Professional Documents
Culture Documents
1) Lam alkol ile ıslatılmış veya kuru bir bez kullanılarak temizlenir.
2) Lam, baş ve işaret parmakları arasında tutulur. Lamın işaret tarafından içeriye
doğru 1cm mesafede olacak şekilde orta noktaya bir damla kan damlatılır.
3) Hastanın parmağından kan alınacak ise, orta parmağı alkollü bir pamuk ile
silindikten ve kuruması beklendikten sonra lancet veya otomatik parmak delici ile
parmağın delinmesi sağlanır.
4) İlk çıkan kan damlası bir pamuk ile silindikten sonra ikinci damlanın sol ile tutulan
lamın üzerine alınması için kan damlası yere bakacak şekilde el çevrilir ve parmak
lama temas ettirilmeden kan damlası lamın üzerine ve işaret parmağı tarafından
içeriye doğru 1 cm mesafede olacak şekilde orta bir noktaya damlatılır.
5) Sağ elin baş ve işaret parmakları arasına alınan bir lamel veya başka bir lam ile kan
damlasının ön kısmına işaret parmağına bakan ve 45° lik bir açı yapacak şekilde
temas ettirilir
6) Kanın lam veya lamelin iki köşesi arasında tamamen yayılması beklenir.
7) Açı sabit tutmak suretiyle baş parmağa doğru seri bir hareketle lam veya lamel
ileriye doğru hareket ettirilir.
8) Lamelin peşinden sürüklenen kan içindeki şekilli elemanlar bozulmadan sol elde
tutulan lamın üzerine yayılması sağlanır.
9) Hazırlanan preparatın havada kurutulması sağlanır.
1
B-KALIN DAMLA KAN PREPARATI HAZIRLAMA TEKNİĞİ
1) Lam alkol ile ıslatılmış veya kuru bir bez kullanılarak temizlenir.
3) Lamın bir tarafından içeriye doğru 1-1,5 cm. mesafede ve aralarında 2 cm mesafe
olacak şekilde 3 damla kan damlatılır.
4) Hastanın parmağından kan alınacak ise, orta parmağı alkollü pamuk ile silindikten
ve kuruması beklendikten sonra, lancet veya otomatik parmak delici ile parmağın
delinmesi sağlanır.
5) İlk çıkan kan damlası kuru bir pamukla silindikten sonra ikinci damlanın sol elde
tutulan lamın üzerine alınması için kan damlası yere bakacak şekilde el çevrilir ve
parmak lama temas ettirilmeden kan damlası lamın üzerine ve işaret parmağı
tarafından içeriye doğru 1 cm. mesafede ve aralarında 1-1,5 cm mesafe olacak
şekilde 3 damla kan damlatılır.
6) Damlatılan kan damlaları bir toplu iğnenin başı ile dairesel hareketler yapmak
suretiyle hem defibrine edilir hem de kan damlasına yaklaşık 1 cm çapında yuvarlak
bir şekil verilir. Böylece eritrositlerin çeperleri parçalanarak Plasmodium’ların kan
plazmasına çıkması sağlanır.
2
C-KAN YAYMALARININ GİEMSA İLE BOYAMA TEKNİĞİ
1) Havada tamamen kurutulmuş olan preparat, kan yayılan tarafı üste gelecek şekilde
bir küvet içerisinde bulunan boya köprüsü üzerine konulur.
2) İnce yayma kan preparatları boyamadan önce metil alkol (methanol) ile tespit
edilmelidir.
Bunun için: boya köprüsü üzerine yerleştirilen kan preparatlarının üzerine metil
alkol dökülür ve 3-5 dk bekletilir. Süre sonunda kalan metil alkol küvete dökülür.
Oda ısısında kurutulur. Kalın damla kan preparatları ise tespit edilmez.
3) Hem ince kan yayma hem de kalın damla kan preparatlarında kandaki parazitlerin
aranması amacıyla en çok tercih edilen kan boyası Giemsa’dır. Boya stok şeklinde
ticari olarak satılmaktadır.
Boyanın Hazırlanışı:
Bunun için 1 ml saf suya 1 damla Giemsa boyası olacak şekilde preparat sayısına
bağlı olarak yeterli miktarda (1 preparat için 5 ml) hazırlanır. Giemsa damlatıldıktan
sonra dairesel hareketlerle hafifçe sallanarak homojen bir karışım elde edilinceye
kadar karıştırılır. Şiddetli olarak veya bir çubuk yardımıyla karıştırıldığında boya
çökeltisi oluştuğu için bu şekilde karıştırmak uygun değildir.
