TEMA 7: REACCIONS AMB MÉS D’UN SUBSTRAT

REACCIONS AMB MÉS D’UN SUBSTRAT

Iden fiquem diferents pus de reaccions amb més d’un substrat (nosaltres ens fixarem en les bisubstrat)

NOTACIÓ DE CLEAND

Aquesta és la notació per descriure una reacció i és un acord al que s’ha arribat que permet esquema tzar les
reaccions amb més d’un producte i més d’un substrat. En aquesta sempre s’indica el sen t de la reacció i les
constants (generalment a la dreta la d’entrada i a l’esquerra la de sor da).

REACCIONS BISUBSTRAT

En quant a les reaccions bisubstrat cal diferenciar que tenim aquelles que segueixen un mecanisme seqüencial
i aquelles que no el segueixen:

Mecanismes seqüencials

Mecanisme seqüencial ordenat

En aquest mecanisme hi ha un orde de manera que la interacció sempre requereix la fixació d’un substrat i quan
aquest ho ha fet el segon ja pot interaccionar. Seguidament, es produeix la transformació i els productes també
són alliberats de forma seqüencial i ordenada. L’enzim lliure està reconeixent el substrat A i és l’únic que pot
fixar per tant, si seguim la reacció en el sen t invers sabem que l’enzim només pot reconèixer el producte Q ja
que el lloc del centre ac u on interacciona el primer substrat (A) correspon al lloc on queda ubicat el substrat
Q.
Un exemple d’aquest mecanisme és el que segueix la lactat deshidrogenasa ja que per poder elaborar la reacció
primerament necessita que l’enzim interaccioni amb el NADH reduït per tal que, més tard, el piruvat pugui
interaccionar amb el centre ac u.

Mecanisme seqüencial estadís c o a l’atzar

En aquest cas l’enzim no segueix un orde, es a dir, la interacció amb el substrat no té

cap requisit i per tant, tampoc existeix el requisit amb els productes. L’enzim
interacciona per igual amb el substrat A i B.

Un exemple d’aquesta reacció és la crea na quinasa:

Mecanisme de doble desplaçament o “ping pong”

La caracterís ca d’aquest pus de mecanisme és que no hi ha complex ternari,

en cap moment trobem la forma Enzim – substrat A – substrat B.

Durant el mecanisme primer interacciona de forma específica un dels substrat i aquest, normalment transfereix
na part de la molècula que queda fixada en l’enzim de forma transitòria i s’allibera el primer producte.
Generalment això provoca la modificació de l’enzim, que interacciona amb el segon substrat per donar lloc a
l’altre producte.

Un exemple d’aquesta reacció és la que segueix l’enzim

aspartat aminotransferases: primerament interacciona
el primer substrat, un aminoàcid que serà desaminat,
sabem que el grup amino de l’aminoàcid que s’està
desaminant transitòriament quedarà unit a l’enzim, al
seu grup prostè c (piroxalat) i seguidament s’alliberarà
el primer producte, el resultat d’aquesta transaminació
de l’aspartat, que és l’oxaloacetat el que permetrà que
entri el segon substrat per alliberar el segon producte.
TRACTAMENT MATEMÀTIC I ANÀLISI DE LA GRÀFICA

Equacions pels diferents mecanismes

Mesurar velocitats inicials en absència de producte

Tenint en compte les premisses anteriors (equacions) i sabent que elaborem l’anàlisi cinè c en l’estat estacionari,
en el qual no hi ha producte (per facilitat els càlculs) podem trobar els paràmetres cinè cs d’una reacció de pus
bisubstrat.

Mecanisme seqüencial ordenat

Si treballem a una concentració molt gran d’un dels substrats (suposem que és B) i dividim l’expressió de
velocitat entre aquesta concentració el que tenim és el que obtenim si treballem experimentalment de manera
que podem treballar a concentracions constants d’un substrat per anar variant l’altre. Aquest estudi ens permet
arribar a la equació de la velocitat però no ens dóna cap pus d’informació sobre el mecanisme.

Mesurar velocitats inicials en presència de producte

Mecanisme seqüencial ordenat

En aquest cas treballem a concentracions variables tant del substrat A com del B i per tant, el número
d’experiments és més elevat. Podem representar pel substrat A tota la cinè ca d’aquest en funció de
concentracions constants de B anomenades B1, B2, B3... de manera que ob ndrem diferents velocitats.
Si representem la concentració de A en funció de la velocitat observarem que a mesura que augmenta la
concentració de B també augmenta la velocitat de la reacció, és a dir, arribem a velocitats majors.

