Chương 1:

1. Định nghĩa của enzyme

- Enzyme là chất xúc tác sinh học. Chúng được tạo ra trong các tế bào sống.
- Chúng làm tăng tốc độ phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống, và nó không bị phá hủy hay biến mất sau phản
ứng.
- Các chất tham gia phản ứng được xúc tác bởi enzyme được gọi là cơ chất.
2. Cách gọi tên enzyme
- Tên thông thường: trypsin, pepsin, renin…
- Tên hệ thống: tên cơ chất đặc hiệu của nó + tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác+ đuôi “ase”.
• ví dụ enzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid) có tên hệ thống là Carbamid-aminohydrodase (tên
thường dùng là urease).
3. Phân loại enzyme
- Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa-khử dehydrogenase, oxydase, cytochromreductase
và peroxydase
- Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị methyltransferase, phosphatransferase,
acyltransferase
- Hydrolase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân glycoside hydroxylase, nuclease
- Lyase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tọ thành nối đôi hoặc kết hợp phân
tử nước vào nối đôi aldehyde lyase, adenylyl cyclase, guanylate cyclase
- Isomerase các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa maleate isomerase, furylfuramide isomerase,
triose-phosphate isomerase
- Ligase xúc tác phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng ATP argininosucciate synthase, chelatase,
DNA ligase
4. Thành phần hóa học của enzyme
Chia thành 2 nhóm:
- Nhóm enzyme đơn cấu tử: Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo từ một thành phần hóa học
duy nhất là protein. Những enzyme được tạo thành chỉ từ protein duy nhất được gọi là enzyme đơn cấu tử.
- Nhóm enzme đa cấu tử: Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme có 2 thành phần:
+ Apoprotein hay apoenzyme: Phần protein thuần
+ Agon: Phần thứ 2 là thành phần không phải protein. Phần này thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò
thúc đẩy quá trình xúc tác.
- Một phức hợp hoàn chỉnh gồm cả apoenzyme và coenzyme được gọi là holoenzyme. Coenzyme trực tiếp tham gia
phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác và làm tang độ bền của apoenzyme đối
với các yếu tố gây biến tính.
- Còn apoenzyme có tác dụng nâng cao hoạt tính xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme. Các
coenzyme thường là các dẫn xuất của accs vitamin hòa tan trong nước.
5. Cấu trúc của enzyme
- Cấu trúc bậc 1: Enzyme bao gồm các chuỗi axit amin được liên kết bằng liên kết peptide, tạo thành chuỗi tuyến
tính được gọi là cấu trúc bậc 1.
- Cấu trúc bậc 2: Ngoài cấu trúc bậc 1, các axit amin trong chuỗi tương tác với nhau, chủ yếu thông qua liên kết
hydro. Sự tương tác này dẫn đến sự hình thành cấu trúc thứ cấp của enzyme, phổ biến là chuỗi xoắn alpha hoặc
phiến gấp nếp Beeta. Trong cấu trúc xoắn alpha, chuỗi protein cuộn quanh chính nó, trong khi ở phiến gắp Bêta,
nó gấp tới lui. Đây là cấu trúc không gian cục bộ.
- Cấu trúc bậc 3: Là dạng cuộn lại trong không gian của toàn chuỗi polypeptide, tạo thành hình dạng chung của một
chuỗi polypeptide.
- Cấu trúc bậc 4: Các enzyme có cấu trúc bậc bốn là enzyme oligomer hoặc polymer do nhiều đơn vị nhỏ cấu tạo
nên được gọi là protomer (tiểu phần dưới đơn vị), mỗi đơn vị nhỏ là một chuỗi polypeptide. Các protomer: giống
hoặc khác nhau về cấu tạo và chức năng. Các tiểu phần tương tác với nhau bằng các kiểu liên kết kỵ nước, liên kết
hydrogen, một số khác nhờ liên kết disulfide
 Cấu trúc dị lập thể: Trung tâm dị lập thể là vị trí thứ 2 trên phần tử enzyme mà các cơ chất (chất allosteric) khi kết
hợp vào vị trí này không chuyển hóa tạo thành sản phẩm mà chỉ làm thay đổi cấu trúc của phân tử enzyme cũng
như cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme. Tính chất: Thay đổi cấu trúc của enzyme theo 2 chiều hướng. Tăng
khả năng hoạt động của enzyme: điều hòa dương. Giảm khả năng hoạt động của enzyme: điều hòa âm.
