[시험용 추출 분말]

(레몬밤)

① beaker 에 레몬밤 50g 와 70% EtOH 1.5L 넣음

② sonicator 30℃ 1 시간씩 3 번 추출 후 농축, 동결건조

③ 레몬밤 추출 분말 5.4g, 총 5g

(오미자)

① beaker 에 오미자 50g 와 70% EtOH 1.5L 넣음

② sonicator 30℃ 1 시간씩 3 번 추출 후 농축, 동결건조

③ 오미자 추출 분말 23.9g, 총 22.6g

[TLC 를 활용한 추출 분말 속 레몬밤 및 오미자 성분확인]

(레몬밤)

① 레몬밤 추출분말 10mg 과 10ml 70% Ethanol 을 섞어 10mg/ml 10mL 레몬밤 시료 제조

② rosmarinic acid 파우더 3.61mg 과 10ml 70% Ethanol 을 섞어 1mM 10mL rosmarinic acid 시료
제조

③ TLC plate 에 레몬밤, rosmarinic acid 각각 5 번 점적 후 전개용매 n-butanol : ethanol : D.W = 4 :

1 : 1 비율로 전개

④ UV lamp 를 사용하여 254nm, 365nm 에서 spot 확인

(오미자)

① 오미자 추출분말 40mg 과 10ml 70% Ethanol 을 섞어 40mg/ml 10mL 오미자 시료 제조

② schisandrin 파우더 4.32mg 과 10ml 70% Ethanol 을 섞어 1mM 10mL 10mL schisandrin 시료
제조

③ TLC plate 에 오미자, schisandrin 각각 5 번 점적 후 전개용매 n-hexane:ethylacetate=5:5 비율로

전개

④ UV lamp 를 사용하여 254nm, 365nm 에서 spot 확인

[레몬밤 HPLC]

1.시료 제조

(레몬밤 시료 1)

① 레몬밤 추출분말 1mg 과 DMSO 1mL 혼합 후 혼합한 시료 0.1mL 에 DMSO 9.9mL 넣어 희석

(레몬밤 시료 2)

① 레몬밤 추출분말 1mg 과 MeOH 1mL 혼합 후 혼합한 시료 0.1mL 에 MeOh 9.9mL 넣어 희석

(rosmarinic acid 시료 1)

① rosmarinic acid 파우더 1mg 과 DMSO 1mL 혼합 후 혼합한 시료 0.1mL 에 DMSO 9.9mL 넣어
희석

(rosmarinic acid 시료 2)

① rosmarinic acid 파우더 1mg 과 MeOH 1mL 혼합 후 혼합한 시료 0.1mL 에 MeOh 9.9mL 넣어
희석

2. 멤브레인을 끼운 실린지에 sample 을 바이알에 각각 1mL 투입 후 분석

[레몬밤, 오미자 ABTS]

1. 시료 제조

(레몬밤 시료 제조)

① 레몬밤 추출분말 4mg 과 70% EtOH 4mL 혼합하여 1mg/mL 4mL 레몬밤 시료 제조 제조

② 1mg/mL 레몬밤 시료 2mL 와 70% EtOH 2mL 혼합하여 0.5mg/mL 4mL 레몬밤 시료 제조

③ 0.5mg/mL 레몬밤 시료 1mL 와 70% EtOH 4mL 혼합하여 0.1mg/mL 5mL 레몬밤 시료 제조

④ 0.1mg/mL 레몬밤 시료 2mL 와 70% EtOH 2mL 혼합하여 0.05mg/mL 4mL 레몬밤 시료 제조

⑤ 0.05mg/mL 레몬밤 시료 1mL 와 70% EtOH 4mL 혼합하여 0.01mg/mL 5mL 레몬밤 시료 제조

(오미자 시료 제조)

