Bài thực hành số 2:

NUÔI CẤY VI KHUẨN KỴ KHÍ TRONG THỰC PHẨM ĐÓNG HỘP

I. Mục tiêu
- Hiểu được mối quan ngại về an toàn từ vi khuẩn kỵ khí trong thực phẩm đóng hộp.
- Nắm được cách đo độ pH, phương pháp nuôi cấy và xác định vi khuẩn Clostridium
dilficile có thể có trong mẫu thực phẩm đóng hộp.

II. Giới thiệu

- Thực phẩm đóng hộp thường là thực phẩm có độ acid thấp, được bảo quản trong môi
trường có độ pH ~4,6 và hoạt độ nước ~0,86. Clostridium botulinum, Clostridium
tetani, Clostridium perfringens, và Clostridium difcile là bốn chủng thuộc
Clostridium spp. có khả năng sinh nội bào tử trong thực phẩm đóng hộp không đúng
cách.
*Dấu hiệu của thực phẩm đóng hộp không đúng cách:
+ Chất lỏng trong suốt trong hộp chuyển màu trắng sữa.
+ Nắp hộp lỏng lẻo hoặc vỏ hộp bị móp méo.
+ Vỏ hộp bị phồng.
+ Có mùi lạ.

Clostridium dilficile
- C. difficile là nguyên nhân phổ biến nhất gây viêm đại tràng liên quan đến kháng
sinh. Độc tố được sản sinh bởi các chủng Clostridioides difficile trong đường tiêu
hóa gây ra viêm đại tràng giả mạc, điển hình là sau khi sử dụng kháng sinh. Các
triệu chứng là tiêu chảy, đôi khi có máu, hiếm khi tiến triển thành megacolon độc,
thủng đại tràng, nhiễm trùng huyết và bụng cấp tính.

III. Chuẩn bị
- Mẫu thực phẩm đóng hộp
- Máy đo pH
- Đĩa thạch máu
- Đĩa thạch TSC (tryptose sulfite cycloserine)
- Thịt đã nấu chín vừa
- Bình kị khí và máy đẩy N2
 - Que cấy đầu tròn vô trùng
IV. Thực hiện
1. Quy trình kiểm tra mẫu thực phẩm đóng hộp
1.1. Mục đích:
Rất nhiều loại thực phẩm được bảo quản bằng cách đóng hộp và các thực phẩm
này được làm chua đúng cách và ở mức độ hợp lý. Các loại thực phẩm có tính
acid (các loại thịt, cá…) khi được xử lý nhiệt thường là khá an toàn. Tuy nhiên,
nếu sản phẩm không được làm chua một cách thích hợp thì sẽ có nguy cơ ảnh
hưởng đến an toàn thực phẩm, dẫn đến chứng ngộ độc thịt hay hết hạn sử dụng
sớm.
Tiêu chuẩn Thực phẩm 2.3.1 của Nhật Bản khẳng định “trái cây và rau củ ngâm
nước muối, dầu, dấm hay nước, trừ các sản phẩm thương phẩm đóng hộp, phải có
pH không lớn hơn 4.6.”

1.2. Phương pháp:

- Đo và ghi lại độ pH của thực phẩm đóng hộp ban đầu được chỉ định (máy đo pH rửa
bằng ethanol 95% trước khi đo)
- Ủ các mẫu thực phẩm đóng hộp trong 10 ngày ở 37°C.
- Kiểm tra bên ngoài thùng chứa xem có “dấu hiệu sự cố” đáng chú ý nào không.
- Khử trùng nắp mẫu thực phẩm đóng hộp bằng clo 200 ppm.

2. Quy trình kiểm tra thực phẩm đã nấu chín

2.1. Cấy vào hai ống thịt vừa nấu chín, một ống chứa 2 g mẫu thực phẩm đóng hộp và
ống còn lại bằng ống 2 ml chất lỏng thực phẩm đóng hộp
Lưu ý: Thịt đã nấu chín phải được hấp trong 20 phút ngay trước khi sử dụng.
2.2. Ủ các ống ở nhiệt độ 37°C trong 5 ngày và ghi lại quan sát của bạn.
Lưu ý: Quá trình phát triển của Clostridium dilficile sinh ra khí.

3. Quy trình phát hiện C. dilficile trong mẫu thực phẩm

3.1. Mục đích:
Những mẫu thực phẩm đóng hộp kín khí là môi trường hoàn hảo cho các loại vi
sinh vật kị khí phát triển. Vì vậy, việc phát hiện sự có mặt của các chủng gây bệnh
trong các mẫu thực phẩm đóng hộp là rất cần thiết.
3.2. Phương pháp
- Cấy 100 μl chất lỏng thực phẩm đóng hộp đã ủ lên môi trường thạch TSC và
môi trường thạch máu.
- Ủ thạch trong bình kỵ khí ở 35°C trong 48 giờ.
- Cấy các khuẩn lạc điển hình (màu đen) vào thạch thioglycollate ở 35°C trong 24
giờ và ghi lại sự thay đổi.
- Cấy các khuẩn lạc điển hình vào giữa môi trường thạch bán rắn. Lưu ý:
C.dilficile không có khả năng di chuyển.
- Đo độ pH của mẫu thực phẩm đóng hộp cuối cùng.
- Tiến hành nhuộm Gram và nhuộm nội bào tử bằng các khuẩn lạc điển hình
V. Yêu cầu
1. Biểu hiện của nhiễm độc C. dilficile.
2. Tại sao quy định về độ pH của thực phẩm đóng hộp lại < 4,6?
3. Mô tả lại hình thái khuẩn lạc của C. dilficile trên đĩa thạch. Giải thích?