TEMA 6: CINÈTICA ENZIMÀTICA: INHIBICIÓ

Fins ara hem estudiat la transformació de substrat a producte en reaccions catalitzades per enzims. En aquest
tema veurem que hi ha molècules que sense par cipar directament en el mecanisme de catàlisi, la seva
presència en el medi de reacció fa que l’enzim es gui inhibit, és a dir, que la reacció vagi a una velocitat inferior.

FUNCIONS DE LA INHIBICIÓ ENZIMÀTICA

La inhibició enzimà ca té una gran diversitat de funcions, entre les quals destaquem:

 La inhibició de l’ac vitat dels enzims és un dels sintemes de regulació més importants pel bon
funcionament de l'organisme. Recordem que l’ac vitat de l’enzim s’ha d’ajustar a les necessitats
biològiques de les cèl·lules.
 Els inhibidors ens permeten, a nivell cinè c, diferenciar entre diferents mecanismes enzimà cs.
 La inhibició ens permet obtenir informació sobre l’estructura de l’enzim i el seu centre ac u. Els podem
fer servir a l’hora de resoldre la estructura tridimensional de l’enzim, de manera que la seva localització
ens donarà informació sobre aquesta.
 Es pot u litzar en aplicacions clíniques ja que sabem que una part molt important dels fàrmacs són
inhibidors d’ac vitats enzimà ques.
 També es poden u litzar en aplicacions industrials on la major part dels herbicides són inhibidors
enzimà cs.

INHIBICIÓ PER EXCÉS DE SUBSTRAT

Quan parlem d’inhibició no parlarem de la pèrdua d’ac vitat enzimà ca per una desnaturalització ja que aquest
no és un efecte caracterís c de la inhibició enzimà ca.

En ocasions, el producte de la reacció pot actuar disminuint la velocitat de la reacció, és a dir, el propi producte
pot actuar com a inhibidor. Quan analitzem la velocitat de la reacció en funció de la concentració de substrat,
veiem que en determinats casos en comptes d’haver-hi una estabilització de la velocitat, en velocitat màxima,
es produeix una davallada.

Aquesta disminució pot ser deguda a la presència de llocs alterna us al centre ac u que trobem en el propi
enzim i que tot i tenir una afinitat menor pel substrat, si la [S] és molt elevada, el substrat es podrà fixar en
aquests centres. Així doncs, si es produeix aquesta interacció es forma un compost terciari que té una menor
velocitat que el complex binari.

Per tant, podem tenir una inhibició per producte o bé per substrat. Però, el que realment ens interessa són les
inhibicions elaborades per molècules diferents a R o P.
INHIBIDORS REVERSIBLES I IRREVERSIBLES

Trobem tres grans grups d’inhibidors que podem diferenciar en: reversibles, irreversibles i de fixació forta.

Inhibidors reversibles

Reversibles --> formació del complex enzim- inhibidor depèn de la concentració d’inhibidor que hi ha en el medi.
CO major sigui la concentració, més desplaçada estarà la reacció cap a les molècules inhibides.

 Aquest sistema com que es un equilibri, funciona ràpidament i és revesible

 A nivell experimental, podem aiilar l’inhibidor in vitro per diàlisi, dilució, gel filtració, etc.
 Tots aquells farmacs que s'agrupen sota 21

Inhibidors irreversibles

Irreversibles queden units de manera covalentment a l'enzim

 El proces 'inhibició és cinè c

 Generalment, la inhibició sol ser més lenta i en principi no pot er rever t. En situacions biològiques
només es reverteix l’ac vitat, sinte tzant enzim de nou.
 Exemple: fàrmacs que actuen per disminuir la resistència dels bacteris en els an biò cs.

Inhibidors de fixació forta

 Aquest pus d’inhibidors d’entrada no s’uneixen covalentment a l'enzim, però l’afinitat és tan forta que
pràc cament es comporten com irreversibles. --> Ki molt pe tet
 En aquests casos, com que la fixació és tan forta , tot i que disminuim la concentració d'inhibidor no es
reversible la reacció. En situacions biològiques es podrà rever r l'ac vitat si se sinte tza enzim de nou.
 Exemple: proteases que actuen sobre el virus Hiv

INHIBICIÓ REVERSIBLE

La inhibició reversible és un procés on la quan tat d'enzim inhibit depèn de la concentració d’inhibidor ja que
es tracta d’un equilibri. Quan nosaltres estudiem la inhibició reversible podem determinar diferents opcions:

1. Inhibició compe va

En el cas de la inhibició compe va, l’inhibidor únicament es pot unir a l’enzim lliure. Així doncs, totes aquelles
molècules que formin el complex ES ja no es podran unir a l’inhibidor. En la inhibició compe va, el substrat i
l’inhibidor competeixen per unir-se al centre ac u de l’enzim. La constant d’inhibició es defineix com KI.
 2. Inhibició acompe va

La inhibició acompe va, l’inhibidor només es pot unir al complex ES. La constant d’inhibició en aquest cas es
I
defineix com Ki’.

