng I nằm lại trong bình tam giác vii lớp oxii
đồng tron bình và trên phễu luôn được phủ một lớp nước nóng để CU2® khỏi bị
oxit hoá O2 của không khí. Hoà tan kết tủa oxit đồng I vào bình bui zen khác
bằng cácỉ' cho nhrmg lượng nhỏ (5m l) dung dịch suníat sắt 3 trong mệ)i trường
H 2S0 , vàc bình có chứa kết tủa C 112O và chuyển sang phễu lọc. Tráng cẩn hận bình
và phễu Icc 3-4 lần bằng nước cất nóng. Nước tráng cũng thu vào bình. E ịnh phân
dung dịch bằng K M 11O 4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt khôAg mất đi
trong 20-; 0 giây. Biết lượiig định phân, tra bảng suy ra lượng đường trệng dung
dịch thí Iiị hiệm. Làm thí nghiệm kiểm chứiig song song thay dung dịch đu^ng bằng
nước cất.

e. T [///; kết quả

H ài^ lượng đường khử tính theo %

a.V.100
RS% =
V,.m.lOOO

trong đó:

a: sằ mg glucoza tra bảng ínig với số ml K M 11O 4 1/30 N trừ đi sô' m KM nO .

1/30N của mẫu kiểm chứng;

V: cỊung tích bình dịnh mức;

V,: lượng dung dịch mẫu thí nghiệm lấy để xác định đường khử (trong ví dụ
trên lOml);

m: lượng mẫu (g) nguyên liệu thực phẩm;

128
 100: hệ s ố c h u y ể n đối %;

1 0 0 0 : hệ số chuyển đổi sang mg.

Bài 6. Xác định đường khử hằng phương pháp Lane-Eynon

Phương pháp Lane-Eynon cũng dựa trên cơ sở khử dung dịch Pehling nhưng
khác với phưcnig pháp Beclran không phải hoà tan kết tủa và định phân bằng
K M n 0 4 nên đòi hởi lì thời gian hơn. Phương pháp này được sử dụng rất rộng rãi
trong ngành sản xuất đường mía, đường glucoza, sản xuất bánh kẹo và các sản
phẩm lên men. So với phương pháp Bectran kết quả giảm đi khoảng 1-2%

a. Ngnyâỉì tắc

Đường khử có khả năng khử làm mất màu m eiyl xanh. V ì vậy dùng vài giọt
m etyl xanh làm chất chỉ thị cho phản itag oxy hoá đường khử bằng Pehling. Cho
vài giọt m etyl xanh vào dung dịch Pehling và đun sôi rồi giỏ từng giọt đường khử
vào, đầu tiên đường khử sẽ khử đồng của Pehling, màu của m etyl xanh không đổi.
K h i tất cả đồng của Pehling đã bị khử hết, đường sẽ khử m etyl xanh làm nó mất
màu, đó là dấu hiệu kết thúc quá Irình định phân.

Yêu cầu tiến hành định phân nhanh và luôn giữ trạng thái dung dịch sôi ổn
định vì hợp chất dẽ bị oxy hoá và trở về trạng thái màu ban đầu.

b. Diuig cụ

- Nồi cách th iiỷ - Bình tam giác 150ml

- Nhiệl kế - Pipet

- Bình định mức 20, 100, 200, 500ml - Buret đầu cong

- Các cốc đimg - Bếp điện

c. Hoú chất

- Pehliiig I: 34,63g CUSO4.5 H 2O / 0,5 lít

- Pehling II: 173g muối xecnhet + 50g NaOH/ 0,5 lít

(Pehling I và Pehling II theo Sockle)

-D u n g dịch H C l( d = h l9 )

129
 - M etyl xanh 1- 2 %

d. Tiến hành và tính kết quả

Xác định đường trong các nguyên liệu dạng rời (các loại bột nghiền nhỏ)

Cân 50g nguyên liệu nghiền nhỏ, chuyển định lượng vào bình định mức
500ml bằng nhiều mẻ nước cất, rửa cẩn thận lượng cặn và xơ), rót cẩn thận vào
bình đến khoảng 3/4 thể tích, cắm nhiệt kế vào bình, đun nóng nồi cách thuỷ 2 giờ,
t" =80"c, lắc thường xuyên. Sau đó làm nguội, thêm nước cất đến vạch, giữ nhiệt độ
20"c, lắc đều, lọc qua giấy lọc khô.

Dùng pipet lấy lOml nước lọc cho vào bình định mức có thể tích thích hợp để
hàm lượng đường trong đó hoảng 1%. Để định lượng sơ bộ lượng đường trong mầu,
cần làm thí nghiệm: lấy lOml Pehling I và lOml Pehling II cho vào bình tam giác
thể tích 150ml, dùng pipet cho 5ml dung dịch đường đã chuẩn bị ở trên \ ’à 5 giọt
metyl xanh. Lắc đều, đun sôi trong 2 phút, nếu mất màu xanh chứng tỏ lượng
đường lấy dư, cần dùng bình định mức lớn hcfn để pha loãng dung dịch đường đã
chuẩn bị.

Dùng pipet lấy lOml nước lọc, thêm 3ml HCl (d = l,1 9 ), lắc đều, giữ trong nồi
cách thuỷ ở 68-70"C chính xác trong 5 phút, theo dõi nhiệt độ bằng nhiệt kế nhúng
trong bình. Làm lạnh bình đến 20“c trong vòng 2-3 phút, trung hoà bằng Na 2C 0 ,
đến màu xanh của giấy quì, làm lạnh, đưa đến vạch của bình định mức bằng nước
cất, lắc, lọc. Nước lọc đổ vào buret có đầu cong để định phân.

Đầu tiên thực hiện định phân sơ bộ; Dùng bình tam giác 150mi, cho lOml
Pehling I + lOml Pehling II, thêm ít giọt metyl xanh, đun sôi, sau đó nhỏ dần dung
dịch dường từ buret(vần giữ sôi dung dịch) cho đến khi mất màu xanh, thêm 4 giọt
metyl xanh và tiếp tục đun. Nhỏ dung dịch đường đến khi mất màu xanh, dung dịch
chuyển sang thành màu đỏ hoặc màu da cam. Tổng thời gian định phân không quá
3 phút.

Sau đó thực hiện quá trình định phân chính. Cho vào bình tam giác 150ml
lOml Pehling I +10ml Pehling II, dùng pipet cho vào bình gần hết sô' m l dung dịch
đường cần tiêu tốn đã biết ở thí nghiệm sơ bộ ở trên, chỉ bớt lại 0 ,5 -Im l. Đun sôi
hỗn hợp 2 phút, vừa đun sôi, cho thêm 3-5 giọt m etyl xanh để trong 2-3 giây vài

130
lần. Phản img kết thúc khi dung dịch đổi từ màu xanh sang màu đỏ hoạc vàng da
cam.

e. Tíỉìlì kếĩ quả

Hàm lượng đường trong nguyên liệu được xác định theo công thức:

a.n

trong đó:

0,0988: lượng đường khử dùng để khử 20ml dung dịch Pehling;

a = 50.10/500 = Ig nguyên liệu khi dùng Im l dịch lọc lấy để xác định đường;

n: lượng m l dung dịch mẫu (dịch lọc) chuấn hết.

Xác địiili hàm lượng đường khử trong kẹo

Cân 0,4g kẹo đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giác V150m l. Thêm lOml
Pehling ỉ và lOml Pehling II, 20ml nước, đun, lắc đều cho sôi trong 1 phút, cho
thêm 3-5 giọt m etyl xanh tiếp tục đun sôi rồi chuẩn độ bằng dung dịch đường khử
1 % đến mất màu.

Dung dịch đường khử 1% được chuẩn bị như sau: Cân l,9g đường saccaroza
tinh khiết (sai số 0 ,0 0 Ig ), cho vào bình dịnh mức 2 0 0 ml pha loãng với nước (khoảng
lOOml), thêm 7-8 giọt HCl d = l,9 , đặt nhiệt kế vào bình, đun trong nồi cách thuỷ
(t‘ -67-70"C) sôi trong 5 phút, làm nguội ngay đến nhiệt độ trong phòng, trung hoà
bàng NaOH loãng cho đến màu vàng da cam (thêm một vài giọt chất chỉ thị metyl da
cam). Thêm 35-50g N aQ để bảo quản, thêm nước đến vạch khấc độ, lắc đểu.

Làm Ihí nghiệm trắng: Dùng biiret cho 8-9ml dung dịch đường khử đã chuẩn
bị ở trên vào bình tam giác V150ml, thêm lOml Pehling I, lOml Pehling II, lOml
nirớc . Đun sôi 1 phút, cho sôi liên tục đồng thời cho 3-5 giọt m etyl xanh và tiếp tục
chuẩn dộ bằng dung dịch đường khử đến khi mất màu xanh, thêm vài giọt metyl
xanh nếu màu dung dịch không đổi là phản ứng kết thúc.

Tính kết quả

Lượng đường khử có trong lOOg kẹo (%) tính theo công thức;

131
 0.01(V -V |).I00
RS% =
m

trong đó:

m : khối lượng kẹo (g);

V : lượng ml đường khử tiêu tốn trong thí nghiệm trắng;

V,; lượng ml đường khử tiêu tốn trong thí nghiệm có kẹo ;

0 ,0 1 : lượng đường khử chứa trong Im l dung dịch đường khử.

Xiic địiìlì liàììi liíợng đường khử trong nước mía (phương pháp Iiliaiili)

Dùng pipet lấy chính xác 5ml dung dịch Pehling 1, 5ml dung dịch Pehling II
cho vào bình tam giác V250ml. Thêm 10 hoặc 20ml nước cất, lắc đều. Thêm
8 -lO m l dung dịch mầu (nước mía) đã được rót vào buret vào bình tam giác chứa

Pehling 1 và Pehling II (lượng nước mía này phải làm thử vì chúng rất khác nhau).
Để dung dịch sôi đều có thể thêm vào bình ít miếng vụn thuỷ tinh hoặc dầu khoáng.
Đặt bình lên bếp và đun nhanh đến sôi. Tiếp tục đun sôi trong 2 phút (chính xác).
Thêm 7-8 giọt metyl xanh, dung dịch phải có màu xanh, nếu không chứng tỏ lượng
đường trong mẫu quá lớn cần bớt lượng mẫu. Để buret có đầu cong cao hơn bình
2-3cm. Tiếp tục định phân giữ bình sôi mạnh và không nâng bình lên khỏi bếp cho
đến khi mất màu xanh hoàn toàn. Lắc đều mỗi khi cho nước mía vào (chú ý không
làm gián đoạn sự sỏi). Quá trình định phân sau khi cho m etyl xanh vào kéo dài 1
phút.

Dùng lượng dung dịch định phân lần này để làm số liệu sơ bộ cho lần sau.
Ghi tổng số lượng mẫu tiêu hao (trước và sau khi đun sôi).

Lần thí nghiệm sau cho gần hết lượng mầu tiêu tốn ở trên vào bình trước khi
đun sôi chỉ chừa lại l - 2 ml để định phân kết thúc trên bếp, đảm bảo thời gian định
phân nhanh.

Tíiih kết quả

Hàm lượng RS trong nước mía có thể tra bảng hoặc tính như sau:

Ví dir. Nước mía có nồng độ chất khô 13,8Bx, d= 1,056. Tổng số lượng mẫu
chuẩn hết 1 0 ,6 ml

132
 RS%= —----- — x i o o
1 0 0 x 1 0 ,6 x 1 .0 5 6

F - hệ số Pehling: là lượng dường khử có nồng độ 0,5% dùng dể chuẩn 5ml

Pehling ỉ và 5ml Pehliĩig II. F tiến hành song song với thí nghiệm nước mía. V í dụ
F=10ml

Bài 8. Xác định đường khử bằng phương ph á p ịpericyanua) (phương

pháp Graxinop)

a. N giívêiì tắc

Dựa vào phản ứng sau:

2K,Fe(CN)fi + 2 K 0 H ^ 2K4Fe(CN), + H ^o + o

Tiếp theo oxy sẽ oxy lioá đường để tạo thành axit đường

C H 20H (C H 0H )4C H 0 + O ^ CO O H(CHO H),CO O II

Phản lìng tổng quát là

6 K,Fe(CN)ft + 6 K 0 H + CH 2 0 H (C H 0 H ) 4CH 0 ÓK^PeíCN)^ +

C 0 0 H (CH 0 H ) 4C 0 0 H + 4H2O

b. Hoá chát

- Dung dịch íericyanua kali 1%

- KOH 2,5N

- M etyl xanh 0,5%

Dụng cụ: bình tam giác, bình định mức, biiret, pipet, cốc đim g, bếp, đồng hồ
bấm giây.

c. Tiểii hành

Dùng pipet lấy 20ml dung dịch íericyanua cho vào bình tam giác 250ml,
thêm 5ml dung dịch K O H và 3-4 giọt metyl xanh (nếu dung dịch đường có nồng độ
< 0,25 thì lấy lOm l fericyanua và 2,5ml KOH)

Lắc đểu, đặt trên bếp điện rồi đun sao cho sau 1-2 phút thì sôi.

133
 Chuẩn độ bằng dung dịch mẫu thí nghiệm đà pha loãng đến mất màu của
metyl xanh: màu của dung dịch sẽ thay đổi từ xanh sang tím hồng và cuối cùng đến
vàng da cam ihì kết thúc. Nếu để nguội màu dung dịch sẽ irở lại tím hồng.

Làm dung dịch chuẩn tiến hành như sau: cân 0,5g đường glucoza hoặc
frucloza tinh khiết, sau đó pha trong bình định mức lOOml (dung dịch có nồng độ
0,5%). Dùng dung dịch để chuẩn độ íericyanua như ở phần trên.

d. Tiìih kết quả

Hàm lượng đường khử trong dung dịch pha loãng

R S (g /1 0 0 m l)= — 100
m

trong đó:

a: số g đường glucoza có trong dung dịch đường glucoza 0,5% chuẩn độ hết
2 0 ml íericyanua;

m ; số m l dung dịch mẫu thí nghiệm chuẩn độ hết 2 0 m l íericyanua.

Ví dụ: khi phân tích để khử 20ml dung dịch íericyanua hết 4,5ml dung dịch
đường khử 0,5%. Như vậy lượng đường glucoza có trong đó là 4,5 X 5 = 22,5mg =
0,0225g ( Im l dung dịch 0,5% chứa 5mg). K h i định phân bằng dung dịch thí
nghiệm thấy tốn hết 5ml. Như vậy hàm lượng đường trong dung dịch thí nghiêm là:

0 0225
=0,45g/100m l

Nếu tính theo % ta chia kết qủa cho trọng lượng riêng của dung dịch (tra
bảng theo nồng độ chất khô)

Nhận xét

Phương pháp này được áp dụng để phân tích hàm lượng đường khử trong
.dung dịch đưcmg hoá và phân tích hàm lượng đường sót trong dung dịch lên men
thay cho phương pháp Lane-Eynon do sự nhận biết màu dễ hơn.

