TEMA 4: REACCIONS AMB UN SUBSTRAT

INTRODUCCIÓ

Aquest tema i el següent ens permetran analitzar els enzims des d’un punt de vista quan ta u segons la reacció
que catalitzen.

La cinè ca enzimà ca ens serveix per tenir informació de com es comporten els enzims, per exemple en funció
de les condicions. També ens dóna informació sobre quin és l’efecte d’algunes molècules sobre la reacció, com
és el cas dels inhibidors; això és molt important en el camp del disseny de fàrmacs.

La cinè ca també ens ofereix informació sobre quin és el mecanisme de la reacció tot i que no l’estudi
directament, és a dir, els resultats que obtenim s’han d’ajustar al model del mecanisme que proposem però que
ho compleixi no vol dir que el mecanisme proposat sigui el correcte; en canvi, si les dades cinè ques no s’ajusten
al model, el podem descartar. Així doncs, ens permet descartar mecanismes i ens aporta coneixements per
recolzar el nostre mecanisme tot i que no ho expliqui totalment.

D’acord amb els models que veurem a con nuació, la velocitat d’una reacció dependrà de la constant de
velocitat de l’etapa més lenta. En general, en una reacció enzimà ca es produeix la transformació de l’enzim
substrat a enzim i producte.

Sabem que ndrem una velocitat inicial que dependrà de la concentració de substrat. Aquesta velocitat inicial
pot ser determinada experimentalment a par r dels mètodes que vam veure al tema anterior.

En el model més simple, quan no tenim més intermediaris que ES, la constant catalí ca equival a K2. En canvi, si
tenim més intermediaris Kcat fa referència a la combinació d’aquestes constants. De fet, la constant catalí ca és
una constant macroscòpica que es pot determinar experimentalment però que pot incloure diferents constants
del procés.

Si volem determinar quina és la constant catalí ca el que haurem de fer és conver r l’expressió anterior en una
que es gui en funció dels valors inicials que sí que coneixem ja que la concentració del complex ES no la podem
determinar. Així doncs, en aquest tema veurem desenvolupaments que ens permetran determinar quins són els
paràmetres cinè cs de la reacció.

ORDRE DE LA REACCIÓ

Recordem que els reaccions enzimà ques poden tenir diferents ordres de reacció.

Pel que fa a les reaccions de primer ordre, únicament contribueix un dels substrats a que aquesta es produeixi,
de manera que la velocitat de la reacció únicament dependrà de la constant del procés i de la concentració del
substrat que intervé.
En les reaccions de segon ordre contribueixen els dos substrats de la reacció i aquests poden ser diferents o bé
que hi hagi dues molècules del mateix substrat que siguin necessàries per generar un producte.

En alguns casos podem trobar situacions que s’anomenen de pseudo – primer ordre i que fa referència a
reaccions en les quals, en un sistema biològic, l’aigua par cipa com a substrat. Per exemple, en una reacció
d’hidròlisi tenim dos substrats: l’aigua i el substrat que s’ha d’hidrolitzar. Sabem que en l’estat fisiològic hi ha una
gran quan tat d’aigua i per tant, la que intervé és menyspreable. Així doncs, tot i que en termes cinè cs es tracta
d’una equació de segon ordre, la considerem d’ordre 1.

En el cas de les reaccions d’ordre 0, que trobem en certes condicions, la velocitat de la reacció no depèn de la
concentració de substrat.

CORBA DE PROGRÉS

En els primers estudis que es van elaborar es van adonar, que en general, en una reacció enzimà ca si
representem la velocitat inicial respecte la concentració de substrat obtenim una gràfica que s’ajusta a una
hipèrbole rectangular.

Inicialment es forma el complex enzim substrat (ES) i aquest passa

a formar enzim lliure i producte. Aquesta úl ma transformació té
una constant que es defineix com constant catalí ca.

Quan elaborem un experiment d’aquest pus obtenim que a concentracions molt

elevades de substrat, mantenint constant la concentració d’enzim, la velocitat no
augmenta més i per tant arribem a velocitat màxima.

En aquestes condicions tenim la màxima formació del complex ES i el que limitarà la

velocitat de la reacció serà la velocitat de l’enzim.

Quan estem en aquesta situació, veiem que la velocitat de la reacció és independent de la concentració de
substrat de manera que en condicions saturants de substrat per a l’enzim, la reacció es comporta com una
reacció d’ordre 0. Per una altra banda, si treballem a concentracions de substrat baixes, la velocitat depèn
d’aquestes i per tant es comporta com una reacció d’ordre 1.