3. Inhibició mixta

En la inhibició mixta, els inhibidors poden unir-se tant a l’enzim lliure com al complex ES. Així doncs, per una
banda tenim la constant
I
d’inhibició K i Iper una altra la K ’.

Sabem que quan aquestes dues constants coincideixen, estem en el cas d’una inhibició no compe va.

Inhibició compe va

Veiem a l’esquema un exemple d’una inhibició compe va on l’enzim s’uneix al substrat o bé a l’inhibidor. La
gran majoria de vegades, quan l’inhibidor ha interaccionat amb l’enzim, independentment del seu grau de
bloqueig, el substrat no té la capacitat d’interaccionar amb el centre ac u.

La velocitat de formació del complex EI és: 𝑣ƒ = 𝐾i[𝐸][𝐼] i la velocitat de trencament del complex EI és: 𝑣𝑟 =
𝐾−i[𝐸𝐼]. Així doncs, com més pe ta és Ki, més gran és l’afinitat per l’inhibidor i en conseqüència, més gran és la
seva efec vitat. Quan estem en estat estacionari es compleix: 𝑘i[𝐸][𝐼] = 𝑘−i[𝐸𝐼].

Equació de Michaelis Menten en presència d’inhibidor. Inhibició compe va

A con nuació desenvoluparem l’equació de Michaelis Menten en presència d’inhibidor. Per una banda hem de
considerar que l’enzim inicial el trobarem en 3 formes diferents: com a enzim lliure, formant complex ES i
formant complex EI. En una inhibició compe va mai no trobarem complex terciari ESI.
Veiem que la velocitat de la reacció depèn de la concentració del complex ES, i per tant depèn de la concentració
d’inhibidor que és capaç d’interaccionar amb l’enzim. Sabem que si la concentració d’inhibidor és molt pe ta,
la seva acció és menyspreable i és això el que ens permet explicar que tot i que hi hagi inhibidor es pugui arribar
a Vmax.

Podem definir la concentració del complex ES en funció de la Km. Per fer-ho considerem les premisses de
l’estat estacionari.

Obtenim una expressió del complex ES que es troba en funció de la concentració de substrat i de l’enzim inicial.
Si ho subs tuïm a l’equació de la velocitat inicial, arribem a l’expressió de Michaelis Menten.

Observem que la velocitat màxima no és alterada per la presència d’inhibidor ja que aquesta pot ser
contrarestada amb una elevada concentració de substrat. Per una altra banda determinem que la Km sí que es
veu afectada, concretament, tenim una Km aparent que és més gran que la real. Així doncs, la presència
d’inhibidor fa que per tenir la meitat de la velocitat màxima, necessitem més concentració de substrat; trobem
una relació que indiquem a con nuació:

Observem un valor de Km aparent més gran que el real, de manera que equival a què la afinitat de l’enzim pel
substrat disminueix però cal tenir present que no és així sinó que la velocitat disminueix perquè tenim enzim
ocupat interaccionant amb l’inhibidor.

Càlcul de la constant d’inhibició (KI)

Per tal de calcular la constant d’inhibició per a un determinat inhibidor disposem de 3 mètodes: linealització de
la corba de Michaelis – Menten, representacions secundàries i mètode de Dixon.
Linealització de la corba de Michaelis – Menten

La linealització de la corba de Michaelis – Menten ens permet saber quin és el pus

d’inhibidor. Per un inhibidor compe u ob ndrem que per a diferents concentracions
d’inhibidor, l’ajust dels punts experimentals coincidiran en un punt a l’eix d’ordenades que
fa referència a l’invers de la velocitat màxima.

Com més gran és la concentració d’inhibidor, més gran és el pendent de la recta, és a dir,
més gran és α. El punt d’intersecció amb l’eix d’abscisses estarà sempre desplaçat cap al 0.