① 오미자 추출분말 4mg 과 70% EtOH 4mL 혼합하여 1mg/mL 4mL 오미자 시료 제조 제조

② 1mg/mL 오미자 시료 2mL 와 70% EtOH 2mL 혼합하여 0.5mg/mL 4mL 오미자 시료 제조

③ 0.5mg/mL 오미자 시료 1mL 와 70% EtOH 4mL 혼합하여 0.1mg/mL 4mL 오미자 시료 제조

④ 0.1mg/mL 오미자 시료 2mL 와 70% EtOH 2mL 혼합하여 0.05mg/mL 4mL 오미자 시료 제조

⑤ 0.05mg/mL 오미자 시료 1mL 와 70% EtOH 2mL 혼합하여 0.01mg/mL 4mL 오미자 시료 제조

(ABTS 용액 제조)
① ABTS 파우더 36mg 과 D.W 10mL 혼합하여 7mM 10mL ABTS 제조

② potassium persulfate 파우더 6.62mg 과 D.W 10mL 혼합하여 2.45mM 10mL potassium persulfate
제조

③ 7mM ABTS 7mL 와 2.45mM potassium persulfate 7mL 혼합하여 16 시간동안 반응시킨 후 사용

④ 반응시킨 ABTS*를 흡광도 0.7 에 근접하도록 70% EtOH 을 사용하여 희석

(L-ascorbic acid)

① 2Mm L-ascorbic acid 1.25mL 와 70% EtOH 3.75mL 혼합하여 500μM 5mL L-ascorbic acid 제조

2. e-tube 에 시료와 ABTS*를 1:9 비율로 넣고 30 분 암실

- P-control = 500μM L-ascoebic acid 0.15mL + ABTS* 1.35mL

- N-control = 70% ETOH 0.15mL + ABTS* 1.35mL

- sample = 레몬밤 1mg/mL, 0.5mg/mL, 0.1mg/mL, 0.05mg/mL, 0.01mg/mL | 오미자 1mg/mL,

0.5mg/mL, 0.1mg/mL, 0.05mg/mL, 0.01mg/mL + ABTS* 1.35mL

3. 96-well plate 에 P-control, N-control, 각 농도의 sample 에서 100μL 옮긴 후 734nm 파장에서

흡광도 측정

[레몬밤, 오미자 DPPH]

1. 시료 제조

(레몬밤 시료 제조)

① 레몬밤 추출분말 4mg 과 70% EtOH 4mL 혼합하여 1mg/mL 4mL 레몬밤 시료 제조 제조

② 1mg/mL 레몬밤 시료 0.1mL 와 70% EtOH 9.9mL 혼합하여 0.01mg/mL 10mL 레몬밤 시료 제조

③ 0.01mg/mL 레몬밤 시료 1mL 와 70% EtOH 4mL 혼합하여 0.002mg/mL 5mL 레몬밤 시료 제조

④ 0.002mg/mL 레몬밤 시료 1mL 와 70% EtOH 4mL 혼합하여 0.0004mg/mL 5mL 레몬밤 시료 제조

⑤ 0.0004mg/mL 레몬밤 시료 1mL 와 70% EtOH 4mL 혼합하여 0.00008mg/mL 5mL 레몬밤 시료
제조

⑥ 0.00008mg/mL 레몬밤 시료 1mL 와 70% EtOH 4mL 혼합하여 0.000016mg/mL 5mL 레몬밤 시료
제조

(오미자 시료 제조)

① 오미자 추출분말 4mg 과 70% EtOH 4mL 혼합하여 1mg/mL 4mL 오미자 시료 제조 제조
② 1mg/mL 오미자 시료 2mL 와 70% EtOH 2mL 혼합하여 0.5mg/mL 4mL 오미자 시료 제조

③ 0.5mg/mL 오미자 시료 1mL 와 70% EtOH 4mL 혼합하여 0.1mg/mL 4mL 오미자 시료 제조

④ 0.1mg/mL 오미자 시료 2mL 와 70% EtOH 2mL 혼합하여 0.05mg/mL 4mL 오미자 시료 제조

⑤ 0.05mg/mL 오미자 시료 1mL 와 70% EtOH 2mL 혼합하여 0.01mg/mL 4mL 오미자 시료 제조

(L-ascorbic acid)