134
 Bài 9. Xác định tinh bột bằng phương pháp Merke (phương pháp enzim-
axit)

a. Ngu véII tắc

Thuỷ phân tinh bộl theo phương pháp merke gồm hai giai đoạn:

Giai đoạn đầu: đường hoá tinh bột đã hồ hoá bằng enzim amilaza để tránh sự
thiiỷ phân của hemicelIiiloza bàng axit làm tăng kết quả phân tích. Sau khi kết thúc
đường hoá (thử âm tính với iod), sản phẩm thiiỷ phân bằng enzim amilaza (mantoza
và dextrin) được đem lọc để tách các phần tử không tan, tạo điều kiện thuỷ phân
sâu xa đến glucoza sau này.

G iai đoạn 2; Thuỷ phân dịch lọc bằng cách đun với axit. Định lượng glucoza
bằng một trong những phưcíng pháp ở trên.

b. Dụng cụ và lioớ chất

- Nồi cách thiiỷ - NaOH 10%

- Ống sinh hàn khí - Dung dịch Pehling

- Bình định mức 200, 250, 500ml - Dung dịch phèn amoniac

- Các cốc đựiig bằng thuỷ tinh và cốc sứ - K M nƠ 4 4,98g/l

- Phễu lọc, giấy lọc - Dung dịch m etyl da cam 0,1%

- Dịch amilaza từ thóc mầm - Dung dịch iod 0,5%

-H C l d = l,1 2 5

c. Tiến hành

Cân 3g bột nghiền m ịn, chuyển định lượng vào bình đáy bằng V200ml. Đầu
tiên trộn bột bằng một lượng nước nhỏ để không vón cục, sau đó đưa thể tích lên
đến lOOml. Để hồ hoá tinh bột đặt bình vào bình cách thuỷ đã đun sôi trong 45
phút. Trong 3-5 phút đầu lắc đều bình. Sau 45 phút làm nguội đến 65"c, thêm
2-3ml dung dịch mầm chiết và đường hoá trong 2 giờ ở 65"c. Sau đó lại cho bình
vào nồi cách thuỷ đã đun sôi trong 30 phút, thêm 2-3m l dịch chiết mầm và lại
đường hoá trong 30 phút ở 65"c. Quá trình đường hoá kết thúc được đánh giá bằng
phản i'mg tạo màu giữa tinh bột và iod. Làm nguội một giọt thuỷ ngân cho vào cốc
sứ, nhỏ vào một giọt dung dịch iod, khuấy đều, nếu iod không đổi màu là quá trình

135
đường hoá đã kết thúc. Để tránh sai số, giọt thiiỷ phân đó sẽ được cho lại vào mẫu.
Sau đó diệt men đường hoá bằng cách đun sôi, làm nguội và chuyển vào bình định
mức 250ml. Tráng bình thuỷ tinh nhiều lần bằng nước cất và rót vào binh định mức.
Đira dung dịch đến khấc, trộn đều và lọc vào bình định mức 200ml.

Chuyển 200ml dịch lọc vào bình định mức 500ml, thêm 15ml HCl d=l,125,
đậy bình bằng ống sinh hàn khí, đun sôi trong bình cách thuỷ trong 2 giờ.

Trong thời gian sôi, mức nước trong bình cách thuỷ phải cao hơn mức dung
dịch trong bình thí nghiệm. V ì vậy phải thường xuyên bổ sung nước vào bình. Sau 2
giờ, làm nguội dung dịch, thèm 1-2 giọt metyl da cam và trung hoà bàng NaOH
10% đến trung tính hoặc axit yếu. Lượng kiềm (khoảng 42m l) thêm vào từ từ và
thận trọng để không phân huỷ glucoza. Không nên thêm kiềm vào dung dịch đang
nóng vì cũng có thể làm glucoza bị phân huỷ. Sau khi trung hoà thêm nước, đưa
dung tích đến khấc, khuấy đều, dùng pipet hút 2 0 m l để xác định glucoza theo
phưcmg pháp Bectran.

cỉ. Tính kết quả

Lượng glucoza có trong 20ml dung dịch được tra bảng Bectran.

Hệ số chuyển sang tinh bột được tính theo phưcíng trình thuỷ phân:

( Q H ,„ 0 ,) „ + nH ^O ^ n Q H i^ O ,

162,1 18,02 180,12

Như vậy một phần trọng lượng glucoza tương ứng với 162,1/180,12 = 0,9
phần trọng lượng tinh bột ^ hàm lượng tinh bột trong 2 0 m l mẫu bằng lượng
glucoza (a) X 0,9

Trong 20ml dung dịch chứa

i|5 ^ = 0 .0 9 6 g b ọ ,
250.500

Do đó hàm lượng tinh bột trong mẫu sẽ là

0 ,9 x a x l0 0
0,096

136
5.4. ĐịNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUXIT BẰNG p h ư ơ n g p h á p SẮC kỷ

Sắc ký và điện di là phương pháp vi lượiig được ứng dụng có hiệu quả để xác
định các monosaccarit và các oligosaccarit.

Nguyên lý cơ bản là tách một hỗn hợp chứa nhiều cấu tử nhờ các dung mõi
cho chảy qua các chất mang khác nhau, sau đó hiện hình bằng một loạt dung môi
khác.

Trước khi định lượng bằng sắc ký các monosaccarit và các oligosaccarit phải
được tách bầng cách kết tủa với etanol hoặc axetol nồng độ 80-90%. Một số muối
vô cơ có trong nguyên liệu có thể cản trở sự tách các g lu xit nên ta phải loại bỏ
chúng bằng cách cho dung dịch qua trao đổi cation hoặc anion.

Trong trường hợp xác định các oza có chứa các oligosaccarit tự do hoặc liên
kết thì mẫu phân tích phải được thiiỷ phân sơ bộ với các điều kiện hết sức nghiêm
ngặt.

5.4.1. SẮC KÝ TRÉN GIẤY

Sắc ký giấy thuộc loại sắc ký phân bố. Chất hấp phụ là giấy xenluloza. Chấm
dung dịch phân tích lên các điểm cách bìa tờ giấy sắc ký 1 khoảng. Sau khi cho bay
hơi (sấy bằng máy sấy tay, đặt giấy vào máng đimg dung dịch gọi là pha di động.
Các cấu tử trong hỗn hợp sẽ chuyển động theo những tốc độ khác nhau và được
tách riêng ra. K h i hiện hình và sấy sẽ xuất hiện thành các vết.

Đặc irimg cho vùng di động là hằng sớ R| là tỉ lệ khoảng cách giữa điểm
chấm và khoảng chảy của dung môi. Nếu cố dịnh các diều kiện thí nghiệm thì R
đặc trưng cho cấu tạo phân tử của các chất cần xác định. Có thể tiến hành sắc ký
xuôi chiều, ngược chiều hoặc sắc ký từ tâm ra. Cũng có thể chia sắc ký một chiều
và hai chiều. Cần lựa chọn phương án chạy dung môi thích hợp. Thông thường chạy
xuôi chiều.

Hệ thống dung m ôi dùng để tách gluxit:

N ,: Butanol-axit acetic-nước (4:1:5), dùng cho giấy sắc ký N,, chạy 2 lần
(2 ngày)

137
 N,: Pyridin-acetat etyl-nirớc (1:2:2, dùng cho giấy sắc ký N |, chạy 18 giờ đối
với m o n o s a c c a rit, hoặc giấy N , (ch ạy 2-6 Iigày tiiỳ th e o m ứ c đ ộ po lim e hoá c ủ a các
oligosaccarit)

N,: Pyridin-acetat etyl- axit axetic-nirớc (5:5:1:3, dùng cho giấy sắc ký N|
hoặc N,. Các dung môi này tách tốt các monosaccarit và oligosaccarit.

Các hoá chất không đặc hiệu

N,: hoá chất nitrat bạc: sử dụng hai dung dịch liên tiếp:

- Dung dịch A: Im l dung dịch bão hoà nitrat bạc/200ml axetol. Hoà tan kết
tủa bằng cách nhỏ từng giọt nước cất

- Dung dịch B: nhỏ 5m l NaOH (40g/100ml) trong 2 0 0 m l etanol 95". Sắc ký

được nhúng vào dung dịch A, giữ trong bóng tối 10-15 phút ở nhiệt độ phòng thí
nghiệm. Sau đó cho qua dung dịch B. Sự chuyển dịch các g lu xit được khảo sát bằng
cách vết đen bằng cách nhúng các sắc ký vào dung dịch amoniac 2N.

N 2: hoá chất oxalat anilin-axit oxalic theo tỉ lệ 2 thể tích dung địch anilin
2m l/100 etanol và 3 thể tích axit oxalic 2,5g/100ml. Sau khi để trong tủ sấy ở nhiệt
độ 105"c trong 10-15phút, các aIdohexoza cho màu hơi xanh lá cây. Các xetoza
cho màu rất nhạt hoặc không màu. Các oligosaccarit tác dụng chậm do đó phải đun
nóng. Quan sát các vết dirới ánh đèn (W OOD)

N ,: hỗn hợp difenilam in anilin-axit octophosphoric (DAP) theo tỉ lệ 5 thể

tích dung dịch difenilam in 4% trong etanol 96" + 5 thể tích anilin nguyên chất
3% + 1 thể tích axit ocotophosphoric nguyên chất. Lắc đểu đến mất màu. Sây sắc
ký ờ 80-100"C trong 3-5phiít. DAP là chất hiện hình lổng hợp có khả năng tạo màu
với cả andoza và hexoza. Các vết của đirờng có liên kết glocozit 1-4 cho màu xanh
đến xanh đậm. Nếu không có liên kết thì cho màu xanh nhạt hoặc vàng đậm phụ
thuộc vào nồng độ các gluxit.

Thực tế chúng tôi thấy để tách hỗn hợp các g lu x it sử dụng dung môi N|Và
hổn hợp hiện hình N , cho kết quả tốt.

Các hoá chất đặc biệt cho các xetoza

138
 - Ureclohidric: dung dịch này cho màu xanh da trời hoặc xanh lá cây với các
xetoza tự do và các xetoza liên kết. Có thể dùng các axit khác nhưng HCl nhạy hcm
cả.

- 96ml etanol 80" và 4m l HCl đậm đặc

- Orcinol: hoà tan 0,5g orcinol và 15g axit tricloroaxetic trong lOOml bão hoà
/ỉ-biitanol. Sau kh i phun chất hiện hình, giữ các giấy sắc ký (sắc ký đồ) ở 105"c
trong 15-20 phút. Các xetohexoza cho màu vàng; xetopentoza cho màu hơi tím,
xetopeptoza cho màu xanh da trời hoặc xanh lá mạ. Còn các axit sialic cho màu nâu
vàng.

Tiên hành thí nghiệm

Việc định lượng g lu xit có thể tiến hành ngay sau khi chạy xong dung m ôi
bằng phương pháp so màu hoặc tiến hành đo mật độ quang của các vết sau khi đã
hiện hình

Xcíc định gliixit trên sắc ký đỗ d ã hiện hình theo hai phương pháp

Phương pháp mật độ quang: độ đậm đặc của các vết được đo bằng quang sắc
kế tự ghi. Sau đó sử dụng đường chuẩn hoặc các mẫu đối chứng của các loại g luxit
tinh khiết cho biết nồng độ trước

Phương pháp có tách vết: hoà tan các vết bằng dung m ôi, sau đó xác định khả
năng hấp thụ của các dung dịch có màu. Phương pháp này phù hợp với lượng lớn
nhất cho m ỗi g lu x it là 50g và sử dụng dung môi chuẩn biết trước lượng g luxit tương
ứng. Sau khi chạy dung m ôi, sấy sắc ký đồ (giấy sắc ký) trong không khí và hiện
hình bằng cách nhúng đều trong hoá chất xitrat anilin 1 , 1 M trong cồn tuyệt đối và
dung dịch axit citric IM . Sau đó giữ các sắc ký đồ trong 10-15 phút ở 100-105"c
trong tù sấy. Cắt những miếng giấy vuông bao quanh vết, trích li trong 3 giờ bằng
dung môi etanol 20% axit H C l 0,5N. xác định khả nãng hấp thụ màu dung dịch ở
400nm.

Xác định gliixit trên sắc ký đồ không liiệii hình

Đánh dấu sự địch chuyển các gluxit trên sắc ký đồ, sau đó tách các đường ra
và định lượng chúng bằng phưcmg pháp sắc ký (cho tất cả các vết)

139
 Sau đây xin giới thiệu một thao tác cụ thể tiếii hành xác định hỗn hợp đường
trên sắc ký giấy

Định tính

Cắt giấy sắc ký thành từng dải kích thước 17x52cm, đường chấm (A ) cách
biên 7cm, gập giấy sắc ký cách biên 2,5cm. Các điểm chấm cách nhau 2,5cm (xem
hình 5.4.1)

Í ! ' 5 cm

52 cm

7 cm

2,5 cm

17 cm

Hình 5.4.1. Giấy sắc ký

Dùng micropipet chấm những chấm dung dịch lên giấy (vừa chấm vừa sấy
khô m ới tiếp tục giọt khác). Vết chấm càng nhỏ càng tốt. Trên đường chấm, ký hiệu
rõ mẫu chuẩn (gồm các gluxit tinh khiết) và các mẫu dung dịch thí nghiệm. Chấm
xong cho vào máng sắc ký đặt trong hộp sắc ký giấy, m ỗi máng gập 2 lờ hoặc nhiều
lờ nếu có thanh đỡ. Rót dung dịch vào m ỗi máng (xem phần dung m ôi). Đậy máng
và cho chạy. Theo dõi để đường chạy dung m ôi thảng. K h i dung môi đã chạy qua
giấy, lấy ra phơi ở nhiệt độ trong phòng thí nghiêm đến khô, cho chạy lần 2 như
trên.

Sau khi chạy xong lần 2, sấy khô ở nhiệt độ trong phòng rồi hiện hình bằng
hoá chất, hiện hình bằng cách đổ ra khay, tráng giấy sắc ký qua hoặc phun vào giấy
sắc ký. Phơi ráo nước rồi cho vào tủ sấy 3-5 phút ở 80-120"C. K h i các vết đã hiện
rõ, lấy ra khoanh bút chì vào để đánh dấu. Thường chấm dung dịch chuẩn 2 bên sắc
ký đồ để so sánh được chính xác.

140
 5.4.2. SẮC KÝ LỚP MỎNG

Hexoza được tách tốt khi dùng silicagen 60 và hệ thống dung môi:
isopropanol/axetat etyl/nước (4:3:1 hoặc 5:4:!). Hiện hình bằng các hoá chất giốiig
sắc ký giấy. Cũng có thể sử dụng dung dịch axit siiníuric 5%, sấy 100-105"c trong
2 0 phút sấy 150"c trong 1 0 phút.

5.4.3. SẮC KÝ CỘT

Có nhiều phương pháp định lượng g liix ii bằng sắc ký cột dựa trên cơ sở khác
nhau về cách dùng các chất mang khác nhau như: sắc ký hấp phụ trên cacbon, sắc
ký tách sơ bộ trên xenliiloza, sắc ký lọc gen trên sepliadex hoạc trên các gen khác
nhau (sắc ký trên cột trao đổi io n ...). Ngày nay, phần lớn các phương pháp tách và
định lượng g liix it bằng phương pháp sắc ký cột đã được đơn giản hoá nhờ quá trình
tự động hoá các bước thao tác, nên được sử dụng khá rộng rãi nhất là sắc ký lỏng áp
suất cao. Mặt khác, phương pháp này không đòi hỏi xử lý sơ bộ các gluxit.