Així doncs, en les reaccions enzimà ques, depenent en quin rang de concentració de substrat treballem,
ob ndrem que és d’un ordre o un altre.

EQUACIÓ DE MICHAELIS – MENTEN

La cinè ca vol donar un tractament matemà c de tal manera que les dades experimentals s’ajus n a un model
i així poder interpretar el gràfic d’hipèrbole rectangular. Cal tenir present que el fet que les dades s’ajus n a un
determinat model no implica que aquest sigui correcte, només recolza la idea. Però en canvi, si les dades no
s’ajusten al model sí que vol dir que aquest és erroni.

Model de l’equilibri ràpid

El primer model que es va proposar i que donava una expressió matemà ca pel comportament dels enzims es
basava en uns supòsits. Aquest model és conegut com a model de l’equilibri ràpid.

En aquest model es té en compte que l’equilibri entre l’enzim lliure i el substrat és molt ràpid en el temps, tant
l’associació com la dissociació. Cal tenir present que aquesta premissa no la compleixen tots els enzims i
posteriorment es va elaborar una modificació. Així doncs, el model de l’equilibri ràpid fa referència a una situació
par cular del cas general.

Supòsits del model de l’equilibri ràpid

El model de l’equilibri ràpid té una sèrie de supòsits que s’han de tenir en compte per tal de poder obtenir
l’expressió matemà ca. Entre els quals trobem que:

1. Hem de treballar a concentracions inicials de substrats molt més elevades que la d’enzim. .
2. La concentració de producte format ha de ser aproximadament 0 i en conseqüència hem de treballar
en situacions de velocitat inicial. Aquest fet ens aporta avantatges ja que simplifica el moment.
3. La formació del complex ES és molt ràpida i es manté en el temps ja que tant la formació de ES com la
seva dissociació són processos molt ràpids.
4. El pas de producció de producte des del complex ES (𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃) és molt més lent que la formació de
substrat a par r del complex ES (𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑆). Així doncs K-1 és molt més gran que K2 (K-1>> K2). Recordem
que aquesta premissa no sempre es compleix ja que això és un cas par cular.

Expressió matemà ca per a l’equilibri ràpid

Donada la següent reacció que està catalitzada per un enzim, E:

Per tal de poder calcular la velocitat de la reacció que està en funció de una constant i la concentració del
complex ES, la expressarem en funció d’altres paràmetres que sí que puguem de terminar ja que [ES] no es pot
determinar.
Un cop hem trobat una forma d’expressar [ES] a par r d’altres paràmetres que coneixem, ho subs tuïm a
l’equació de la velocitat.

Arribem a obtenir una equació en la qual la velocitat depèn de la concentració d’enzim inicial que és coneguda
ja que l’afegim nosaltres.

Si la concentració de substrat és molt gran, és a dir, si ens trobem en condicions de velocitat màxima, sabem
que [𝐸𝑆] = [𝐸0] i per tant: 𝑣𝑚𝑎𝑥 = 𝐾2[𝐸0].

Veiem que a l’equació trobem Ks en comptes de Km i això és degut que no hem ngut en compte la K-2 ja que
suposàvem que aquesta reacció era molt més ràpida que la de K2. Cal tenir present que en algunes condicions
la Km la podem equiparar a la Ks, però no sempre.

Modificació de l’equació de Michaelis – Menten per Briggs – Haldane. Model de l’estat estacionari

Van haver-hi estudis que demostraven que la reacció amb una K2 no era més lenta que la que tenia K-1 i en
conseqüència es va fer una modificació de l’equació proposada per Michaelis – Menten, aquesta modificació
es va elaborar per Briggs – Haldane.

La modificació va consis r en introduir un supòsit més ampli que es compleix en la majoria de casos: l’estat
estacionari. La [E] i, per tant, [ES] són molt més pe tes en comparació a [S]. La variació de ES és pràc cament
insignificant durant el període inicial de la reacció, si exceptuem el breu període en el qual es forma ES.
L’estadi estacionari correspon a un període de la reacció enzimà ca on la velocitat de formació del complex ES
es correspon amb la velocitat de producció de E+P.