El que farem és reordenar l’expressió de la velocitat per poder calcular les constats i per tant, obtenir informació
sobre el mecanisme. Par nt de l’expressió general (mostrada adalt) el que farem és reordenar el denominador
amb aquells termes relacionats amb la concentració de A per elaborar un tractament algebraic (dividir l’equació
entre K b +[B]). Arribem a una expressió de la velocitat relacionada amb una concentració de substrat A variable
m

per tant, al treballar a diferents concentracions de B constants observo diferents valors de velocitat màxima,
que depenen de la concentració de B i per tant, observarem una Vmax aparent (que depèn de la concentració
del substrat fix i de la km) i una Km aparent (que depèn només de la concentració de substrat fix).

En aquest pus d’assaig, per cada mesura individual tenim informació de Vmax, [b], Kmb, Kma, Kia que es
mantenen constants durant l’assaig.

Representació dels inversos

Si per aquests resultats elementals elaborem la representació de Lineweaver – Burk (representació dels inversos)
observem que quan tenim un mecanisme Bi-Bi seqüencial ordenat obtenim que els ajustos a les rectes dels
punts experimentals a diferents concentracions del substrat B ens donen rectes que per una banda ens
conflueixen en l’eix d’ordenades en diferents posicions (la interacció i el pendent de les rectes depèn de [B]).

Quan tenim una concentració [B2]>[B1] el que veiem és que l’invers de la velocitat és més gran quan la
concentració del substrat fix és més pe t i per tant, la recta de [B1] ndrà un invers de la velocitat major. El
quocient entre Km/Vmax, que ens determina el pendent de la recta, depèn de la concentració de substrat fix
(que està en el denominador) i per tant, com més gran és aquesta concentració més pe t és el pendent de la
recta.
Així doncs obtenim una sèrie de rectes que interaccionen en un punt i per tant, tenen inversos de velocitats
aparents diferents i també quocients de Km/Vmax diferents (pendent). En aquests casos podem dir que l’enzim
es comporta segons un mecanisme bi-bi seqüencial ordenat. Cal tenir present però que aquest comportament
també l’observarien en el cas d’un mecanisme bi – bi seqüencial estadís c.

Representació secundària

A par r de la cinè ca anterior també podem elaborar representacions secundàries i obtenir tots els paràmetres
cinè cs de la reacció. Arribem a una reordenació dels termes de l’equació de Michaelis – Menten on el primer
terme ens indicarà el pendent i el segon l’ordenada a l’origen, ja que és l’equació d’una recta:

Com que acabem de veure que en funció de la concentració de substrat B a la que treballem tenim diferents
pendents i ordenades a l’origen el que podem fer és una representació secundària amb tots els punts que tenim:
representarem per separat les ordenades a l’origen i els pendents:

 Representació dels pendents: representem en l’eix (y) els pendents respecte l’invers de la concentració
treballada en l’eix (x). En aquesta representació observem que la intersecció amb l’eix d’ordenades és
Kma/Vmax mentre que el pendent de l’expressió és el primer terme que trobem en l’equació del
pendent (Kia Kib/Vmax)/Vmax.
 Representació de les ordenades a l’origen: representem en l’eix (y) les diferents ordenades en funció
del invers de la concentració de substrat en l’eix (x) de manera que obtenim una recta en que el punt
de tall amb l’eix d’ordenades és 1/vmax i el pendent és Kmb/Vmax.

Observem el següent esquema de les representacions i el que obtenim d’elles. Cal tenir present que de la
primera representació si desenvolupem el quocient del pendent obtenim Kia i si agafem el punt d’intersecció de
cada recta i els dividim obtenim Kma.

En general es un procés que implica elaborar cinè ques en que treballem a concentracions constant d’un
substrat per anar modificant l’altre i tenir totes les possibilitats.
Mecanisme seqüencial estadís c

La equació és del mateix pus que anteriorment de manera que si elaborem la representació dels inversos
ob ndrem un perfil molt similar a l’anterior de manera que no podrem diferenciar per la cinè ca un mecanisme
seqüencial ordenat a un estadís c.

