MİKROBİYOLOJİK ÖRNEK

ALMA VE KÜLTÜR YAPMA

(KÜLTİVASYON)
Kültür: Üzerinde veya içinde mikroorganizma üretilmiş (ya da üremiş)
besiyerlerine denir.
Kültür tipleri:
Saf kültür:Besiyerinde yalnızca tek bir mikroorganizma türü
üretilmiş kültürlerdir.
Karışık kültür:İki veya daha fazla çeşitte mikroorganizma türü
üretilmiş kültürlerdir.
Sıvı kültür:Sıvı besiyerlerinde oluşturulmuş
kültürlerdir.
Katı kültür:Katı besiyerlerinde (agar içeren)
geliştirilmiş kültürlerdir. Bu tip kültürler, agarlı besiyerinin bileşimi ve
hazırlanışı ile örneğin inokülasyon şekline göre değişik isimlerde
anılabilmektedir (yatık agarlı kültür, saplama kültür, yarı katı kültür,
çalkalama kültür, plak kültürler, vb.). Plak kültürler; kültür kabı olarak
Petri kutusu kullanılan kültürlerdir.
KÜLTÜR YAPMA: KÜLTÜR YAPMA (KÜLTİVASYON);
MİKROORGANİZMALARI BULUNDUKLARI ORTAMLARDAN BELİRLİ
TEKNİKLERLE ALINARAK, UYGUN BİR BESLEYİCİ ORTAMA
(BESİYERİNE) AKTARILMASI VE BURADA GELİŞMELERİNİN
SAĞLANMASIDIR.
• Ancak kültür yapmadaki bu aşamalardan daha önce bir takım
ön hazırlıkların gerçekleştirilmesi gereklidir.
• Bu amaçla yapılacak ilk işlem steril besiyerinin
hazırlanmasıdır. Bunun için önce kültürü yapılacak örneğe
veya incelenecek mikroorganizma ya da mikroorganizma
grubuna uygun bir besiyeri seçimi yapılır.
• Daha sonraki aşamada ise, bu besiyeri usulüne uygun olarak
hazırlanır ve sterilize edilerek kullanıma hazır hale getirilir.
• Bu arada gerçekleştirilecek diğer bir işlem ise; kültüre ait
bilgilerin, örnek besiyerine aktarılmasından daha önceki bir
aşamada, besiyerinin hazırlandığı Petri kutusu, tüp, balon
veya Erlenmayer gibi kapların uygun bir yerine cam yazar
bir kalem ile yazılmasıdır. Bu bilgiler şunlar olabilir:
• İnkübasyonun başlatıldığı tarih, gerekirse saat,
• Ekilen örneğin adı veya kodu,
• Örneğin dilüsyon oranı (dilüsyonlar yapılmışsa)
• Gerekirse besiyerinin adı,
• Gerekirse inkübasyon sıcaklığı ve süresi.
 ÖRNEK ALMA VE ALINAN ÖRNEĞİN İNOKÜLASYONA
HAZIRLANMASI:
• Örnek alma ve alınan örneğin inokülasyona hazırlanması kültür
yapmadaki en önemli aşamalardan birisidir.
• aseptik koşullara tümüyle uyulmalıdır,
• örneğin alınmasında kullanılan araç-gereç ile örneğin
aktarılacağı örnek kapları daha önceden sterilize edilmelidir,
• Örneğin alınması ve örnek kabına aktarılması anında, mümkün
olabilirse Bunzen beki alevi altında çalışılmalıdır. Bunzen beki
alevi ile çalışmanın olanaksız olduğu durumlarda, bir ispirto
ocağından yaralanılabilir. Bu olanak da yoksa, örnek çok seri
bir şekilde alınır, bekletilmeden ve gereksiz hareketlerden
kaçınılarak hemen örnek kabına aktarılır.
• İncelenecek örnek;

 herhangi bir katı, sıvı veya gaz madde (toprak; su; hava; un, et,
peynir, süt ve meyve suyu gibi çeşitli gıdalar;
 kimyasal maddeler;
 bitki ve hayvan doku ve organları;
 idrar ve dışkı gibi vücut sıvı ve atıkları, vb.),
 herhangi bir yüzey (el, yüz, tırnak, saç, burun, diş, boğaz gibi vücut
yüzeyleri; bina, duvar, taban ve tavanları, masa ve çeşitli tezgahlar,
işletmelerdeki kazan, tank gibi ekipmanın yüzeyleri; ambalaj
materyali yüzeyleri, vb.)
 veya diğer bir sıvı ya da katı kültür olabilir.
ÇEŞİTLİ YERLERDEN ÖRNEK ALMA
Örnek alınan yer Örnek alma
Hava Petri kutusunun kapağını açık bırakma/
hava örnekleme cihazı ile çöktürme
Toprak Steril spatül, kaşık vb. ile steril
bir kaba alma
Su Su kaynağına göre steril kaba alma
Gıda maddeleri Örneğin çeşidine göre steril spatül,
bıçak, pens, kaşık, pipet v.b ile steril
kaba alma
Yüzeyler Eküvyon, agar sucuğu vb. ile yüzeye sürterek veya
temas ettirerek / yüzey yıkama, yüzey
kazıma yada dilimleme ile
Vücut yüzeyleri Çoğunlukla eküviyon ile
(el, yüz, tırnak, saç,
burun, diş,boğaz vb.)
Vücut atıkları Steril bir örnek kabına usülüne uygun olarak alma
 AKTARMA TEKNİKLERİ VE İNOKÜLASYON
İnokülasyon = ekim = aşılama: incelenecek örneğin steril bir besiyerinin
üstüne ya da içine, aktarma tekniklerinden yaralanılarak, uygun bir
şekilde aktarılması.