5) İnce yayma kan preparatları 30 dk, kalın damla kan preparatları ise 45 dk boyada
bekletilir.
6) Preparatların boyası dökülür. İnce yayma kan preparatları yavaş akan musluk
suyunda, kalın damla kan preparatları ise bir petri kutusu içindeki suda yıkanır ve
havada kurutulur.
7) İncelenecek preparat üzerine bir damla immersiyon yağı dökülür ve x100 büyütmeli
objektif (immersiyon objektifi) kullanılarak ışık mikroskobunda incelenir.
3
NOT:
İnce yaymanın incelemesi eritrositleri bir tabaka halinde lama yaydığından dolayı
daha kolaydır. Ancak kalın damla da daha fazla miktarda kanın incelenmesine
olanak tanır.
4
DIŞKI İNCELEME YÖNTEMLERİ
Dışkının hazırlanması için özel bir alan düzenlenmeli, işlem sonrası atılacak dışkılar
özel torbalara konulmalıdır, burada kullanılan malzemeler başka yerlerde
kullanılmamalıdır.
Beklemiş veya yetersiz miktardaki örnekler veya kötü biçimde saklanan dışkı örnekleri
tanıyı kısıtlar, yanlış tanıya sebep olur.
Örnek alınmadan önce hastanın almış olduğu belli bazı maddeler barsak
protozoonlarının saptanmasını zorlaştırmaktadır. Bu maddeler;
Mineral yağ
Antibiyotikler
Antimalaryal ilaçlar
Baryum, bizmut
Emilmeyen ishal kesici ilaçlar
Dışkı örnekleri temiz ve geniş ağızlı kaplarda toplanmalıdır. Sızıntı veya nem kaybı
önlenmelidir. Dışkının su, idrar veya diğer yabancı maddelerle teması önlenmelidir.
5
Değişik tanı yöntemleri ve seri dışkı incelemeleri sonucu
Dışkı örneğinin kıvamına göre kist ve trofozoit dağılımı
E. histolytica (/dispar) saptanmasında görülen artış
6
B-TAZE DIŞKI İNCELEMELERİ
1) Yöntemin uygulanması için bir lam, iki lamel, fizyolojik su (serum fizyolojik) ve %2’lik
iyot solüsyonu gerekmektedir. İyot solüsyonuna lügol solüsyonu adı da verilmektedir.
2) Birkaç damla fizyolojik su lamın bir yarısına, birkaç damla %2’lük lügol solüsyonu
lamın diğer yarısına konulur (1 ve 2).
3) Cam veya plastik bir çubuk dışkı örneğinin farklı yerlerine birkaç kez daldırılıp
çıkarılarak alınan örnek (3), önce fizyolojik su içinde dairesel hareketlerle yayılır (4).
4) Çubuk tekrar dışkıya aynı şekilde daldırılıp çıkarılarak (5) bu kez lügol solüsyonu
içinde aynı işlem uygulanır (6).
6) Işık mikroskobunda x400 objektif kullanılarak incelenir (8). İnceleme esnasında bütün
lamelin kapladığı alanın sistematik olarak taranması idealdir (9).
%2’lik lügol solüsyonunun hazırlanması: Toz iyottan 2 gr, potasyum iyodür’den 4 gr.
tartılarak 100 ml saf suyun içinde eritilir ve koyu renkli bir şişede saklanır. Solüsyon,
bu şekilde uzun süre saklanabilmektedir.
7
C-YOĞUNLAŞTIRMA (KONSANTRASYON) YÖNTEMLERİ
Yoğunlaştırma
Çöktürme Yöntemi Yüzdürme Yöntemi
Yöntemleri
Avantaj Çökelti dışkıdaki bütün parazitleri içerir. Hazırlanan preparatlar daha temizdir.
Hem taze hem de saklanmış dışkı Dışkı artığı yoktur.
örneklerine uygulanabilir.
8
MODİFİYE FORMOL-ETİLASETAT ÇÖKTÜRME YÖNTEMİ
Yöntemin esası: Santrifüj veya basit yerçekimi etkisi ile dışkıda yer alan parazitlere ait
tüm yapıların dibe çökmesi sağlanır.