① 2Mm L-ascorbic acid 1.25mL 와 70% EtOH 3.75mL 혼합하여 500μM 5mL L-ascorbic acid 제조

2. conical tube 에 시료 0.5mL, DPPL assay 0.3mL, 70% EtOH 3mL 넣고 30 분 암실

- P-control = 500μM L-ascoebic acid 0.5mL + DPPH assay 0.3mL + 70% EtOH 3mL

- N-control = 70% ETOH 3.5mL + DPPH assay 0.3mL

- sample = 레몬밤 0.01mg/mL, 0.002mg/mL, 0.0004mg/mL, 0.00008mg/mL, 0.000016mg/mL |

오미자 1mg/mL, 0.5mg/mL, 0.1mg/mL, 0.05mg/mL, 0.01mg/mL + DPPH assay 0.3mL + 70% EtOH
3mL

3. 96-well plate 에 P-control, N-control, 각 농도의 sample 에서 100μL 옮긴 후 517nm 파장에서

흡광도 측정

[tyrosinase]

1. 시료 및 용액 제조

(pH6.8 100mM Phosphate Buffer 100mL 제조)

① monosodium phosphate 파우더 857.5mg, dibasic sodium phosphate 파우더 404mg 과 D.W
50mL 혼합

② 가라앉은 가루 Vortex 기기를 사용하여 Vortexing 후 D.W 50mL 를 더 넣어 100mL 로 만들어줌

(2mM 10mL L-Dopa)-실험하기 직전에 제조

① L-Dopa 파우더 100.105mg 과 PB 3mL 혼합 후 2mL 더 넣어줌

② 고농도의 L-Dopa 5mL 에서 0.3mL 를 덜고 14.7mL 의 PB 를 넣어줌

(레몬밤 시료 제조)

① 레몬밤 파우더 49mg 과 10mL 의 Ethanol 을 섞어 40mg/ml 레몬밤 시료 제조

② 40mg/ml 시료에서 250μL 를 덜고 Ethanol 9.75mL 을 섞어 1mg/ml 10mL 레몬밤 시료 제조

③ 1mg/ml 시료에서 250μL 를 덜고 Ethanol 9.75mL 을 섞어 25μg/ml 레몬밤 시료 제조

④ 25μg/ml 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 12.5μg/ml 10mL 레몬밤 시료 제조

⑤ 12.5μg/ml 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 6.25μg/ml 10mL 레몬밤 시료 제조

⑥ 6.25μg/ml 시료에서 5ml 를 덜고 Ethanol 5ml 을 섞어 3.125μg/ml 10ml 레몬밤 시료 제조

⑦ 3.125μg/ml 시료에서 5ml 를 덜고 Ethanol 5ml 을 섞어 1.5625μg/ml 10ml 레몬밤 시료 제조

(오미자 시료 제조)

① 오미자 파우더 10mg 10mL 의 Ethanol 을 섞어 1mg/ml 오미자 시료 제조

② 1mg/ml 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 500μg/ml 10mL 오미자 시료 제조

③ 500μg/ml 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 250μg/ml 10mL 오미자 시료 제조

④ 250μg/ml 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 125μg/ml 10mL 오미자 시료 제조

⑤ 125μg/ml 시료에서 5ml 를 덜고 Ethanol 5ml 을 섞어 62.5μg/ml 10ml 오미자 시료 제조

(gomisin A 시료 제조)

① gomisin A 파우더 4.325mg 과 10mL 의 Ethanol 을 섞어 200μM gomisin A 시료 제조

② 200μM 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 100μM 10mL gomisin A 시료 제조

③ 100μM 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 50μM 10mL gomisin A 시료 제조