*Aktarma esnasında kullanılacak olan öze ve pipet gibi gereçler mutlaka

steril olmalıdır.
*incelenecek olan örneğe veya aktarma yapılacak olan steril besiyerine
sterilize edilmemiş öze veya pipet daldırılmamalıdır.
*Pipet kutusu içinde veya kağıda sarılı vaziyette sterilize edilmiş olan
pipetler, Bunzen beki alev çatısı altında usulüne uygun olarak çıkarılır ve
bek alevinden seri bir şekilde geçirilerek aktarma işleminde kullanılır.
*Aktarma işlemi tamamlandıktan sonra, pipetler tekrar alevden
geçirilmez; doğrudan içinde dezenfektan çözeltisi bulunan uygun bir
kaba konulurlar.
*Öze ise işlem bittikten sonra tekrar aleve tutularak sterilize edilir.
Böylece de çalışan bölgenin kontaminasyon riski ortadan kaldırılmış olur.
SIVI ÖRNEKLERİN İNOKÜLASYONU
KATI ÖRNEKLER VE YÜZEYLERDEN İNOKÜLASYON
GIDA MADDELERİNİN
İNOKÜLASYONU
* Tüpteki sıvı besiyerine inokülasyon:
ilk aşamada aktarılacak sıvı kültür (veya sıvı örnek) tüp içinde kuvvetlice çalkalanır
(katı kültür için böylesi bir işlem yapılamaz) (şekil 3.a).
Homojen karışım sağlandıktan sonra tüp sol ele alınır. Öze sağ elde kalem gibi
tutularak, uç kısmı Bunzen beki alevinin mavi kısmına daldırılır ve öze dike yakın
bir konuma getirilir. Özenin ucu tamamen akkor hale gelinceye kadar, öze yavaşça
aşağı yukarı hareket ettirilerek beklenir. Bu esnada öze alev içinde
saklanmamalıdır. Daha sonra öze alev çatısı altına indirilerek, öze ucunun soğuması
için 10-15 saniye kadar beklenilir. Aksi takdirde, öze ucunun sıcaklığı temas
ettirilen örnekteki mikroorganizmaları yakabilir. Diğer taraftan sıcak özenin
örneğe değdirilmesi ile örnek kabı içerisinde aerosol oluşumu sorunu ortaya
çıkabilir ve mikroorganizmalar kap içerisinde kolayca yayılabilir (bu durum ise
daha ileride açıklanan, Petri kutusundaki agarlı besiyerlerinde geliştirilmiş bir
kültürden saf kültür elde edilmesi çabalarını tehlikeye düşürebilir).
Bir sonraki aşamada ise sol elde bulunan tüpün ağzındaki pamuk tıkaç, öze tutulan
sağ elin parmaklarıyla, tüp hafifçe ekseni etrafında çevrilerek çıkarılır (Şekil 3.b).
Tüpün ağız kısmı alevden geçirilir ve tüp hafif eğilerek öze ucu sıvı örneğe
daldırılır. Öze ucuna sıvı içerisinde karıştırma hareketi yaptırılır ve öze ucu tüpe
hiç değdirilmeden dışarı çıkarılır. Bu işlemler sonucunda, “bir öze dolusu örnek”
alınmış olur. Bir öze dolusu örnek deyimi; sıvı örneğin öze ucundaki halkanın iç
kısmına ince bir film halinde yayılmasını tarif etmek için kullanılmaktadır. Eğer sıvı
örnek öze ucundaki halkanın iç kısmına film halinde yayılmamışsa, öze ucu yanlış
şekilde kıvrılmış demektir. Böyle durumlarda öze ucu yakıldıktan sonra
düzeltilerek işlemler aynen tekrarlanmalıdır.
Öze ile örnek alınımını takiben, örneği içeren tüpün ağız kısmı alevden
geçirilir ve pamuk tıkaç tekrar yerine yerleştirilir. İşi biten tüp, tüplüğe
konur. Tüpler hiçbir şekilde çalışılan tezgâh üzerine yatık vaziyette
bırakılmamalı veya önlük cebine konulmamalıdır.
Daha sonraki aşamada sol ele steril besiyerini içeren tüp alınır ve
olabildiğince dip tarafından tutularak, pamuk tıkacı alev çatısı altında
öze tutan sağ elin parmaklarıyla çıkarılır. Tüpün ağzı alevden geçirilir ve
tüp hafifçe eğik vaziyette alev çatısı altına indirilir. Öze tüp içine sıvı
seviyesine kadar sokulur ve öze ucu sıvıya daldırılmadan, sıvı yüzeyinin
hemen üstündeki bir tüp bölgesine değdirilir ve sürtme hareketi
yaptırılarak örneğin bu bölgede yayılması sağlanır. Daha sonra öze ucu
sıvı besiyerine daldırılır ve özeye karıştırma işlemi yaptırılır (şekil 3.c).
Öze ucu besiyerinden çıkarılarak, tekrar örneğin yayıldığı bölgeye temas
ettirilir. Özeye bu bölgede sürtme hareketi yaptırılarak, incelenecek
örneğin besiyerine çıkarılarak, tekrar örneğin yayıldığı bölgeye temas
ettirilir. Özeye bu bölgede sürtme hareketleri yaptırılarak, incelenecek
örneğin besiyerine yıkanarak aktarılması sağlanır. Öze ile
gerçekleştirilen bu inokülasyon; cama yayma -besiyerine daldırma-
besiyerine doğru yıkama işlemleri, duruma göre birkaç kez
tekrarlanabilir. Sonuçta, örneğin sıvı besiyerine aktarılması
(inokülasyonu) sağlanmış olur. En son olarak öze, tüpten çıkarılır ve
Bunzen beki alevinde sterilize edilir. Tüpteki sıvı besiyerine inokülasyon,
örnek ve steril besiyeri tüpleri aynı elde tutularak, Şekil 3.d ‘de
görüldüğü gibi de gerçekleştirilebilir.
* Petri kutusundaki agarlı besiyerine inokülasyon
Petri kutusundaki agarlı besiyerlerine