Yöntemin uygulanışı:
1) Uygun bir kap içerisinde 1-1,5 gr (sulu ise 5-6 ml) dışkı 10 ml %10’luk formol ile
tamamen ezilir. Fiksasyonun tam olması için 30 dk veya daha fazla beklenir.
2) Süspansiyon iki tabakalı gazlı bezden diğer bir kap içine süzdürülür ve 15 ml’lik
konik santrifüj tüpüne aktarılır.
3) Üzerine serum fizyolojik eklenir ve 3000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir. Bu yıkama
işlemi üst sıvı berraklaşmaya başlayana dek tekrarlanır.
4) Üst sıvı atılır. Dipteki çökeltiye 10 ml %10’luk formol eklenir.
5) Süspansiyona 3 ml etil asetat veya eter eklenir ve tüpün ağzı kapatılarak 30 sn
kuvvetlice çalkalanır.
Eğer eter kullanılacaksa tüp yüz mesafesinden uzak tutulmalıdır, çünkü formol-
eter karışımı çalkalanırken tüpün tıpası patlayabilir. Tüpü çalkaladıktan sonra
basıncı azaltmak için tıpa yavaşça gevşetilerek gaz çıkmasına izin verilir. Etil asetat
bazı yumurta ve kistlerin dışkı artığı tıkacına takılmasını engeller, fakat yağlı ve
mukuslu dışkılarda bu maddelerin uzaklaştırılmasında eter kadar etkili değildir.
6) Süspansiyona 3000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir. Tüp santrifüjden çıkarıldığında 4
tabaka görülür. A) en üstte eter veya etil asetat B) tüpün duvarına yapışan dışkı
artığı tabakası C) formol tabakası D) çökelti tabakası
7) Dışkı artığı tıkacını ortadan kaldırmak için üst sıvı bir çubuk yardımı ile karıştırılır
ve üstteki 3 tabaka dökülür. Bundan sonra kenarlarda kalan sıvının az bir miktarı
tekrar çökelti üzerine akar.
8) Tek kullanımlık cam pipet kullanarak bu sıvı çökelti ile karıştırılır. Çökelti hala katı
ise birkaç damla serum fizyolojik eklenerek vorteksle veya elle çalkalayarak
karıştırılır.
9) İnceleme için lugol solüsyonu ile doğrudan bakı preparatları hazırlanır.
9
D- KALICI BOYALI YAYMALAR
1) Dışkının lama yayılması amacı ile , temiz bir suluboya fırçası yardımı ile alınan dışkı
örneğinden lamın yaklaşık üçte birini kaplayacak şekilde ince ve düzgün bir yayma
hazırlanır.
İyi bir preparat elde etmede yaymanın kalınlığı, yaymanın arkasındaki gazete yazısı
okunabilecek kadar olmalıdır. Yayma kalın olduğunda organizmalar yeterince boya
alamaz ve çeşitli yapıların üst üste gelmeleri sonucu paraziter yapıların ayırt edilmesi
güçleşir. İnce yaymalarda ise dışkıda seyrek bulunan organizmaları saptamak
zordur.
Dışkı örneğinin fırçayla alınması Dışkı örneğinin lama yayılması Dışkı örneğinin kalınlığı
10
2) Yaymalar kurumadan Schaudinn fiksatifi içeren şaleye daldırılır. Yaymalar burada
en az 30 dakika, en çok 24 saat kalabilir.
3) Schaudinn fiksatifi ile 30 dk tespit edilmiş lamlar %70’lik etil alkol içeren şalede 2
dakika tutulur. Lamlar bu aşamada birkaç saat veya bir gece bekletilebilir.
4) %70’lik etil alkole demli çay renginde bir solüsyon elde edene kadar D’Antoni’nin iyot
solüsyonu eklenir, lamlar bu solüsyonda 3-5 dakika tutulur.
5) Lamlar iki ayrı %70’lik alkol solüsyonunun her birinde 2-5 dakika tutulur. Lamlar
bu aşamalarda birkaç saat veya bir gece bekletilebilir.
7) Fazla boyası süzülmüş dik tutulan lamlar 2-3 saniyeden fazla olmamak koşuluyla
%90 asit alkole batırılır, kağıt havluya değdirdikten sonra önce %95 alkolde sonra,
%100 alkol veya karbol-ksilen solüsyonunda çalkalanır ve ikinci %100 alkol veya
karbol-ksilen solüsyonuna aktararak boyadan arındırma işleminin durması sağlanır.