6. Đặc điểm của enzyme
 Đặc điểm hóa học
- Có hoạt tính mạnh: Ở điều kiện thích hợp, hầu hết các phản ứng có sự xúc tác của enzyme đều diễn ra với tốc độ
nhanh.
- Có tính đặc hiệu cao: Đa số enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối, chỉ xúc tác cho một cơ chất nhất định.
- Có sự phối hợp hoạt động giữa các enzyme: Trong tế bào, enzyme hoạt động theo kiểu dây chuyền, sản phẩm
phản ứng của enzyme trước là cơ chất của enzyme sau.
- Enzyme có sự định khu trong tế bào: Enzyme có thể ở dạng hòa tan trong tế bào chất hoặc được định khu trong
các bào quan.
- Hầu hết các enzyme có nguồn gốc tự nhiên đều không độc.
- Enzyme chịu sự tác động của một số yếu tố: Nhiệt độ, pH, áp suất,… Mỗi enzyme hoạt động tối ưu trong những
điều kiện nhất định, ở những môi trường không thích hợp, enzyme sẽ mất hoạt tính.
 Đặc điểm axit-bazo
- Tổng điện tích của một phân tử protein phụ thuộc vào mức độ phân ly của các nhóm ion hóa, do đó phụ thuộc vào
pH.
- Enzyme sẽ tích điện dương tại mức pH thấp và tích điện âm tại mức pH cao. Giá trị pH tại đó protein không tích
điện được gọi là điểm đẳng điện pI.
- Enzyme có hoạt tính xúc tác khi nhóm cạnh bên được ion hóa ở dạng thích hợp, do đó hoạt động xúc tác của
enzyme phụ thuộc vào pH
 Độ hòa tan
- Nồng độ muối: thấp -> tăng độ hòa tan, cao -> giảm độ hòa tan
- pH:
• quá cao hay thấp -> biến tính -> giảm độ hòa tan.
• pI -> kết tụ enzyme
- Nồng độ dung môi hữu cơ ethanol, aceton -> giảm độ hòa tan
- Nhiệt độ: tăng ở 40-50oC. Nếu cao hơn -> giảm độ hòa tan.
7. Đặc hiệu enzyme
Mỗi enzyme chỉ xúc tác chuyển hóa được một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất
định, được gọi là tính đặc hiệu của enzyme.
• Đặc hiệu kiểu phản ứng
+ Enzyme chỉ xúc tác cho một loại phản ứng nhất định
• Đặc hiệu theo cơ chất
- Đặc hiệu tuyệt đối: Enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chất xác định và chỉ xúc tác cho
phản ứng ấy mà thôi
- Đặc hiệu nhóm/cấu trúc: Các enzyme chỉ tác dụng lên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên
kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở phần liên kết chịu tác dụng
- Đặc hiệu liên kết: Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà
không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó
- Đặc hiệu quang học: Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất
 Thuyết “ổ khóa và chìa khóa”
Các trung tâm hoạt động thường được hình thành sẵn ở các enzyme. • Tương tác giữa E và S tạo thành phức hợp
ES giống như quan hệ của ổ khóa và chìa khóa (hình dạng của E và S bổ sung cho nhau), -> enzyme nào chỉ xúc tác
cho đúng cơ chất đó. -> Giải thích được tính đặc hiệu tuyệt đối của E, nhưng không giải thích được tính đặc hiệu
tương đối của E
 Thuyết “khớp cảm ứng”
 TTHĐ của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác động cảm ứng của cơ chất • Có thể biến đổi về cấu hình không
gian trong quá trình tương tác với S sao cho phù hợp với S, để có thể tạo thành phức hợp ES.
8. Cơ chế phản ứng
- Để một phản ứng có thể xảy ra, phân tử tham gia va chạm phải có đủ năng lượng để vượt qua hàng rào thế năng
còn gọi là năng lượng hoạt hóa.
- Năng lượng hoạt hóa là năng lượng tối thiểu cần thiết để hình thành trạng thái chuyển tiếp từ các chất tham gia
phản ứng.