 sürme (ÇİZGİ EKİM),

 yayma veya dökme plak

yöntemlerinden herhangi birisiyle inokülasyon yapılabilir.

Sürme yöntemi öze kullanarak gerçekleştirilebilir. Bu
yöntem pek çok yerde “tek koloni düşürme tekniği“ olarak da
anılmaktadır.
PETRİ YÜZEYİNE
SÜRME EKİMİ
ÇEŞİTLİ ÇİZGİ EKİM YÖNTEMLERİ İLE
TEK KOLONİ ELDESİ
SIVI ÖRNEKTEN DİREKT
AKTARMA:
• c) Sıvı örnekten direkt aktarma:
• Aktarılacak hacmin önemli olmadığı durumlarda, sıvı örnekten
direkt aktarma da yapılabilmektedir. Bu amaçla aşağıdaki
şekilde bir yol izlenebilir. Aktarılacak örnek tüpü karıştırma
işlemi yapıldıktan sonra sol ele alınır ve Bunzen beki alevi altında
sağ elin parmaklarıyla pamuk tıkacı çıkarılır. Tüpün ağız kısmı
alevden geçirilir. Sağ elle steril besiyerini içeren tüp alınarak,
sol elin parmaklarıyla pamuk tıkacı çıkartılır ve tüpün ağız kısmı
alevden geçirilir. Daha sonra Şekil 7.’de görüldüğü gibi hareket
edilerek Bunzen beki alevi altında direkt aktarma
gerçekleştirilir.
 YÜZEYLERDEN ÖRNEK ALMA VE
İNOKÜLASYON:

