การนาเสนอกรณีศึกษา PLE IP-2 ครั้งที่ 2/2566

ด้านการประกันคุณภาพและการควบคุมคุณภาพ

Analytical Method
Validation
for assay of Urea in raw material by
High Performance Liquid Chromatography

นศภ. พีรยา คล่องขยัน รหัสประจาตัวสอบ 640234178

คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น
 1 บทน
1 บทนาา

2 ส่วนประกอบของการทา Validation

3 กรณีศึกษา
Overview • system suitability • Precision
• Specificity • Accuracy
• Linerity and range • Robustness
4 สรุปผล
1 บทนำ ความหมายและความสาคัญ

การตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีการวิเคราะห์ (method validation)

มีความสาคัญต่อการพัฒนาและปรับปรุงวิธีวิเคราะห์ขึ้นมาใหม่ ซึ่ง
การตรวจสอบวิธีวิเคราะห์นั้นทาขึ้นมาเพื่อยืนยันว่า กระบวนการวิเคราะห์
ใหม่นี้นั้นสามารถนามาใช้ได้อย่างถูกต้องและแม่นยา กับตัวอย่างนั้นๆ ได้
2 ส่วนประกอบของกำรทำ Validation

หัวข้อกำรทำ Method Validation ตำมกลุ่ม ICH Guideline Q2(R1)

1 Identification test (การพิสูจน์เอกลักษณ์)

2 Control of impurities (การควบคุมสารปนเปื้อน)
Quantitative tests for impurities content
Limit tests for the control of impurities
3 Assay (การวิเคราะห์ปริมาณตัวยาสาคัญในยาหรือผลิตภัณฑ์ทางยา)
2 ส่วนประกอบของกำรทำ Validation

หัวข้อการทา Method Validation ตามกลุ่ม

Analytical Method Validation

for assay of Urea in raw material by
High Performance Liquid Chromatography
 การตรวจสอบความถูกต้องของการวิเคราะห์

3
Urea ใน raw material ในหัวข้อ Assay
ซึ่งใช้ High Performance Liquid Chromatography
โดยมีหัวข้อการตรวจสอบ ดังนี้

กรณีศึกษำ • System suitability

• Specificity
• Linerity and range
• Precision
• Accuracy
• Robustness
3 กรณีศึกษำ

วิธีกำรอ้ำงอิง
อ้างอิงวิธีการวิเคราะห์จาก USP 44-NF 39
Method of Analysis
Method : Chromatography Column temperature : 30 ๐C
Equipment : HPLC Flow rate : 1 mL/min
Analysis : Described as below Injection volume : 2 µL
Reagent : Formic acid HPLC grade Run time : 15 minutes.
: Acetonitrile HPLC grade Diluent : Acetonitrile and water (90:10)
: Deionized Water Type I
Detector : UV 195 nm
Column : 15-cm x 4.6-mm; 2.7-µm packing L86
Mobile phase A : Transfer 1 mL of formic acid to a 1-L ในการวิเคราะห์ได้มีการปรับความเข้มข้นของ
volumetric flask, dilute with water to volume and mix, filtrate the Standard และ Sample solution
solution through a nylon membrane filter of 0.22 µm pore size.
Mobile phase B : 100% Acetonitrile.
3 กรณีศึกษำ
• System suitability
เป็นการทดสอบความเหมาะสมของระบบ เช่น สภาวะของการวิเคราะห์ และตัวอย่างที่วิเคราะห์ ว่าสามารถประเมินผลได้อย่างถูกต้อง
และหัวข้อนี้จะเป็นส่วนหนึ่งในทุกระบบของกรณีศึกษานี้
วิธีเตรียมสำร
Impurity stock solution System suitability solution
Transfer 1 mL of
Weigh and transfer accurately about 100 mg of Impurity stock solution
Weigh and transfer accurately about 10 mg of Urea Urea Standard USPRS (or secondary standard)
Related Compound A USPRS (or secondary standard)

dissolve and dilute to Final concentration are about

dissolve and dilute to
volume with diluent
and mix
Urea Related 10 mg/mL of Urea
volume with diluent
Compound A 0.1 mg/mL and 0.01 mg/mL of Urea
and mix
Related Compound A