SI linealitzem l’equació de Michaelis – Menten en presència d’inhibidor obtenim:

De la fórmula podem deduir que la Ki coincideix amb aquella [I] en què el valor de la Km aparent duplica el valor
de la Km real. A par r de l’equació de Lineweaver – Burk en absència i presència d’una determinada [I], es pot
tenir la relació entre les dues pendents de les corresponent rectes.

El problema de determinar la Ki a par r d’aquest mètode és que la aproximació està feta a par r d’una [I] i així
estem limitant els resultats experimentals. En conseqüència podríem obtenir una Ki poc fiable i per tant,
necessitem sistemes que ens perme n fer el càlcul més precís.

Representacions secundàries

Per a determinar de forma més correcta el valor de la constant d’inhibició es pot fer una representació
secundària de les dades cinè ques ob ngudes a diferents [I]. Un cop hem calculat les diferents Km aparents, les
representem en funció de la concentració d’inhibidor.
Sabent que el punt que talla l’eix d’ordenades fa referència a la Km i el que talla l’eix d’abscisses a –Ki, podem
calcular la constant d’inhibició per a l’inhibidor.

Mètode de Dixon

El mètode més general per determinar Ki és mitjançant el mètode de Dixn que

és el més precís. A par r de la gràfica ob nguda pel mètode de Lineweaver –
Burk es dedueix una gràfica secundària on es representa el valor de 1/Vo vs la
concentració d’inhibidor a dues o més concentracions de substrat.

Observem que per a cada concentració de substrat, les rectes es creuen en un punt i que el valor d’abscissa
d’aquest coincideix a la Ki. Per tal de calcular aquest punt d’intersecció matemà cament, diem que 1/v1 =1/v2.
Arribem a una expressió que únicament serà certa quan [I]=Ki ja que [S1] no pot ser igual a [S2], per definició.

Inhibició acompe va

En la inhibició acompe va, els inhibidors només interaccionen quan el complex ES està format. Cal tenir
present que aquelles molècules que tenen inhibidor no tenen ac vitat. Definim la constant d’inhibició com:

Per poder definir l’ac vitat en funció de la presència d'aquest inhibidor fem un tractament anàleg al cas anterior.

Aquest cas difereix de l’anterior en el fet que la velocitat queda en funció del terme α’ que està modificant el
terme de substrat del denominador.

Si tenim valors elevats de [S], la Km és menyspreable de manera que la velocitat màxima tendeix al valor de
Vmax/α’. Per tant, en aquest cas, l’efecte de l’inhibidor no es reverteix quan la concentració de substrat
augmenta.
Per una altra banda, a valors de [S] molt baixos ([S]<<Km), l’efecte de l’inhibidor es pot menysprear.

En aquest pus d'inhibició veiem que quan es produeix l’equilibri de formació de ES, part
d'aquest va cap a la formació de ESI, fent que la presencia d’inhibidor desplaci l’equilibri cap a
més formació de complex ES, de manera que el valor de Km més pe t. Així doncs, aparentment
observem que l’enzim té més afinitat pel substrat però això no és veritat, con nua tenint la
mateixa).

Quan elaborem la representació de Lineweaver – Burk observem que en presència d’un inhibidor acompe u,
a diferents concentracions d’inhibidor (diferents α’) obtenim línies paral·leles.

Així doncs, obtenim en relació a diferents [I], una família de línies

paral·leles amb un pendent Km/Vmax (igual que pels valors en
absència d’inhibidor. La intersecció en 1 /[S] correspon a –α’/Km i
en 1/Vo a α’/Vmax.

La inhibició acompe va requereix que l’inhibidor no ngui afinitat

per l’enzim lliure i per tant, Ki tendeix a infinit. En canvi, Ki’ és finit
ja que requereix que hi hagi afinitat pel complex ES. Cal tenir
present que això és contrari al que obtenim en la inhibició
compe va.

Inhibició mixta

En la inhibició mixta observem que l’inhibidor es pot unir tant a l’enzim lliure com al complex ES,
de manera que la formació del complex amb l’inhibidor no és excloent. Com que hi ha dues
possibilitats de formació del complex amb l’inhibidor, tenim dues constants Ki (formació EI) i Ki’
(formació EIS. Cal tenir present que par m de la suposició que aquestes dues constants no tenen
perquè coincidir.

El tractament matemà c torna a ser el mateix que en els casos anteriors amb la diferència que hi
ha més constants ja que hi ha més equilibris:
Quan fem la corresponent transformació a la formula de Michaelis – Menten i la representació obtenim:

De manera que el valor de la Vmax està afectat per α’ i el terme Km està afectat pel quocient α/Vmax.