Các monosaccarit thường được tách bằng hai phương pháp:

Sắc ký cột trao đổi ion: Thường được dùng cột dowex 1x8 (dạng bisiinfit)
cùng với etanol loãng. Chất lượng của quá trình tách gluxit phụ thuộc vào nồng độ
etanol, kích thước hạt chất trao đổi ion (rezin), tốc độ chảy của dung dịch và nhiệt
độ. Các chất trao đổi ion dang xốp (nhiéu lỗ hổng). V í dụ amberlyst, XN-1001,
dowex 2xk, dowex 1x8 có khả năng tách ghixit tốt hơn. M ặt khác phương pháp này
còn tách tốt các polyol, các loại đường đã metyl hoá 1 phần và các gluxit không
chứa các ion.

Sác ký trao đổi ion dưới dạng borai hoá: nguyên tắc là monosaccarit tác dụng
với borat cho 1 phức axit có thể tách dược bằng cột rezin kiềm mạnh. Sự tạo phức
được thực hiện bằng dung dịch borat loãng. Khả năng gắn của phức borat trên rezin
phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, số gốc hyđroxyl và sự liên kết không gian của
phân tử. Phưcmg pháp này rất nhạy với hàm lượng monosaccarit trong khoảng từ
0,7-4 g. Hiện nay hệ thống phân tích tự động đường "Jeol" cùng với 1 cột rezin
amoniom dưới dạng borat hoá được ứng dụng rộng rãi để phân tích các loại đường:

141
hỗn hợp, saccaroza, xenlobioza, matoza, lactozíi, glucoza và fructoza. Sau khi tách
bằng sắc ký cột, các monosaccarit được xác định bằng phương pháp sắc kế.

Các oligosaccarit thường được tách bằng sắc ký cột cacbon-selit nhờ gradien
nồng độ của etanol nhờ lọc gen. Hệ thống này gồm nhiều cột sephadex hoác bio-
gel. Có thể tách được các oligom của fructoza, glucoza, xyloza. Ngoài ra các
oligosaccarit cũng có thể tách được bằng các cột trao đổi ion như Dowex. DEAE-
xenliiloza, DEAE-sephadex. Nói chung nếu chỉ sử dụng riêng biệt một phương
pháp thì khó tách, vì vậy dùng phối hợp.

5.4.4. SẮC KÝ CHẤT LỎNG ÁP Lực CAO (HPLC)

Ngày nay HPLC được sử dụng tương đối rộng rãi như là phương pháp chính
để phân tích g luxit vì chúng là hợp chất khó bay hơi, ngoài ra chúng là các hợp chất
có độ phân cực cao, phương pháp này nhanh và nhạy.

HPLC dưới pha liên kết: các cột dưới dạng ankyl-am in và hệ dung môi
axetonintrit (MeCN)/nước có thể tách tốt các mono và oligosaccarit. V í dụ với hệ
thống MeCN/nước (72:25) sau 12 phút có thể tách fructoza, glucoza, saccaroza
metibioza, rafinoza, mantoza, mantobioza, mantotetraoza. Phương pháp này thường
dùng để tách đường có nguồn gốc lương thực, thực phẩm. Tách g lu x it ở pH<9 pha
động MeCN/nước, cô' định pH đến 6,4 bằng dung dịch đệm photphat.

Ngoài ra còn tách đường bằng HPLC trên cột trao đổi ion hoặc trên gel silic.

5.4.5. SẮC KÝ KHÍ

Hiện nay sắc ký khí được ứng dụng rộng rãi để định tính và dịnh lượiig các
mono và oligosaccart. s ắ c ký khí có ưu điểm là nhanh và nhạy. Trước khi chạy sắc
khí phải chuyển sơ bộ các g liix it sang dạng chất bay hơi.

Trước hết là cất mạch glucozit bằng cách thuỷ phân hoặc metanol hoá. Sau
đó biến tính hoá học các monosaccarit để tạo hợp chất bay hơi như m elyl hoá, axyl
hoá, trim etinsilyl hoá hoặc dưới dạng butyloboronat. Trong tất cả các trường hợp
trên, m ỗi monosaccarit đều cho nhiều pic; anome a và p, isome pyramic hoặc
íuranic. s ắ c ký đồ sẽ hết sức phức tạp nếu ta phân tích một mẫu có nhiều
monosaccrit khác nhau. Mặt khác nó đòi hỏi nhiều cột sắc ký cao để hạn chế áp lực

142
 các pic đè lên nhau. V ì vậy phần lớn các tác giả khử các monosaccrit thành polyol
hoặc chuyển chúng thành oxim trước khi chuyển sang hổn hợp bay hơi. Trong
trường hợp này các monosaccrit được giải phóng bàng phương pháp thuỷ phân
(xem tài liệu chuyên ngành).

5.5. XÁC ĐỊNH GLUXIT BẲNG p h ư ơ n g p h á p ENZIM

5.5.1. ĐỊNH LƯỢNG CÁC OZA

Các phản ứng enzim được sử dụng trong phân tích cho một dải các phản ứng
đặc hiệu trong dung dịch mà không cần phải tách các chất cần xác định ra khỏi môi
trường chứa chúng. Tuy nhiên dung dịch trước khi định lượng cần làm sạch các vết
cồn, các kim loại nặng, các protein (loại bằng axit percloric) sau đó làm sạch bằng
than hoạt tính.

Nguyên tắc

Glucoza được định lượng bàng ba nguyên lý enzim khác nhau;

aD glucoza
G6PDH
chuyển h ì G6P) ' GP gluconat
gluco-deshydrogenaza
Gluconoladon ------- p D glucoza NAD (P)H2
ADP n AD (P)
glucooxydaza

NAD (P) H

2Hp

CH
Axit D gluconic

Hình 5.5.1a. Sơ đổ nguyên tắc định lượng glucoza bằng phương pháp enzim

O xy hoá a -D glucoza thành axit gluconic bàng enzim glucooxyzidaza (EC

1.1.3.4) peroxydaza (EC 1.1.1.17) với sự tham gia của một chất khử mang màu
trung gian như axit ascorbic, am inoaxit... oxy hoá thành glucono-5-Iacloza bằng

143
enzim gliicodeshydrogenaza (EC 1.1.1.49). Đây là phương pháp động học đo lượng
N A D H tạo thành. Phospho hoá a và |3-D glucoza thành glucoza- 6 -phosphat (GÓP)
bằng hexokinaza (EC 2.7.1.1) sau đó oxy hóa GÓP thành 6 -phosphoglucono-ơ-
lacton bằng 1 enzim gliicoza- 6 -phosphat dehydrogenaza (EC 1.1.1.49). Fructoza
được xác định hoặc bằng E.hexokinaza cho izomeraza (EC 5.3.1.9) hoặc trực tiếp
bằng gluco- 6 -phosphat dehydrogenaza (EC 1.1.1.48). Galactoza được định lượng
bằng galacto dehydrogenaza ng E.hexokinaza cho izomeraza (EC 5.3.1.9) hoặc trực
tiếp bằng gliico- 6 -pliosphat dehydrogenaza (EC 1.1.1.48) hoặc galactooxydaza (EC
1.1.39). Các oligosaccarit được thuỷ phân thành một monosaccarit rồi định lượng
monosaccarit đó. Lactoza được thiiỷ phân thành glucoza và galactoza bằng
P-galactozidaza (EC 3.2.1.23) sau đó định lượng glucoza rafinoza được thuỷ phân
thành galactoza và saccaroza bằng a-galactosidaza (EC 3.2.1.22). Saccaroza thành
glucoza và fructoza bằng [3-fruloziciaza (EC 3.2.1.6), mantoza thành hai glucoza
bằng mantoza (EC 3.2.1.20).

Bài 10. xác định gliicoia bằng phương ph á p B oehringer M annheim

a. Nguyên tắc

Glucoza được phospho hoá thành glucoza- 6 -phosphat (GÓP) với sự tham gia
của enzim hexokinaza (H K ) và adenosin-5-triphosphat (ATP)

HK
Glucoza + ATP -> G - 6 -P + ADP
ADP-adenosin-5-diphosphat

Sau đó với sự có mặt của enzim glucoza-6 -pho.sphat dehydrogennaza (G 6 P-

DH) glucoza-6 -phosphat bị oxi hoá bởi nicotinam id adenin-dinucleotit-phosphat
(NADP) thành gluconat- 6 -phosphat và tạo thành nicolinam id adenin dinucleotit
phosphat (N AD PH )

G - 6 -P-DH
G - 6 -P + N AD P -> gluconat- 6 -phosphat + NADPH +

Hàm lượng N AD PH tạo thành trong phản ứng ti lệ thuận với hàm lượng
glucoza. Đo mật độ quang ở 334nm, 340nm hoặc 365nm.

144
 b. Hoá chất

- 3 bình (1) gồm khoảng 7,2g hỗn hợp ở dạng đông khô bao gồm; dung dịch
đệm trietanolam in pH 7,6; llO m g NADP; 260m g+ A T P , suníat m agie; chất ổn
định;

- 3 bình (2 ) gôm l , l m l dịch enzim dạng huyền phù g ồ m hexotánaza « 7 2 0

glucoza-6-p hosphat dehydrogenaza 160đv;

- dung dịch glucoza.

c. Tiến hành

Hoà tan lượng chất trong bình (1) với 45ml nước cất 2 lần, còn bình (2) sử
dụng trực tiếp k h ôn g cần pha loãng. Có thể bảo quản bình sô' 1 trong 4 tuần ở +4‘’c
và 2 tháng ở 2‘'c. D un g dịch trong bình (2) bền trong 1 năm nếu bảo qtiản ở +4"c.
Đ o mật độ quang ở 34 0 n m , 365nm hoặc 334nm , cuvet Icm , nhiệt đ ộ 2 0 -2 5 " c . Thể
tích m ẫu 3 ,0 2 m l, dung dịch thí nghiệm chứa 3-lOOịu.g g lu c o z a /l cuvet (trong 0,1-
2 ml m ẫu thí ngh iêm ).

Thứ tự tiến hành như sau:

Pha mẫu trong cuvet

Kiểm Mầu thí

chứng nghiệm
Dung dịch 1 1,0ml 1.0ml
Mẫu 0,1 ml
Nước cất 2 lần 2,0ml 1,9ml
Trộn đều khoảng 3 phút, sau đ ó đo mật độ quang các dung dịch (được í ^ đ o A i)

Thực hiện phản ứng bằng cách thêm

Kiểm chứng Thí nghỉệtn

Dung dịch 2 0,02ml 0,02ml

T fộn đ ều , c h ò phản ứng kết thúc (khoảng 10-15 phút) đ ọ c mật độ quang
(A 2). N ếu sau 15 phút phản ứng chưa kết thúc, cứ 5 phút sau tiếp tục đo mật độ
quang 1 lần đến khi kết quả giữa 2 lần đo không đổi.

145
 cl. Tinh kết qitả

(A 2- A 1) của mầu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm. Suy ra sự khác nhau giữa
mật độ quang của mẫu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm. Ta được A A (glucoza).

Nồng độ gliicoza được tính như sau:

v.p,M
AA (g//)
E.d.v. 1 0 0 0

trong đó:

V : thể tích mẫu (m l);

V : thể tích mẫu thử (m l);

Pm : trọng lượng phân tử cùa chất thí nghiệm;

d ; chiều dày ciivet;

e : hệ số hấp phụ NADPHỞ 340nm:6,3 (/ m m or'.cm ' );

ở 365nm:3,5 (/ m m or'cm ');

ở 334nm:6,18 (/ mmol 'cm ').

Đối với glucoza

3,02.180,18 ^

= 5 ,4 4 1 ^
e
Nếu pha loãng dung dịch khi chuẩn bị mẫu thì kết quả được nhân với hệ số
pha loãng nhir bảng 3.3.1.

Bảng 5.5.1. Hệ số pha loãng dung dịch glucoia

Lượng glucoza (g//) đo ở Pha vói Hệ sô'

340 hoặc 334nm 365nm nưốc cất pha loãng

<0,5 <1 1

0,5-5,0 1,0-10 1+9 10

5.0-50 10-100 1+99 100

>50 >100 1+999 1000

146
 Bài I I . Xác định gliicoKi bằng phương p h á p /ericyanua và eniiììi
gliicooxydaia

a. Hoá clỉẩỉ

- Dung dịch (1) K 4Fe(CN)f, 0,6%.

- Dung dịch (2) lOmg glucooxydaza và 6 8 ml dung dịch đệm axelat-natri

pH=5,0 đưa đến khấc bình định mức lOOml bằng dung dịch ferocyanua-kali 0,6%.

b. 'Xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị các dung dịch glucoza có nồng độ khác nhau từ 50 - 750|j.g trong
Im l nước cất. Dùng pipet lấy 0,2ml từ mổi dung dịch, thêm 3ml dung dịch (2), giữ
ờ nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 65 phút. Tiến hành với mẫu kiểm chứng (0,2ml
nước và 3ml dung dịch (2). Đo mật độ quang D với chiều dài bước sóng ^=400nm
(so sánh với nước cất)

Hình 5.5.76. Đường chuẩn xác định glucoza bằng phương pháp gỉucooxydaza

Tiến liàỉìli thí ngììiệm và đo kếĩ quả

Chuẩn bị dung dịch mẫu thí nghiêm để hàm lượng glucoza nằm irong khoảng
50-750mg/ml. Lấy 0,2ml mẫu tiến hành giống như khi xây dựng đường chuẩn. Đo
mật độ quang D. Dùng giá trị của D để tra ra hàm lượng của glucoza có trong dung
dịch theo đường chuẩn. Từ lượng glucoza đó lính ra hàm lượng glucoza trong mẫu
thí nghiệm m g/m l hoặc % khối lượng.

147
 Bài 12. Xác định tinh bột bằng phương pháp am iloglucosidaia

a. Nguyên tắc

Tinh bột là hợp chất của các D glucoza được nối với nhau bằng liên kết
glucozit a-1,4 (w95%) và a-1,6 i~5%). Trước khi xác định tinh bột cần tách hết
glucoza vàịcác oligosaccarit bằng cồn 80“. ở trạng thái s ô i (5 -1 0 thể^lícíl cồn) sau
đó định lưc|Bg glucoza bằng phương pháp enzim.

Hoà ịtan tinh bột (dịch hoá) bằng nhiệt hoặc hoà tan bằng dim etyỊ-sulíoric
(DMSO) híiặc hoà tan trong kiểm (NaOH, KOH), trong m uối (CaCl2 , N a sO b ,..
ỉ
Thu}^ phân tinh bột bằng các enzim n h ư :

+ a-ặaBilaza và p-amilaza (EC 3.2.1.2) của thóc mầm và đại mạch.

+ AÈOÌIoglucosidaza (EC3.2.1.3) thu nhận từ Aspergillus (oryzad, niger),

Rhizopus vặ Endomyces. Rhizopus Deleman dùng thuỷ phân có ưu điểm llơn cả so
với các loại khác vì không chứa enzim transglucosidaza.