Eküvyonla birim alandan örnek alma ve dilüsyon

hazırlama
• Eküvyon:
• Eküvyon otoklavda sterilize edilir. Eküvyon kuru olarak hazırlanmışsa,
zorunlu durumlarda sterilizasyon için Pastör fırını kullanılabilir. Ancak bu
durumda, eküvyon çubuğu ucundaki pamuğun kuru sıcaklıktan olumsuz
yönde etkilenebileceği ve bununda sağlıklı örnek alımını etkileyeceği
unutulmamalıdır. Steril eküvyon örnek alınacak bölgeye götürülür ve
burada eküvyon çubuğu aseptik koşullarda tüpünden çıkarılarak, uçtaki
pamuk kısmı örnek alınacak yüzeye kuvvetlice bastırarak sürülür. Eküvyon
çubuğu tüpünden çıkarılırken veya sürme işlemi esnasında üst ucundan
tutulur, diğer kısımlarda sterilitenin bozulmamasına özen gösterilir.
Sürme esnasında eküvyon çubuğa değişik eğimler verdirilerek ve çubuk
kendi ekseni etrafında yumuşak hareketlerle döndürülerek yüzeydeki
mikroorganizmaların pamuk ucun tamamına geçmesi yönünde gayret
gösterilir. Eküvyon çubuğu daha sonra hiçbir yere temas ettirilmeden
tüpüne yerleştirilir ve tüp en kısa sürede laboratuara yetiştirilerek
hemen ekime geçilir. Bu amaçla eküvyon çubuk alev çatısı altında tüpten
çıkarılır ve uç kısmı daha önceden hazırlanmış Petri kutusundaki agarlı
besiyeri yüzeyine (besiyerinin kenar kısmındaki herhangi bir noktaya),
besiyerini yırtmamaya özen göstererek, temas ettirilir. Daha sonra petri
kutusunun kapağı kapatılır ve eküvyon çubuğu tüpüne yerleştirilir. Bu
tüpün işi bitmiştir ve sterilize edilmek üzere ayrılmalıdır. En son aşamada
ise, Petri kutusundaki besiyerinde, örneğin temas ettirildiği noktadan
başlamak üzere öze ile sürme ekime geçilir.
• Yüzeydeki mikroorganizmaların sayımı gerçekleştirilmek istendiğinde,
örnek alımı için özel yapılmış ince metal (paslanmaz çelik) levhalardan da
yararlanılabilir. Bu levhaların iç kısmı belli bi alan oluşturacak şekilde
oyulmuştur (Şekil 8). Alkolle yakılarak sterilize edilen bu levha
incelenecek yüzeye, aseptik koşullarda temas ettirilir ve eküvyon çubuğun
pamuklu ucu levhanın oyuk yüzeyinin her tarafına belirtildiği şekilde
sürülerek örnek alınır. Eküvyon tüpü laboratuara getirilir çubuk tüpten
çıkarılarak, daha önceden hazırlanmış olan tüpteki steril 10 ml’lik dilüsyon
sıvısına (1/4 kuvvetinde Ringer çözeltisi, serum fizyolojisi, v.b.) aseptik
koşullarda daldırılır ve tüpün ağzı kapatılır. Bu işlemler yapılırken tüpün
yine çubuğa giren kısmına elle dokunulmamalı ve sterilite bozulmayacak
şekilde davranılmalıdır. Tahta çubuklu eküvyon kullanılıyorsa, yukarıdaki
işlemlerde çubuğun tüp içinde kırılması şeklinde de hareket
edilebilmektedir (Şekil 8.). Daha sonra tüp içeriği dikkatlice çalkalanır (ya
da çubuk ucundan tutularak 10 kez sıvıya daldırılır ve çıkarılır.) ve
böylece de ilk dilüsyon hazırlanmış olur. Gerekirse ileri dilüsyonlar
hazırlanarak petri kutularındaki uygun katı besiyerlerine ekim yapılır
(dökme plak, yayma, v.b. tekniklerden birisiyle).
• Eküvyon çubuğu ucuna kalsiyum alginat pamuğun sarılması
(50mg’ı aşmamak üzere) dilüsyon sıvısı olarak da %1
oranında steril Calgon (sodyum hegzametafosfat) içeren ¼
kuvvetindeki Ringer çözeltisi kullanılması önerilmektedir.
Aljinat pamuğu suda çok çabuk çözülmektedir. Ringer
çözeltisi ise sodyum hegzametafosfat içerdiğinden
çözülme işlemi kolay ve kısa zamanda olmaktadır. Ancak
Calgon’un zayıf bir bakteriyostatik etkisi bulunmaktadır.
Bu nedenle Calgon’a yer verildiği durumlarda besiyeri
olarak Nutrient Agar yerine Calgon’un inhibitör etkisini
belirli ölçülerde engelleyebilen Trypticase Soy Agar (BBL),
Tryptone Agar (oxoid) veya Plate Count Agar‘ın kullanılması
önerilmektedir. Sayım sonuçları cm²’de sayı olarak verilir.
• Diğer taraftan özel bir eküvyon çeşidi olan Triger aygıtı,
sahip olduğu yay sistemiyle, her zaman aynı boyutlarda
(yüzey alanında) ve aynı basınçta örnek alımına olanak
sağlamaktadır.
•
AGAR SUCUĞUNUN HAZIRLANMASI VE
ÖRNEK ALMA
• Sellobant tekniği:
• Sellobant’ın yapışkan yüzeyi, incelenecek yüzeye
temas ettirilerek örnek alınır (bu yöntemde sellobantların
yapışkan yüzeylerinin, üretimde kullanılan uçucu çözücüler
v.b. maddeler nedeniyle otosterilizasyona uğradığı kabul
edilmektedir). Örnek alındıktan sonra sellobant’ın örnek