Supòsits del model de l’estat estacionari

1. A la fase inicial de la corba de progrés de la reacció, v0, es considera únicament la formació de ES com a
intermediari. La concentració total d’enzim ve donada per l’expressió: [E0] = [Ef]+[ES].
2. [S]>> [E]. La formació d’ES inicial no disminueix significa vament la [S]. Per tant [SF] (substrat lliure) ≈
[S0] (substrat total).
3. A la fase inicial de la corba de progrés [P] ≈ 0 i la disminució de [S] és mínima. A l’inici de la reacció hi ha
una etapa molt curta de formació del complex ES (burst, pre-steady state), seguida d’una fase en la que
ES es manté constant degut al balanç entre la velocitat de formació i de trencament.
a. Quan un mira amb tècniques més o menys complexes, com evoluciona una reacció enzimà ca
el que veu és que par m d'un punt de par da on la concentració de substrat és molt més gran
a la de un producte i també que la d’enzim. Durant la reacció, en aquestes condicions, hi ha un
temps curt al començament que és conegut com estadi pre estacionari i fa referència al temps
de formació del complex ES.
4. A la fase de l’estat estacionari, quan treballem sota aquestes condicions, la concentració del complex ES
es manté constant ja que tot i que una part passi cap a la formació de producte, aquesta va sent
subs tuïda per nou complex ES. Així doncs, hi ha un temps llarg de la reacció que tot i haver-hi formació
de producte s’observa que [ES] és constant.

Expressió matemà ca pel model de l’estat estacionari

Donada la reacció següent:

La concentració del complex ES, [ES], depèn per una banda de la velocitat de formació del complex (definida per
k1 i la concentració d’enzim i substrat lliure) i per una altra banda de la velocitat d’eliminació del complex
(definida per k-1 i k2).
Arribem a una expressió de [ES] que està en funció de paràmetres que coneixem. D’aquesta manera si subs tuïm
a la equació de la velocitat podem arribar a l’equació de Michaelis – Menten.

Aquesta equació es diferencia de l’anterior en la constant del denominador ja que

aquí tenim Km en lloc de Ks. La Km coincideix amb la Ks en aquelles reaccions en les
quals K2<< K-1, i per tant K2 es pot menysprear.

El supòsit de l’equilibri ràpid és un cas par cular en relació al cas general de l’estat
estacionari on K-1 >> K2. En aquestes condicions:

Vmax és el valor que s’obté quan l’enzim actua a valors de [S] molt superiors a Km. Si [S] >>km es pot menysprear
en el denominador i per tant, V0 = Vmax.

Informació con nguda a la gràfica de velocitat inicial v0 en funció de [S]

1. [S] molt pe ta. Km >> [S0]

Quan la concentració de substrat és molt pe ta, el seu valor en el denominador és

menyspreable. Si la concentració d’enzim es manté constant, la V0 de la reacció és
proporcional a [S] i en conseqüència la reacció és d’ordre 1.

2. [S0]=Km

Recordem que la Km té sempre unitats de concentració de substrat i la podem determinar

experimentalment sabent que fa referència a la concentració en la qual tenim la meitat
de la velocitat màxima.

Vmax i Km són els paràmetres que defineixen el sistema; per una banda, Km és una constant que és independent
de la concentració d’enzim; per una altra banda, la Vmax varia en relació a [E], a major concentració, major
velocitat. En aquest cas la reacció respecte de [S] és de ordre intermedi, entre 0 i 1.

3. [S] molt elevada. [S0] >> Km

En aquesta situació obtenim que la velocitat inicial és independent de la concentració de substrat i en

conseqüència s’iguala a la velocitat màxima. En aquestes condicions es comporta com una reacció d’ordre 0.

Quan la concentració de substrat és molt elevada, la velocitat és proporcional a la concentració d’enzim. Si

representem la concentració de producte format en funció de [E0]·t, obtenim una recta en la qual el pendent fa
referència a K2.
Reaccions enzimà ques amb més d’un complex intermediari enzim – substrat

En reaccions enzimà ques amb més d’un complex intermediari, si treballem amb els supòsits de l’estat
estacionari, observem que el sistema es simplifica una mica ja que no hem de considerar K-2 ni K-3. En aquestes
condicions, [ES] i [EP] es mantenen constants.

La velocitat de formació de P és igual a la velocitat de desaparició d’EP ja que K3 és molt ràpida

La fórmula final és també la d’una hipèrbola rectangular i el que varia és el significat dels paràmetres cinè cs.

Kcat i Km estan mul plicats pel factor K3/K2+K3 que és sempre inferior a la unitat, Per una altra banda, Kcat i Km
aparent seran sempre inferiors a K2 i Km, respec vament.

Quan K2<<K3, es pot eliminar del denominador i per tant Kcat=K2 i Km= Km app.