④ 50μM 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 25μM 10mL gomisin A 시료 제조

⑤ 25μM 시료에서 5ml 를 덜고 Ethanol 5ml 을 섞어 12.5μM 10ml gomisin A 시료 제조

(rosmarinic acid 시료 제조)

① rosmarinic acid 파우더 0.036g 과 10mL 의 Ethanol 을 섞어 10mM rosmarinic acid 시료 제조

② 10mM 시료에서 1mL 를 덜고 Ethanol 9mL 을 섞어 1mM 10mL rosmarinic acid 시료 제조

③ 1mM 시료에서 100μL 를 덜고 Ethanol 9.9mL 을 섞어 10μM 10mL rosmarinic acid 시료 제조

④ 10μM 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 5μM 10mL rosmarinic acid 시료 제조

⑤ 10μM 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 5μM 10mL rosmarinic acid 시료 제조

⑥ 5μM 시료에서 2mL 를 덜고 Ethanol 8mL 을 섞어 1μM 10mL rosmarinic acid 시료 제조

⑦ 1μM 시료에서 5mL 를 덜고 Ethanol 5mL 을 섞어 0.5μM 10mL rosmarinic acid 시료 제조

⑧ 0.5μM 시료에서 2mL 를 덜고 Ethanol 8mL 을 섞어 0.1μM 10mL rosmarinic acid 시료 제조

(레몬밤 시료와 오미자 시료 혼합한 시료 제조)

- 25μg/ml 레몬밤 시료 + 200μg/ml 오미자 시료

① 500μg/ml 오미자 시료에서 2mL 를 덜고 Ethanol 3mL 을 섞어 200μg/ml 5mL 오미자 시료 제조

② 25μg/ml 레몬밤 시료 1mL 와 200μg/ml 오미자 시료 1mL 혼합하여 시료 제조

-25μg/ml 레몬밤 시료 + 12.5μg/ml 오미자 시료

① 125μg/ml 오미자 시료에서 1mL 를 덜고 Ethanol 9mL 을 섞어 12.5μg/ml 10mL 오미자 시료 제조

② 25μg/ml 레몬밤 시료 1mL 와 12.5μg/ml 오미자 시료 1mL 혼합하여 시료 제조

- 1.5625μg/ml 레몬밤 시료 + 200μg/ml 오미자 시료

① 1.5625μg/ml 레몬밤 시료 1mL 와 200μg/ml 오미자 시료 1mL 혼합하여 시료 제조

- 1.5625μg/ml 레몬밤 시료 + 12.5μg/ml 오미자 시료

① 1.5625μg/ml 레몬밤 시료 1mL 와 12.5μg/ml 오미자 시료 1mL 혼합하여 시료 제조

[0.5mM Arbutin 용액 10Ml 제조]

① Arbutin 파우더 1.36mg 과 10mL 의 PB 용액 혼합

(Mushroom Tyrosinase 제조)

① tyrosinase 9.3mg 과 PB 2.1mL 를 혼합하여 12500μ/mL 제조

② 250μ/mL 인 tyrosinase 용액을 제조하기 위해선 12500μ/mL:PB=1:49 이기 때문에 12500μ/mL 를

0.02mL, PB 를 0.98mL 를 혼합하여 250μ/mL tyrosinase 용액 제조

③ 위 방법으로 10 개를 미리 제조 후 냉동보관, 남은 12500μ/mL tyrosinase 용액도 냉동보관

④ 만들어 놓은 시약을 해동해서 사용하고, 더 필요한 경우 12500μ/mL tyrosinase 용액을 해동하여

다시 희석 후 사용

2. 96-well microplate 에 다음과 같이 넣고 37℃, 20 분 동안 Incubation

※ PB, sample, tyrosinase, DOPA 순으로 시약 처리

N-C01 N-C1 P-C01 P-C1

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

Arbutin - - 40 μL 40 μL

Tyrosinase - 40 μL - 40 μL
 Buffer 40 μL 40 μL -

Ethanol 40 μL 40 μL

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

1.5625 μg/ml 3.125 μg/ml 6.25 μg/ml

S01 S1 S02 S2 S03 S3

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

레몬밤 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tyrosinas
- 40 μL - 40 μL - 40 μL
e

