TEMA 8: CINÈTICA DELS ESTATS EFÍMERS O FUGAÇOS

ESTAT ESTACIONARI I PRE – ESTACIONARI

En aquest tema veurem l’anàlisi de reaccions enzimà ques a temps molt curts, és a dir, a temps de reacció previs
a l’estat estacionari.

Fins ara hem estat assumint l’estat estacionari que fa referència al moment en el qual la variació de la
concentració del complex ES en el temps es manté constant.

Per tal d’arribar a l’estat estacionari, la reacció passa per un període molt curt on la formació de producte és
molt baixa i que es coneix amb el nom de estat pre – estacionari. Aquest estat ens pot interessar per elaborar
estudis de mecanismes de reacció i de càlcul de constants que fan referència a processos molt ràpids.

MÈTODES DE MESURA DE REACCIONS RÀPIDES

A la imatge veiem les escales de temps en les quals nosaltres podem treballar. Escollirem una o altre en funció
de la Kcat de la reacció. El mètode manual està situat en l’ordre de segons.

Si tenim un enzim amb una Kcat = 1000 s-1 i aconseguim treballar amb una tècnica on l’anàlisi de la reacció sigui
de 1 ms, estaríem per sota de la constant de la reacció i en conseqüència estaríem mesurant els equilibris de
formació de l’enzim lliure i el substrat.

Normalment es treballa en l’ordre de microsegons ja que cal tenir present que els aparells per fer aquestes
mesures són molt cars i moltes vegades no es disposa d’ells.

Esquema general dels sistemes

Trobem diferents pus de tècniques en funció de l’escala amb la qual volem treballar. Tots els sistemes estan
cons tuïts per diferents mòduls que separem en: inici de la reacció ràpida, detecció del canvi en la reacció,
registre del senyal.
Pel que fa al mòdul d’inici de la reacció ràpida en trobem de diferents pus en funció del mètode que emprem
ja que la cubeta de reacció ndrà unes caracterís ques determinades. En trobem:

 Mètodes de flux
 Mètodes de relaxació
 Mètodes de irradiació

El mòdul de detecció s’encarrega d’enregistrar un canvi en les propietats de la nostra barreja de reacció i també
tenim diferents possibilitats per fer-ho:

 Fotometria ja sigui d’absorció, fluorescència, CD o RMN.

 Dispersió de la llum
 Conduc vitat elèctrica

Seguidament trobem un mòdul que registra la senyal i ens permet obtenir uns resultats.

MÈTODES DE FLUX

Els mètodes de flux es basen en mesurar la reacció con s’està produint la formació del complex ES. Aquesta
mesura es produeix pel desplaçament de la barreja de reacció a la càmera de mescla.

Mètode de flux con nu

El mètode de flux con nu no s’u litza molt en l’actualitat però és un dels més fàcils d’entendre. En aquest cas
disposem de dues càmeres, en una tenim l’enzim i en l’altre el substrat. Mitjançant un sistema d’èmbols molt
precís, s’elabora un impuls sobre les dues càmeres de manera que totes dues queden barrejades a la càmera de
mescla. Com a conseqüència de la pressió que s’exerceix, el líquid va avançant sobre el conducte.

Amb aquest sistema el que volem mesurar és la transformació al cap d’un temps de reacció i això ho podem fer
jugant amb la distància a la qual es troba el receptor del tub de sor da.

Hem de tenir present dues coses a l’hora de mesurar transformacions a temps molt pe ts:

 Com que volem treballar a etapes inicials, la concentració d’enzim i de substrat ha de ser semblant.
 En funció si volem veure temps més grans o més curts de reacció, la quan tat d’enzim varia molt. De
manera que si aquest és molt car, fer la mesura serà cara.

Per u litzar aquest mètode hem d’aconseguir que el flux no ngui turbulències ja que sinó la lectura no serà
ní da i les lectures seran errònies.