Lượitg enzim phải được tính toán để thuỷ phân hoàn toàn lượng ịtinh bột
trong thời ^ian xảy ra phản ứng. í

Trong bài thí nghiệm, tinh bột được thuỷ phân thành glucoza bfelỊg enzim
amiloglucoịaidaza, sau đó glucoza được định lượng bằng glucooxydaza (COD) và
peroxydaza(POD). Sơ đồ thí nghiêm (sử dụng cho các sản phẩm chứa tinh bột):
í ■ '

Ngâm bằng etanol 80% (rửa)

Phân giải
(hổ hoá + đun1hỏ135°C)

Thuỷ phân bằng enzim

(pH 4,8; 5 5 OC, 50% E/cơ chất)

Lọc
Định lượng glucoza (GOD, POD)

Hình 5.5.1 c. Sơ đồ thủy phân tinh bột bằng enzim

148
 Chương 6
LIPIT

6.1. GIÓI THIỆU • i

L ip it hay còn gọi là chất béo là một trong nhưng thành phần thức ận chủ yếu
của con người. Chất béo, protein và gluxit là ba chất cơ bản không thể ihiếu được
trong quá trình cấu thành tế bào và đảm bảo các hoạt động sinh lý trong bơ thể con
người.

Chất béo dù ở dạng nhìn thấy được như mỡ động vật, dầu thậc vật, bơ,
m acgarin... hoặc ở dạng không nhìn thấy được là thành phần trong miôt sô' thực
phẩm như thịt, trứng, sữa, phomat.. .đều có vai trò rất quan trọng. T rtlỗ t tiên phải
nói đến giá trị dinh dưỡng cao vì nó là thức ăn giàu năng lượng, năng lỊrợng cung
cấp bởi tliộ l đơn vị khối lượng chất béo lớn gần gấp 2 lần một đơn vị khối lượng
tương điỊỡBg cùa g lu x it và protein.

Ig dầu m ỡ cung cấp 9,1 kcal ■

1g glu xit cung Cấp 4 ,0 kcal

1g protein cung cấp 4,0 kcal

Chái béo dùng làm thực phẩm có thể là mỡ động vật hoặc dầu thục vật. Đứng
về phươãg diện sinh lý và mức độ tiêu hoá thì dùng dầu thực vật có nh|ều ưu việt
hơn mỡ áộng vật. Thành phần axit béo trong dẩu thực vật chủ yếu là nhlliig axit béo
không no như axĩt oleic (C 1 8 :l); axit linoleic (C18:2) và axit linolenic (C18:3),
trong đó axit linoleic và axit linolenic là những axit béo không thay thế rất cần thiết
cho cơ thể con người. Từ axit linoleic cơ thể con người có thể chuyển hoá thành axit

149
a-linolenic và axit arachidonic (C20:4) là axit có chức năng của vitam in F. Nếu
trong thức ăn hàng ngày mà thiếu chất béo lâu dài sẽ dẫn đến những rối loạii về
hoạt động sinh lý cũng như sự mất càn bằng vậi chất gây nên suy nhược cơ thể và
íìhiều hiện tượng bệnh lý.

Nói chung nhữiig axit béo không no có hoạt động sinh học cao, ví dụ như
axit linoleic và axit linolenic có vai trò chuyển hoá cholesterol trong cơ cho nên ăn
nhiều dầu thực vật có thể kéo dài được tuổi thọ và phòng chữa được một số bệnh về
tim mạch.

Ngoài ra chất béo còn có giá trị cảm quan, góp phần làm tăng giá trị về cấu
trúc cũng như m ùi vị cùa các sản phẩm thực phẩm.

6.1.1. THÀNH PHẦN VÀ TÍNH CHẤT CỦA DẦU MỠ

Nếu chỉ dựa trên những nét hoá học đại cương thì chất béo động vật và chất
béo thực vật không có sự khác nhau lớn. Chúng đều cấu tạo chủ yếu là từ trig lyxe rit
(90-95%). Về cấu tạo hoá học của chúng là este của rượu ba chức glyxerin và các
axit béo có công thức:
C H 2C O O R ,

CHCOOR2

C H 2C O O R 3

Do các axit béo tham gia tạo thành glyxerit trong dầu m ỡ khác nhau về loại,
vể số lirợng nên giá trị sinh lý, giá trị thực phẩm của dầu mỡ khác nhau. V í dụ ở
động vật thì axit béo tham gia tạo thành glyxerit chủ yếu là các axit béo no như axit
panmitic, axit stearic..... Còn trong dầu mỡ thực vật thì chủ yếu là axit béo không
no như axit oleic, axit linoleic.

Thành phần hoá học các axit béo của trig lyxe rit của mỡ động vật hoặc dầu
thực vật thay đổi tùy theo giống, địa điểm trồng trọt hoặc chăn nuôi, tuổi hoặc mùa
thu hoạch. M ỗi loại chất béo khác nhau được đặc trưng bởi thành phần các axit béo
khác nhau.

150
 Thành phần các axit béo của trilyxe ril thực vật, trừ trường hợp đặc biệt đều là
axit béo một chức, mạch thẳng và có số nguyên tử cacbon chẩn, thường hay gặp là
các axit béo có 18 nguyên tử cacbon.

Tính chất vật lý và hoá học của axit béo do số nối đôi và số nguyên tử cacbon
tạo ra. Các axit béo no bền đối với các tác dụng khác nhau. Các axit béo không no
dễ bị oxy hoá bởi oxy không khí làm cho dầu bị hắc đắng (ôi) bị polime hoá tạo
thành màng, bị khử ở vị trí nối đôi (bị hydrogen hoá) chuyển thành axit béo no.
Khả năng phản ứng của các axit béo không no tăng cìing với sự tăng nối đôi và nếu
vị trí các nối đôi trong phân tử axit béo không phải là cách 3 nguyên tử c như thông
thường mà cách 2 (nối đôi liên hợp liền) thì phản ímg oxy hoá và polime hoá sẽ xảy
ra nhanh hơn.

Tính chất của dầu và mỡ do thành phần các axit béo và vị trí của chúng trong
phàn tử trig ly xe rit quyết định.

T rig ly xe rit dạng hoá học tinh khiết không có màu, không mùi, không vị.
Màu sắc, mùi vị khác nhau của dầu là do sự có mặt cùa các chất kèm theo.
T rig lyxe rit do khối lượng phân lử tương đối cao, nên không bay hơi ngay cả trong
điều kiện chân không cao. ở nhiệt độ trên 240"C-250"C trig lyxe rit sẽ bị phân hiiỷ
thành các sản phẩm bay hơi. Dưới tác dụng của enzim lipaza, khi có nước và nhiệt,
trig lyxe rit sẽ bị th iiỷ phân thành các axit béo tự do, do đó trong dầu mỡ bao giờ
cũng có mật một sổ các axit béo tự do. Thành phần glyxerit của dầu và mỡ rất phức
tạp. Sô' loại g lyxe rit trong thành phần dầu, mỡ có từ hàng chục đến hàng trăm.

Trong dầu thô (dầu chưa tinh chê') còn có chất photpholipit, là một loại lipit
phức tạp trong thành phần cấu tạo có photpho và nitơ.

Về cấu tạo hoá học, photpholipit là dẫn xuất của glyxerit là dẫn xuất của
triglyxerit. Đó là những trig lyxe rit mà một trong ba gốc axit béo dược thay thế bằng
một gốc axit photphoric với nhóm thế.

C HpCO Ri
CHOCOR Trong đó X là nhóm thế (X có thể là hydro, rượu
ỵO H amin cholin, etanolamin, xerin, ion zit...)
c —o - P ^ O
^2 ox

15
 Các photpholipit hoà tan tốt trong dầu và trong đa sô' các dung môi hữu cơ.
Chúng có khả năng phản ứng hoá học dể hơn trig lyxe rit và rất dễ bị oxi hoá. Người
ta có thể tách photpholipit ra khỏi dầu bằng cách thuỷ hoá dầu. Sau khi thuỷ hoá,
photpholipit kết hợp với nước, mất khả năng hoà tan trong dầu và kết tủa cặn. Trong
dầu thực vât còn có sáp^ là một loại lip it đơn giản, về cấu tạo hoá học, sáp là este
của các axỊt béo mạch cacbon dài (có 24-26 nguyên tử cacbon) với rượu một hoặc
hai chức. Ị

C ô n Ị thức hoá học: R 1CH 2OCOR 2

trong đó: !

R| - gốc rượu;

R 2 - |ố c axit béo.
(

Sáp feũng như các este khác, dễ bị thủy phân nhưng so vớ i g lyxerit thì phản
ứng xẩy ra iehậm và ở điều kiện mạnh hơn.
I

T r o i^ đầu mỡ còn có^một luợng nhỏ các hợp chất không béo, không xà
phòng hoá j đó là nhóm các hợp chất hữu cơ có cấu tạo hoá học đặc trưng khác nhau
và nó chínắ là những chất gây ra cho dầu có màu sắc và m ùi vị riêng biệt. Những
chất gầy m |u trong dầu thường là sắc tô' hoà tan trong chất béo và những lip it mang
màu, chẳnậ hạn trong dầu thường gập là nhóm carotenoit có màu vàng tươi đến đỏ
sẫm, trong |đó quan trọng nhất là caroten có 3 dạng đồng phân a , p, y, chúng
!
mang tính! chất provitamin A. Trong số các sắc tố hoà tan trong dầu còn có
clorophin 1 ^ 1 cho dầu có màu phớt xanh.
i

Nhữág chất gây m ùi và vị của dầu là các tecpen, các hydrcx:acbiia mạch
thẳng khác nhau và các sản phẩm phân huỷ chúng.

Các ^lợp chất không béo, không xà phòng hoá trong dầu m ỡ còn ỉà những
rượu đa vòỊig như các sterol, tcx:oferol mang tính chất của vitam in E, có hoạt tính
chống oxy ^oá mạnh, những dẫn xuất của naphtoquinol có tính chất của vitamin K.

152
 6.1.2. CÒNG NGHỆ SẢN XUẤT DẦU THựC VẬT

Hiện nay trong công nghiệp sản xuất dầu áp dụng rộng rãi hai phương pháp
ép bằng những máy ép có cơ cấu khác nhau và phương pháp trích ly bằng các dung
môi hữu cơ.

Trong công nghiệp sản xuất dầu thực vật, ứng với các nguyên liệu khác nhau,
có nhiều sơ đồ công nghệ chế biến khác nhau và ứng với m ỗi sơ đổ công nghệ có
chế độ kỹ thuật nhất định. Nhưiig nói chung với đa số các nguyên liệu hạt dầu khi
chế biến thành dầu đều qua các công đoạn kỹ thuật sau:

Làm sạch: làm sạch hạt trước khi đưa vào bảo quản và chế biến có ý nghĩa
quan trọng làm giảm độ ẩm cho khối hạt, giảm nhiệt độ cho khối hạt, giảm và tiêu
diệt vi sinh vật, làm tăng thể tích hữu ích của kho và năng suất hữu ích của thiết bị,
năng cao chất lượng của dầu sản phẩm và khô đầu.

Sâỳ hạt: nhằm hạn chế hoặc giảm cường độ phá huỷ hạt do các enzim và vi
sinh vật gây nên và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình bóc tách vỏ và nghiền
nhân hạt n tó m nâng cao được hiệu suất tách dầu.

Bảo quản: nhằm bào tồn các giá trị dinh dưỡng của hạt khỏi bị hư hỏng, làm
tãng cường các đặc tính của hạt thuận lợ i cho quá trình chê' biến sau nhằm mục đích
đạt hiệu suất tách dầu cao nhất và chất lượng sản phẩm thu được tốt nhất.

Bóc tách vỏ: tạo điều kiện cho việc nghiền nhân được dễ dàng đạt đến độ nhỏ
mong mu|ỉn, làm giảm tổn thất dầu trong quá trình sản xuất, nâng cao năng suất
thiết bị và nhất là để nâng cao chất lượng của dầu và khô dầu. Đ ối với m ột số loại
hạt dầu, do kích thước hạt rất bé vỏ dính chặt vào nhân rất khó khăn cho việc bóc
tách thì thường nghiền và ép cả vỏ, nhimg nói chung ép cả vỏ đều ảnh hiỂíng không
tốt cho quy trình sản xuất và chất lượiig của dầu và giá trị sử dụng của khồ dầu.

Nghiền nhản: nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào nguyên liệu chứa dầu, nhằm giải
phóng dầu ở dạng tự do, kh i ép hoặc trích ly dầu dễ thoát ra. Bột càng mỏng, càng
nhỏ các tế bào chứa dầu càng được giải phóng và do đó hiệu suất tách dầu sẽ cao.

Chưng sấy: để tạo điều kiện cho bột nghiền có sự biến đối vể tính chất lý
học, tức là làm thay đổi tính chất vật lý của phần háo nước và phần béo, làm cho

153
bột có tính đàn hồi, làin điìt hoặc làm yếu mối liên kết phân lử bền vững giữa dầu
với các thành phần háo nước, khi ép dầu dể dàng thoái ra. Chưng sấy làm cho độ
nhớt của dầu giảm, dầu linh động nên dễ dàng thoát ra khi ép. Chưiig sấy còn làm
bay hơi bớt một phẩn chất gây mùi dưới ảnh hưởng của hơi nước và nhiệt độ cao,
irong một vài trường hợp chưng sấy tạo cho một số thành phần không có lợi như
các độc tố bị biến đổi tính chất. Chế độ kỹ thuật chưng sấy ảnh hưởng rất lớn đến
hiệu suấl tách dầu cũng như chất lượng của dầu và khô dầu.

Ép: dưới tác dụng của áp lực ép, các phần lừ bội sẽ bị biến dạng và làm thoát
dầu ra khỏi các khe vách giữa các bề mặt bên trong cũng như bên ngoài của các
phần tử bột.

Trích ly: dùng dung môi hữu cơ để hoà tan dầu có trong nguyên liệu rắn ở
điều kiện xác định và sau đó tách dung môi ra khỏi dầu. Sau đây là một sơ đồ công
nghệ chế biến hạt dầu bằng phương pháp ép:

Dầu sau khi ép hoặc trích ly gọi là dầu thô. Thông thường để dùng vào mục
đích thực phẩm và để có thể bảo quản được lâu dài hơn, dầu thô sau khi ép hoặc
trích ly được tinh luyện để tách một số tạp chất hoà lan trong dầu.

154
 vỏ

Hình 6.1.2. Sơ đồ công nghệ ép dáu một lần

6.1.3. KIỂM TRA CÒNG NGHỆ SẢN XUẤT DẦU THựC VẬT

M ục đích kiểm tra công nghệ sản xiiấl dầu thực vật là nhằm xem xét một
cách có hệ thống phẩm chất nguyên liệu, điều kiện tiến hành là các quá trình và
chất lượng của thành phẩm. Kiểm tra quá trình công nghệ trong sản xuất dầu thực
vật cần phải đảm bảo theo dõi được các chế độ kỹ thuật đã để ra để thu được dầu,
khô, bã và các sản phẩm chế biến từ dầu có phẩm chất cao đồng thời hạn chế mức
độ thấp nhất tổn thất dầu trong sản xuất.

155
 Hơi dung môi
Bột chưng sấy

1_____í

Chưng cất Làm nguội

X Dầu
Dung môi
Ị Bào quản thu hồi

Dung môi mới Bế chứa dung môi f

Hình 6.1.3a. Sơ đồ công nghệ trích ly dầu

Dầu thô

Hình 6.1.3b. Sơ đ6 quá trình tinh luyện dầu

Trong sản xuất dầu thực vật, kiểm tra sản xuất là kiểm tra thực tế quá trình
côn g nghệ k ể c ả ỉả ểm tra thu nhận ngu yên vật liệu và k iểm tra thành phần.