- E làm giảm năng lượng hoạt hóa bằng cách kết hợp với S để hình thành trạng thái chuyển tiếp khác có mức năng
lượng thấp hơn so với trạng thái chuyển tiếp của phản ứng không có sự tham gia của chất xúc tác . Vì thế E làm gia
tăng vận tốc phản ứng . Sau phản ứng , E lại hồi phục về trạng thái ban đầu để tiếp tục xúc tác.
- Quá trình tạo thành phức ES và sự biến đổi phức này thành sản phẩm thường xảy ra qua 3 giai đoạn:
• E gắn với S bằng các liên kết yếu (tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác Van der Waals) tại TTHĐ tạo phức
ES không bền. Phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp.
• Các nhóm chức năng của các gốc amino acid trong TTHĐ tương tác với S, xảy ra sự biến đổi S, -> sự kéo căng và
phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng -> S được hoạt hóa, dễ dàng tham gia phản ứng hơn.
• Sự tách P ra khỏi vị trí gắn, đồng thời E được giải phóng ở dạng tự do.
9. Động học enzyme
- Động hóa học là môn khoa học nghiên cứu về tốc độ phản ứng và các nhân tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng và
cơ chế của phản ứng hóa học
- Tốc độ phản ứng là đại lượng đặc trưng cho diễn biến nhanh hay chậm của một phản ứng. Nó được đo bằng độ
biến thiên nồng độ chất phản ứng trong một đơn vị thời gian
- Định luật tác dụng khối lượng (Guldberg và Waage, 1867): tốc độ của phản ứng tại mỗi thời điểm tỷ lệ thuận với
tích số nồng độ của các tác chất.
10. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme.
 Ảnh hưởng của [E] và [S]
- Nồng độ enzyme: tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ enzyme khi điều kiện của phản ứng không đổi
và cơ chất bão hòa.
- Nồng độ cơ chất: tốc độ phản ứng tăng khi nồng độ cơ chất tăng cho đến khi phản ứng đạt đến vận tốc cực đại
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
- thấp -> bất hoạt.
- T0 opt : mức nhiệt độ mà tại đó enzyme đạt được hoạt tính cao nhất (~37-40oC).
- T > t0 opt -> biến tính
 Ảnh hưởng của pH
- pH: mỗi enzyme có một giá trị pHopt tại đó enzyme đạt hoạt tính tối đa.
Ví dụ, pHopt của pepsin, pancreatic lipase, salivary amylase lần lượt là 1,5-2 (acidic); 7.5-8 (alkaline); 6.8 (slight
acidic).
- Khi pH thay đổi -> làm giảm tốc độ của hoạt động enzyme
 Ảnh hưởng của thời gian
- Ban đầu, tốc độ phản ứng tăng
- Sau đó tốc độ phản ứng giảm do:
(1) sự giảm nồng độ cơ chất;
(2) sự tích lũy sản phẩm cuối;
(3) sự thay đổi pH của phản ứng, tạo ra giá trị pH mới khác biệt với giá trị pH tối thích của enzyme ở thời điểm ban
đầu
 Ảnh hưởng của các chất khác
- Nồng độ của coenzyme: Đối với những enzyme có coenzyme, sự tăng nồng độ của coenzyme làm tăng tốc độ phản
ứng của hoạt động enzyme. •
- Nồng độ của các chất hoạt hóa ion kim loại: Sự tăng nồng độ của các chất hoạt hóa ion kim loại làm tăng tốc độ
hoạt động enzyem. Nhiều enzyme được kích hoạt bởi các ion kim loại như là ion cloride kích hoạt salivary
amylase, ion Ca2+ kích hoạt thrombokinase.
- Sự hiện diện của các chất kìm hãm làm giảm hoặc mất hoạt tính enzyme
 Chất kìm hãm
- Các chất kìm hãm là những chất làm giảm tốc độ của phản ứng được xúc tác bởi enzyme.
- Chất kìm hãm thuận nghịch (reversible inhibitor) gắn vào enzyme theo phương thức thuận nghịch và có thể được
loại bỏ bằng thẩm tích để tái tạo hoạt tính enzyme hoàn toàn. Kìm hãm cạnh tranh, phi cạnh tranh, không cạnh
tranh, hỗn hợp.