El temps de reacció es pot definir com:

Si treballem amb un flux d’una velocitat de 10 m/s i a una distància de 1 cm, obtenim que el temps de reacció
és de 1 ms.
Aquest mètode té unes limitacions en quant al temps més curt de reacció al qual podem treballar i això és el
que ens ha portat ha classificar els mètodes en funció del temps que som capaços de detectar. En el mètode de
flux con nu, el temps mort, és a dir, el temps mínim de reacció que podem mesurar està en 0,1 – 0,2 ms. Així
doncs, aquells processos que es produeixen per sota d’aquest temps no es pot detectar. S’es ma que el temps
màxim al qual podem treballar amb aquest detector és de 100ms.

Mètode de flux de ngut

El mètode de flux de ngut té una base similar al mètode de flux con nu. En aquest cas tenim dues xeringues
que contenen l’enzim i el substrat i es diferencia pel fet que hi ha una tercera xeringa que és l’encarregada
d’aturar el flux del líquid de reacció.

Així doncs, aquest mètode és bàsicament igual a l’anterior però varia la forma de mesurar el temps de reacció.
El temps de mort és una mica més elevat, de 0,5 ms.

Mètode d’ex nció (quenched flow)

El mètode d’ex nció és diferent als anteriors ja que en aquest cas no mesurem directament la reacció, és a dir,
en els casos anteriors teníem la mescla de reacció en una càmera i allà fèiem la mesura però, en aquest cas
tenim la barreja de reacció i en el temps establert en el qual volem aturar la reacció el que fem és afegir un
reac u al medi que aturi la reacció. La reacció es pot veure aturada per diversos factors, com ara la inhibició de
l’enzim i es poden fer servir àcids com ara el tricloracè c, sempre i quan no ens afec l’enzim i puguem disposar
del que volem.

L’aturada de la reacció es produeix de manera molt ràpida i aquesta barreja la podem recollir i analitzar
tranquil·lament la formació de productes. El quenched flow té l’avantatge que podem tenir posteriorment la
mostra en les condicions que vulguem, però cal tenir present que el temps mort és molt més elevat que en els
altres casos, d’uns 4 – 5 ms.

MÈTODES DE RELAXACIÓ

Els mètodes de relaxació es basen en dues premisses:

1. Són aplicables només a les reaccions reversibles

2. La mesura la començarem par nt del complex ES en equilibri a unes certes condicions. Fins ara par em
d’enzim i de substrat lliure.
Recordem que l’equilibri d’una reacció depèn de la temperatura, de manera que si la temperatura varia,
l’equilibri també ho farà. Els mètodes de relaxació es basen en això de manera que necessitem aparells que ens
perme n fer canvis de temperatura a temps molt curts que al qual mirem el que passa a la reacció.

A la imatge veiem que al canviar la temperatura, la reacció arriba a un nou equilibri i que aquest canvi és del
pus exponencial. Aquesta zona exponencial es pot linealitzar i coneixent la constant macroscòpica d’equilibri i
el pendent d’aquesta recta linealitzada, podem determinar els constants d’equilibri K1 i K-1.

APLICACIONS DELS MÈTODES

A con nuació veurem de forma senzilla quines aplicacions donen els mètodes que hem vist anteriorment. Per
exemple, a par r d’un comportament cinè c anòmal podem explicar quin és el mecanisme d’una reacció.

Reaccions enzimà ques: fases de “burst” o “lag”

Recordem que a vegades, quan comencem a mesurar la velocitat incial d’una recció a temps molt curts, aquesta
no es comporta com esperem. Pot ser que trobem una etapa amb més pendent (fenomen de burst) o bé amb
menys pendent (fenomen de lag).

El comportament pot ser simplement per un problema de disseny de l’aparell que estem u litzant o també pot
ser degut a un mecanisme seqüencial ordenat. Suposem que el mecanisme de la reacció és del pus seqüencial
però volem determinar si és ordenat o bé estadís c; podem determinar quin dels dos és a par r dels resultats
que obtenim.

Mecanisme seqüencial ordenat

Si elaborem un assaig mitjançant un mètode de flux on tenim en una

de les cambres tenim l’enzim i un dels substrat i en l’altre cambra
l’altre substrat, si el mecanisme és seqüencial ordenat no veurem
reacció fins que no es produeixi la barreja de les dues cambres.