Kiểm tra phẩm chất hạt nhập vào cần đảm bảo sao cho ở nhà máy sản xuất
dầu có được nguyên liệu đáp ứng đúng yêu cầu tiêu chuẩn do nhà nước đã ban
hành. Trên cơ sở những số liệu về phẩm chất của hạt mà sắp xếp theo từng loại vào

156
các kho, bởi vì đối với mỗi loại nguyên liệu có phẩm chất khác nhau thì yêu cầu
điều kiện bảo quản cũng khác nhau.

Kiểm tra tình trạng nguyên liộu khi bảo quản, nhờ đó có thế tạo ra khả năng
sao cho tổn thất nguyên liệu hạn chế được ở mức thấp nhất, đảm bảo cho dầu, khô
hoặc bã dầu thu đuợc có phẩm chất cao. V ì vậy cần phảir^ặe biệt tìieo dõi, quan sát
một cách có hệ thống nhiệt độ và độ ẩm của hạt trong bảo quản và xác định được
chỉ sô' axit của dầu trong hạt.

Kiểlíit tra hoạt động của các Ihiết bị như kiểm tra hoạt động của ịmáy làm
sạch đượcitiến hành bằng cách xác định hàm lượng tạp chất trong hạt IB^C và sau
khi làm sạch nhằm mục đích sao cho nguyên liệu sau khi đã làm sạch có lÈ m lượng
tạp chất cờn lại thấp nhất, không để ảnh hưởng tới phẩm chất và cũng khâ^g làm hư
hỏng hoặơ để các thiết bị bị ăn mòn. Kiểm tra máy bóc tách vỏ cần đảm bảo theo
dõi chế độ xay xát và tách vỏ tốt. '

Kiểna tra sản xuất trong trích ly dầu cần đảm bảo ch o dầu và bã thu xdược phù
hợp với tiêu chuẩn nhà nước, giảm tổn thất dung môi, an toàn ở chỗ làm Ýiệc trong
phân xưởng trích ly.

K iể tti tra sản xuất trong tinh luyện dầu cần xác định được lư ợ n í nước và
nhiệt độ t iu ỷ hoá, lượng xút và nồng độ xút cũng như chế độ gia nhiệt; để trung
hoà, rửa nhằm đảm bảo cho hiệu suất thu hồi dầu cao nhất và chất lư ợ i^ dầu tinh
tốt nhất. ;

NhíÉlg kết quả kiểm tra hoá học và cô n g nghệ sản xuất ch o thấy m pc độ của
cô n g nghệ sản xuất, phát hiện được những thiếu sót của quá trình cô n g nghệ, tạo ra
được những biện pháp nhanh chóng hợp lý hoá và tối ưu hoá liên tục côngỊ nghệ sản
xuất.

T ổ ehức lấy m ẫu kiểm tra nguyên liệu, sản phẩm tru ng gian ỳà th à n h

phẩm

Côitg đọạntìiii n h ậ ỊÌỊ làm sạch, sấy đ ể đưa vào bảo ệuản '\

• Hạt nhập về nhà máy

lấy mẫu từ các phưcmg tiện vận chuyển

157
 -> các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng tạp chất, hàm lượng dấu, chi
số axit của dầu trong hạt, hình thái tự nhiên 1 0 0 0 hạt, nhiễm bẩn có hại

• Hạt đem đi làm sạch và sấy

lấy mẫu từ các bàng tải đưa hạt đi làm sạch

—)• các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng tạp chất, hàm lượng dầu

• Hạt sau khi làm sạch, sấy

-> lấy mẫu từ các bãng tải đưa hạt vào kho hay vào sản xuất

các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng tạp chất, hàm lượng dầu

• Hạt bảo quản ở kho

lấy mẫu từ kho bảo quản

-> các chỉ tiêu cần xác định: nhiệt độ, độ ẩm, chỉ số axit của dầu trong hạt

Công đoạn clìiiđii bị trước khi ép

• Hạt đưa vào bóc và tách vỏ

-> lấy mẫu từ băng tải chuyển hạt đi bóc vỏ

các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, tỉ lệ vỏ và nhân, hàm lượng dầu của vỏ
và của nhân, độ ẩm của nhân, hàm lượng tạp chất.

• Nhân

-> lấy mẫu từ cửa ra của máy bóc tách hoặc vít tải chuyển nhân vào máy
nghiền

các chỉ tiêu cần xác định: tỉ lệ hạt chưa bóc vỏ, tỉ lệ vỏ lẫn vào nhân, độ
ẩm, hàm lượng dầu

• Vỏ

lấy mẫu từ ống đẩy vỏ ra khỏi nơi sản xuất

các chỉ tiêu cần xác định: tỉ lệ nhân lẫn vào vỏ, độ ẩm, hàm lượng dầu

• Bột nghiền

—> lấy mẫu từ cửa ra của máy nghiền

158
 - » các c h ỉ tiêu c ẩ n xác định: độ ẩm , mức độ nhỏ c ủ a hạt nghiền

Công đoạn chưng, sấy, ép

• Bột chimg

-> lấy mẫu từ cửa vào tầng sấy

->■ các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, nhiệt độ

• Bột ép

lấy mẫu từ chỗ thoát ra ở tầng sấy hoặc trục tiếp liệu của máy ép

-> các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, nhiệt độ

• Dầu thô

-> lấy mẫu từ sau máy ép và bể chứa sau khi lọc

các chỉ tiêu cần xác định: độ trong suốt, hàm lượng cặn, độ ẩm, chỉ số axit

• Khô dầu

lấy mẫu từ cửa thoát ra của máy ép

các chỉ tiêu cần xác định: chiều dày mảnh khô, độ ẩm, hàm lượng dầu

Công đoạn tinh luyện dầu thực vật

• Dầu đưa vào thuỷ hoá

-> lấy mẫu từ thiết bị thuỷ hoá và từ ống hút vào thiết bị trung hoà

các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, chỉ số axit, hàm lượiig photpholipit

• Dầu Ihuỷ hoá

lấy mẫu từ thiết bị thuỷ hoá và từ ống hút vào thiết bị trung hoà

các chỉ tiêu cần xác định: nhiệt độ, độ ẩm, chỉ số axit, hàm lượng
photpholipit

• Dầu trung hoà

-> lấy mẫu từ thiết bị trung hoà và cửa ra của thiết bị rìra sấy.

159
 các chỉ tiêu cần xác định: nhiệt độ, độ ẩm, chi số axit, hàm lượng xà
phòng.

• Cặn xà phòng

-)■ lấy mẫu từ thùng chứa cặn

các chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng dầu

• Dầu tinh I

-> lấy mẫu từ bể chứa dầu sau khi khử m ùi ;

-» cếc chỉ tiêu cần xác định: độ ẩm, hàm lượng cặn, hàm lượng ph^tpholipit,
chỉ sô' axit, các chỉ số cảm quan.

6.2. PHẦN THỰC HÀNH

i
ì

Trong công nghiệp thực phẩm, việc phân tích chất béo nhằm ba mụlị đích:

- X ác định hàm lượng chất béo c ó trong sản phẩm thực phẩm .

- Xác định thành phần cùa chất béo.

- x i c định chất lượng của chất béo. ’

Tuỳ theo sản phẩm và mục đích sử dụng mà ba mục đích phân tí(Ểh trên có
tầm quan trọng khác nhau. V í dụ trong trường hợp đối với các hạt dầu thì ịviệc phân
tích chủ fếu nhằm vào các mục đích xác định hàm lượng dầu và chất lượng của
dầu. Đ ối Ị ú i người tiêu thụ hoặc một nhà máy chế biến dầu m ỡ thì việc xác định
hàm lư ợ n i dầu lại không quan trọng bằng việc kiểm tra chất lượng và độ ịtinh khiết
của dầu. I I

6.2,1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT BÉO

i

BàỊ 1. Xác định hàm lượng chất béo bằng phư ơn g ph á p Soxh let

PHiIb bì piláp dựạ vặo tính chất hoà tan của các chất béq vào dưng môi hữu
cơ, chất béo được chiết ra khỏi mẫu phân tích bằng thiết bị chiết Soxhlet (hình
6 .2 .1)

160
 a.Diuig cụ, lioú clìấĩ

- 'rủ sấy; Cốc ihuỷ tinh;

- Nồi cách thuỷ; Mặt kính đổiig hồ;

- Bình hiìt ẩm; Ete petrol hoặc ete etylic (dung mỏi);

- Cân phân tích; Bộ chiết Soxhlel.

- Giấy lọc, bông;

Hinh 6.2.1. Thiết bị Soxhlet;

1. túi giấy lọc;

2 . ống xiphông;

3. tháp trích ly:

4. binh cầu;

5. ống sinh hàn;

6 . nổi cách thuỷ.

h. Tiếiì ììùỉììi

Cân khoảng 5g mẫu phân tích dà được nghiền nhò cho vào ống giấy lọc (cần
chú ý là ổng giấy lọc phải thấp hơn ống xiphông của máy chiết), gói kín ống giấy
lọc và có lót bổng ở hai đầu. Sau đó cho vào tháp irích ly. Láp bình cầu đã được sấy
khô và cân bằng cân phân tích để biết trọng lượng vào hộ thiết bị cùng với ống sinh
hàn. Qua cổ ống sinh hàn rót dung môi vào bình cầu. Lượng dung môi rót vào
chiếm khoảng 2/3 dung lích bình cầu hoặc 2 lần dung lích tháp irính ly. Cho nước
chảy liên tục vào ống làm lạnh. Dùng nổi cách thuỷ đun bình cầu sao cho dung môi
có nhiệt độ 40 -60"c. Để tránh tổn thất dung mồi, dung inôi trong bình cầu không

161
được sôi mạnh, đảm bảo sao cho cứ sau 1 giờ có 8-10 lần dung dịch mixen qua ống
xiphông chảy xuống bình cầu.

Thời gian trích ly liiỳ thuộc vào hàm lượng có trong mảu phân tích (6-10
giờ). Muốn biết quá trình chiết đã kết thúc hay chưa, lấy túi giấy lọc ra cho nhỏ vài
giọt vào tấm kính đồng hồ hoặc tờ giấy lọc, khi dung m ôi bay hơi hết, trên mặt kính
hoặc mặl giấy lọc không có vết chất béo thì quá trình chiếl đã kết thúc.

Sau khi quá trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc ra rồi liến hành cất ete ngay
trong tháp để thu hồi ete (trường hợp nếu dung dịch trong bình cầu đục, có lẫn bột
nghiền thì phải lọc qua giấy lọc rồi mới cất thu hồi dung m ôi). Sau đó đem sấy khô
chất béo ở nhiệt độ 100-105“c đến trọng lượng không đổi. Lần sấy đầu sau 1 giờ thì
cân, các iần sau cứ sau nửa giờ.

c. Tính kết quả

Hàm lượng chất béo theo %, tính bằng công thức

x% = ~^ 100
G

trong đó:

G,: trọng lượng bình cầu chứa chất béo, g;

G 2; trọng lượng bình cầu không, g;

G: lượng mấu phân tích, g;

Sai lệch giữa 2 lần xác định song song không được quá 3%.

B à i 2 . X á c đ ịn h h à m lư ợ n g c h ấ t b éo b ằ n g p h ư ơ n g p h á p F O L C H

Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng chất béo của các sản phẩm rắn
và lỏng.

a. Dụng cụ, lioá chất

- Máy ly tâm ; - Phễu chiết ;

- Máy lấc đồng nhất h oặc máy khuấy - Bình cầu ;

’ - Bộ cất chân không ;

162
 - Pipet : - Metlianol (CH,OH);

- Bình húl ẩm ; - Dung dịch HCl 6N;

- Phễu lọ c ; - Dung clỊch KC l 0,37M (27,58g//);

- B()l aniiãng, cát, bông thuỷ tinh ; - Cồn tuyệt đối 99".

- Cloroíooc (C H C l,) ;

b. Tiến hành

Cân Ig mẫu phân tích đã nghiền nhỏ (nếu mẫu phán tích là chất rắn) hoặc lấy
2,5-3ml (nếu mẫu phân tích là chất lỏng) vào cốc của máy li tâm (cốc có nút đậy).
Thêm vào đó 20m l hổn hợp CHCiyCH^OH với li lệ 2:1 theo thể tích, lắc mạnh
trong 1 phút (có thể lắc bằng máy khuấy từ hoặc máy đồng nhất), rồi thêm vào đó
80|.il HCl 6N đê’ yên ít nhất 2 giờ, sau đó thêm 4,2ml dung dịch KCl 0,37M, lắc
mạnh rồi đưa \ ’ào máy li tâm quay khoảng 10 phút, lấy ra díing pipet loại bỏ phần
trên còn phần dưới cho vào đó lOml dung dịch H 2O /CH 1O H/CHCI, (dung dịch này
pha sẩn theo tỉ lệ 47/48/3 theo thể tích), lắc mạnh rồi ly tâm, loại bỏ phần trên còn
phần dưới lại cho lOm l H20/CH,0H/CHC1t rồi lặp lại như trên lần 2. Sau khi loại
bỏ phần Irên, phần còn lại cho vào phếu chiết, thêm vào đó một ít CHCl, và nước
câ't, !ắc mạnh dể lắng rồi thu hồi lấy phần dưới vào một bình cầu đã cân sẩn để biết
trọng lượng. Lại cho thêm C H C l, và nước vào phần còn lại ở phếu chiết, lắc để thu
hồi hết chất béo còn lại ở phần trên.

Phẩn dưới lại thu hồi vào bình cầu trên, sau đó lắp bình cầu vào một bộ cấl
chân không để cất đuổi CHCI 3 sau đó cho ít cồn tuyệt đối vào bình cầu và cất cho
đốn khô. Phần còn lại trong binh cầu chi là chất béo. Để bình cầu vào bình hút ẩm
rồi cân (nếu trường hợp thấy trong bình cầu đục hoậc có cặn thì cho vào đó ít
CHCl, và lọc qua lớp bột amiăng, cát, bông thuỷ tinh rồi rnới cất đổ tách hết CHCl,)

c. Tính kết quả

Hàm lượng chất béo theo % tính bằng công thức sau:

G. -G
100
G

163
trong dó:

Gj : trọng lượng bình cầu chứa chất béo, g;

G 2 : trọng lượng bình không, g;

G : irọỉig lượng mẫu phân tích, g.

6.2.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN CHẤT BÉO

Việc xác định thành phần châì béo nhằm kiểm tra độ linh khiết của m ội loại
dầu hoặc mộl loại mỡ nào đó hoặc để xác định bản chất của loại dầu mỡ có trong
sản phẩm.

Đế xác định thành phần chất béo, người ta dùng các phương pháp sắc ký,
phương pháp lý hoá hoặc các phương pháp hoá học bằng cách xác định các chỉ số
hoá học.

Bài 3. Xác định thành phẩn axit béo có trong dấu m ỡ

Việc phân tích thành phần axit béo của một chất béo cho chúng ta biết bản
chất của chất béo đó là loại dầu gì hoặc mỡ gì bởi vì m ỗi loại chất béo khác nhau
được dạc irim g bởi thành phần các axit béo khác nhau. Thành phần axil béo của dầu
thực vật hoặc mờ động vậi thay đổi tuỳ theo giống, địa điểm trổng trọt hoặc chăn
nuôi, luổi hoặc mùa thu hoạch. So sánh thành phần các axil béo của mẫu phân tích
với các bảng thành phần axit béo của chất béo cho trong tài liệu (bảng 6 .2 .2 a và
bảng 6 .2 .2 b) để nhạn biết được loại chất béo.