10-mL volumetric flask

100-mL volumetric flask
 3 กรณีศึกษำ
• System suitability
วิธีเตรียมสำร วิธีทำ
Standard solution ฉีดสาร (mobile phase, diluent, system suitability solution และ
standard solution ) เข้า HPLC system ปริมาตร 2 µl และประเมินตาม
Weigh and transfer accurately about 25 mg of Urea Acceptance criteria
Standard USPRS (or secondary standard)

dissolve and dilute to Final concentration is

volume with diluent about 0.5 mg/mL of Urea
and mix
The relative retention times for urea related compound A
and urea are 0.9 and 1.0, respectively
50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• System suitability
Acceptance Criteria
• Resolution ระหว่าง Urea Related Compound A
และ Urea NLT 1.5
• Tailing factor NMT 2.0
• %RSD ของ area of Urea จาก system suitability
NMT 1.0%
• %RSD ของ area of Urea standard NMT 2.0%
 3 กรณีศึกษำ
• System suitability
Acceptance criteria Result Conclusion
The resolution between Urea Related Compound A and Urea NLT 1.5 1.977 Passed
Tailing factor
- Urea Related Compound A NMT 2.0 1.181 passed
- Urea NMT 2.0 1.902 Passed
The relative standard deviation for five replicate injections
- area of Urea จาก system suitability NMT 1.0% 0.290 passed
- area of Urea standard NMT 2.0% 0.444 Passed
 3 กรณีศึกษำ
• Specificity
เป็นการทดสอบความจาเพาะต่อตัวอย่างที่นามาวิเคราะห์ โดยวิเคราะห์ร่วมกับ impurity หรือ degraded product เพื่อตรวจสอบว่า
ตัวอย่างสามารถแยกออกมาได้จากสารเจือปนอื่น ๆ ได้
Standard solution
Identification
Weigh and transfer accurately about 25 mg of Urea
Sample solution Standard USPRS (or secondary standard)

Weigh and transfer accurately about 25 mg of Urea raw material

dissolve and dilute to Final concentration is
volume with diluent about 0.5 mg/mL of Urea
dissolve and dilute to and mix
Final concentration is
volume with diluent about 0.50 mg/mL of Urea
and mix 50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
50-mL volumetric flask of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Specificity
Acceptance criteria
• No peak appears in the negative sample solution at the retention time of the analyte peak in the standard solution.
• The retention time of the analyte in the sample solution corresponds to the analyte in the standard solution.
3 กรณีศึกษำ
• Linearity and range
Standard solution
Linearity - กระบวนการวิเคราะห์ทจี่ ะ
Weigh and transfer accurately about 250 mg of Urea
ให้ผลการวิเคราะห์อย่างตรงไปตรงมา ที่ทาให้ Standard USPRS (or secondary standard)
ความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มข้นของสาร
วิเคราะห์และค่าที่วัดได้เป็นเส้นตรง
dissolve and dilute to Final concentration is
Range – ช่วงความเข้มข้นสูงสุดและ volume with diluent about 5 mg/mL of Urea
and mix
ต่าสุดของสารวิเคราะห์ที่เหมาะสมในการทา
precision, accuracy และ linearity โดยวิธี 50-mL volumetric flask
วิเคราะห์ที่เขียนไว้ Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Linearity and range วิเคราะห์สารมาตรฐานจานวน 5 ความเข้มข้นที่ครอบคลุมความเข้มข้น
ที่จะวิเคราะห์ตัวอย่าง 80-120%
Level-1 solution (80%) Level-2 solution (90%)
Transfer 4.0 mL of Standard stock solution Transfer 4.5 mL of Standard stock solution

dissolve and dilute to Final concentration is dissolve and dilute to Final concentration is
volume with diluent about 0.4 mg/mL of Urea volume with diluent about 0.45 mg/mL of Urea
and mix and mix

50-mL volumetric flask 50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Linearity and range วิเคราะห์สารมาตรฐานจานวน 5 ความเข้มข้นที่ครอบคลุมความเข้มข้น
ที่จะวิเคราะห์ตัวอย่าง 80-120%
Level-3 solution (100%) Level-4 solution (110%)
Transfer 5.0 mL of Standard stock solution Transfer 5.5 mL of Standard stock solution

dissolve and dilute to Final concentration is dissolve and dilute to Final concentration is
volume with diluent about 0.50 mg/mL of Urea volume with diluent about 0.55 mg/mL of Urea
and mix and mix