Tot i això, la velocitat de reacció dependrà de quin substrat nguem amb l’enzim a la cambra, és a dir, tenim
dues possibilitats:

 Si a la cambra on tenim l’enzim també hi trobem el primer substrat, ja estarà format el primer complex
ES quan es produeixi la barreja amb l’altre substrat que permetrà formar el complex ternari i així obtenir
producte. En aquest cas el temps de formació de producte serà més pe t ja que una part de la reacció
ja s’havia avançat en la cambra.
  Si a la cambra on tenim l’enzim tenim el segon substrat, aquests no podran interaccionar entre ells fins
que no interaccioni primer el primer substrat que es troba a l’altre cambra. Per tant, el temps de reacció
a par r del qual es comença a formar producte és més gran.

Així doncs, si tenim una reacció amb un mecanisme seqüencial ordenat ndrem temps de reaccions diferents
depenent de com elaborem l’assaig i això ens permetrà diferenciar quin dels dos substrats és el primer.

Mecanisme seqüencial estadís c

Si el mecanisme de la reacció és seqüencial estadís c, ob ndrem el mateix temps de reacció tant si par m de
la barreja de l’enzim amb un substrat o amb l’altre substrat.

“Burst”: determinació de la concentració d’enzim

A par r dels estudis de l’estat pre – estacionari podem estudiar quins són
els mecanismes de la reacció tenint en compte aquells exemples d’enzims
on trobem el fenomen de burst. Aquest fa referència quan mesurem la
quan tat de producte front el temps de reacció i observem dues
pendents, on la primera mostra una connec vitat del sistema molt més
gran que a temps posteriors.

Hi ha diverses raons que poden provocar aquest fenomen de burst:

1. Es tracta d’una reacció on el producte interacciona molt fortament amb l’enzim, és a dir, és un inhibidor
molt potent. En aquestes circumstàncies observarem que la velocitat baixa molt i per tant, la
concentració de substrat també ho fa.
2. El mecanisme de la reacció per l’alliberació de producte és molt lent però, a temps curts de reacció, com
que l’enzim es troba lliure, la velocitat és més elevada.
3. L’enzim reacciona amb el substrat mitjançant un mecanisme de doble desplaçament on la formació del
primer producte és molt més ràpida que la del segon. En conseqüència, la descomposició de
l’intermediari (Segona etapa) és la que limita la velocitat de la reacció.

Anàlisi de la reacció per mètodes de flux. Exemple: quimotripsina

A la imatge següent veiem diferents pus de corbes en funció del moment de la reacció en el qual ens trobem.

 Gràfic 1. Observem quin és el comportament per la quimotripsina, on hi ha un primer pendent que fa

referència a un temps molt ràpid de la reacció i després una estabilització d’aquest pendent, és a dir,
l’estadi estacionari. A la gràfica 2 veiem una extrapolació de la fase estacionària d’aquest cas.
 Gràfic 2. En aquest cas veiem com comença la reacció i a con nuació no hi ha pendent, és a dir, que la
formació de producte es manté constant. Un cop el pendent de la reacció és nul, no ens trobem en estat
estacionari.
Gràcies a aquests anàlisis podem determinar si una reacció es troba en estat estacionari o no i si hi ha diferents
velocitats de reacció.

Reacció catalitzada per la quimotripsina

La quimotripsina és una proteasa i en seu substrat natural són les proteïnes, concretament, reconeix
específicament enllaços pep dics quan trobem aminoàcids hidrofòbics. Per tal d’estudiar la quimotripsina i les
seves propietats, s’u litzen substrats sintè cs que ens permeten analitzar la cinè ca i el seu mecanisme.

Se solen u litzar substrats pe ts on la quimotripsina elabora el mateix mecanisme que amb un substrat natural.
Per fer aquests estudis s’u litzen compostos com ara el p – nitrofenolacetat.