alınan yüzü Petri kutusundaki agarlı besiyeri yüzeyine
temas ettirilir ve diğer yüzünden hafifçe baskı yapılarak
belli bir süre beklenir. Daha sonra da bant buradan
çıkarılarak bir dezenfektan çözeltisine atılır. Bu yöntem
çok sık başvurulmamaktadır. Sellobant yerine yüzeye
steril bir lam temas ettirilerek aynı şekilde örnek
alınabilmekte ve ekim gerçekleştirilebilmektedir.
• Yüzey kazıma ve yüzeyden ince kesitler alma:
• Steril bıçak, bistüri ve pens gibi gereçler
kullanılarak incelenecek yüzeyden kazıma, soyma veya ince
kesitle hazırlama şeklinde örnek alınarak bunlar steril
örnek kabına aktarılır. Daha sonra bu örnekler 1/10’luk
dilüsyon oluşturacak şekilde, steril bir dilüsyon sıvısı
içinde homojenize edililir.
• Yüzey yıkama ve dilüsyon sıvısına daldırma:
• İncelenecek yüzey (bu yönteme uygun bir yüzey;
örneğin bir tavuk yumurtası, sosis çeşitli meyve ve
sebzeler) bir kısım ağırlığı başına 10 kısım steril
dilüsyon sıvısı içinde çalkalanarak yıkanır veya bu
sıvıya daldırılır (1/10’luk dilüsyon). Bu işlemle
yüzeydeki bütün mikroorganizmaların yıkama sıvısına
geçemeyeceği unutulmamalıdır. Bu nedenle yıkama
anında, örneğin özelliği de göz önüne alınarak ve
uygun steril gereçler kullanılarak örneğe ezme ve
ufalama işlemleri de uygulanabilir.
• Bu işlemler olabildiğince standardize edilmeli ve
sonuçların rapor edilmesinde uygulanan yöntem
mutlaka belirtilmelidir (özellikle sayımlarda).
• İNKÜBASYON
• Kültür elde etmedeki son aşamadır. İnkübasyon, ekim
yapılmış besiyerini içeren kabın, uygun bir inkübatörde; belli
bir sıcaklık derecesinde ve belli bir süre tutulması işlemidir.
İnkübasyon için genellikle etüv veya su banyosu gibi
inkübatörlerden yararlanılır. Ancak bazı durumlarda,
inkübasyon bir laboratuardaki tezgah üzerinde de (oda
sıcaklığında) gerçekleştirilebilir. Bu durumda ise kontrollü bir
inkübasyondan söz edilemez. Oda sıcaklığındaki inkübasyon
daha çok küflerin üretimi için önerilmektedir. İnkübasyonu
takiben; tüpler metal bir tüplükte veya uygun bir cam kap
(beher gibi) içerisinde, balon ve Erlenmayer gibi kaplar ise
direkt olarak inkübatöre yerleştirilir. İnkübatör olarak su
banyosu kullanılıyorsa, bu kapların (tüp, balon, Erlenmayer
v.b.) su banyosu içinde yan yatmaması için gerekli önlemler
alınmalıdır. Bu amaçla kapların boyun kısımlarına metal ağırlık
halkaları geçirilebilir. Petri kutularının inkübasyonu için
yalnızca etüvden yararlanılır.
• Petri kutuları inokülasyonu takiben belli süre beklendikten
sonra (örnek absorbsiyonu ve agarın katılaşması gibi
nedenlerle) genelde ters çevrilerek inkübatöre yerleştirilir.
Bu durumda, Petri kutusu içinde oluşabilecek su buharının
kapakta kondense olup besiyerine damlama, böylece de
kültürün kontaminasyonu ile olduğundan fazla sayıda
ve/veya büyük koloni oluşumu riskinin önüne geçilmiş olur.
Ancak Petri kutuları, küf kültürlerinin elde edilmesinde
etüve düz konumda da yerleştirilebilmektedir. Bu tip
uygulamanın amacı; küf sporlarının kapağa düşüp, sonradan
çalışmalar anında çevreye yayılmasının önlemektir.
İnkübasyon anında etüv sıcaklığının etüv içinde homojen
dağılabilmesi için etüve çok fazla sayıda tüp, balon, Petri
kutusu, v.b. yüklenmeli, kapılar aralarında boşluk kalacak
şekilde dizilmelidir. Petri kutuları tek sıra olacak şekilde
etüve yerleştirilir. Ancak zorunlu durumlarda en fazla 2-3
tanesi üst üste olacak şekilde bir yerleştirme yapılabilir.
• İnkübasyon sıcaklığı ve süresi, genelde ekim yapılan örnek
veya çalışılan mikroorganizmanın özelliği ya da çalışmanın
amacına göre, bilgi birikimi ve deneyimlere de
dayandırılarak çalışan tarafında belirlenebilir. Ancak bu
konuda daha çok çalışılacak olan yöntemde belirtilen
değerlere uyulmaktadır. Bu yöntemleri ise, genel ve özel
amaçlı çeşitli yayınlarda bulmak mümkündür (mikrobiyolojik
analizler ve uygulama kitapları, ilgili tüzük, yönetmelik ve
standartları içeren kitaplar, v.b.).
• ÖRNEĞİN; bir kaynak suyundaki psikrotrofik bakterilerin
sayımı için inkübasyon sıcaklığı olarak 22°C seçilebilirken,
aynı suda kontaminasyona bağlı olarak bulunabilecek
koliform bakterilerin varlığını ortaya koyma veya sayısını
belirlemede inkübasyon sıcaklığı 37°C, yine kontaminasyon
