Namn: Sana Abo Hamdeh

Datum: 2023/Mars/08
Klass: Na 21
Kurs: Bioteknik
Skola: Angeredsgymnasiet

Gelfiltrering
Inledning
Gelfiltrering är en vanlig teknik inom biokemi och molekylärbiologi för att separera och
karakterisera en mängd olika biomolekyler, inklusive proteiner, nukleinsyror och
polysackarider. Gelfiltrering är en skonsam och effektiv metod som bygger på
storlekslutning, vilket separerar molekyler baserat på deras storlek och form. Förutom att rena
biomolekyler från föroreningar används gelfiltrering också för att bestämma molekylvikt och
analysera aggregationstillstånd.

Den grundläggande principen för gelfiltrering är att olika molekyler har olika förmåga att ta
sig in i gel matrisens porer. Gel Matrisen består av tvärbundna polymerer som agaros och
polyakrylamid, vilka bildar en porös struktur. Ju mindre biomolekylen är, desto lättare är det
för den att passera genom gelens porer och desto längre tid tar det för den att passera genom
kolonnen. Å andra sidan stängs större biomolekyler ute från porerna och passerar därför
snabbare genom kolonnen.

För gelfiltrering experiment krävs en gelfiltrering kolonn som är packad med en gelmatris.
Syftet är att applicera en provlösning som innehåller biomolekyler på toppen av kolonnen och
låta dem passera genom matrisen under kontrollerade förhållanden. Som ett resultat separeras
biomolekylerna efter storlek, där mindre molekyler kommer ut sist och större molekyler
tidigare.

För att uppnå önskad separation och karakterisering är det viktigt att optimera de
experimentella parametrarna, till exempel valet av gelmatris med lämplig porstorlek och
kolonn längd. Dessutom påverkar flödeshastigheten och prov volymen också
separationsresultat. Genom att välja rätt förhållanden kan de önskade resultaten uppnås och
de önskade biomolekylerna kan renas och erhållas.

Gelfiltrering är en värdefull teknik inom biokemisk forskning och molekylärbiologi som

möjliggör separation och karakterisering av biomolekyler med minimal påverkan på deras
struktur och funktion. Genom att använda principerna och protokollen för gelfiltrering kan
forskare studera biomolekylers storlek, renhet och interaktioner, vilket i sin tur bidrar till en
djupare förståelse av biologiska processer och sjukdomsmekanismer.

I den här laborationen kommer du att utforska gelfiltrering tekniker och lära dig hur man
separerar och karakteriserar biomolekyler med hjälp av gelfiltrering kolonner. Du kommer
också att utforska olika experimentella parametrar och deras inverkan på separationen.
Syfte
Syftet med detta experiment är att introducera principerna för gelfiltrering kromatografi som
en metod som separerar molekyler efter deras storlek och form. En blandning av två olika
molekyler kommer att separeras i detta experiment.

Teori
Gelfiltrering, även känt som storlek testning eller gelkromatografi, är en form av
kromatografisk separation baserad på skillnader i molekylstorlek. Grundprincipen är att
använda en gles matris som innehåller porösa partiklar för att separera biomolekyler beroende
på deras storlek. Ju större molekylen är, desto snabbare kan den passera genom gelen
eftersom den inte kan passera genom mindre porer. Om molekylerna å andra sidan är mindre
kan de inte passera genom de små porerna och det tar längre tid för dem att passera genom
gelen.

Det finns två typer av gel filter: cutoff-filtrering och intag filtrering. Vid skjuv filtrering
förbereds gel matrisen så att den har ett specifikt spektrum av porstorleksfördelning. De
molekyler som ska separeras filtreras genom matrisen och separeras beroende på deras
förmåga att ta sig in i porerna. Gel Matrisen och provet blandas och när provet har trängt in i
gelen sväller gelen och bildar ett fast nätverk. Separation sker sedan när provet rör sig genom
nätverket.

Det är viktigt att välja rätt gelmatris beroende på vilka biomolekyler som ska separeras.
Storleken på porerna i gel matrisen bestäms av storleken på de biomolekyler som ska
separeras; en gelmatris med stora porer är lämplig för att separera stora molekyler, medan en
gelmatris med små porer är lämplig för att separera små molekyler.

Material
● Tio 50 mL eller 100 mL bägare eller flaskor
● Liten bägare eller kolv (10 eller 25 mL) eller ett 10 mL provrör
● Ring Stativ med klämma för varje pelare
● Destillerat eller avjoniserat vatten (Destillerat vatten tillgängligt i stormarknader är av
lämplig kvalitet)
● 5 eller 10 ml pipetter och pipett pumpar

Metod
PACKA KOLUMNEN

1. Blanda matrisen noggrant genom att snurra eller försiktigt röra om.

2. Med en 5 eller 10 mL pipett, pipettera försiktigt all den blandade slurryn i kolonnen genom
att låta det strömma ner genom reservoarens innerväggar eller hälla slurryn i behållaren
kolumn. (Om materialflödet stoppas av en luftficka, sluta hälla och knacka ordentligt på
kolonn tills luften avlägsnas och slammet rinner ner. Fortsätt hälla resten av slurryn.)
3. Tillsätt elnueringsbuffert med en överförings pipett för att fylla behållaren.