Ví dii\ dầu dừa hoặc dầu nhân cọ chứa khoảng 50% axit lauric, dầu lạc, dầu
đậu tương chứa nhiều axit oleic, đầu cùi cọ chứa nhiều a x il panmetic, Irong bơ của
cacao ihì thành phần axit panmetic, axit slearic và axit oleic gẩn bằng nhau.Trong
dầu thực vật thường không có các axit béo, có số phân tử cacbon lẻ.

164
 B á n g 6.2.2a. Thành phấn axit béo của một số chất béo thực vật (%)

Lạc Đậu Dừa Nhân Cùi cọ Hướng Olỉu Bơ

tưdng co dưdng cacao
C8 3,4^15 2.4-6,2
CIO 3,2-15 2.6:7
C12 41-56 41-55 0.3-1.2
C14 13-23 14-20 0,5-5.9 <0.5
C16 8-12 10-13 4-12 6.5-11 32-59 4,8-8 7-22 25-29
C18 3,5-4 1.3-4,8 1-4.7 1,3-3.5 1,5-8 3,3-7 0,7-5 31-35
C18:1 57-65 22-31 3,4-12 10-23 27-52 20-52 48-55 34-36
C18;2 14-25 48-55 0.9-37 0,7-5,4 5-14 37-71 3,1-23 2,4-3.2
C18:3 <0.05 5,2:8,5 <0,2 0 . 1- 1.6
C20 1,4-1,8 <1 <0,5
C20:1 1-1,9 <0.2 <0.1

Bảng 6.2.2b. Thành phần các axit béo của một sỏ' chất béo động vật (%'

LỢn Bò Bơ Dầu của trứng

C10.............. .. <0,1..... ... <0,1 2,1-3,9 -

C12 <o"l <0,2 2,6-4,2 _

C14 2,7-3,3 8,2-14,F 0,4-0,6

C15 <0.1 0,5-08 1,5-1,8 -
C16 24-33 24-28 22-38 23-26
C16:1 1,8-2.8 .... 2,2-3,4..... 1.9-2,6 3-4
C17 .....0^6-1,4 ..... 2,1-4,0..... 1,9-2,9......
C18 15-25 6,6-13,5 6.5-9.5
C18:1_ 37-44 31-42 16-35 45-47
C18:2 3,3-8,0 1,0-3,9 1,3-2,9 11-13
C18:3 <1,0 0,4-1,8 0,7-4,8 <1.0
C20 <0,5 0,2-0,6 <0,5 -

Muốn xác định thành phần của hỗn hợp các axil béo người ta có thể dựa vào
các tính chất vật lý như tính hấp phụ ánh sáng, tính tan, nhiệt độ sôi, nhiệl độ đông
đặc, độ có cực và các tính chất hoá học của các axit béo. Phương pháp cất phân
đoạn dùng để tách các axit béo có nhiệl dộ sôi khác nhau. Dựa vào sự khác nhau về
nhiệt dợ đông đặc ta dùng phương pháp kết tinh phân đoạn. Phương pháp quang
phố dựa trên tính hấp phụ ánh sáng khác nhau của các axit béo.

165
 Có thể dùng phuơiìg pháp sắc ký (như sắc ký cột, sắc ký giấy, sắc ký khí) để
phân lập lừng cấu tử của một hỏĩi hợp các axit béo. Hiện nay, phương pháp thường
dùng nhấi để phân tích ihành phần axil béo có trong dầu mỡ là phương pháp phân
lích bằng máy sắc ký khí. ưu diếm của phương pháp sắc ký khí là có khả nàng tách
tất cả các chất có trong hỏn hợp cùa chúng và xác định hàm lượng của chúng kế cả
những chất có hàm lượng rất nhỏ lới vài microgam ( 1 0 '^g). sác ký khí chi áp dụng
để phân tích những chất dễ bay hơi hoặc nhCmg chất không dề bay hơi nhimg có thể
chuyển sang dạng hợp chất bay hơi.

Chất béo là những chất khó bay hơi, để phân tích bằng sắc ký phải chuyển
chúng thành nhữiig este methyl. Este hoá bằng rượu m ethylic các chất béo khác
nhau tuỳ thuộc vào thành phần các axit béo có trong chất béo đó, tức là tuỳ thuộc
vào độ dài mạch cacbon, độ bay hơi và tính tan trong nước của các axit béo, tuỳ
thuộc vào chì số axit CỈUI chất béo phân tích theo các bước sau đây:

Meíliyl lỉoâ các axiĩ béo ĩrong dấu ĩliực vậĩ

Đẩu tiên xà phòng hoá các glyxerit của dầu, rồ i este hoá các axit béo được
giải phóng ra với sự có mặt của triAuoruabo (BFO

a. Dụiiq cụ và lìoủ cìiấĩ

- Ổng thuỷ linh có nút dung tích lOml.

- Pipeí có khắc độ 0,1 ml, pipet tự động, pipet Pastơ.

- Bê'p cách cát.

Dung dịch NaOH 0,5N trong methanol (hoà tan 2g NaOH vào lOOml
methanol (methanol không chứa quá 0,5% nước). Dung dịch này khi dùng trong
thời gian Iirơng đối lâu có thể có Íí cặn cacbonat natri đượctạothành, nlumg nó
không ảnỉi hưởng đến sự chuẩn bị các este melhyl.

- Dung dịch BF^ irong methanol 14% theo trọng lượiig

- Dung dịch NaCl bão hoà (35g NaCl irong lOOml nước)

- Iso octan hay hexan

- Na 2SƠ4 khan

- Bông thuỷ tinh

166
 b. Tiếiì lỉà/ìlì

Đ ối với mẫu phân tích > lm g (từ 1-iOOmg): cân dầu vào ống thuỷ tinh dung
tích lOml. Nếu dầu chưa làm khô phải làm khô bằng dòng khí nitơ. Thêm vào
0 ,2 ml chất đệm (dùng để tính kết quả sau khi phân tích sắc ký khí), chất đệm này

phải là một axit béo không có trong dầu phân tích. Đối với dầu thực vật, người ta
thường dùng axil hepta-decanoic (Im g axit trong Im l CHClO. Sau đó cho khí N 2
vào để làm bay hơi C H C I 3 rồi cho Im l dung dịch NaOH trong methanol 0,5N, sau
đó cho khí nitơ đi qua (để tránh sự oxy hoá các axit béo không no có trong dầu), rồi
đạt lên bếp cách cát ở 80*’c và đun trên bếp cách cát trong 15 phút. Làm nguội sau
đó cho thêm vào 2m l dung dịch NaCl bão hoà và Im l hexan. Lắc rồi để lắng. Phần
irên là pha hexan có chứa este metylic.

Lấy phần trên cho vào một pipet Pastơ có chứa Na 2S0 4 khan và bông thuỷ
tinh (hình dưới) để ihu được este metyl hoàn toàn khô.

Hình 6.2.2. Làm khô este methỵỉ:

1. pipet Pastơ;
2.

3. bông thủy tinh.

Phần dưới dùng hexan tráng lại 2-3 lần để thu hồi các este methyl, các este
methyl này cũng làm khô nhir trên.

167
 Bảo cỊiiân các este methyl trKỚc khi dem phân tích bầiiỵ sâc kỷ khí

Dung dịch hexan chứa este methyl nếu chưa dem phàn tích sắc ký thì cần
phải bảo quản trong lủ lạnh với sự có mật của một khí trơ. Trường hợp muốn bảo
quản trong một thời gian dài, đế bảo vệ cho các este m ethyl khỏi bị oxy hoá, người
ta có thể cho thêm vào đó chất chống oxy hoá

Pliáit lích các esle lìietlìvl cùa cúc axit béo bằng sắc kỷ khí

Dùng máy sắc ký khí để định tính và định lượng các hỗn hợp các este methyl
của các axit béo đã thu đirợc ở phần trên. Để phân tích axit béo thường dùng máy
sắc ký khí với detectơ ion hoá ngọn lửa. Tuỳ vào mẫu phân tích, cần chọn những
điều kiện làm việc tối ưu như:

- Chọn đường kính và chiều dài của cột;

- Bản chấl và lượng củạ pha tĩnh;

- Nhiệt độ cột, detectơ, iiýectơ;

- Tốc độ của khí mang.

Điều kiện làm việc của máy sắc ký khí dùng để phân tích axit béo của dầu
thường như sau:

- Cột loại mao dẫn với pha tĩnh là C A R B O W A X 20M ;

- Chiều dài cột 20-50m;

- Đường kính trong của cột 0,3-0,5mm;

-N h iệ t độ lò 190"C;

- Nhiệt độ deteciơ và injectơ: 240‘’C;

- Khí mang N 2 hoặc He;

- Khí hyđro phải c ó độ tinh khiết 99,9%;

- Không khí phải khô và không chứa tạp chất hữu cơ.

c. Tíiilì kết quả

Sau khi đưa mẫu phân tích vào máy ta sẽ cóphố sắc ký. Dựavào phổ sắc ký,
có nhiều cách để tính ữược % trọng lượng các axit béo có trong mẫuphân tích.
Trường hợp tổng quát nhất là có thể tính % trọng lượng từng axit béo biểu thị bằng
este methyl như sau:

168
 % chất 1 = ^ A,
= ^ 100
Z a,
trong đó:

A, : tiết diện pic của chấl i;

lA ;: tổng liết diện của tất cả các pic.

Bài 4. Xác định hàm lượng chất khóng xà phòng hoá

a. Nguyên tắc

Những chất không xà phòng hoá trong dầu thực vật là những chất không tác
dụng với kiềm, thường là các sterol, các rượu có phân tử lớn, các cacbiiahyđro và
các chất màu. Nó biểu thị phẩm chất và độ tinh khiết của dầu. Dùng kiềm để xà
phòng hoá dầu. Sau đó dụng ete petrol để chiết các chất không xà phòng hoá ra
khỏi dung dịch xà phòng

b. Dụng cụ, lioú chất

- Bình nón dung tích 250ml; - Cân phân tích;

- Phễu chiết dung tích 500ml; - Bê'p cách thuỷ;

- Ống sinh hàn khí; - Tủ sấy;

- Bình cầu;

- Dung dịch K O H 2N trong ethanol. Dung dịch này phái không màu hoặc vàng nhẹ
(cồn để pha K O H cần được xử lý bằng cách cho vào llí t ethaiiol 5-lOg KO H, lắp
ống sinh hàn khí rồi đun sôi 1 giờ, sau đó cất lại);

- Dung dịch K O H 3-5% trong nước; - Ete petrol (có thể dùng //-hexan);

- Dung dịch K O H 0,1N; - Natri siiníat khan.

- Rượu ethylic 95%, 50% trung tính;

c. Tiến lìàiili

Càn vào bình nón khoảng 5g mẫu chất béo, thêm vào đó 50ml dung dịch
KOH 2N pha trong ethanol, lắp ống sinh hàn khí đun sôi trên bếp cách thuỷ óOphiit
(có thể cho một vài hạt thuỷ tinh nhỏ vào bình để tạo cho sôi đều). Sau đó thêm vào

169
50ml nước, rồi để nguội và chuyển dung dịch vào phễu chiết. Dùng 70ml ete petrol
chia làm vài lần để tráng bình và đổ vào phễu chiết, lắc mạnh một phút. Để yên hỗn
hợp cho phân thành 2 lớp. Tháo lớp nước xà phòng (lớp dưới) sang phễu chiết khác,
rồi lại cho 50inl ete peirol vào, lắc kỹ, để lắng rồi lại lấy lớp xà phòng ra chiết lại
lần thứ ba với 50ml ete petrol. Để tránh sự tạo thành nhũ tương, cho thêm vào phễu
chiết 5-lOml ethanol 95% hoặc 2-3 giọt dung dịch K O H 3-5%. Gộp cả 3 lần ete
chiết được vào một phều chiết và tiến hành rửa sạch xà phòng bằng ethanol 50%
(mỗi lần rửa 25ml) cho đến khi dung dịch rửa không hiện màu hổng với
phenolphtalein (lấy một phần dung dịch rửa với 3 phần nước, rồi thử với
phenolphtalein). Lọc eíe petrol bằng giấy lọc có chứa Na 2S0 4 khan vào bình đã sấy
khô và biết trước trọng lượng . Cất ete petrol trên bếp cách thuỷ. Phần còn lại đem
sấy khô ở nhiệt độ 103‘t ± 2*’c đến trọng lượng không đổi. Lần đầu sau 1 giờ thì
cân, những lần sau thì sấy 30 phút lại cân đến khi trọng lượng 2 lần cân không khác
nhau 0,000Ig thì được. Cần kiểm tra độ tinh khiết của chất không xà phòng bằng
cách : dùng lOml ethanol 95% trung íính để hoà tan phần còn lại trong bình và đem
chuẩn độ bằng dung dịch KO H 0,1N với chí thị phenolphtalein. Nếu phép chuẩn độ
trẽn tốn quá 0 ,1 m l thì phải xác định lại.

d. Tính kết quả

Hàm lượng chất không xà phòng X được tính bằng % theo công thức:

x%=
G

trong đó:

G,: trọng lượng chất không xà phòng hoá thu được, g;

G; irọng lượng mẫu phân tích;

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song.

Bài 5. Xác định chỉ sô' hyđroxyl

a. Nguyên tắc

Chi’ số hyđroxyl của một chất béo là số mg hyđroxyt kali cần thiết để trung
hoà lượng axit axetic tạo thành khi axetyl hoá Ig chất béo. Chỉ sô' hyđroxyl đặc
trưng cho lượng rượu có trong chất béo. A xe tyl hoá lượng rượu có trong chất béo
bằng anhydric axetic và piridin. Dùng K O H để chuẩn độ lượng axit axetic tạo thành

170
 b. Dụng cụ vù hoá cììảt

- Bình tam giác cổ rộng; - Buret;

- Sinh hàn khí; - Cân phân tích;

- Bếp cách th iiỷ hoặc bếp cách cát; - Hỗn hợp anhydric axetic và piridin khan,

Hỗn hợp này được chuẩn bị như sau: cân vào bình định mức lOOml 25g anhydric
axetic (nhiệt độ sôi 137-139‘’C) rồi thêm piridin m ới cất (t" sôi: 114-117'’C) đến
vạch định mức. Trộn cẩn thận để tránh sự nóng đột ngột. Sau đó đổ vào bình thuỷ
tinh nâu, khô. Hỗn hợp này không để quá 2 ngày;

- Etanol 95% trung tính;

- H ydroxyt kali 0,5N trong ethanol 95-96%;

- Phenolphtalein: Ig trong lOOml methanol 95-96%.

c. Tiến hành

Chất béo dùng để xác định chi số hyđroxyl phải thật khô và đã lọc sạch.
Lượng mẫu phân tích cần lấy tuỳ thuộc vào chỉ sô' hyđroxyl của tìmg chất béo. Lấy
lượng mẫu phân tích và lượng chất phản ứiig theo bảng 6 .2 .2 .:

Bảng 6.2.2a. Lượng mẫu phân tích và lượng mẫu phản ứng lấy theo chỉ sô' hyđroxyl

Chỉ số hyđroxyl Lượng mẫu (g) Lượng chất

dự kiến phản ứng (ml)
10-100 2,0 ................. 5..... ............
100-150 1,5 5
150-200 ... .......... J,,0........ ...... .5 .......................
200:250 ' ] ... .... 0 7 5 .. ......... ,5....... I I
250-300 0,6 I 5 .....
1,2 10
300-350 1,0 10

Cân mẫu phân tích vào bình tam giác và thêm một lượng chính xác hỗn hợp
anhydric axetic và pyrydin (theo bảng trên). Lắp ống sinh hàn khí. Sau đó đun nóng
trên bếp cách cát hoặc bếp cách thuỷ ở t": 95‘’-100"C trong một giờ (có thể cho vào
bình một vài hạt thuỷ tinh nhỏ để tạo cho dung dịch sôi đều). Làm nguội qua ống
sinh hàn cho thêm Im l nước cất, lắc rồi lại đun nóng trên bếp cách thuỷ 10 phút.