- Chất kìm hãm không thuận nghịch (irreversible inhibitor) không bị loại bỏ ra khỏi phân tử enzyme bằng thẩm tích
(do sản phẩm của phản ứng hoặc do cơ chất thừa)
11. Đơn vị đo hoạt độ
- Đơn vị IU (đơn vị quốc tế) : là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa 1 micromol cơ chất sau thời gian một
phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1IU = 1 μM cơ chất (10-6 M / phút)
- Đơn vị katal (kat): là lượng enzyme có khả năng xúc tác 1 mol cơ chất sau thời gian 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 kat = 1 Mol cơ chất / giây
1IU = 1/60 x 10-6 kat = 16,67 nkat.
- Hoạt độ riêng : được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ enzyme trên đơn vị khối lượng protein. IU hoặc kat / 1 mg
(ml) protein
- Hoạt độ phân tử (hoạt độ riêng phân tử) : được biểu diễn bằng số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân
tử enzyme sau một đơn vị thời gian (thường là phút).
- Hoạt độ tâm xúc tác: là số phân tử cơ chất bị chuyển hóa bởi trung tâm hoạt động sau 1 phút.
Chương 2:
1. Nguồn nguyên liệu
 Nguồn động vật
TỤY TẠNG:
- Lipase, trypsin, chymotrypsin.
- Làm mềm da, khử các vết nứt, sản xuất các chế phẩm dịch tụy y học, thực phẩm…
DẠ DÀY:
- Pepsin A, B, C, D; gastrisin; celulase; renin.
- Công nghệ sản xuất pho mát
CÁC LOẠI NỘI TẠNG KHÁC:
- Gan, tim lợn để tách aspartat – glutamat aminotransferase
- Huyết tương để tách trombia (protein chống đông máu)
 Nguồn thực vật
CÂY ĐẬU RỰA:
HỌ DỨA:
- Bao gồm các loại dứa trồng lấy quả, lấy sợi
- Thủy phân protein cơ và mô liên kết, làm mềm thịt
NHỰA ĐU ĐỦ:
- Mủ của quả đu đủ xanh
- Thủy phân protein, làm mềm thịt
Nhược điểm của nguồn động, thực vật
- Chu kỳ sinh trưởng dài
- Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được.
- Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn
các chế phẩm
 Nguồn vi sinh vật
- Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh.
- Enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao.
- Hệ enzyme của VSV rất phong phú.
- VSV thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp.
- Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất.
VI KHUẨN:
- α-amylase, β-amylase từ Bacillus ứng dụng trong tinh bột
- protease từ Bacillus ứng dụng trong tẩy rửa
NẤM SỢI
- Lipase, Catalase, Lactase
NẤM MEN
- Invertase từ Saccaromyces ứng dụng trong mứt kẹo
- Lipase từ Candida ứng dụng trong thực phẩm
2. Quy trình sản xuất chế phẩm enzyme
- Sinh tổng hợp enzyme
- Thu nhận enzyme: phá vỡ tế bào, tách enzyme, cô đặc enzyme
- Tinh sạch enzyme
- Hình thành công thức chế phẩm enzyme
a. Sinh tổng hợp enzyme
Các dạng chế phẩm enzyme
 Chế phẩm thô
o Chế phẩm thô từ canh trường lỏng
o Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt
 Chế phẩm kỹ thuật: Là chế phẩm đã được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzyme tạp chất đã được
tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa hỗn hợp một vài enzyme chủ yếu.
 Chế phẩm enzyme tinh khiết: trong chế phẩm này đã loại bỏ hoàn toàn các protein và enzyme tạp, chỉ còn lai duy
nhất một enzyme mong muốn. Các chế phẩm này chỉ dùng trong y học, nghiên cứu khoa học và phân tích.
Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme
- pH: pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7 ± 2).
- Nhiệt độ: cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (0 0C đến 5 0C)
- Tránh tạo bọt
- Không dùng các dụng cụ dao kéo dụng cụ xay đã han rỉ
- Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, ethanol để kết tủa enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp.