A la imatge veiem que totes les rectes conflueixen en un punt que està fora dels eixos d’abscisses i ordenades.
Cal tenir present que el podem trobar tant per sobre de l’eix X com per sota. En la inhibició mixta s’observa
variació en les dues constants cinè ques: Km i Vmax.

Depenent d'aquestes relacions, la representació ens donaria per sobre o per sota de l’eix d'abscisses.

Inhibició no compe va

Si Ki = Ki’ (α = α’) les rectes ob ngudes a diferents [I] tenen el punt d’intersecció en l’eix d’abscisses, corresponent
a - 1/Km. Així doncs en aquestes condicions, l’efecte sobre la Km serà nul però la velocitat màxima es veurà
afectada. Quan tenim aquesta situació l’inhibidor es coneix com inhibidor no compe u.

RESUM

Representació de l’efecte dels diferents inhibidors reversibles

Taula resum de les caracterís ques dels mecanismes d’inhibició reversibles

Representació de Dixon

INHIBIDORS REVERSIBLES. APLICACIONS FARMACOLÒGIQUES

El primer grup de molècules amb propietats an biò ques que es van iden ficar van ser les sulfamides que
frenen el creixement bacterià.

Hem vist que a les reaccions enzimà ques o metabòliques, quan hi ha transferència de grups monocarbonats,
sovint intervé el tetrahidrofolat. Sabem que aquesta molècula o les seves derivades no les sinte tzem nosaltres
ja que els precursors els ingerim amb la dieta. Concretament necessitem dels precursors: 6 – mteilpterina, p –
aminobenzoat i glutamat.

El mo u pel qual interfereixen les sulfamides en el creixement bacterià resideix en el fet que moltes vies de
síntesi bacterianes u litzen el p – aminobenzoat i les sulfamides actuen com a inhibidors compe us. Així doncs,
en presència de sulfamides es bloqueja la síntesi de tetrahidrofolat i els bacteris no poden sobreviure.
CONCEPTE DE IC50

El concepte de IC50 s’u litza molt en el camp dels fàrmacs per tal d’avaluar la seva eficiència. Aquest paràmetre
té una certa relació amb el càlcul de la inhibició enzimà ca. Cal tenir present en quines condicions podem aplicar
aquest concepte i en quines no i a més a més, quines són les conclusions que podem treure.

Quan tenim una molècula que té un efecte, el IC50 és un terme biològic, no enzimà c, i ens diu quina és la
concentració de la molècula que produeix el 50% de l’efecte observat. Quan fem un anàlisi dosi – resposta , la
representació implica una gràfica logarítmica de la concentració de l'efector. Observem a la imatge que està en
funció d’un màxim de resposta (1) i un mínim (0).

En aquest pus de comportament veiem que obtenim unes corbes de pus

sigmoidal on podem determinar quina és la concentració de l'efector que hem
dona el 50% de resposta. Aquest sistema és molt ú l perquè per exemple si a la
industria farmacèu ca cal avaluar fàrmacs o molècules que ho poden ser, el que
es fa és calcular els valors de IC50. Així doncs, aquells que donen l'efecte més bo
són els que anem seleccionat.

Premisses per aplicar el concepte de IC50

Quan analitzem l’efecte de IC50 sobre un procés, treballem sota unes certes condicions. Per exemple, quan
treballem en el camp dels enzims i els inhibidors, amb el IC50 podem veure quin és l’efecte de l’inhibidor sobre
la velocitat. Així doncs, al gràfic podem veure quina és la velocitat respecte la màxima a diferents concentracions
d’inhibidor i a una determinada de substrat.

El valor de IC50 depèn de quina és la concentració de substrat i alhora de quines són les
condicions en les quals l’hem determinat. En la imatge veiem que el valor de IC50 varia
en funció de [S] que hem u litzat; en aquest cas quan teníem [S]=Km i [S]=10Km.

És important considerar això ja que quan volem repe r un experiment fet anteriorment
o bé fet per uns altres inves gadors, hem de garan r que estem treballant en les
mateixes condicions, tant de pH, força iònica com en la concentració de substrat. Així
doncs, el IC50 és un sistema d’anàlisi d’interaccions biològiques molt diverses que podem
aplicar en sistemes enzimà cs.

Aplicació del concepte en l’anàlisi de fàrmacs

Inhibidors dels enzims COX (ciclooxigenases)

Les ciclooxigenases són enzims que par cipen en la biosíntesis de lípids anomenats
tromboxans i prostaglandines, que estan implicades en respostes biològiques molt
diverses com la secreció de la mucosa gàstrica, processos inflamatoris, ar culacions,
febre, contracció del úter....