50-mL volumetric flask 50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Linearity and range วิเคราะห์สารมาตรฐานจานวน 5 ความเข้มข้นที่ครอบคลุมความเข้มข้น
ที่จะวิเคราะห์ตัวอย่าง 80-120%
Level-5 solution (120%) วิธีทำ
ฉีดสาร (mobile phase, diluent, system suitability solution และ
Transfer 6.0 mL of Standard stock solution
standard solution ) เข้า HPLC system ปริมาตร 2 µl และประเมินตาม
Acceptance criteria

dissolve and dilute to Final concentration is

volume with diluent about 0.60 mg/mL of Urea
and mix

50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Linearity and range
Acceptance criteria
Linearity • The coefficient of determination should be greater than 0.999
• The Y-intercept should be not more than 2.0% of the target concentration response
Range • The range should be acceptable for linearity, accuracy, and precision
3 กรณีศึกษำ
• Linearity and range

Y = 626193X-399.760
R2 = 0.9998347
 3 กรณีศึกษำ
• Linearity and range
Acceptance criteria Result Conclusion
Linearity
- The coefficient of determination greater than 0.999 0.9998347 passed
- Y-intercept of the target concentration response NMT 2.0% -0.1286% Passed
Range
-The range should be acceptable for linearity, accuracy, and 80-120 % 80.99-119.99 passed
precision.
3 กรณีศึกษำ
• Precision
เป็นการทดสอบความแม่นยาของระบบ โดยการ
ทดสอบซ้าๆ เพื่อประเมินว่า การทดสอบสามารถทาซ้าได้
โดยผลจะไม่ต่างไปจากเดิม โดยไม่คานึงถึงความถูกต้อง
Standard solution
Weigh and transfer accurately about 25 mg of Urea
Standard USPRS (or secondary standard)

ของผลที่ได้
dissolve and dilute to Final concentration is
วิธีทำ volume with diluent about 0.5 mg/mL of Urea
แบ่งเป็นการทา repeatability และ intermediate and mix
precision โดย repeatability ทาการวิเคราะห์ 6 ครั้ง
ที่ 100% ของ test concentration 50-mL volumetric flask
Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Precision

Sample solution (100%) วิธีทำ

ฉีดสาร (mobile phase, diluent, standard solution and 6 sample
Weigh and transfer accurately about 25 mg of Urea raw material
solutions) เข้า HPLC system ปริมาตร 2 µl และประเมินตาม Acceptance criteria

dissolve and dilute to Final concentration is

volume with diluent about 0.50 mg/mL of Urea
and mix

50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Precision
Repeatability
Acceptance Result Conclusion
criteria
The %RSD from 6
determinations of NMT 2.0% 0.787 passed
sample solution
3 กรณีศึกษำ
• Precision
Intermediate precision
Acceptance Result Conclusion
criteria
The %RSD from 6
determinations of NMT 2.0% 0.527 passed
sample solution
The overall statistical NMT 2.0% 0.657 passed
%RSD for 12
determinations (both
repeatability and
intermediate precision)
3 กรณีศึกษำ
• Accuracy
Standard solution
เป็นการทดสอบความถูกต้องของกระบวนการ
Weigh and transfer accurately about 250 mg of Urea
วิเคราะห์ที่ให้ผลวิเคราะห์ใกล้เคียงกับค่าที่แท้จริง Standard USPRS (or secondary standard)
วิธีทำ
เป็นการนาตัวอย่างทีใ่ ช้ในการวิเคราะห์มาฉีด HPLC dissolve and dilute to Final concentration is
volume with diluent
3 ความเข้มข้นความเข้มข้นละ 3 ครั้ง และประเมินตาม and mix
about 5 mg/mL of Urea

