Sterylizacja, dezynfekcja

STERYLIZACJA, DEZYNFEKCJA

W laboratorium mikrobiologicznym do prowadzenia badań i wykonywania analiz niezbędne jest

stworzenie warunków jałowych, czyli pozbycie się mikroorganizmów z używanych narzędzi,
szkła, podłóż czy stanowiska pracy. Oznacza to, że drobnoustroje (zarówno formy wegetatywne
jak i przetrwalne) występujące na danej powierzchni czy w danej objętości/przestrzeni powinny
zostać wyeliminowane za pomocą odpowiednich metod. Wyróżnia się metody termiczne,
chemiczne lub mechaniczne przez filtrację albo promieniowanie. W zależności od zastosowanej
metody i osiągniętego efektu, można przeprowadzić dezynfekcję lub sterylizację.

1. Sterylizacja, a dezynfekcja
 Dezynfekcja to proces, w wyniku którego w danym środowisku giną formy wegetatywne
mikroorganizmów (zarówno saprofitycznych jak i patogennych). Dezynfekcję przeprowadza
się za pomocą środków chemicznych lub metod fizycznych (temperatura, promieniowanie).
 Sterylizacja to proces, w którym giną wszystkie mikroorganizmy, zarówno formy
wegetatywne jak i przetrwalne.

2. METODY TERMICZNE
Procesy sterylizacji metodami termicznymi wykorzystuje wysoką temperaturę jako czynnik
sterylizujący i może przebiegać w suszarkach, autoklawach lub aparatach Kocha.

Sterylizacja termiczna sucha

 Sterylizacja w suszarkach
 Czynnikiem sterylizującym w suszarkach jest gorące suche powietrze, które powoduje
denaturację białek i kwasów nukleinowych drobnoustrojów.
 W procesie sterylizacji giną formy wegetatywne i przetrwalne mikroorganizmów.
 W suszarce przeprowadza się jałowienie szkła laboratoryjnego (kolby, probówki, pipety,
płytki Petriego), które należy odpowiednio przygotować np. probówki i kolby zakorkować
korkiem metalowym lub z waty, bagietki i pipety owinąć papierem.
 Pipety szklane sterylizuje w specjalnych pojemnikach zwanych tubusami.
 Standardowe parametry wyjaławiania szkła to: 160°C przez 2 godziny lub 180°C
przez 1 godzinę, przy czym czas wyjaławiania odlicza się od momentu osiągnięcia
zadanej temperatury.

 Wyżarzanie – polega na rozgrzaniu w płomieniu palnika ezy lub igły bakteriologicznej aż do

rozżarzenia.

 Opalanie – polega na krótkotrwałym kontakcie płomienia z brzegiem naczynia (kolby lub

probówki) lub narzędziem (np. pinceta).

Sterylizacja termiczna parą wodną

 Sterylizacja przegrzaną parą wodną w autoklawie
 Czynnikiem sterylizującym w autoklawie jest przegrzana nasycona para wodna pod
zwiększonym ciśnieniem, która umożliwia osiągnięcie temperatury powyżej 100°C.
 Przegrzana para wodna powoduje denaturację białek i kwasów nukleinowych oraz
zerwanie wiązań wodorowych w komórkach drobnoustrojów.
 W autoklawach przeprowadza się sterylizację pożywek mikrobiologicznych, narzędzi, jak
również utylizację hodowli.

Opracowanie: D. Gwiazdowska, K. Marchwińska, K. Juś

 Sterylizacja, dezynfekcja

 Warunki sterylizacji zależą od rodzaju materiału. Pożywki jałowi się w temperaturze

121°C przez 20 – 30 min, pożywki zawierające cukry, żelatynę lub inne składniki
wrażliwe na działanie wysokiej temperatury sterylizuje się w temperaturze 117°C, a
materiał zawierający drobnoustroje chorobotwórcze w temperaturze 134°C. Na
skuteczność sterylizacji ma wpływ czas procesu i objętość jałowionego materiału. Im
wyższa temperatura i im mniejsza objętość wyjaławianych podłoży tym krótszy czas
działania czynnika sterylizującego.

 Sterylizacja bieżącą parą wodną w aparacie Kocha

 W aparacie Kocha przeprowadza się sterylizację w atmosferze bieżącej pary wodnej –
tzw. tyndalizację.
 Tyndalizacja polega na trzykrotnym, 30-minutowym ogrzewaniu w temperaturze 100°C
co 24 h.
 Podczas pierwszego jałowienia giną wszystkie formy wegetatywne, natomiast formy
przetrwalne zostają pobudzone do wzrostu, przechodzą w formy wegetatywne i giną w
kolejnym etapie jałowienia. Ostatni, trzeci etap ogrzewania przeprowadza się dla
potwierdzenia pełnej jałowości. W aparacie Kocha przeprowadza się sterylizację pożywek
zawierających termolabilne składniki oraz upłynnianie pożywek mikrobiologicznych.

3. METODY MECHANICZNE
Do metod mechanicznych należy sterylizacja przez filtrację, którą wykorzystuje się najczęściej do
wyjaławiania płynnych pożywek lub ich składników, które są nieodporne na działanie wysokiej
temperatury i mogą zmieniać właściwości fizykochemiczne np. witaminy, aminokwasy, niektóre
cukry czy krew. Metoda ta polega na mechanicznym zatrzymaniu mikroorganizmów na powierzchni
filtra mikrobiologicznego o porowatości mniejszej od średnicy komórek, czyli 0,22 - 0,45 µm. Mogą
to być filtry strzykawkowe bądź zestawy wyposażone w pompę próżniową. Skuteczność procesu
zależy od wielkości mikroorganizmów, ich ładunku oraz od zastosowanego filtra. Proces filtracji
wykorzystuje się często wyłącznie do przefiltrowania termolabilnego składnika, który następnie
dodaje się do sterylnego podłoża mikrobiologicznego.