171
Để nguội đến nhiệt độ không khí trong phòng. Sau đó cho 5ml ethanol 95% (cho
qua ống sinh hàn để tráng ống sinh hàn và cổ bình tam giác). Chuẩn độ bằng dung
dịch KO H 0,5N Irong ethanol với chất chi ih ị phenolphtalein. Thực hiện m ội mẫu
trắng với cùng điều kiện như trên nhưiig không có chất béo.

d. Tíỉìlì kếĩ quả

Chi sốhydroxvỉ(H ) được tính theo công thức sau:

trong đó:

v„; lượng dung dịch KO H dùng chuẩn độ mẫu trắng, m l;

V ,: lượng dung dịch KO H dùng chuấn mẫu phán tích, ml;

G: lượng mẫu phân tích, g;

A^: chỉ sô' axit của chất béo.

Bài 6. Xác định chỉ s ố xà phòng

a. Nguyên tắc

Chỉ số xà phòng biểu thị bằng số mg K O H dùng để xà phòng hoá Ig chất

béo. Xà phòng hoá chất béo bằng dung dịch hyđroxyt kali trong ethanol. Sau đó
chuẩn lượng K O H dư bằng axit clohydric. Chỉ sô' xà phòng có quan hệ chặt chẽ với
thành phần cấu tạo của glyxeril. Nó đặc trưng cho khối lượng phân tử trung bình
của các axit béo có trong thành phần dầu mỡ. Nếu các axit tạo thành glyxerit của
dầu mỡ có trọng lượng phân tử thấp thì chỉ số xà phòng lớn. Ngược lại chỉ số xà
phòng nhỏ khi trọng lượng phân tử của glyxerit lớn (tức là của các axit béo). V ì vậy
qua chi’ sô' xà phòng ngưòi ta có thể phán đoán được thành phần axit béo của chất
béo đó, bảng 6 .2 .2 b.

Bảng dưới đây là một số ví dụ chứng tỏ quan hệ trên:

172
 B ả ng 6.2.2b. Mối quan hệ giữa axit béo và chỉ số xá phòng của triglyxerit

Số nguyên tử Phân tử lượng Phân tử lư ợng Chỉ sô xà phòng

Axit
cacbon của axit của triglyxerit của triglyxerit
Lauric 200.31 639,0 263,4
Panmetic 16 256,42 807,3 208,6
stearic 18 284,47 891,5 188,8

Ngoài ra chỉ số xà phòng còn liên quan với hàm lượng axit béo tự do, mono,
diglyxerit, hàm lượng chất không xà phòng hoá có trong chất béo.

b. Dụng cụ, lioá chất

- Bình nón hoặc bình cầu dung tích 250ml;

- Buret;

- Pipet;

- Ống sinh hàn khí dài Im ;

- Cân phân tích;

- Bê'p cách thuỷ hoặc bếp cách cát;

- Dung dịch K O H 0,5N trong elhanol 95%;

- Dung dịch H C l 0,5;

- Dung dịch phenolphtalein 1% pha irong ethanol;

- Dung dịch alkalin xanh 6 B (dùng làm chỉ thị cho dầu sảm màu).

c. Tiến hành

Cân 1 , 5 - 2 gam mẫu phân tích vào bình nón dung tích 250 ml. Dùng pipet
cho thêm vào đó 25 m l dung dịch KOH 0,5N irong cồn. Lắp ống sinh hàn khí và
đun sôi trên bếp cách thuỷ (hoặc cách cát) trong 1 giờ (cho một vài hạt thuỷ tinh
nhỏ vào bình để tạo cho dung dịch sôi đều). Tháo ống sinh hàn khí, cho dung dịch
vừa xà phòng hoá 0,5 m l chất chỉ thị pheiiolphtalein 1% (đối với dầu sáng màu) hay
dung dịch alkalin xanh 6 B (đối với dầu sẫm màu) và nhanh chóng chuẩn độ bằng
dung dịch H C l 0,5N cho đến phản ứng trung tính. Song song làm một mẫu trắng
(không có chất béo) với điều kiện như trên.

173
 d. Tính kết quả

Chỉ sô' xà phòng (X) được tính theo công thức:

28,055 x K x ( V - V , )
G

trong đó;

28,055 : lượng hydroxyt kali ứng với 1 m l dung dịch HCl 0,5 (mg);

K : hệ số hiệu chỉnh nộng độ của dung dịch HCl 0,5N;

V : lượng dung dịch HCl 0,5N dùng để chuẩn mẫu trắng, m l;

V ,: lượng dung dịch H Q 0,5N dùng để chuẩn mẫu chất béo, m l;

G : trọng lượng mẫu phân tích, g.

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả phân tích song song.
Chênh lệch cho phép 2 kết quả song song không quá Im g.

Bài 7. Xác định ch ỉ s ố iod theo phương pháp Wijis

Chỉ số iod là lượng iod tính bằng gam tương đượng với halogen kết hợp với
lOOg chất béo. Chi’ sô' iod đặc trưng cho mức độ no và không no của các axit béo có
trong chất béo. Qua chỉ số iod người ta quyết định giá trị sử dụng của dầu mỡ.

a. Nguyên tắc

Phương pháp dựa vào phản ứiig của dung dịch IC l với các nối đôi của axit
béo. Lượng IC l dư sẽ tác dụng với iodua kali để giải phóng ra iod tự do và được
chuẩn độ bằng thiosunfat natri theo các phản ứng.

-C H = C H - + ICl c c

C1 I
IC l (dư) + KI -> KCl + I2

I2 + 2Na2SjO, ^ 2NaI + ^^28,0 ,

b. Dụng cụ và lioá chất

- Bình nón có nút nhám dung tích 250ml, pipet, cốc thuỷ tinh, buret.

174
 - Tetraclorua cacbon, cloroíooc, axit axetic đ ậ m dặc, khí clo, iod.

- Dung dịch iodiia kali 10%. Dung dịch này cần phải trong suốt, không màu,
nếu có màu hơi vàng thì thêm vào tìnig giọt dung dịch NaỊSịO, 0,1N cho đến khi
dung dịch mất màu hoàn toàn.

- Dung dịch NasSỊƠ, 0,1N, dung dịch hồ tinh bột 1%

Cliitẩii bị diiiig dịch phàn ửiìg

Cho 13g tinh thể iod vào một cốc thuỷ tinh dung tích 2 lít, cho thêm vào 1 lit
axit axetic đậm đặc. Đặt cốc trên bếp điện có lưới amiăng để đun cho iod tan hoàn
toàn (nhiệt độ không quá 100"C). Sau đó để nguội, lấy ra 200ml dung dịch trên.
Phần còn lại đem sục kh í clo khô và sạch (khí clo cần phải được qua bình chứa
H 2SO4 đậm đặc để hút hết nước) đến khi nào màu của iod tự do mất đi và hiện màu
nâu đỏ thì thôi. Nếu sục khí clo quá nhiều thì màu sẽ nhạt, cẩn cho thêm dung dịch
iod đã lấy ( 2 0 0 m l dung dịch đã lấy ở trên) vào.

Nếu dùng dung dịch Na 2S2 0 , 0,1N chuẩn độ dung dịch W ijis thì thể tích
Na 2S2Ơ , tiêu hao phải gấp hai lần khi chưa sục khí clo vào.

Dung dịch W ijis phải được chứa trong chai màu nâu có nút nhám và bảo
quản ở chỗ tối. Dung dịch này chi nên sử dụng trong 2 tháng kể từ lúc bắt đầu pha.

c. Tiến hành

Cân lượiig mẫu theo bảng 6.2.2c (chính xác 0,0002g) vào bình nón có nút
nhám.

B áng 6.2.2C. LưỢng mẫu dùng để xác định chỉ số lod

Chỉ số iod dự kiến Lượng mẫu cân (g)

5-20................ ................ 1,0 ...........
20-50 ^'^.1....1'''..' 0,6 ........ ..
50-100 . 0,3 '
100-150 0,2
150-200 0,15
Hoà tan dầu bằng lOm l clorofooc, sau đó cho chính xác (bằng buret hoặc
pipet) 25ml dung dịch phản ứng. Đậy nút bình, dùng dung dịch K I xoa nút và
miệng bình (chú ý không để dung dịch K I rơi xuống bình), cẩn thận lắc bình và để

175
vào nơi tối ở nhiệt độ 20'*c trong 1 giờ đối với dầu có chỉ số iod <150; 2 g iờ đối với
dầu có chí số iod >150.

Sau thời gian quy định trên, thêm vào vào Ỉ5m l dung dịch K I 10% và nước
cất, lắc mạnh và chuấn độ bằng dung dịch Na 2S2 0 ^ 0,1N cho đến khi hiện màu vàng
rơm. Sau đó cho thêm vào l “2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến
khi hoàn toàn mất màu xanh. Chíí ý trong quá trình chuẩn độ cần phải lắc thật
mạnh để giải phóng hết iod bị hấp phụ trong cloroíooc. V ớ i điều kiện như trên,
đồng thời tiến hành làm mẫu trắng (không có dầu).

cì. Tính kếĩ quả

Chỉ số iod (Ix) được tính bằng % txheo công thức sau:

, ^ J V , - V , ) . 0 . 0 I 2 6 9 . K ,^^
G
trong đó:

V,: lượng dung dịch NaiSỊƠ, 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng, ml;

Vi- lượng dung dịch Na 2S2 0 , 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích, ml;

K: hệ số hiệu chinh nhiệt độ cùa dung dịch Na 2S2Ơ , 0,1 N;

0,01269: lượng iod tưcíng ứng với Im l dung dịch Na 2S2 0 ,;

G: lượng mẫu phân tích, g.

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả phân tích songsong .
Chênh lệch cho phép giữa hai kết quả phân tích song song không đượclớn hơn 1.

Gìii CÌIÚ:

- Phương pháp này có ưu điểm là phản ứiig thực hiện nhanh, quá trình thí
nghiệm đơn giản, kết quả chính xác. Nhưng việc điều chế dung dịch phản ứng
W ijis khá phiền phức.

- Chỉ số iod còn có thể được xác định bằng phương pháp Huebl và phương
pháp Hannus (xem thí nghiệm chuyên ngành). Các phương pháp này có ưu điểm là
thực hiện nhanh nhimg kết quả kém chính xác, nhất là đối với các loại dầu có chứa
các axit béo chưa no có nối đôi liên hợp.

176
 6.2.3. XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG CHẤT BÉO

Trong quá trình bảo quản, dầu rnỡ dề bị biến chấl gây nên sự hư hỏng, làm
cho dầu mỡ không thể dùng vào mục đích thực phẩm được. K hi chất béo bị biến
chất, các glvxerit sẽ bị thiiỷ phân (dưới tác dụng của enzim, nước và nhiệt độ) đê
tạo thành các d ig ly x e rit, monoglyxerit, các axit béo tự do và glyxerin.

Các axit béo chưa no trong dầu rất dề bị oxy hoá dưới tác dụng trực tiếp của
oxy không khí, ánh sáng, nhiệt độ với xúc tác của ezim lipooxydaza.

Lipooxydaza oxy hoá axit linolenic rất dẻ dàng, đối với axit oleic có chậm
hơn

C H 3OCOR CH,OH
Lipaza
a o CHOCOR + RCOOH
CHOCOR

CH.OCOR CH.OCOR

CH.O H CH,OH
Lipaza
CHOCOR H ,0 CHOCOR + RCOOH

CH.OCOR CH.OH

CH.O H Lipaza CH,OH

+ H ,0 + RCOOH
CHOCOR CHOH

C H.O H CH,OH

A x it béo chưa no bị oxy hoá tạo thành các peroxit:

Lipooxydaza
H H
R C H rC H =C H -(C H 2)„C O O H + O2 RH 3C c c (CH 2)nC 0 0 H

o o
Peroxit là sản phẩm trung gian của sự oxy hoá các axit béo chưa no. Khi bị
phân huỷ, các peroxyt tạo thành oxit và oxy tự do, nó là nguồn sinh ra ozon và
hydroperoxit (H 2O 2):

177
 RH,C c c (C H ,)nC O O H __ HC CH (C H 2)nCOOH
^ p. + o, + H2O2
0 0 o

Sự tạo ra ozon có thể xảy ra dưới ảnh hưởng của tia tử ngoại. Do vậy ở điều
kiện thường, sự ôi của dầu là do có sự tạo nên ozon. Ozon sẽ lại bị oxy hoá các
phần tử axit béo chưa no để tạo thành ozonit.
RH,CHC C H (C H 2)nCOOH
R C H rC H =C H -(C H 2)„C 0 0 H + o,, —^ Q, Q
Ozonit

Ozonit là hợp chất không bền, khi gặp nước nó bị phân giải mạnh và tạo nên
aldehyt.
RH^CHC CH(CH 2)nC 0 0 H
+ H .o RCH 2C H 0 + 0 H C -(C H 2 )„C 0 0 H
o o

Các aldehyt lại bị oxy hóa tiếp tục thành axit m onodicaboxylic và
dicacboxylic.

RCH 2CHO + H 0 C (C H 2)„C 00H + O 2 RCH 2COOH + H 0 0 C (C H 2 )„C 0 0 H

Trong quá trình dầu mỡ bị ôi, các peroxyt cũng tạo thành oxyt axit.

RH,C c c (CH,)nCOOH RH c c c (CH )nCOOH

- - + H 2O — ^ _+ O 2
o o OH

Và các oxyt cũng tạo thành các oxyt axit.

R H ,C H C C H (C H j)n C O O H R H ,C c c (C H ,)n C O O H

Đổng thời với sự tạo thành các sản phẩm oxy hoá, trong dầu mỡ còn xảy ra
sự polyme hoá tạo thành các hợp chất có phân tử lưạng lớn.

178
 Những sản phẩm tạo thành do quá trình thuỷ phân và oxy hoá làm cho chất
béo có mùi vị khó chịu, chua, hắc, đắng và làm cho dầu mỡ bị hư hỏng hoàn toàn.
Vì vậy đế kiểm tra sự ôi của dầu mỡ, người ta phân tích cảm quan màu, mùi, vị của
dầu mỡ và phân tích hoá học, hai chi sô' đặc tnmg cho sự ôi của dầu là chi số axit và
chi số peroxit. Ngoài ra người ta còn xác định các hydroperoxit bằng quang phổ tia
cực tírn và định lượng các oxy axit bằng sắc ký lớp mỏng.