8) Lamlar ikinci ve üçüncü %100 alkol veya karbol-ksilen solüsyonunda 2-5’er dakika
tutulur.
9) Lamlar iki ayrı ksilen veya toluen içeren şalede 2-5’er dakika tutulur. Lamlar bu
aşamalarda birkaç saat veya bir gece bekletilebilir.
10) Lamların üzerine Entellan veya başka bir kaplama solüsyonu damlatarak lamelle
kapatılır.
11) İncelenecek preparat üzerine bir damla immersiyon yağı dökülür ve x100 büyütmeli
objektif (immersiyon objektifi) kullanılarak ışık mikroskobunda incelenir.
11
E-SELOFAN BANT YÖNTEMİ
1) Bir cam veya plastik çubuk ve selofan bant ile önceden tercihan alkol veya kolonya ile
temizlendikten sonra kurutulmuş bir lam bu işlemin yapılması için yeterlidir.
2) Yaklaşık 10 cm. uzunluğunda bir selofan bant yapışkan tarafı dışarı gelecek şekilde
bir cam veya plastik çubuğun üzerine geçirilir, bant elin işaret ve başparmakları ile iki
ucundan tutulur ve çubuğun üzerinde gergin durması sağlanır.
3) Bu şekilde hazırlanan bant, anüs kenarları iyice açılarak perianal bölgeye temas
ettirilir. Helment yumurtalarının anüsün kıvrımları arasında olacağı düşünülerek
kıvrımların gerginleştirilerek açılması önemlidir.
4) Bu şekilde alınan örnek, temizlenmiş lamın üzerine yapıştırılır. Bandın fazla gelen
kısımları da lamın arkasına kıvrılıp yapıştırılır.
5) Işık mikroskobunda üzerine bir şey kapatılmadan x10 objektif kullanılarak incelenir.
NOT!!!
12
PROTOZOONLAR
Leishmania sp.
Tür Hastalık Vektör
L. donovani donovani
L. donovani infantum Kala-Azar
Phlebotomus sp.
L. donovani chagasi (Visseral leishmaniasis)
L. tropica
L. tropica
L. major Kutanöz leishmaniasis Phlebotomus sp.
L. aethiopica
L. braziliensis
Mukokutanöz leishmaniasis Lutzomyia sp.
L. mexicana
Amastigot Promastigot
• 12-20 µm uzunluğundadır.
• 2-4 µm uzunluğundadır.
• Mekik şeklindedir.
• Yuvarlak veya ovaldir.
• Kum sineğinde ve besiyerlerinde bulunan
• Memeli konakta RES makrofajları içinde
formudur.
çoğalır.
• Giemsa ile parazitin sitoplazması mavi,
• Giemsa ile parazitin sitoplazması mavi,
çekirdeği ise pembe ya da koyu kırmızı renge
çekirdeği ise pembe ya da koyu kırmızı renge
boyanır.
boyanır.
13
Trypanosoma sp.
Amerikan trypanosomiasisi Afrika trypanosomiasisi
(Chagas hastalığı) (Afrika uyku hastalığı)
Tripomastigot Tripomastigot
14
Toxoplasma gondii
• Omurgalı canlılarda çekirdekli bütün hücreleri enfekte eder.
• Kesin konak kedigiller, ara konak insan ve diğer omurgalılardır.
• Kedide eşeyli-eşeysiz, ara konakta eşeysiz çoğalır.
• 3 enfektif evresi vardır;
• Takizoit (Trofozoit): Hızlı çoğalan form
• Bradizoit: Doku kisti içinde yavaş çoğalan form
• Ookist: Kedi dışkısındaki form
Takizoit
15
Plasmodium türleri
Özellikleri İnsanda yerleşen Plasmodium türleri
Plasmodium vivax
• Genç eritrositleri enfekte eder.
• Eritrosit içerisinde schüffner tanecikleri vardır.
• Karaciğer döneminde hipnozoit dönemleri vardır ki bunlar relapsların (reccurens) nedenidir.
• Nöbetler 48 saatte bir görülür.
• Eritrosit içerisindeki parazit sayısı nadiren birden fazladır.
• Eritrosit normalden büyüktür.
Olgun Şizont
16
Plasmodium falciparum
• Giemsa boyası ile çekirdek koyu kırmızı, sitoplazma açık mavi boyanır.
• Periferik kanda sadece genç trofozoit ve gametositler görülebilir.