- Cần phải làm thí nghiệm nhanh (mẫu càng mới hoạt tính cao)
- Giữ nhiệt độ và pH của các thành phần tham gia phản ứng ổn định trong khi thực hiện phản ứng
- Sử dụng pipette đúng cách để lấy lượng enzyme thật chính xác
- Tránh đánh rơi nguồn enzyme tạp vào mẫu
- Cần bảo quản chế phẩm enzyme ở nhiệt độ thấp hoặc sấy chân không hoặc đông khô để bảo quản trong thời gian
lâu hơn.
b. Thu nhận enzyme: phá vở tế bào, tách enzyme, cô đặc enzyme
Thu nhận enzyme ngoại bào
- Ly tâm lạnh: Ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa
- Lọc: Lọc ép (thể tích nhỏ), lọc chân không, lọc theo dòng chảy cắt ngang
Thu nhận enzyme nội bào - Phá vỡ tế bào
 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lý
 Phương pháp nghiền với bột thủy tinh hoặc thép
- Khi huyền phù tế bào được lắc cùng với hạt bằng thủy tinh hoặc bằng thép nhỏ (đường kính khoảng 0,2 – 1,0
mm) thì tế bào sẽ bị phá vỡ do lực cắt của chất lỏng cao và do va chạm với các hạt này.
 - Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme tùy thuộc vào vận tốc lắc, kích cỡ của hạt và đường kính của thiết bị.
- Nhược điểm của phương pháp là làm tăng nhiệt và mức tiêu thụ năng lượng, vì vật cần phải thiết kế các thiết bị
làm lạnh thích hợp.
 Phá vỡ bằng rotor-stator mill
- Thiết bị gồm phần tĩnh ở dưới và phần động là rotor hình nón cụt ở phía trên.
- Tốc độ quay của rotor là 10000 đến 50000 vòng.
- Dịch huyền phù của tế bào được cho vào từ khoảng trống nhỏ giữa phần động và phần tĩnh.
- Dịch sau khi phá vỡ được đây ra ngoài do quá trình ly tâm cũng như tốc độ phá vỡ cao tạo ra do không gian giữa
phần động và phần tĩnh.
- Thiết bị này được sử dụng phổ biến cho các đối với tế bào động thực vật.
 French press
- Thiết bị gồm một ống hình trụ tròn khớp với một pittong đã được kết nối với bộ phận ép.
- Dịch huyền phù tế bào được đặt giữa pittong và ống trụ tròn.
- Ống trụ tròn có một lỗ kết nối với vòi được gắn trên đĩa, tại đây dịch được ép với vận tốc lớn ra ngoài qua vòi
phun.
- Thể tích của thiết bị từ vài ml đến vài trăm ml. Áp suất hoạt động 10000 đến 50000 psig.
 Siêu âm
Nguyên tắc:
- Sóng siêu âm tạo nên hiện tượng sủi bong bóng khi tần số âm thanh đủ lớn để tạo nên vô số các vi bọt tại các
vùng tập trung sinh khối trong chất lỏng.
- Các bọt sẽ lớn lên trong pha giãn và xẹp đi trong pha nén của sóng âm thanh. Việc xẹp bóng bọt sẽ chuyển năng
lượng âm thanh thành năng lượng cơ học ở dạng các sóng gây sốc tương ứng với áp suất hàng ngàn atm (300
MPa).
- Năng lượng này sẽ có tác dụng phá vỡ tế bào. Ngoài ra, các vi dòng có các gradient vận tốc lớn cũng tăng khả
năng phá vỡ tế bào.
• Quá trình phát sóng siêu âm có thể liên tục hoặc không liên tục.
• Tần số phổ biến sử dụng là 25 kHz
• Sự phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm phụ thuộc vào loại tế bào, thể tích mẫu và nồng độ tế bào.
• Đối với tế bào vi khuẩn như E. coli, sử dụng 30-60 giây cho thể tích mẫu nhỏ. Đối với nấm men 2-10 phút.
• Ưu: đơn giản, phổ biến, hữu ích ở quy mô nhỏ. Nhược: sinh nhiệt gây biến tính enzyme.
 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp hóa học
 Chất tẩy rửa
Nguyên tắc: Trong điều kiện pH, nhiệt độ, lực ion xác định, các chất tẩy rửa phá vỡ cấu trúc của màng tế bào bằng
cách hòa tan phospholipid.