Representació dels inversos

Quan, per mitjà d’altres aproximacions ja sabem que es tracta d’un mecanisme seqüencial estadís c, podem
elaborar les representacions secundaries per calcular els paràmetres cinè cs de la reacció.

Mecanisme de doble desplaçament

Elaborem el mateix estudi que anteriorment, prenem mesures a diferents concentracions d’un substrat (que
està constant) mentre l’altre varia. Si treballem a [B] constant mentre que [A] varia sabem que hem de dividir el
terme de la velocitat entre (Kmb + [b]) tal com veiem:

En reordenar les expressions observem (de Vmax i Km aparents) que el pendent de les rectes és independent
de la concentració de subsrtat B i per tant, a qualsevol concentració
d’aquest la recta de la representació dels inversos ndrà el mateix pendent
i el que variarà serà l’invers de la velocitat màxima. Si elaborem la
representació obtenim un conjunt de rectes paral·leles que no es tallen i
per tant, podem dir que el mecanisme s’ajusta a un mecanisme de doble
desplaçament (en els altres mecanismes les rectes es tallaven).
Representació secundària

També podem elaborar una representació secundària on obtenim:

Anàlisi del mecanisme a par r de la inhibició per producte

A par r de la cinè ca podem iden ficar un mecanisme de doble desplaçament però no podem diferenciar si es
tracta d’un mecanisme seqüencial ordenat o estadís c i per tant, existeixen altres aproximacions, com per
exemple veient l’efecte que produeixen els productes de la recció sobre les velocitats.

Mecanisme seqüencial ordenat

Qualsevol producte de la reacció (quan tenim una reacció que no es troba a velocitats inicials) ens actuarà com
un inhibidor perquè desplaçarà la reacció en sen t contrari. Si tenim en compte que la reacció la podem
entendre com:

Podem analitzar el pus d’inhibició que produeix el producte P o Q al analitza el substrat A o B. Hem de recordar
sempre que quan ordenem el mecanisme el lloc d’interacció del substrat A (que és el primer que entra en la
reacció) correspondrà al lloc de sor da de l’úl m producte de la reacció (Q) perquè la reacció es comporta de
la mateixa forma en un sen t que en l’altre ja que el primer substrat ocuparà una posició rela vament similar a
l’úl m producte.

En un assaig en que treballem a una concentració fixa del substrat B i a una concentració variable del substrat A
podem afegir en el medi producte P. A nivell de la reacció que es produeix sabem que el substrat A interaccionarà
amb l’enzim i provocarà la formació del complex EAB, el que provocarà l’alliberació del producte P. Sabem però,
que en el medi ja tenim producte P i per tant, la dissociació del producte format per la reacció serà menor per
aquesta alteració. Per tant, en presència del producte P sobre el substrat A ens donarà una inhibició del pus
mixte, perquè interacciona en la mateixa posició que el substrat B. Així doncs, en aquelles molècules de l’enzim
en que el producte P interaccioni en la posició corresponent no podrà interaccionar B el que ens donarà dos
efectes: competència entre B i P i menor alliberació de P. Aquests dos efectes provoquen que observem una
inhibició mixte. En el cas de l’efecte del producte Q sobre el substrat A sabem que els dos competeixen per
l’enzim lliure i per tant, observarem una inhibició compe va.

Mecanisme seqüencial estadís c

La presència de qualsevol dels dos productes elabora una competència compe va perquè els productes volen
accedir a l’enzim lliure. Així doncs els productes actuen com inhibidors el que ens permet diferenciar entre un
mecanisme seqüencial ordenat i estadís c en que només trobarem inhibició compe va en el segon cas.
Mecanisme de doble desplaçament

En aquest mecanisme a nivell de la cinè ca ja tenim informació perquè les rectes de regressió eren paral·leles
mentre que els casos anteriors es tallaven. En aquest pus de mecanisme mai hi ha la formació del complex
ternari i es produeix una forma modificada de l’enzim transitòria de manera que aquesta pot ser que interaccioni
amb el substrat B i vaig cap a la formació de productes o bé que interaccioni amb el producte P per retornar a
la situació de l’enzim original.

Si treballem amb el substrat A variable en presència del producte P aquest desplaçarà la reacció cap a l’esquerra
perquè part de l’enzim modificat pot interaccionar amb el producte i generar la reacció contraria, com passava
en el cas anterior de manera que trobarem una inhibició mixte. Si la concentració de substrat A és molt gran
però no observarem inhibició perquè com que interaccionen en la mateixa posició tot estarà ocupat pel substrat
A.