Bài 8. Xác định chỉ sô axit của chát héo

Chi sô' axit là sô' mg K O H cần thiết đè trung hoà axit béo tự do có trong Ig
chấl béo. Để xác định chi sô' axit cùa chất béo có thể dùng phương pháp chiiấn độ
điện thế hoặc phương pháp chuẩn độ chị thị.

a. Dụng cụ và Ììoá chất

- Bình nón dung tích 250ml, buret, microburet, cân phân tích;

- Dung dịch K O H 0,1N, dung dịch phenolphtalein 1% pha trong ethanol;

- Dung dịch alkalin xanh 6 B 0,75% pha trong ethanol;

- Dung m ôi hỗn hợp gồm 2 phần (ete ethylic) và một phần rượu ethylic (theo
thể tích). Hỗn hợp được trung hoà bằng dung dịch K O H 0,1N đến khi hiện màu
hổng nhạt.

b. Tiểu hành

Cân 3-5g mầu vào bình nón, thêm vào đó 50ml dung môi hỗn hợp đã được
trung hoà, lắc cho tan dần. Trường hợp chất béo khó tan, phải vừa lắc vừa đun nhẹ
trên bếp cách th iiỷ rồi làm nguội đến nhiệt độ 20"c. Sau đó cho vào bình 5 giọt chỉ
thị phenolphtalein và chuẩn độ bàng dung dịch KO H Ơ,1N đến khi xuất hiện màu
hồng nhạt bền trong 30 giây.

Trường hợp dầu sảm màu phải dùng chất chi thị alkalin xanh 6 B (khoảng
Im l).

Nếu chuẩn độ bằng dung dịch K O K trong nước thì để tránh sự thuỷ phàn,
lượng ethanol dùng trong dung môi hỗn hợp ít ra là gấp 5 lần dung dịch kiểm dùng
để chuẩn độ. Nếu xác định chỉ số axit của dầu mỡ đã tinh chế thì phải dùng
m icrobiiret để chuẩn độ.

179
 (\ Tính kết quả

Chỉ số axii (A ,) của chất béo được tính bàng công thức:
^ 5 ,6 1 1 .K .V

trong đó:

V: lượng dung dịch KO H 0,1N dùng đế chuẩn độ, ml;

K: hệ số hiệu chinh nồng độ của dung dịch K O H 0,1N;

5,611: lượng hydroxit kali tương ứng với Im l dung dịch K O H 0,1N;

G: lượng mẫu phân tích, g.

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của kết quả thử song song. Chênh lệch
kết quả giữa hai mẫu phân tích song song không được quá 0 ,1 mg.

Bài 9. Xác định chỉ sô'peroxyt

Chỉ số peroxit là sô' gam iod được giải phóng ra khi cho dung dịch iodua kali
tác dụng với lOOg chất béo dưới lác dụng của các peroxit có trong chất béo. Chỉ số
peroxit đặc trưng cho sự ôi của chất béo.

a. Nguyên tắc

Các peroxyl trong chất béo tác dụng với iodua kali, giải phóng ra iod, sau đó
chuẩn lượng iod bằng dung dịch thiosuníat natri.

RH,C c c (CH,)nCOOH HC CH (CHj)nCOOH

+ 2 K I + H 2O + 2 K O H + Ỉ2
0 0 0
Phản ứng này xẩy ra trong m ôi trường axit, vì trong môi trường kiềm iod tạo
thành sẽ lại tác dụng với kiềm.

2K 0H + I2 KIO + KI + H 2O

b. Dụng cụ, lioá chất

- Bình nón có nút nhám d u n g tích 250ml, buret, pipet, cân phân tích;

- A x it axetic đậm đặc, clorofooc, dung dịch iodua kali bão hoà (mới pha),
dung dịch NusSsO, 0 ,0 IN , dung dịch hồ tinh bột 1%.

180
 c. T iế ìi lỉàỉìli

Cán 2-4g mẫu chất béo (chính xác 0,00Ig) vào bìiih nón, ihêm vào 30-40ml
hỗn hợp axii axetic và clorofooc (theo ti lệ 3:2 theo khối lượng). Lắc cho tan hoàn
toàn. vSau dó thèm 5ml dung dịch KI bào hoà rồi đế yẽii 30 phút trong tối. Sau đó
thêm 30ml nước cất và chuẩn độ lirợng iod ihoál ra bằng dung dịch Na 2S2 0 'i 0,0 IN
chođến khi dung dịch có màu vàng Iơm, thêm \'ào Im l dung dịch hồ tinh bột 1%
và chuẩn tiếp đến lìc't màu xanh. Khi chuán cần phải lắc mạnh. Đổng thời liến hành
mẫu iráiig với điều kiện giống như trôn.

t i T íỉìli k ế i cỊiiả

Chi sô' peroxyi (Px) biểu thị bằng sớ gam iod thoái ra từ lOOg chất béo, được
lính iheo công thức sau:

trong đó:

V,: lượng dung dịch Na 2S2Ơ, 0 ,0 IN dùng chuẩn độ mẫu chất béo, ml;

V 2: lượng dung dịch N a ,s ,0 , 0,01 N dùng chuẩn độ mẫu trắng, ml;

N: nồng độ đương lượng của dung dịch Na 2S2Ơ, (ở đây 0 ,01);

G: trọng lượng mẫu phân tích, g.

Chênh lệch cho phép giữa hai kết quả phân tích song song không được quá
5%.

Đ ối với chất béo có hàm lượng peroxyl thấp thì có thể dùng dung dịch
NaỊS^O, 0,002N để chuẩn độ.

Bài 10. Xác định mùi, rnàu sắc và dộ trong của chất béo hằng cảm quan

a. Xác địnìi mùi

Để xác định m ùi của dầu, phết một lớp dầu mỏng lên mặt kính hoặc xoa vào
lòng bàn tay rồi ngửi để đánh giá. Nhằm phân biệt mùi dầu chính xác hơn, cho
30ml dầu vào cốc thuỷ tinh đun trên bếp cách thuỷ đến khoảng 50"c, dùng đũa thuỷ
tinh khuấy nhanh và tiến hành thử.

181
 b. Xác định lììảii

Xác định màu sắc của chất béo cho ta nhận định sơ bộ phấm chất của chất
béo. Màu sắc nhạt, đậm chứiig tỏ dầu tốt hay xấu. Để xác định màu sắc của dầu
bằng phương pháp cảm quan, cho dầu vào cốc thuỷ tinh có đường kính = 50mm,
chiều cao lOOmm, chiều cao của dầu = 50mm. Đặt cốc trước nền trăng và nhờ sự
phản xạ ánh sáng của màu để quan sát. Biểu thị kết quả thành màu sau:

- Màu vàng nhại ; - Màu ánh xanh;

- Màu vàng ; - Màu trắng trong.

- Màu vàng nâu;

c. Xác định độ trong

Dầu phải trộn đều trước khi đem xác định. Đối với chất béo bị đông đặc phải
đun nóng sơ bộ trên bếp cách thuỷ ở 50"c trong 30 phút rồi làm nguội và lắc đểu.
Rót lOOml dầu vào ống thuỷ tinh không màu có đường kính 30mm và để yên trong
24 giờ. Quan sát dầu để lắng yên với ánh sáng phản chiếu trên nền trắng. Mẫu dầu
được xem như trong suốt nếu không có vẩn đục hoặc những sợi lơ lỉmg.

d. Xảc cíỊiili chỉ s ố màu của dấu

Chỉ số màu của dầu được biểu diễn bằng mg iod tự do có trong lOOml dung
dịch iod với màu giống màu dầu nghiên cứii ứng với chiều dày lớp dầu lOmm.

Có thể xác định chỉ số màu cùa dầu bằng hai phương pháp:

1. Quan sát và so sánh dầu đã lọc chứa trong ống thuỷ tinh không màu,
đường kính trong lOmm với thang màu dung dịch iodua kali tiêu chiiấn hoặc dung
dịch bicromat kali trong H 2SO4 đặc.

2. So sánh màu dầu đã lọc với màu dung dịch iodua kali bằng máy so màu.
Dung dịch iod dùng làm dung dịch màu tiêu chuẩn để xác định chi sô' màu của dầu
bằng máy so màu được róttrong một cốc. Cốc khác cho dầu vào một lớp dày cô'
định (lO m m ). Thay đổichiều dày lớp dung dịch tiêu chuẩn sao cho cường độmàu
của trường đo bằng nhau, ghi chiều dày lớp dung dịch màu tiêu chuẩn. Tiến hành
đo lặp lại vài ba lần.

182
 Nồng độ dung dịch iod (10%) tương đương với màu của lớp dầu dày lOmm
tính bằng công thức:

c.h
C x = - ^

trong đó:

Q,; lượng iod có trong lOOml dung dịch tiêu chuẩn, mg;

h„: chiều dày lớp dung dịch tiêu chuẩn, mm;

hsi chiểu dày lớp dầu, mm.

Sai khác trong những lần đo ứng với một lớp dày lOmm không được quá
0 ,1 mm trong trường hợp màu của dầu không trùng với màu của dung dịch iod, phải

dùng kính lọc màu xanh khi đó màu của thị trường sẽ giống nhau. Trong trường
hợp đó tất cả loạt đo so sánh được tiến hành trong cùng một điều kiện và phải ghi rõ
màu và số hiệu kính lọc cũng như kiểu thiết bị đo đã dùng để xác định chi số màu.

6.3. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG DẦU BÉO SAU QUÁ TRÌNH CÒNG NGHỆ

Chất béo sau kh i tinh luyện hoậc chế biến cần phải đạt được các chỉ tiêu chất
lượng sau;

- Hàm lượng photpholipit (lượng P) < 5ppm ;

- Chỉ sô' axit (lượng axit béo tự do) phải < 0,05-0,3 :

- Hàm lượng xà phòng < 15ppm;

- Hàm lượng dung môi không còn.

Đ ối với dầu m ỡ hydrogen hoá thì hàm lượng chất xúc tác hầu như không còn,
không được vượt quá vài ppm. Đ ối với chất béo sau khi tinh chế thì chi sô' peroxyt
coi như bằng không. Để đánh giá những chất lượng trên có thể dùng phương pháp
hoá học, sắc ký hoặc bằng phương pháp cảm quan. Qua các chỉ số cảm quan cũng
có thể giúp ta phân biệt được dầu thô và dầu tinh.

183
 Bài I L Xác dịnh hàm lượng photpholipil

a. Ngnyêỉi tắc

Đôì cháy mầu bằng oxyl magie đà được nung sẵn rồi dùng dung dịch
molipden amoni và so màu quang điện với mẫu kiểm tra. Phương pháp này dùng để
xác định photpho trong dầu không linh chế, dầu tinh chế, những chế phẩm
photphatit và những chấl khác có hàm lượng photpho > 0 ,0 0 2 %

h. Diuig cụ, lioủ cliấĩ

- Cân phàn tích, lò nung, chén sứ nung, bình định mức, máy so màu quang
điện, bếp cách thuỷ.

- O xyt magie, molipden, dung dịch H2SO4 2N

c. Tiến hànlì

Cân 0,5g mẫu (đối với dầu không tinh chế, dầu hyđrat hoá, chế phẩm
photphatit) hoặc l,3g (đối với dầu tinh chế) và 0,75g oxyt magie đã được nung, trộn
lẫn vào chén sứ rồi cho vào tủ sấy nhiệt độ 130"c trong 15 phút để dầu thấm ướt
đều. Sau đó đốt chén hỗn hợp đó trên ngọn lửa cho đến khi Iro hoá hoàn toàn rồi đặt
vào lò nung ở nhiệt độ 800-900“C trong 1 giờ 30 phút. Lấy ra và làm nguội đến
nhiệt độ trong phòng, cho vào chén 2 0 m l nước cất và vừa đun, vừa hoà tan cặn bằng
2 0 ml dung dịch H 2SO4 2 N.

Khi phân tích dầu lin h chế, dầu hydrat hoá thì dung dịch nhận được chuyển
vào bình định mức lOOml.

Khi phân tích dầu chưa tinh chế, chế phẩm photphatil, dung dịch nhận được
pha loãng bằng nước cất đến thể lích 500ml, sau đó lấy 50ml dung dịch này vào
bình định mức lOOml.

Sau đó cho 20ml chất phản ứng molipden vào dung dịch, đạt trên bếp cách
thuỷ 30 phút dể hiện màu. Làm nguội đến nhiệt độ trong phòng, bổ sung nước vào
cho đến thể tích lOOml và đo mật độ quang tương img với mẫu kiểm tra có độ dày
lớp chất lỏng Icm Irên máy so màu quang điện với kính lọc màu đò = 680nm)

184
 M ầu kiểm tra cluiẩỉi h i nlìic san:

Cân 0,75g oxyl magie mới nuns; cho 20ml dung dịch H 2SO4 2N, 20ml chất
phản ứng molipden, 20ml nước cất rổi đạt lèn bếp cách thuý 30 phút, đế nguội và
bổ sung nước cất cho đến thế tích lOOml. Dung dịch này phải hoàn toàn trong suốt.
Độ nhạy của phương pháp này là 0,0002mg photpho trong 1 liì dung dịch hoặc
0,002% khi lượng mẩu là Ig. Thời gian phân lích 3,5-4 giờ. Sai số lương dối cùa
phương pháp 3%.

Bài 12. Xác định hàm lượng xà phòng trong dầu tinh c h ế

Hàm lượng chất xà phòng trong dầu linh chế là hàm lượng muối kim loại
kiềm cỉia các axit béo còn sót lại trong quá trình luyện dầu. Hàm lượng chấi xà
phòng biểu thị phẩm chất dầu và có ảnh hường dến độ trong suối của dầu.

a. D íiỉig cụ, Ììoủ clìđt

- Bình nón dung lích 250ml, microburet, bếp cách thuỷ, cân phân lích;

- Dung dịch H 2SO4 0,1N (hoặc dung dịch HCl 0,1N);

- Dung dịch m elliyl đò Irong rượu 0,2%.

h. Tiếỉì hànlì

Càn chính xác 5g dầu vào một bình nón, thêm 5ml ethanol 95% và 30ml ete
peirol, lắc đều cho dầu lan hoàn loàn. Sau đó cho vào 50ml nước cất ở nhiệt dộ
80'’c , lắc thành dạng nhũ tương cho vào 5 giọl meiyl dó và chuán độ bằng dung
dịch H 2SO4 0,1 N . Trong quá trình cluiấn độ, gÌLÌ dung dịch dầu luồn nóng. M ỏi lần
nhỏ axil xuống phải lắc dầu ihật mạnh và đc láng cho phân lớp, quan sát màu của
lớp dung dịch phía dưới đến khi chuyển thành màu hổng nhại.

Song song làm mẫu đối chứng với điều kiện như trên.

Chú íliíclr. trường hợp nếu hàm lượng xà phòng trong dầu linh chế quá ít, cho
phép dùng dung dịch I Ỉ 2SO4 hoặc HCl 0,0 IN để chuẩn độ.

185
 c. Tính kếĩ quả:

Hàm lượng xà phòng tính bằng % theo công thức sau:

o
trong đó:

G: lượng mẫu phân tích, g;

V I : lượng dung dịch H 2SO4 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích, m l;

V2; lượng dung dịch H2SO4 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng, m l;

K: hệ sô' hiệu chỉnh nồng độ dung dịch H 2SO4;

0,034: lượng xà phòng tương ứng với Im l dung dịch axit nồng độ 0,1N, g.

186