• Genç trofozoit eritrositlerin 1/5-1/6’sını kaplar. Bir eritrosit içerisinde birden fazla bulunabilir.
• Gametositler iki ucu künt muza benzer. Boyları eritrositin 1,5 katıdır. Çekirdek ortadadır ve
pigment taneleri vardır.
• Eritrosit zarında Maurer tanecikleri vardır.
Babesia sp.
• Morfolojik olarak Plasmodium’a benzeyen hücre içi sporozoondur.
• Omurgalı konak vücudunda eritrositler içinde yaşar.
• Ortalama 1.5-5 µm büyüklüğündedir.
• Eritrosit içinde gözyaşı damlası şeklinde veya yuvarlak, oval, halka ya da amibimsi şekilde
görülür. Halka şeklinde görüldüğünde Plasmodium falciparum’un yüzük şekline benzer.
• Giemsa boyası ile boyanmış kan preparatlarında eritrosit içindeki parazit sıtma parazitlerine
benzer; ancak Plasmodium’ların diğer karakteristik gelişme formları ve sıtma pigmenti
(hemozoin) olmaması ile ayrılır
Trofozoit (Tetrad)
17
Entamoeba sp.
Entamoeba histolytica Entamoeba coli
Trofozoit 8-65 µm 12-55 µm
Kist yapısı
Entamoeba histolytica
Trofozoit Kist
18
Giardia intestinalis
Trofozoit Kist
• Ortadan ikiye bölünmüş armut şeklindedir • Oval, bazen yuvarlak ve çift çeperlidir
• 4 çift kamçı ve bir aksonem vardır
• Olgun (enfektif) kistler 4 çekirdeklidir
• 2 çekirdeklidir
• 8-14 µm uzunluğunda, 7-10 µm enindedir
• 9-21 µm uzunluğunda, 5-15 µm enindedir
Trofozoit Kist
Dientamoeba fragilis
• Trofozoiti iki çekirdeklider ve 7-12 µm büyüklüğündedir.
• Kist evresi tanımlanmamıştır.
• Bazı konaklarda patojen etki gözterdiği kabul edilmektedir.
Trofozoit
19
Blastocystis sp.
• Anaerop bir patojendir. İnsanın kalın bağırsağında yaşar.
• Yalancı ayak çıkardığı, ikiye bölünerek çoğaldığı, daha önce vakuol diye tanımlana, zarla çevrili
bir merkezi cisimciğe sahip olduğu saptanmıştır.
• Merkezi cisim parazitin yaklaşık %90’ını oluşturur ve parazitin üremesinde rol oynar.
• Dışkıda görülen şekilleri 6-40 µm çapında, yuvarlak ve hemen tamamen merkezi (orta) cisim
tarafından kaplanmış yapılardır.
• 4 önemli morfolojik formu vardır: vakuolar, granuler, ameoboid ve kist formu.
Vakuolar Form
20
İntestinal Coccidialar
Özellikler Cyclospora sp. Cystoisospora sp. Cryptosporidium sp.
2 sporokist 2 sporokist
Ookist 4 sporozoit
2’şer sporozoit 4’er sporozoit
Hücre içi,
Hücre içi yerleşimi Sitoplazma içi Sitoplazma içi
sitoplazma dışı
Sporoblastlar koyu
Asit fast boyada görünümü Değişkenlik gösterir Koyu kırmızı
kırmızı
Cryptosporidium parvum
Ookist
21
Pneumocystis jirovecii
Trofozoit: Düzensiz görünümde, 1-4 µm çapında ve temel yerleşim yeri akciğer alveolleridir.
Giemsa ile sitoplasması mavi, çekirdeği kırmızı-mor boyanır.
Prekist: Trofozoit ile kist arası. Başlangıçta tek, sonra 2-4 nükleusludur.
Kist: Yuvarlak, 5-8 µm büyüklüğünde ve kalın duvarlıdır. Tanı koydurucu formdur. İçinde 8 adet
intrakistik cisimcik vardır.
İntrakistik cisimcikler:
• 1.5 µm, yuvarlak, haç şeklinde veya amoeboid
• Bütün bu hayat döngüsü şekilleri akciğer alveolleri içindedir, hücre içine girmez
• Beslenmesini alveol içindeki sıvıdan sağlar
Kist
22
Trichomonas vaginalis
Trichomonas vaginalis’in özellikleri İnsanda yerleşen Trichomonas türleri
Trofozoit
23