- Các hóa chất này được sử dụng chủ yếu để phá vỡ tế bào động vật.
- Đối với vk, sử dụng chất tẩy rửa kết hợp với lysozyme.
- Đối với tế bào nấm mốc, thành tế bào phải được làm yếu trước khi sử dụng chất tẩy rửa.
- Có thể phân chất tẩy rửa làm 3 loại: cationic, anionic (natri laurysulfat) và non-ionic.
+ Chất tẩy rửa non-ionic (Triton – X hay Tween series) được ưa chuộng vì chúng ít gây tổn thương đến protein và
DNA. Triton x – 100 sử dụng riêng rẽ hoặc cùng với các chất khác như guanidine – HCl được dùng để trích ly các
enzyme liên kết màng rất có hiệu quả
- Hạn chế: một lượng lớn protein bị biến tính hay kết tủa cần được loại bỏ ra khỏi sản phẩm
 Dung môi hữu cơ
- Nguyên tắc: hoạt động chủ yếu lên màng tế bào bằng cách hòa tan phospholipid và biến tính các protein gắn trên
đó.
- Một vài loại dung môi như toluene có thể phá vỡ thành tế bào.
- Hạn chế (tương tự với chất tẩy rửa): cần loại ra từ sản phẩm và gây biến tính protein. So với chất tẩy rửa, dung
môi dễ bay hơi nên dễ được loại bỏ hơn.
 Xử lý kiềm
 - Nguyên tắc: Xử lý kiềm ở pH giữa 11,5 và 12,5 sẽ làm thủy phân màng tế bào và do đó sẽ giải phóng enzyme.
- Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho các enzyme bền trong môi trường kiềm ít nhất trong khoảng 20 – 30
phút. Người ta thường dùng phương pháp này để trích ly asparaginase từ Erwinia chrysathemi.
 Sốc thẩm thấu
- Nguyên tắc: tao ra sự khác biệt về nồng độ chất tan xuyên qua màng bán thấm. màng tế bao là màng bán thấm
và sự chuyển tế bào đột ngột từ môi trường đẳng trương (isotonic) sang môi trường nươc (nhược trương –
hypotonic) khiến nước tràn nhanh vào tế bào, kết quả làm thể tích tế bào bị phồng to và sau đó bị vỡ.
- Phương pháp này dùng chủ yếu cho tế bào động vật có vú. Với tế bào vi khuẩn và nấm, thành tế bào cần được
làm yếu trước khi bị phá vỡ bằng phương pháp sốc thẩm thấu.
- Phương pháp này được sử dụng để loại bỏ các chất ở khoang chu chất (chủ yếu là protein) từ tế bào mà không
cần sử dụng phương pháp phá vỡ vật lý.
 Lysozyme
Nguyên tắc: Lysozyme thường thủy phân lên kết β – (1,4) – glucosid của các peptidoglucan vốn tạo ra độ cứng cho
tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Lysozyme thường được liên kết với EDTA để tạo phức với canxi sẽ làm
giải phóng các lipopolysaccarit và phá hủy tế bào.
- Phá vỡ thành tế bào chủ yếu là vi khuẩn Gram dương.
- Sử dụng một mình lysozyme không thể phá vỡ được tế bào vì nó không phân giải được màng plasma  kết hợp
giữa lysozyme và một chất tẩy rửa thường hay được sử dụng (tác dụng lên cả thành và màng tb).
- Lysozyme có trong nước bọt, lòng trắng trứng.
- Lysozyme từ lòng trắng trứng là enzyme dung giải duy nhất có thể sử dụng ở quy mô thương mại.
- Hạn chế: • chỉ áp dụng được ở quy mô nhỏ do các điều kiện thao tác kinh tế và giá thành lysozyme cao, đồng
thời cần loại lysozyme ra khỏi sản phẩm, hiện diện của các enzyme khác như protease trong mẫu.
Phương pháp cô đặc
- Làm tăng hoạt tính enzyme trong một khối dung dịch enzyme.
- Làm giảm chi phí và công sức và chi phí cho việc xử lý sau này.
- Tăng khả năng bảo quản enzyme.
- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản.
- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất.
 Kết tủa
Có 2 loại kết tủa: kết tủa âm và kết tủa dương.