Les diferents prostaglandines provenen d’un metabòlit comú: arachidonat. En la

primera reacció aquest es converteix en PGG2 per acció d’aquests enzims, dels COX.
Aquests enzims són inhibits per fàrmacs del pus an inflamatoris no esteroideos
(NSAIDs o AINEs). La inhibició d’aquesta reacció genera un problema ja que si inhibim
la síntesi de prostaglandines a nivell del producte final potser estem inhibint algun procés que potser l’organisme
necessita per funcionar correctament.

Dels enzims amb ac vitat COX trobem de dos pus:

 COX1: associat a la regulació de la mucosa gàstrica en l’estomac

 COX2: implicat en la biosíntesi de prostaglandines associades amb el
dolor i la inflamació

Veiem que tant l’estructura de COX 1 com la de COX2 són molt similars entre
elles, és una estructura formada per un heterodímer on tenen una part unida
al re cle endoplasmà c, el lloc d’entrada de l’àcid arachidonit i el lloc
d’interacció dels fàrmacs.

Si una persona u litza com a fàrmac l’aspirina o l’ibuprofè depenent de l’eficàcia d’aquest sobre la forma COX1
o la forma COX 2 pot ser que se li millorin els efectes inflamatoris (que la inflamació baixi) però també pot tenir
com a conseqüències que la mucosa gàstrica de l’estomac funcioni incorrectament i per tant, el sistema diges u
no acabarà de funcionar correctament.

En el camp dels fàrmacs el que es va veure és que a par r de l’anàlisi estructural de les formes COX 1 i COX 2 tot
que es va veure que eren molt similars entre elles hi havia una pe ta regió, una zona de connexió corresponent
a la interacció amb el re cle endoplasmà c que es diferent i per tant, es poden generar els fàrmacs amb més
especificitat en que, per exemple, l’aspirina té un 0,45 de IC50 per COX1 mentre que és de 13 per COX2

Per cadascun dels fàrmacs es pot calcular la relació entre COX1 i COX2 amb el quocient COX2/COX1, en que,
l’aspirina té una relació de 3 i per tant, és més important i efec va en la COX2 tot i que l’efecte secundari sobre
la COX1 també pot ser important. Trobem altres fàrmacs en que la relació de IC50 és molt favorable per la COX2,
és a dir, que té molts efectes sobre aquest i pocs sobre COX1 i per tant, aquests van ser molt importants per
millorar els processos inflamatoris ja que l’avantatge que tenen és que inhibeixen molt COX2 i pràc cament res
COX1 tot i que en el mon farmacològic es va generar una controvèrsia perquè aquests tenien efectes secundaris
en pacients amb altres patologies.

D’alguna manera, a par r de l’estudi de IC50 es pot avaluar la capacitat d’un fàrmac sobre un determinat enzim.
Trobem molts inhibidors enzimà cs que actuen per mecanismes diferents i que tenen u litats clíniques en un
ampli ventall de malal es com an biò cs o derivats de la penicil·lina.
INHIBICIÓ IRREVERSIBLE

Els inhibidors reversibles es caracteritzen perquè hi ha un equilibri en la formació del complex enzim – inhibidor
que depèn de la concentració d’inhibidor. En una inhibició irreversible, en els seus inhibidors el que observem
és la unió covalent de l’inhibidor a l’enzim i per tant, això és un procés cinè c, és la transformació de l’enzim cap
a una nova forma modificada, diferent a l’anterior.

Tal com vem veure en les caracterís ques generals, l’enzim modificat només pot recuperar l’ac vitat per síntesis
de nou enzim ja que aquesta reacció no pot rar enrere, no es tracta d’una reacció reversible.

Efecte dels inhibidors irreversibles en l’ac vitat de l’enzim

El que hem de veure de forma important és que la inhibició segueix un procés cinè c, és una reacció que té una
transformació i per tant, la velocitat de transformació depèn de la formació del complex enzim – inhibidor, el
canvi en el temps depèn de la constant de la velocitat per la concentració d’inhibidor.

Si desenvolupem les expressions anteriors arribem a una expressió en que hi ha una relació logarítmica entre
l’ac vitat que hi ha en una preparació al cap d’un cert temps (t) en funció de l’ac vitat inicial. Aquest aspecte
depèn de la constant de velocitat de la reacció, del temps i de la concentració d’enzim.