Acceptance criteria
50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Accuracy วิเคราะห์สารมาตรฐานจานวน 3 ความเข้มข้นที่ครอบคลุมความเข้มข้น
ที่จะวิเคราะห์ตัวอย่าง 80-120%
Level-1 solution (80%) Level-2 solution (100%)
Transfer 4.0 mL of Standard stock solution Transfer 5.0 mL of Standard stock solution

dissolve and dilute to Final concentration is dissolve and dilute to Final concentration is
volume with diluent about 0.4 mg/mL of Urea volume with diluent about 0.5 mg/mL of Urea
and mix and mix

50-mL volumetric flask 50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Accuracy วิเคราะห์สารมาตรฐานจานวน 3 ความเข้มข้นที่ครอบคลุมความเข้มข้น
ที่จะวิเคราะห์ตัวอย่าง 80-120%
Level-3 solution (120%) วิธีทำ
Transfer 6.0 mL of Standard stock solution

dissolve and dilute to Final concentration is

volume with diluent about 0.60 mg/mL of Urea
and mix

50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Accuracy
Acceptance Criteria 2. Accuracy 100%
Each individual sample %recovery Analyzed by No. %Recovery
and average of each concentration A 1 99.93
should be within the range of A 2 99.86
%Recovery =
98.0%-102.0% 98.17 – 99.93%
A 3 99.48
1. Accuracy 50% 3. Accuracy 120% Passed
Analyzed by No. %Recovery Analyzed by No. %Recovery
A 1 98.50 A 1 98.68
A 2 99.44 A 2 98.20
A 3 98.61 A 3 98.17
3 กรณีศึกษำ
• Robustness วิธีทำ
เป็นการทดสอบความสามารถของกระบวนการวิเคราะห์ Standard solution
ที่จะทาให้ผลการวิเคราะห์คงที่แม้ว่าจะมีกาเปลี่ยนแปลง Weigh and transfer accurately about 25 mg of Urea
Standard USPRS (or secondary standard)
สภาวะของระบบเพียงเล็กน้อย

วิธีทำ dissolve and dilute to Final concentration is

volume with diluent about 0.5 mg/mL of Urea
เป็นการนาตัวอย่างที่ใช้ในการวิเคราะห์มาฉีด และนามา and mix
เปรียบเทียบกับ ระบบที่มีการเปลี่ยนแปลงสภาวะ และนา
ผลมาประเมินตาม Acceptance criteria 50-mL volumetric flask

Filtrate the solution through a filter having 0.22 µm, discarding the first 5.0 mL
of the filtrate. Use the clear filtrate as the system suitability solution
3 กรณีศึกษำ
• Robustness
Parameter ที่นำมำวิเครำะห์

Acceptance criteria
• The resolution between Urea Related Compound A and Urea should be not less than 1.5.
• The %RSD of area of Urea from the system suitability should be not more than 1.0%.
• The %RSD of area of Urea from the standard should be not more than 2.0%
3 กรณีศึกษำ
• Robustness

passed
 3 กรณีศึกษำ
• Robustness
Acceptance criteria Result Conclusion

The resolution between Urea Related Compound A and Urea

Flow rate
- 0.9 mL/min NLT 1.5 2.01 passed
- 1.0 mL/min NLT 1.5 1.98 Passed
- 1.1 mL/min NLT 1.5 1.95 Passed
2. Temperature
- 25 ºC NLT 1.5 1.91 passed
- 30 ºC NLT 1.5 1.98 Passed
- 35 ºC NLT 1.5 1.91 Passed
3. Buffer concentration
- 0.09% Formic acid NLT 1.5 2.00 passed
- 0.1 % Formic acid NLT 1.5 1.89 Passed
- 0.11% Formic acid NLT 1.5 1.99 Passed
 4
สรุปผล
จากผลการตรวจสอบวิธีการวิเคราะห์ วิธี
การวิเคราะห์นี้ผ่านการประเมินในทุกหัวข้อ
และสามารถนาวิธีการวิเคราะห์นี้มาใช้ได้จริง
Reference
• ICH Q2 (R1) : Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.
2005. Accessed May 27, 2021.
• United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 44-NF 39). United
States Pharmacopeial Convention; 2016. Accessed May 27, 2021.
• ASEAN Technical Guidelines to ACTR on Quality: ASEAN Analytical Validation
Guideline. 2549. Accessed May 27, 2021.
• AOAC International, Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance
Requirements
Thank you!