sonucu bu suda bulunabilecek fekal koliformların varlığını
veya sayısını belirlemede ise inkübasyon sıcaklığı 44-45°C
olmalıdır. İnkübasyon süresi 24, 36, 48, 72 saat ya da 5, 7
gün gibi çeşitli şekillerde ifade edilmekte ve yine çoğunlukla
yöntemde bu yönde belirtilen sürelere uyulmaktadır.
 • ANAEROBİK MİKROORGANİZMALARIN
KÜLTİVASYONU
• Bilindiği gibi anaerobik mikroorganizmalar oksijen (hava)
varlığında üreyip gelişemezler. Çünkü oksijen bu
mikroorganizmalar üzerinde toksik etki yapmaktadır.
Ancak anaerobik mikroorganizmaların geniş bir aralıkta
oksijen toleransı bulunmakta ve buna göre de çeşitli
tiplere ayrılmaktadırlar.
• Örneğin oksijen, “zorunlu anaeroblar” için çok toksiktir
ve bunların oksijen varlığında üremeleri mümkün değildir.
• Buna karşılık “aerotolerant anaeroblar” ortamdaki bir
kısım oksijeni tolere edebilmekte, hatta çok az oksijen
içeren ortamlarda üreyebilmektedirler. Bununla birlikte,
oksijen bu mikroorganizmaların metabolizmasında
kullanılmamakta ve bunların üremesi gerçekte oksijenin
ortamdan tam olarak uzaklaştırılmasıyla daha iyi
gerçekleşmektedir.
•
• Aerobik mikroorganizmalar oksijenli ortamlarda,
• Fakültatif anaerob mikroorganizmalar ise hem oksijenli hem
de oksijensiz ortamlarda üreyip gelişebilmektedirler.
• Mikroaerofilik mikroorganizmalar, havadakinden biraz daha
az miktarda oksijen içeren ortamlarda, diğer bir değişle
hafifçe indirgenmiş ortamlarda daha iyi gelişmektedirler.
• Besiyeri çevresindeki moleküler oksijen, besiyeri
tarafından absorblanmakta ve besiyerinde çözünmüş
oksijen haline geçmektedir. Çözünmüş oksijenin
besiyerinde toksik serbest radikaller ve H2O2 oluşumuna
neden olduğuna inanılmaktadır. Anaerob m.o. ların bu toksik
öğeleri detoksifiye edecek enzim sistemleri
bulunmamaktadır. Buna karşılık diğer mikroorganizmalar
besiyerindeki oksijeni çeşitli şekillerde kullanabilirler.
• Diğer taraftan çözünmüş oksijen besiyerinin oksidasyon-
redüksiyon potansiyelini de etkilemektedir. Herhangi bir
anda, besiyerindeki bazı maddeler okside (O)
(yükseltgenmiş) durumdayken, diğer bazı maddeler redükte
(R) (indirgenmiş) durumdadır. Besiyerindeki bu okside ve
redükte moleküllerin varlığı mV (milivolt) ile ölçülen bir
potansiyel farkı yaratmakta ve buna oksidasyon-redüksiyon
potansiyeli (O/R) adı verilmektedir. O/R özel aygıtlar
kullanılarak ölçülebilmekte ve sonuçlar Eh değeri şeklinde
verilmektedir.
• Çözünmüş oksijen miktarı arttıkça,
besiyerindeki organik moleküller daha fazla
okside hale gelirler ve buna bağlı olarak da
besiyeri yüksek (pozitif) bir O/R potansiyeli
gösterir. Buna karşılık, besiyeri ekimlerden önce
ısıtılır veya besiyerine kuvvetli aerobik bir
bakteri ekilip üretilir ya da besiyerine indirgen
bir madde (H verici bir madde) eklenirse,
besiyeri düşük (negatif) bir O/R potansiyeline
sahip olur. Besiyerine indirgen ajan olarak daha
çok sodyum tiyoglikolat ve sistein gibi maddeler
eklenmektedir. Sodyum tiyoglikolat (HS-CH2-
COONa) ve sistein (HS-CH2CH(NH2) COOH
serbest SH grubu içeren maddelerdir ve bu
nedenle de hidrojeni (H) kolayca bir diğer
maddeye (H-alıcı) vererek, bu maddeyi
indirgeyebilir. Böylece kendisi yükseltgenirken,
H-alıcı madde indirgenir.
• Et parçaları, glukoz, bazı demir bileşikleri ve
hatta besiyerine konulacak küçük çiviler de
indirgen özelliğe sahiptirler. Örneğin Cooked
Meat Medium kalp kası ve glukoz, Liver Broth
ise karaciğer parçaları içerek şekilde formüle
edilmiştir. Bu besiyeri aerobik ve anaerobik
mikroorganizmaların stok kültürlerinin elde
edilmesi için de kullanılmasına karşılık, daha
çok anaerob mikroorganizmalar, özellikle de
Clostridium cinsi bakterilerin kültivasyonunda
kullanılmaktadır. Besiyerindeki değişiklikler
belirlenerek proteolitik organizmalar
(Clostridium sporogenes, C. histolyticum) ile
sakkarolitik organizmaları (C. perfringens)
birbirinden ayırmak mümkün olabilmektedir.
• Anaerobik mikroorganizmaların kültürünü
yapmada iki önemli nokta;
1. ortamdan oksijenin uzaklaştırılması (veya
ayrılması)
2. besiyerine indirgen maddeler ekleyerek,
besiyerinde negatif bir oksidasyon/redüksiyon
potansiyeli yaratılmasıdır (Eh -100 mV, -200 mV
gibi).