Si elaborem la representació de l’ac vitat/ac vitat inicial en funció del temps veiem que per cadascuna de les
concentracions d’inhibidors tenim un pendent que és un reflex de la velocitat d’aquest inhibidor. Així doncs, com
més elevada és la concentració d’inhibidor més ràpidament s’inhibeix l’enzim. El pendent de cadascuna de les
situacions depèn de la concentració del inhibidor i de la constant d’aquest.

Inhibidors irreversibles inespecífics

Aquests inhibidors són molècules que reaccionen covalentment amb l’enzim i disminueixen la seva ac vitat però
no tenen cap pus de reconeixement específic de l’enzim sobre el qual actuen sinó que la seva base d’acció és
la seva capacitat reac va sobre cadenes laterals de certs pus d’aminoàcids. Els principals aminoàcids que són
modificats per la reac vitat són la cisteïna, his dina, lisina i rosina, en que, generalment trobem un grup
electròfil que forma un enllaç covalent amb un nucleòfil de l’enzim.
Marcadors d’afinitat

A nivell d’estructura tenen com a caracterís ca que hi ha una part de la seva estructura que té afinitat pel centre
ac u de l’enzim i per tant, hi ha un reconeixement específic enzim – inhibidor. Per una altre banda, hi ha un grup
reac u que permet la unió covalent del inhibidor amb l’enzim per tant, tenen especificitat per la part de la
molècula que és reconeguda pel centre ac u (Els anteriors només tenen la reac vitat però no és específica).

Així doncs es produeix una reacció covalent que com a conseqüència té la formació d’una unió covalent d’un
electròfil amb un nucleòfil i això ens dona dos avantatges:

 Dóna especificitat a la reacció inhibida, cal un reconeixement previ

 El reconeixement específic afavoreix a un increment de la concentració local d’inhibidor en el centre
ac u perquè la afinitat fa que la interacció inicial del inhibidor sigui gran, la unió covalent ha de ser fàcil.

Un exemple d’aquest pus de reac u és la aspirina en que hi ha un aminoàcid que serina tant en COX1 com en
COX2. La part de l’aspirina que és reconeguda per afinitat del centre ac u és la seva estructura d’anell (reconeix
la part hidrofòbica) i per altre banda, la seva part reac va és el grup ace l. La reacció que es produeix permet
l’ace lació de la serina i per tant aquesta no pot elaborar la seva funció de manera que, actua com un marcador
d’afinitat.

Marcadors d’afinitat (inhibidors irreversibles dirigits al centre ac u)

Aquests es troben dins dels marcadors d’afinitat i són marcadors anomenats substrats suïcides o bé inhibidors
basats en el mecanisme. D’alguna manera, l’inhibidor és reconegut igual que pel marcador d’afinitat (interacció
en el centre ac u) però per una altre banda, en la reacció el que es produeix és que l’inhibidor es transforma
parcialment pel propi mecanisme de l’enzim, en interaccionar sobre el centre ac u, el mecanisme catalí c de
l’enzim actua sobre l’inhibidor de manera que es genera una certa recció però mai no acaba amb l’alliberació
d’un producte. Així doncs el que tenim és que el substrat es transforma i aquesta molècula que resulta queda
permanentment unida al centre ac u, no hi ha una alliberació del producte i això és conseqüència del
mecanisme de catàlisi de l’enzim.

Aquests pus d’inhibidors en el cas dels fàrmacs són molt bons perquè si no hi ha l’enzim no produeixen cap
pus de reacció i quan actuen el seu producte no és alliberat de manera que, la constat de fixació del inhibidor
és molt superior a la de dissociació (que no existeix).
Exemple 1: Les penicil·lines

Els an biò cs en contra de la penicil·lina es basen en una estructura caracterís ca on tenen un anell comú de
azolina (en groc) i un anell de β-lactam. En funció del pus de subs tuent en el carboni 6 d’aquest úl m anell
trobem diferents pus de penicil·lines amb aplicacions diferents com per exemple:

 Penicil·lina V: és una molècula rela vament estable en les condicions de pH de l’estomac (àcid). Aquest
és un medicament que es pot administrat via oral.
 Penicil·lina G: és una estructura que no suporta les condicions de l’estomac però és més estable amb
les resistències bacterianes (mecanismes per els quals els bacteris és fan resistents a l’efecte
d’an biò cs). És un medicament que s’administra per via intravenosa.

Així doncs acabem d’observar que les propietats a nivell químic estan relacionades amb la forma d’administració.