4. METODY CHEMICZNE
Metody chemiczne polegają na zastosowaniu związków chemicznych do niszczenia drobnoustrojów
chorobotwórczych i saprofitycznych w procesie dezynfekcji. Środki dezynfekcyjne stosuje się do
sterylizacji powierzchni (podłóg, ścian i powierzchni roboczych, maszyn lub ich elementów).
Aktywność biobójcza środków dezynfekcyjnych zależy od rodzaju związku chemicznego, rodzaju
mikroorganizmów, liczebności populacji, a także czynników środowiskowych takich jak temperatura,
pH podłoża, obecność związków organicznych. Substancje wykorzystywane do dezynfekcji powinny
być skuteczne w niskich stężeniach w szerokim zakresie pH, dobrze rozpuszczalne w wodzie,
nieszkodliwe dla ludzi i zwierząt, działać przez określony czas i w odpowiedniej temperaturze, a także
nie powinny niszczyć dezynfekowanych powierzchni
Do dezynfekcji najczęściej stosuje się kwasy i zasady, środki utleniające, sole metali ciężkich,
alkohole, fenole, krezole, aldehydy i czwartorzędowe związki amonowe. Mechanizm ich działania
polega m.in. na:
• uszkodzeniu ściany i błony komórkowej (detergenty, czwartorzędowe związki amoniowe,
kwasy, fenole, zasady),
• denaturacji białek (alkohole, aldehydy, fenole, czwartorzędowe związki amonowe),
• uszkodzeniu kwasów nukleinowych.

Opracowanie: D. Gwiazdowska, K. Marchwińska, K. Juś

 Sterylizacja, dezynfekcja

5. METODY FIZYCZNE – DEZYNFEKCJA PROMIENIOWANIEM

ULTRAFIOLETOWYM
Fale promieniowania UV o krótkiej częstotliwości i największej energii (długość fali 100-280 nm)
powodują zniszczenie kwasów nukleinowych i białek, w wyniku czego dochodzi do zabicia lub
unieszkodliwienia komórek mikroorganizmów. Najbardziej efektywne jest promieniowanie o długości
fali 260 nm, które jest pochłaniane przez zasady purynowe i pirymidynowe oraz promieniowanie o
długości fali 280 nm - pochłaniane przez aminokwasy aromatyczne (tryptofan, tyrozyna,
fenyloalanina). Promieniowanie UV charakteryzuje się słabą przenikliwością i nie przenika przez
zwykłe szkło, dlatego nie wykorzystuje się tej metody do wyjaławiania szkła ani pożywek w
szklanych naczyniach. Sztuczne promieniowanie UV-C jest emitowane przez specjalistyczne
promienniki w lampach bakteriobójczych wykorzystywanych do dezynfekcji i wyjaławiania
pomieszczeń (powietrza, powierzchni) i wody czy opakowań spożywczych. Efekt promieniowania
zależy między innymi od kubatury pomieszczenia, objętości napromienianego powietrza, odległości i
ustawienia lamp UV. Czas oddziaływania promieniowania UV powinien wynosić co najmniej 30 min.

6. WSKAŹNIKI KONTROLI PROCESU STERYLIZACJI

Wskaźniki sterylizacji to materiały/odczynniki chemiczne lub czynniki biologiczne, które mają
potwierdzić skuteczność przeprowadzonego procesu wyjaławiania wsadu przy użyciu określonej
metody sterylizacji.

 Wskaźniki chemiczne
Chemiczne wskaźniki sterylizacji to substancje chemiczne, które zmieniają barwę pod wpływem
działania czynników sterylizujących tj. np. wysokich temperatur lub kombinacji czasu i temperatury.
Są to taśmy, paski lub etykiety bądź też specjalne oznaczenia na materiałach opakowaniowych,
których przebarwienie świadczy o poprawności procesu. Wynik jest widoczny natychmiast po cyklu
sterylizacji.

 Wskaźniki biologiczne
Wskaźniki biologiczne tzw. sporotesty zawierające przetrwalniki bakterii, są najbardziej
wiarygodnymi narzędziami do monitorowania sterylizacji, które wkłada się do urządzenia na czas
wyjaławiania, po czym umieszcza w kolbie z pożywką i inkubuje w odpowiednich warunkach. Wzrost
mikroorganizmów świadczy o nieprawidłowo przeprowadzonym procesie sterylizacji. Na wynik
analizy trzeba poczekać przynajmniej 24 godziny.
• Sporal A –biologiczny wskaźnik kontroli procesu sterylizacji parą wodną w autoklawie. Ma
formę małego paska bibuły nasyconego zawiesiną przetrwalników bakterii z gatunku
Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953. Na brzegu torebki umieszczony jest pasek
będący wskaźnikiem zmieniającym barwę (na brązową) po przebyciu sterylizacji.
• Sporal S – biologiczny wskaźnik kontroli procesu sterylizacji suchym gorącym powietrzem.
Ma postać krążka bibuły nasyconego zawiesiną niepatogennych przetrwalników szczepu
Bacillus subtilis, umieszczonego w papierowej kopercie.

Opracowanie: D. Gwiazdowska, K. Marchwińska, K. Juś

 Sterylizacja, dezynfekcja

Opracowanie: D. Gwiazdowska, K. Marchwińska, K. Juś