Anaerobik kültür yapmada genel olarak her iki koşul

birlikte yaratılmaya çalışılır. Ancak ortamdaki
oksijenin uzaklaştırılmasının, bu yönde daha
büyük önemi vardır. Çünkü Eh’si-50mV olan bir
besiyerinde dahi, eğer ortamda oksijen varsa
anaerobik mikroorganizma gelişiminin inhibe
olduğu gösterilmiştir.
• Anaerobik mikroorganizmaların (özellikle aerotolerantların)
sıvı besiyerinde kültürünü yapmak nispeten daha kolaydır. Bu
amaçla incelenecek örneğin inokülasyonundan önce, besiyerini
içeren tüp veya şişe kaynar su banyosunda yaklaşık 10 dakika
tutularak sıvıdaki çözünmüş haldeki oksijen ortamdan
kolayca uzaklaştırılabilir. Daha sonra besiyerinin inkübasyon
sıcaklığına soğuması sağlanır ve takiben inokülasyona geçilir.
Bu ekimlerde besiyerinin ağzı metal veya sıcaklığa dayanıklı
plastikten yapılmış vida kapaklı tüp veya şişelerde
hazırlanması önerilmektedir (besiyeri ekimler öncesi
ısıtılırken kapak gevşetilir).
• Sterilizasyon öncesinde besiyerine indirgen bir madde
eklenmesi, anaerobların gelişmesi açısından çoğunlukla
zorunlu hale gelmektedir. İnokülasyon sonrası kapların vida
kapakları sıkıca kapatılır. Ancak bu yola gaz oluşturmayan
anaeroblar için başvurulmalıdır. Çünkü sıkıca kapatılmış kap
içinde aşırı miktarda gaz oluşumu, kabın basınçla patlamasına
veya parçalanmasına neden olabilir. Gerçekte de anaerob
mikroorganizmaların kültivasyonunda gaz oluşumu sorunuyla
sık karşılaşılmaktadır.
• Böylesi bir sorunla karşılaşmamak için, besiyeri
ağzı vida kapaklı olmayan pamuk tıkaçlı bir tüp veya
şişe içinde hazırlanır. İnokülasyonu takiben
eritilmiş steril vazelin, agar, Vaspar (bir kısım
vazelin + bir kısım parafin) veya mineral bir yağ
dökülerek besiyeri yüzeyi kaplanır. Yüzeyde oluşan
tabaka, ekim yapılmış besiyerinin oksijeni absorbe
etmesini önler. Mikroorganizmaların gelişmesiyle
oluşacak gaz bu tabakaları ittirir, mineral yağda
ise yalnızca kabarcıklar oluşturur. Böylece de tüp
içinde oluşacak basınç, tüp kırılmadan
uzaklaştırılmış olur (steril sıvı parafin kullanımı,
mikroorganizmaların gaz oluşturmasının tespitine
olanak vermediği için önerilmemektedir).
 ANAEROPLARIN TÜPTEKİ AGARLI
BESİYERİNDE GAZLI ÜREMESİ (DERİN
KÜLTÜR)
• Anaerobik mikroorganizmaların katı besi yerlerinde
kültivasyonu iki şekilde gerçekleştirilebilir. Birinci şekilde
tüpteki agarlı besiyeri kullanılmakta ve “derin kültür” veya
“çalkalama kültürü” adı verilen yöntemlerle kültürler elde
edilmektedir. Derin kültür tekniğinde tüp veya uygun bir
şişede sterilize edilmiş agarlı besiyeri, ekimler öncesi
kaynar su banyosunda eritilerek burada çözünmüş oksijeni
uzaklaştırmak amacıyla 10 dakika bekletilir. Besiyeri
sıcaklığının daha sonra yaklaşık 45 0C ye düşmesi sağlanır
ve steril bir pipetle incelenecek sıvı örnekten aktarma
yapılır. Bu amaçla aşağıdaki şekilde hareket edilebilir.
Pipetle, ağzından parmak gevşetilmeden besiyerinin dip
kısmına kadar gerilir ve daha sonra parmak yavaş yavaş
gevşetilirken, pipette yavaş bir şekilde yukarı doğru
çekilerek örnek besiyerine aktarılmış olur. Ekimler
tamamlandıktan sonra agarın kendiliğinden katılaşması
sağlanır. Derin kültür elde etmede, iğne öze ile tüpteki
katılaşmış dik agarlı besiyerine (yaklaşık 20 mL) saplama
ekim yapacak şekilde de hareket edilebilir.
• Çalkalama kültüründe ise, yine aynı şekilde eritilmiş ve kaynar su
banyosunda bekletildikten sonra soğutulmuş besiyerine sıvı örnekten
pipetle normal bir aktarma yapılır. Daha sonra tüp iki el ayası arasında
kuvvetlice döndürülerek karıştırma işlemi gerçekleştirilir. Bu esnada hava
kabarcıkları oluşmamasına gayret gösterilmelidir. Daha sonra tüp soğuk su
banyosuna daldırılarak agarın katılaşması sağlanır. Bu kültürler için
kullanılan besi yerlerinde çoğunlukla indirgen maddelere de yer
verilmektedir. Ekimlerden önce veya ekimleri takiben tüpteki besiyeri
üzerine steril eritilmiş agar, vazelin, parafin veya Vaspar dökülerek hava
ile temas kesilmeye çalışılır. Bu maddeler ekimlerden önce dökülmüşse,
ekimler Pastör pipeti veya uygun bir pipet ile erimiş haldeki bu katı
geçerek gerçekleştirilir. Anaerobik mikroorganizmalar tüpün dip kısmında
ürerler.
• Bu nedenle derin kültürden bakterilerin (kolonilerin) ayrılması çok zordur.
Bu amaçla aşağıdaki şekilde bir yol izlenebilir. Tüpün dış yüzeyi ağız
kısmından başlayarak alkol emdirilmiş bir pamukla iyice temizlenir. Daha
sonra tüpün pamuk tıkacı çıkarılarak, tüp üst kısma yakın bir yerden tahta
bir maşa ile tutulur ve tüpün dip kısmı Bunzen beki alevinden birkaç kez
geçirilir. Bu durumda agarlı besiyeri tüpün ağzına doğru hareket
edecektir. Agarlı besiyerinin üst kısmı tüpün ağız kısmını biraz geçince
besiyerinin üst kısmı steril bir bistüri ile kesilerek içinde dezenfektan
bulunan bir kaba atılır. Geriye kalan dip kısım steril bir pens yardımıyla
tüpten çıkarılarak steril bir Petri kutusuna aktarılır. Boşalan tüp hemen
dezenfektanlı kaba konur. Petri kutusunda steril pens, bistüri ve öze
yardımıyla anaerobik bakteri kolonilerinin izolasyonuna geçirilir.
 Anaerobik
kavanoz.