Les penicil·lines són bons an biò cs perquè inhibeixen el procés de síntesis de la paret cel·lular bacteriana i per
tant, aquesta és una via metabòlica exclusiva dels bacteris de manera que només afecta a la viabilitat d’aquest i
no a la del pacient (aquest és un aspecte molt important ja que tenen un efecte molt pe t sobre l’hoste).
Concretament, aquest pus d’an biò c actuen sobre la úl ma via de la síntesis i la reacció que inhibeixen és
una transpep dasa; en la paret cel·lular hi ha fragments de pèp ds que formen entrecreuaments entre ells i el
que inhibeixen és precisament aquest nivell, és a dir, tota l’etapa pot funcionar bé però aquesta part s’atura i
per tant, tot el bacteri deixa de funcionar.

Així doncs, en absència de transpep dasa la penicil·lina circula per la sang, amb un temps de vida suficient llarg
com per poder fer efecte en les cèl·lules que toca, és a dir, per difondre’s per tot l’organisme. Quan arriba al lloc
de la infecció bacteriana interacciona amb el centre ac u amb molta afinitat ja que té una cadena lateral d’una
serina que reconeix l’an biò c com a substrat i per tant, s’inicia el procés de reacció que genera en el temps un
intermediari covalent entre la serina i l’an biò c. La reacció queda aturada en aquest punt i per tant, el producte
queda unit al centre ac u.

En aquest esquema veiem en el costat que dins les resistències (per els quals existeixen diferents mecanismes)
els bacteris poden desenvolupar una ac vitat anomenada β-lactamasa, que reconeix l’anell β-lactàmic de
l’an biò c i per un mecanisme semblant al que segueix la inhibició efec va de la penicil·lina trena aquest anell,
generant una forma de la penicil·lina que si és alliberada però que és inac va.

La ac vitat i eficiència ve donada per la relació entre la no resistència i la resistència però generalment l’an biò c
necessita d’un inhibidor de la β – lactamasa
Exemple 2: Infeccions per protozous i la malal a de la son

La malal a de la son està produïda per un organisme unicel·lular eucariota i s’anomena d’aquesta manera
perquè l’organisme en ser infectat produeix una primera resposta immunitària i durant un temps, la persona
infectada bloqueja l’efecte de procés infecciós. La part proteica però té una alta tasa de mutació de manera que
al cap d’un cert temps, la part que es reconeguda pel sistema immunitari queda modificada, l’organisme
reconeix com una segona infecció la infecció primària de manera que desencadena una resposta immunitària
massiva. Aquest aspecte sumat a condicions de vida poc favorables produeix que en cada episodi de resposta i
l’organisme quedi més debilitat.

Una opció per combatre aquesta malal a era intentar trobar una via metabòlica específica però no exis a cap
sobre la qual es pogués incidir. Es va trobar però, que hi havia un enzim (orni na descarboxilasa) del
metabolisme del patogen que es caracteritzava pel temps de vida mitja en quant a proteïna (el temps de vida
mitja dels protozous és major al dels humans) i que estava implicat en la biosíntesi de les poliamides per les
quals és necessari un aminoàcid no proteic (orni na). Aquest enzim té en el seu centre ac u un grup proteic
no prostè c (pirodoxal fosfat) que durant el procés dona un intermediari transitori entre el substrat i el rosol
fosfat, que és una base de shiff. Aquest producte permet la descarboxilació de la orni na el que permet
regenerar el procés

Hi ha un fàrmac derivat de l’orni na (DFMO o difluorome l orini na) amb una estructura rela vament semblant
a l’orni na però amb dos àtoms de ferro. Si administrem aquest a una persona infectada aquesta començarà el
procés, formarà la base de Shiff i seguirà el mecanisme fins a la descarboxilació del fàrmac i per efecte de la
persona i la reac vitat dels dos àtoms de ferro en aquesta posició hi ha un grup de l’enzim que forma un enllaç
covalent amb el producte de la reacció, de manera que

l’enzim queda modificat de forma permanent a causa del producte. Com que l’enzim en quant a proteïna del
patogen té un temps de vida llarg al patogen no li dona temps a canviar aquest enzim modificar per noves formes
de l’enzim mentre que la persona infectada té un intercanvi del derivat de l’orni na molt ràpid i és subs tuït
ràpidament per noves molècules d’enzim, de manera que els efectes secundaris sobre l’hoste són baixos.