En presència del mateix producte però amb el substrat B observarem una inhibició compe va perquè ambdós
competeixen per la forma de l’enzim modificat i el mateix passa en el cas del substrat A i el producte Q.

Taula resum dels efecte

Intercanvi isotòpic

L’intercanvi isotòpic és un mètode per poder iden ficar en una reacció bisubstrat quin és el mecanisme de la
reacció: seqüencial estadís c o de doble desplaçament.

En l’intercanvi isotòpic el que fem és u litzar substrat o producte que està marcat radioac vament. Cal tenir
present que el marcatge radioac u no afecta als paràmetres cinè cs que estem estudiants ja que tenim el mateix
pus de comportament a la reacció tant si tenim l’àtom marcat o no.

A con nuació veurem dues reaccions que sobre l’esquema de la reacció donen el mateix pus de reacció però
el mecanisme és diferent.

a) Mecanisme de doble desplaçamentSacarosa fosforilasa. La sacarosa fosforilasa trenca la sacarosa

mitjançant una reacció de fosfohidròlisi, de manera que obtenim els dos monosacàrids que la
cons tueixen: la fructosa i la glucosa 1-P. En aquesta reacció intervé el fosfat inorgànic que fa el paper
de l’aigua en una hidròlisi.
 b) Mecanisme seqüencial Maltosa fosforilasa. La maltosa fosforilasa u litza la maltosa i el fosfat
inorgànic per donar glucosa i glucosa 1-P.

Recordem que l’estudi per intercanvi isotòpic parteix de la u lització de compostos marcats radioac vament, la
qual cosa ens permet veure les molècules i fer una quan ficació.

Intercanvi isotòpic. Mecanisme Bi – Bi de doble desplaçament. Exemple: Sacarosa fosforilasa

Per elaborar el experiment afegirem al medi de la reacció: l’enzim sacarosa fosforilasa, sacarosa (reac u) i
fructosa marcada (producte de la reacció). En aquesta primera part de l’experiment no afegim el segon substrat,
és a dir, no afegim fosfat inorgànic. S’ha vist que quan incubem això obtenim sacarosa marcada radioac vament.

Per tant, si obtenim aquest resultat podem determinar que la reacció té un mecanisme de doble desplaçament
ja que pels altres mecanismes que hem vist cal la formació d’un complex ternari, és a dir, hauríem de trobar al
medi de reacció els dos substrats.

Així doncs, quan fem l’assaig, en aquestes condicions d’absència de fosfat inorgànic (segon substrat), el que es
produeix és la interacció del disacàrid amb l’enzim que provoca l’alliberació de fructosa. Com que hi ha un
equilibri entre aquestes reaccions, la fructosa marcada que hi havia lliure en el medi es podrà incorpora en noves
molècules de sacarosa. Si a aquest assaig afegim el segon substrat, s’alliberaria el segon producte ( glucosa 1-P).

També podem elaborar l’assaig par nt de l’úl m producte de la reacció que en aquest cas és la glucosa 1 – P.
Per fer l’experiment, a la barreja de reacció hem de tenir l’enzim sacarosa fosforilasa, G1P i fosfat inorgànic
marcat radioac vament (segon substrat que s’incorpora). En presència de G1P i l’enzim es produirà la formació
de del complex E- Glucosa i si en el medi hi ha Pi marcat es podrà incorporar a aquest complex per mantenir
l’equilibri de les reaccions i formar G1P marcada.

Cal tenir present que aquets resultats només els obtenim en un mecanisme de doble desplaçament i mai no a
un seqüencial ja que necessitem dels dos substrats.

Hem vist que amb l’intercanvi isotòpic, a més de poder determinar si es tracta d’un mecanisme de doble
desplaçament, podem determinar quin dels dos substrats entra abans i quin producte s’allibera primer.
Intercanvi isotòpic. Mecanisme Bi – Bi seqüencial. Exemple: Maltosa fosforilasa

En el cas de la maltosa fosforilasa, per molt que fem el mateix procés que en el cas anterior, no es produirà la
reacció ja que és imprescindible la formació del complex ternari. Amb això podem concloure que el mecanisme
és seqüencial.