Tlenek azotu

Dwa z nich ulegają konstytutywnej ekspresji i są aktywowane przez zwiększony wewnątrzkomórkowy

poziom wapnia, co prowadzi do wytwarzania niskich poziomów NO (tj. nanomolowych), które będą
głównie aktywować rozpuszczalną cyklazę guanylanową. (i) Neuronowy NOS (nNOS) występuje
głównie w mózgu, gdzie NO działa jako neuroprzekaźnik, Śródbłonkowy NOS (eNOS) jest obecny w
śródbłonku naczyń i głównie przyczynia się do rozluźnienia mięśni gładkich, wpływając na ciśnienie
krwi. Trzeci NOS to indukowalny NOS (iNOS). Jest wyrażany przez makrofagi w odpowiedzi na różne
cytokiny prozapalne i jest samoistnie aktywny (tj. nie wymaga podwyższonego stężenia wapnia)

Nadprodukcja NO

przez nNOS i iNOS wiąże się z różnymi stanami patofizjologicznymi

Zatem potencjalną strategią terapeutyczną jest opracowanie inhibitorów NOS, gdzie jeden klinicznie
użyteczny inhibitor powinien być selektywny w stosunku do docelowej izoformy, aby oszczędzić
podstawowych fizjologicznych ról dwóch pozostałych. Szczególnie dotyczy to eNOS, którego
niepożądane hamowanie naraża się na poważne skutki uboczne. Uzyskanie takiej selektywności jest
wyzwaniem, ponieważ miejsca wiązania substratu trzech izoform są wysoce konserwatywne.

Inhibitory NO

W tym kontekście opracowano oparte na substracie inhibitory dipeptydomimetyczne zgodnie ze

strategią Silvermana. Porównując skuteczność hamowania każdego z inhibitorów opartych na
substracie i każdego typu łącznika, odkryto, że najlepsze inhibitory na ogół zawierały Ugrupowanie S-
etyloizotiomocznika i albo wiązanie amidowe, albo heterocykl 1,2,4-oksadiazolu jako łącznik.
Zwiększono długość i/lub objętość rozszerzenia, aby dotrzeć do innych obszarów kanału dostępu do
substratu, gdzie mogą mieć miejsce rozbieżne interakcje, co prowadzi do wyższej siły działania i/lub
selektywności.

Synteza związków dipeptydopodobnych 7–27

Wszystkie końcowe związki wytworzono na fazie stałej z pojedynczego związku pośredniego. Metoda
ta umożliwia wygodną syntezę dużej liczby związków z jednego prekursora na nośniku.

Na koniec tiomocznik etylowano przez działanie jodkiem etylu i związki 7–27 odbezpieczono i
uwolniono z żywicy przez rozszczepienie TFA (Schemat2). Zakończenie kilku etapów (tj. sprzęgania,
aminowania redukcyjnego i S-etylowanie) oceniano poprzez rozszczepienie małej ilości żywicy w
warunkach kwasowych i analizę otrzymanej pozostałości za pomocą LC-MS.

Technika LC-MS/MS jest wykorzystywana w wielu laboratoriach diagnostycznych do oznaczania

różnorodnych parametrów. Jej największą zaletą jest możliwość oznaczania wielu parametrów w
czasie jednej analizy, niski koszt pojedynczej analizy i możliwość dodawania nowych analitów.
Synteza analogów 1,2,4-oksadiazolu 28–42

W porównaniu ze związkami dipeptydopodobnymi zastąpienie wiązania amidowego izosterycznym

pierścieniem 1,2,4-oksadiazolowym może modulować powinowactwo, selektywność, stabilność
metaboliczną i biodostępność

Ogólnie, zakończenie każdej reakcji sprawdzano za pomocą analizy LC-MS pozostałości otrzymanej po
rozszczepieniu małej części żywicy. Powiązanie pomiędzy grupa S-etyloizotiomocznikowa i nośnik
amidowym Rinka są dość odporne, wymagają dwukrotnie powtarzanej długotrwałej obróbki TFA i
lekkiego ogrzewania w celu odzyskania związków ze stałego nośnika. Wszystkie związki otrzymano z
niską do średniej wydajnością (5–50%) po oczyszczeniu metodą HPLC w odwróconych fazach.

Ocena biologiczna hamowania syntaz NO

Działanie hamujące wszystkich związków na trzy rekombinowane NOS (szczurze nNOS, mysie iNOS i
bydlęce eNOS) oceniano w 96-studzienkowych płytkach przy użyciu testu na oksyhemoglobinę.

W szeregu dipeptydopodobnym (tab1), wprowadzono osiemnaście różnych grup benzylowych

(Sugrupowanie )-amino-piperydyny.

większość związków nie hamowała eNOS i na ogół nie hamowała i /lub była jedynie umiarkowanym
inhibitorem iNOS. W przypadku nNOS obecność grup hydroksylowych i/lub nitrowych lub
metoksylowych na ugrupowaniu benzylowym była generalnie niekorzystna (9–13,15,16). Ponadto
związki te często nie wykazywały selektywności wobec iNOS.

W serii 1,2,4-oksadiazolowej (tab2) zsyntetyzowano cztery związki mono- i dziesięć di

podstawionych, dipodstawione analogi były na ogół lepszymi inhibitorami nNOS i/lub iNOS niż ich
monopodstawione odpowiedniki.

Hamowanie NOS w komórkach

Została oceniona zdolność wybranych związków (dipeptydów7,8, 21i 1,2,4-oksadiazole30 i 40) w celu
hamowania iNOS w komórkach RAW 264.7 (ryc2), gdzie iNOS był indukowany przez LPS (1μg/ml).
Aktywność iNOS mierzono po indukcji LPS poprzez ilościowe oznaczenie akumulacji azotynów w
supernatancie.

Studium modelowania

Zbadano przypuszczalny sposób wiązania dipeptydopodobnego związku i 1,2,4- oksadiazolu związku

w miejscu aktywnym nNOS i eNOS poprzez eksperymenty z dokowaniem.

Wnioski

W tym badaniu zostało zsyntetyzowane 36 nowych związków (21 związków dipeptydopodobnych, 15

1,2,4-oksadiazole) przy użyciu oryginalnej strategii syntezy w fazie stałej.