- Kết tủa âm là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ không nằm trong phần tủa.
- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần tủa, còn protein tạp nằm trong
phần dung dịch
 Kết tủa phân đoạn bằng muối (NH4 )2SO4
- Nguyên tắc: mỗi protein có một khoảng nồng độ muối mà tại đó protein enzyme sẽ bị kết tủa hoàn toàn (khoảng
nồng độ muối tích).
- Cách tiến hành: Thêm vào dịch có chứa enzyme một lượng thể tích muối trung tính bão hòa hoặc một lượng
muối trung tính dạng rắn để có một độ phần trăm bão hòa nào đó của muối này
- Có thể dùng: (NH4 )2SO4 , Na2SO4 , MgSO4 ... (NH4 )2SO4 là tốt nhất vì an toàn, rẻ và phổ biến.
- Ưu điểm: đơn giản, dễ thu nhận chế phẩm enzyme
- Nhược điểm: cần loại bỏ muối (thẩm tích, sắc ký lọc gel)
 Kết tủa dùng dung môi hữu cơ
- Nguyên tắc: giảm hằng số điện môi của dung dịch làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein làm cho
các phân tử protein liên hợp tạo thành kết tủa
- Mỗi enzyme được kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau.
- Ưu điểm: không cần loại muối, và một số dung môi có thể chưng cất và thu hồi lại được.
- Nhược điểm: dễ làm vô hoạt enzyme,  tiến hành nhanh ở nhiệt độ thấp; chế phẩm có màu.
- Phương pháp này thường được sử dụng cho các enzyme ít bị biến tính bởi dung môi hữu cơ, và ít được dùng ở
quy mô lớn, do chi phí cao, dễ gây cháy nổ.
 Kết tủa đẳng điện
- Một protein enzyme thường kết tủa ở điểm đẳng điện (pI) vì ở pI các phân tử enzyme có tổng điện tích bằng 0
(không có lực đẩy tĩnh điện), nên các phân tử enzyme sẽ kết hợp với nhau tạo ra kết tủa.
- Có thể kết tủa đẳng điện enzyme quan tâm cũng như các enzyme và protein tạp khác -> Tiến hành lọc và li tâm
để thu hoặc loại bỏ các kết tủa
c. Tinh sạch enzyme
Xác định mục tiêu
Lựa chọn phương pháp phù hợp đảm bảo thu nhận lượng enzyme tinh sạch lớn với hoạt tính cao, đảm bảo tính
kinh tế (chi phí thấp, thời gian ngắn)
+ Xác định mức độ tinh khiết cần đạt được của sản phẩm
+ Xác định nguồn tạp nhiễm quan trọng
+ Xác định bản chất của các nguồn tạp nhiễm còn lại ngay khi có thể.
+ Nguồn tạp nhiễm ảnh hưởng đến protein đích cần được loại bỏ đầu tiên (protease)
+ Mức độ tinh sạch càng cao càng tốt
Xác định đặc điểm của enzyme đích và nguồn tạp nhiễm
Mục đích: để lựa chọn phương pháp tinh sạch phù hợp và tránh làm bất hoạt enzyme trong suốt quá trình tinh
sạch
 Kích thước
 pI
 Tính kỵ nước
 Độ hòa tan
 Độ bền pH
 Độ bền nhiệt
 Ion
Ổn định nhiệt độ Cần làm việc nhanh ở nhiệt độ thấp
Độ pH ổn định Lựa chọn dung dịch đệm để chiết và tinh chế
Lựa chọn điều kiện trao đổi ion, sắc kí ái lực và sắc kí pha đảo
Độ ổn định của dung môi Lựa chọn điều kiên cho sắc ký pha đảo
hữu cơ
Yêu cầu chất tẩy rửa Xem xét ảnh hưởng của các bước sắc kí và nhu cầu loại bỏ chất tẩy rửa. Cân nhắc
lựa chọn chất tẩy rửa
Muối (cường độ ion) Lựa chọn điều kiện cho kĩ thuật kết tủa, trao đổi ion và sắc ký tương tác kị nước
Các yếu tố đồng thời cho sự Lựa chọn chất phụ gia, pH, muối, chất đệm
ổn định hoặc hoạt động
Độ nhạy protease Cần loại bỏ nhanh protease hoặc bổ sung chất ức chế
Độ nhạy với ion kim loại Cần them chất đệm EDTA hay EGTA
Độ nhạy oxy hóa khử Cần them chất khử
Trọng lượng phân tử Lựa chọn phương tiện lọc gel
Tính chất điện tích Lựa chọn điều kiện trao đổi ion
Ái lực đặc hiệu sinh học Lựa chọn phối tử cho môi trường ái lực
Biến đổi sau khi dịch mã Lựa chọn môi trường có ái lực đặc trưng cho nhóm
Tính kị nước Lựa chọn môi trường sắc kí tương tác kỵ nước

 Sắc ký lọc gel

- Nguyên tắc: phân đoạn một số hỗn hợp protein theo khối lượng phân tử của chúng.