Exemple 3: Síntesi del midilat i objec us quimioterapeú cs

Per inhibir el midilat com agent an tumoral, des del punt de vista estricament del mecanisme s’elabora a par r
del cluoroacil. Sabem que per l’obtenció del substrat de dUMP es troba la forma fluorada, produint un producte
final covalent en el qual no hi ha dissociació del producte de la reacció de manera que l’enzim queda modificat
el que està associat a la necessitat de nucleò ds de mina en les cèl·lules el que provoca la inhibició ràpida del
creixement cel·lular i de la formació de tumors.
Inhibidors de fixació fora o pseudoirreversibles

Aquests inhibidors es caracteritzen per ser teòricament reversibles però l’afinitat entre l’inhibidor i l’enzim és
molt més elevada i per tant, tenen valors de la constant d’inhibició molt pe ts (generalment menor a 10-8 M) i
per tant, tenen molta afinitat per la formació del complexi per tant es comporten pràc cament com a reversibles
el que pot confondre en un estudi cinè c.

Per l’estudi del sistema aquest ha de tenir dues caracterís ques:

 L’inhibidor ha de tenir una estructura molt similar a l’estat de transició de la reacció i per tant, parlarem
d’anàlegs d’aquest estat. Aquestes són molècules estables en estructura química però que recorden a
la distribució anatòmica que té l’estat de transició en un moment determinat. Hem de tenir present que
podem trobar tant anàlegs del substrat com de l’estat de transició.
 Quan els inhibidors interaccionen en el centre ac u de l’enzim aquest en el seu mecanisme de catàlisi
ha d’implicar un canvi conformacional de l’estructura que afec al seu centre ac u.

Aquesta caracterís ca la podem trobar per exemple en la proteasa del virus del VIH.
Aquesta proteasa té una estructura dimèrica en que el centre ac u es troba en la meitat.
Sabem que el substrat d’aquest centre ac u és una altra proteïna de manera que com a
inhibidor el que es fan servir són molècules semblants a l’estructura del substrat (no
aminoàcids) en que ja es sa sfà la primera condició esmentada anteriorment.
Generalment, si funciona correctament l’enzim, quan es produeix la interacció es genera
un canvi en el centre ac u d’aquest; en absència de substrat és una estructura oberta amb
dos flaps però durant el procés de catàlisi aquestes dures regions pateixen un canvi
conformacional i els dos flaps es sobreposen el que permet que el centre ac u quedi
tancat durant la catàlisi i alliberi el producte. En presència del inhibidor però les
interaccions són molt fortes i queda estabilitzat i per tant, la forma tancada de l’enzim no
allibera el producte i no canvia de conformació el que provoca la inhibició d’aquest.

El coneixement de l’estructura tridimensional d’aquest enzim ha permès desenvolupar

tota una sèrie de fàrmacs que es basen en la mateixa estratègia: molècules que es situen en el centre ac u
d’aquest enzim.

MESURES PER L’EFECTE DE FÀRMACS

Amb la informació explicada anteriorment podem classificar i analitzar el comportament d’una molècula com a
fàrmac en el cas que aquest que es guem estudiant vagi en contra d’un enzim. Així doncs, aquest estudi ens
pot donar una idea de l’eficiència del compost com a fàrmac tot i que això sempre genera ambigüitats.

 KD: és la constant de dissociació de la interacció entre el fàrmac i el receptor, que si estem parlant d’un
sistema amb un enzim inhibidor sabem que la iden ficarem com Ki quan sabem que mesurem la
interacció del inhibidor amb l’enzim lliure o Ki’ quan sabem que l’inhibidor està interaccionant amb el
complex enzim – substrat.
 IC50: és la concentració d’inhibidor a la qual tenim el 50% de l’ac vitat màxima
 ED50: és la dosi efec va d’un fàrmac, aquella dosi que es requereix per produir un efecte terapèu c del
50% en una mostra, que pot ser un efecte de supervivència o del que sigui.
 TD50: és aquella dosi que es requereix per produir un efecte tòxic del 50%, com més elevat és aquest
valor el sistema és més resistent.
 LD50: en aquest cas ens referim a la dosi necessària per causar un efecte letal del 50%.
 TD50/ED50: el quocient és la relació entre aquella concentració que produeix toxicitat en funció d’aquella
que dóna l’efecte necessari. Aquest quocient ha de ser elevat, per produir la toxicitat necessitaríem una
 elevada concentració de fàrmac mentre que per produir l’efecte necessari necessitaríem una baixa
concentració.

Quan es comença a iden ficar algun compost com a possible fàrmac, si estem parlant d’un compost basat en la
inhibició enzimà ca el primer valor que s’ha de conèixer és KD, que ha de ser menor a 1µM.