S’ha pogut determinar que la quimotripsina hidrolitza enllaços pep dics mitjançant un mecanisme de doble
desplaçament i per tant, durant el procés de catàlisi hi ha un temps de reacció on l’enzim està unit
transitòriament al producte de la reacció.

Concretament, es forma el complex ES, a con nuació s’allibera el primer producte i queda unit l’enzim amb
l’altre part de la molècula (que serà el segon producte). Quan entra el segon substrat, que en aquest cas és
l’aigua, es pot produir l’alliberació del segon producte.

Considerant aquest model sobre el substrat sintè c veiem que a la primera part de la reacció, el
paranitrofenilacetat es trenca alliberant paranitrofenol i l’enzim que queda transitòriament ace lat. Quan entra
l’aigua, aquesta modificació es desfà alliberant àcid acè c. Aquesta úl ma etapa és la més lenta de tota la
reacció.
Anàlisi de burst en la formació de p – nitrofenolat a par r de p – nitrofenilacetat catalitzada per la quimiotripsina

Hi ha un fet molt important i és que la constant catalí ca de la primera reacció és molt més ràpida que la de la
segona.

Per tant, si nosaltres mesurem el primer producte alliberat, observarem dos pendents diferents. A més, el nivell
de formació de primer producte en l’etapa ràpida depèn de la concentració d’enzim, on a major quan tat, major
pendent.

Això només es pot explicar des del punt de vista cinè c s diem que K1 i K2 són molt més ràpides que K3 i per
tant, quan totes les molècules d’enzim han arribat a formar E – I, l’alliberació del producte dos i per tant d’enzim
lliure per tornar a formar producte 1 és molt més lenta. En conseqüència obtenim que a temps curts, la velocitat
de la reacció va molt més ràpida degut que disposem d’enzim lliure però posteriorment hi ha una limitació
d’aquest.

Aquests anàlisis cinè cs els trobem sobretot associats a altres proves on obtenim que un dels dos processos de
catàlisi és més ràpid que l’altre. En aquests casos, la constant catalí ca fa referència a la segona part del procés
ja que la primera, al ser molt ràpida, no l’apreciem.

Una deducció rela vament simple ens indica quin és o com podem expressar la prolongació de la segona zona
sobre l’eix d’ordenades. A la imatge de la pàgina anterior observem que a major concentració d’enzim, més alt
és el punt d’intersecció. Aquest punt també depèn de les constants K2 i K3, però com que en aquest cas K3<<K2,
podem simplificar el punt d’intersecció (π) com:

Així doncs, el punt d’intersecció ens donarà quina és la concentració d’enzim ac u que tenim a l’assaig.

Exemple d’anàlisi cinè ca per stopped - flow

En aquest pus d’anàlisi cinè ca obtenim que la interacció de l’enzim amb el substrat, és a dir, la formació del
complex ES provoca un canvi en la conformació de l’enzim que afecta a la fluorescència de les rosines o
triptòfans que conté. La formació del complex ES és molt ràpida i per tant no ho podem estudiar amb mètodes
de cinè ca de l’estat estacionari però sí amb mètodes de cinè ca ràpida com aquest.

Així doncs, en aquest cas par m d’un determinat nivell de fluorescència que augmentarà fins al punt de formació
del complex ES.
Mètodes de relaxació. Determinació de constants de la cinè ca de l’estat pre – estacionari. Exemple de reacció
de primer ordre, reversible

Recordem que els mètodes de relaxació s’apliquen a sistemes reversibles on es fa un canvi en la variable de la
temperatura per arribar a un nou equilibri.

Així doncs, par m d’un equilibri inicial en la transformació A ↔B. Quan elaborem un canvi en la temperatura,
es produeix un canvi en l’equilibri i aquest el podem establir en funció de la formació de producte com ∆[B0].
Per tant, les transformacions estan associades a un canvi de temperatura.

Si integrem, arribem a una equació que ens relaciona ∆[B0] amb les constants. Si linealitzem l’equació
exponencial nega va, obtenim una recta on el pendent es defineix com: m = K1 + K-1.