Buffer 40 μL - 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

12.5 μg/ml 25μg/ml

S04 S4 S05 S5

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

레몬밤 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tyrosinase - 40 μL - 40 μL

Buffer 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

6.25 μg/ml 12.5 μg/ml 25 μg/ml

S01 S1 S02 S2 S03 S3

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

오미자 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL
Tyrosinas
- 40 μL - 40 μL - 40 μL
e

Buffer 40 μL - 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

50 μg/ml 100 μg/ml

S04 S4 S05 S5

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

오미자 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tyrosinase - 40 μL - 40 μL

Buffer 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

1.5625μg/ml 레몬밤 1.5625μg/ml 레몬밤

+ 12.5μg/ml 오미자 + 200μg/ml 오미자

S01 S1 S02 S2

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

레몬밤+오미자 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tyrosinase - 40 μL - 40 μL

Buffer 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

25μg/ml 레몬밤 + 25μg/ml 레몬밤 +

12.5μg/ml 오미자 200μg/ml 오미자

S03 S3 S04 S4
 L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

레몬밤+오미자 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tyrosinase - 40 μL - 40 μL

Buffer 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

6.25 μM 12.5 μM 25 μM

S01 S1 S02 S2 S03 S3

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

gomisin A 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tyrosinas
- 40 μL - 40 μL - 40 μL
e

Buffer 40 μL - 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

50 μM 100 μM

S04 S4 S05 S5

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

gomisin A 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tyrosinase - 40 μL - 40 μL

Buffer 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

0.1 μM 0.5 μM 1 μM

S01 S1 S02 S2 S03 S3

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

 rosmarini
40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL
c

Tyrosinas
- 40 μL - 40 μL - 40 μL
e

Buffer 40 μL - 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

5 μM 10 μM

S04 S4 S05 S5

L-Dopa 120 μL 120 μL 120 μL 120 μL

rosmarinic 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tyrosinase - 40 μL - 40 μL

Buffer 40 μL - 40 μL -

200 μL 200 μL 200 μL 200 μL

3. 10 분간 incubation 후 생성된 Dopachrome 의 양을 475nm 에서의 흡광도 측정

4. 측정한 흡광도를 이용하여 저해율을 구하고 다음 공식을 이용하여

IC50(저해율의 50%가 되는 농도) 구함

[제품 제작]

1. 토너 제조

① 오미자 추출 분말 40mg 과 D.W 10mL 혼합하여 4mg/mL 10mL 제조

② 레몬밤 추출 분말 10mg 과 D.W 10mL 혼합하여 1mg/mL 10mL 제조

③ 오미자 시료와 레몬밤 시료를 각각 하나의 통에 담아줌

④ 각 용액이 담긴 통에 헥산디올 8mL 과 글리세린 20mL 를 넣어줌

⑤ 정제수를 400mL 가 될 때까지 넣어줌 (최종 시료 농도: 오미자 100μg/mL, 레몬밤 50μg/mL)

2. 토너 pH 측정

① pH 교정용액 (pH 4, pH 7, pH 10)을 사용하여 오차확인 후 토너에 TEA(Triethanolamine)을 넣어

pH 가 5.5~5.8 되도록 맞춰줌
3. 토너 멸균

① 병에 토너를 담은 후 뚜껑을 살짝 덮은 다음 호일로 감싸줌

② Autoclave 에 넣고 Autoclave 뚜껑을 완전히 닫아줌

③ 온도, 기압, 멸균시간을 설정

④ 멸균이 끝난 후 기압이 다 떨어지면 꺼내줌

4. 패트가 들어있는 용기에 담아 완성