- Pha tĩnh là các hạt gel chứa đầy trong cột (trơ, bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. không có tính đàn
hồi và ưa nước) -> sephadex, polyacrylamide
 Sắc ký trao đổi ion
• Nguyên tắc: dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme.
- Nhựa trao đổi ion cationit
 - Nhựa trao đổi ion anionit
Quá trình phân tách trên cột gồm 2 giai đoạn:
a) Hấp phụ thuận nghịch protein – enzyme cần tinh sạch vào nhựa trao đổi ion.
b) Khử hấp phụ các protein đã hấp phụ bằng cách:
- Thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi ion hóa, do đó thay đổi điện tích tổng của protein.
- Tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh. Các protein enzyme nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất
sẽ bị đẩy ra ngoài trước tiên và ngược lại.
 Sắc ký ái lực
- Nguyên tắc: dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch của một enzyme với một phân tử khác (phối tử),
đã được gắn bằng liên kết cộng hóa trị vào một chất mang không hòa tan chứa trong cột.
- Khi cho hỗn hợp protein chứa enzyme cần phân tách đi qua thì chỉ có enzyme quan tâm bị giữ lại. Tiếp đó,
enzyme sẽ được rửa giải bằng các phương pháp khác nhau.
• Kháng thể gắn kháng nguyên
• Niken- His tag
• GST tag (Glutathione-S-tranferase) ái lực cao với Glutathione
 Sắc ký ái lực- chất mang
- hoàn toàn không hòa tan trong pha động.
- có độ bền về hóa học và sinh học.
- có độ cứng cơ học, có tính háo nước, tính thấm.
- không có các tương tác đặc hiệu.
- có chứa các nhóm chức có khả năng biến đổi khi hoạt hóa trong điều kiện nhẹ nhàng.
-> polyacrylamide, polystyrên, cross-linked dextran, agarose Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu
 Rửa giải enzyme
Dung dịch đệm rửa giải thường phải:
- Có chứa một phối tử (tự do) của enzyme có khả năng cạnh tranh với phối tử đang ở trạng thái liên kết với
enzyme. Phối tử cạnh tranh sau đó được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tích.
- Dùng pH để gây biến tính thuận nghịch enzyme do đó làm biến dạng tâm hoạt động của enzyme.
 SK ái lực
- Ưu: đơn giản, hiệu quả cao, tinh sạch trong thời gian ngắn
- Nhược: giá thành đắt
d. Phát triển phương pháp phân tích
Mục tiêu: theo dõi tiến độ tinh sạch, đánh giá hiệu quả trong từng bước (hoạt tính sinh học, hiệu suất thu hồi), từ
đó tối ưu hóa quá trình tinh sạch.
- Loại và lượng dung môi
- Lượng mẫu nạp vào (capacity)
- Độ phân giải (resolution)
- Phân đoạn nào chứa enzyme
 Tạo sản phẩm enzyme
Chế phẩm enzyme có thể tạo thành các loại sản phẩm sau: enzyme dạng dung dịch, enzyme dạng huyền phù,
enzyme dạng bột khô, enzyme dạng viên nhỏ.
- Enzyme dạng dung dịch hay huyền phù có nhược điểm là rất khó bảo quản. Do đó, người ta phải đưa chúng vào
dung dịch bảo quản và giữ ở nhiệt độ thấp ổn định.
- Enzyme dạng bột khô hoặc ở dạng viên nhỏ: thường dễ bảo quản và khả năng bảo quản rất lâu.