• Anaerobik mikroorganizmaların katı besiyerinde

kültürünün gerçekleştirilmesinde BİR DİĞER
YÖNTEM Petri kutusu kullanmaktır. Böylece
yukarıda yaşayacak olan bakteri izolasyonundaki
güçlük ortadan kaldırılmış olmaktadır. Ancak bu
yöntem, “anaerobik jar =kavanoz” adı verilen özel
bir inkübasyon kabını gerektirmektedir
• Anaerob mikroorganizmaları üretmek için gaz
geçişine izin vermeyen plastik torbalar da
kullanılabilmektedir. Steril besiyeri bu torba
içine aktarılmakta ve ekimleri takiben torbanın
ağız kısmı ısıl bir işlemle tekniğine uygun bir
şekilde kapatılmaktadır. Bu amaçla Vinilinden
klorit polimerler ve saran A(00 gauge, 0,02 mm
kalınlık) plastik torbaların sterilizasyonu için
torbalar aşağıda bileşimi verilen çözeltilere
daldırılır ve yaklaşık bir dakika bekletilir. Daha
sonra buradan alınan torbalar dört ayrı kaptaki
steril damıtık su içerisinde ayrı ayrı sırayla
çalkalanır. En son çalkalamayı takiben torbalar
yavaşça durulanır ve steril petri kutusuna
konulmak üzere yerleştirilir. Torbaların
sterilizasyonu için 60 kısım %96'lık alkol, 30
kısım damıtık su, 10 kısım konsantre HCL içeren
bir çözelti kullanılır.
• Clostridium perfringens gibi anaerobik ortam konusunda daha az
titiz olan bazı anaerop bakterilerin kültivasyonu ve sayımlarında
anaerobik jar kullanımına gerek kalmadan hareket edilebilir (derin
kültür, çalkalanma kültürü, plastik torbaların kullanıldığı kültür
şekilleri, vb.).
• Yukarıda açıklanan yöntemlerin uygulanmasındaki aşamalarda
(besiyeri hazırlığı, ekim ve inkübasyon) her zaman bir kısım oksijenin
besiyerinde veya besiyerini çevreleyen atmosferde kalma riski
bulunmaktadır. Özellikle zorunlu anaeropların aktarma, besin ve
inkübasyonları tamamen anaerop bir çevre içinde yapılmalıdır. Bu
amaçla, anaerobik çalışmalar için özelleştirilmiş laboratuvarlarda
şeffaf materyallerden yapılmış küçük anaerobik kabinlerden
yararlanılabilmektedir. Bu kabinlerden havanın giriş-çıkışı
engellenecek şekilde önlemler alınmıştır. Ayrıca bu kabinlerin dış
yüzeyinde inert bazı gazların verilebilmesi için vanalar ile kabine hava
geçirmeyecek şekilde ve kabin içerisine tutturulmuş olan lastik
eldivenler bulunmaktadır. Laboratuvarda çalışan kişi ellerini bu
eldivene geçirerek, kabini açmadan işlemlerini sürdürebilir. Bu
kabinlerde, kabin içi atmosferi steril etmek için bir UV lambası
bulunmaktadır. Kabin aynı zamanda termostatlı ısıtıcı sistemlerine de
sahip olup, inkübasyon kabin içerisinde gerçekleştirilmektedir.
• Anaerobik çalışmalarda örnek alımı ve alınan örneğin
transportu konularının da ayrı bir önemi vardır. Bu
konularda gereken dikkat ve özen gösterilmeli ve
örneklerin hava ile temasının olmaması (veya en az
olması) yönünde önlemler alınmalıdır.
• Örneğin, eküvyonu özel işlemlerden geçirmeden veya
Stuarts Transport besiyerine yerleştirmeden, örnek
alımı ve transportunda kullanmak sağlıklı sonuç alma
yönünde sakıncalıdır. İncelenecek sıvı örnek çok
miktarda ise anaerobik koşullarda transportuna
gerek yoktur. Ancak bu şekildeki örnekler gereksiz
yere bekletilmeden hemen incelemeye alınmalıdır.
 SAF KÜLTÜR ELDESİ
Saf kültür eldesi genel olarak iki aşamada gerçekleştirilir.
1.İzole kolonileri elde etmek (Petri kutusundaki uygun bir katı besiyerinde),
2.İzole koloniyi ayırarak, ayrı bir besiyerine aktarmak (genelde önce sıvı bir
besiyerine, daha sonra da buradan katı bir besiyerine aktarma).
İzole kolonileri elde etmek için, ilk aşamada incelenecek örnekten Petri
kutusundaki uygun agarlı bir besiyerine (genel veya selektif) belirlenecek bir
yöntemle ekim yapılır. Bu amaçla daha çok tek koloni düşürme tekniği veya yayma
tekniği kullanılmaktadır. Besiyerleri için petri kutusunun tercih edilmesi ise, Petri
kutusunda besiyerinin daha geniş olmasıdır. Böylece ekim yapılan besiyerindeki
mikroorganizma hücrelerinin bu geniş yüzeye daha rahat yayılarak, inkübasyon
anında ayrı ayrı gelişmeleri ve ayrı ayrı koloni oluşturmaları (izole koloni) mümkün
olabilmektedir. Petri kutuları ekimleri takiben inkübasyona terkedilir. İnkübasyon
sonrası Petri kutusunda oluşan izole koloniler incelenir ve birbirine hiç temas
etmeden ayrı özellikteki koloniler ikinci aşama için seçilir. İkinci aşamada seçilen
koloniden önce bir öze ile sıvı besiyerine aktarma yapılır (adaptasyon ve
canlandırma amacıyla). Bu aşamada koloniler birbirine çok yakınsa iğne öze tercih
edilmelidir. İnkübasyonu takiben elde edilecek kültürden uygun bir katı besiyerine
(genellikle tüpteki yatık agarlı besiyerine) tekrar aktarma yapılarak inkübasyon
işlemi gerçekleştirilir. İnkübasyon sonrasında da saf kültür elde edilmiş olur. Bu
kültürün saf olup olmadığını, tek koloni düşürme tekniklerinden birisi kullanılarak
Petri kutusundaki agarlı besiyerine ekim yapılır ve inkübasyon sonrasında besiyeri
yüzeyinde gelişen koloniler şekil, yapı, büyüklük, renk vb. özellikleri yönünden
incelenir. Farklı özelliklere sahip kolonilerin varlığı gözlendiğinde, kültürün karışık
olmasından şüphelenilir. Bu konuda kesin yargıya varmak için, bu kolonilerden ayrı
ayrı Gram boyamalar yapılır ve gerekirse bunlara tanımlama testleri uygulanabilir.