4. Placera en tom bägare under kolonnen.

5. Ta bort locket från pipen på kolonnen.

6. Låt bufferten rinna genom kolonnen i cirka 10 minuter. Matrisen kommer att packas ner i
kolonnen.

7. Placera locket på pipen på kolonnen.

8. Matrisen packas när den slutar komprimeras.

BRÖKSAMLING

1. Märk 8 provrör 1-8. Sätt dina initialer eller labbgruppsnummer på alla rören.

2. Ta försiktigt bort all buffert ovanifrån bädden med en överföringspipett. Sängens ovansida
ska utsättas för luft.

Sätt in en pipett genom behållaren. Försök att minimera störningar av sängen samtidigt som
du tar bort bufferten.

3. Ladda innehållet i "Sample"-röret (x) på toppen av sängen med en överföringspipett. Låt

provet droppa ner

insidan av kolonnens väggar.

4. Placera en bägare under kolonnen.

5. Ta bort locket från pipen. Provet kommer långsamt in i sängen. När den har kommit helt in
i sängen (den

toppen av sängen kommer att utsättas för luft), sätt tillbaka locket.

6. Tillsätt försiktigt flera droppar buffert över bädden med en överföringspipett. Öppna locket
och låt bufferten komma in

kolumnen.

7. Fortsätt att lägga till buffert, flera droppar åt gången, pausa för att tillåta bufferten att
komma in i bädden.

8. När det blå färgämnet når nära botten av kolonnen, börja samla 0,5 ml fraktioner. Håll rör
#1 direkt under kolumnen. (Tuberna är graderade för att hjälpa dig att mäta 0,5 ml.)

9. När färgämnena gradvis separeras i kolonnen, tillsätt med jämna mellanrum ny buffert till
behållaren för att hålla den full.

10. Fortsätt att samla 0,5 ml fraktioner i vart och ett av de 2-8 rören.
11. Efter att alla rör med kolonnavlopp (kolonnfraktioner) har samlats upp, sätt tillbaka locket
på pipen.

12. Identifiera röret med den största mängden blått dextran som eluerade från kolonnen.

13. Identifiera det rör som har den största mängden orange färgämne som eluerade från
kolonnen.

Resultat

Experimentet visade att den orange färgen, som har en mindre molekylvikt än den blå färgen,
kunde tränga in i pärlornas porer och röra sig långsamt. Den orange färgen kunde diffundera
in i porerna på grund av sin mindre molekylära struktur. Därför tog det längre tid för den
orange färgen att röra sig längs kolonnen än för det blå pigmentet. Det blå pigmentet var för
stort för att tränga in i porerna och rörde sig istället runt pärlorna och eluerade mycket
snabbare än det orange.

Diskussion
Laboratorium Resultaten från gel filtreringen visar tydligt skillnaden i migrations hastighet
och separation mellan de två färgerna med olika molekylvikten. Den orange färgen, som har
en lägre molekylvikt än den blå färgen, observerades tränga in i gles matris, pärlornas porer
och röra sig långsamt genom kolonnen. Det blå pigmentet, å andra sidan, kunde inte tränga in
i porerna på grund av sin högre molekylvikt och eluerade istället snabbare genom att röra sig
runt pärlorna.

Denna observation kan förklaras med den grundläggande principen för gelfiltrering.
Gelfiltrering är en teknik som bygger på att biomolekyler separeras efter storlek. Porerna i gel
matrisen fungerar som en barriär för större molekyler och hindrar dem från att tränga in i
porerna. Små molekyler, å andra sidan, kan passera genom porerna och tar längre tid på sig
att röra sig genom gelen.

I vårt fall indikerar den orange färgen med mindre molekylvikt förmågan att diffundera in i
porerna på grund av dess förmåga att tränga in i gel matrisens täta nätverk. Som ett resultat
måste molekylerna "röra sig" genom porerna och färdas därför långsammare genom
kolonnen. Blå pigment, å andra sidan, är för stora för att passera genom porerna, så de tvingas
röra sig runt pärlorna i gelen. Elueringshastigheten för det blå pigmentet är därför snabbare
eftersom det inte begränsas av porernas storlek.
Dessa resultat bekräftar att gelfiltrering är en effektiv teknik för att separera molekyler
beroende på deras storlek. Genom att välja en gelmatris med en lämplig porstorlek för den
molekyl som ska separeras kan den önskade separationen och reningen uppnås.

Det bör noteras att resultaten av detta experiment kan vara användbara för framtida
tillämpningar inom områdena biokemi och molekylärbiologi. Genom att förstå hur
molekylvikt och storlek påverkar separationen kan protokoll för gelfiltrering utformas och
optimeras för att separera och karakterisera specifika biomolekyler i komplexa prover.

Gelfiltrering Kromatografi skiljer sig från andra separationstekniker som

jonbyteskromatografi och affinitetskromatografi genom sin princip att separera efter
molekylstorlek. Medan jonbyteskromatografi utnyttjar elektrostatiska interaktioner mellan
laddade molekyler och en laddad matris och affinitetskromatografi utnyttjar specifik bindning
mellan ligander och målmolekyler, fokuserar gelfiltrering kromatografi på storlek separation.

Vid gelfiltrering kromatografi används en elueringsbuffert för att transportera provet genom
kolonnen och samla upp de separerade molekylerna vid utloppsventilen. Bufferten spelar en
viktig roll för att skapa en gynnsam miljö för separation genom att tillhandahålla lämpligt pH
och jonstyrka och underlätta provets väg genom matrisen genom att minska interaktionerna
mellan molekylerna och matrisen.

Linjära molekyler eluerar först från kolonnen jämfört med sfäriska molekyler. Detta beror på
att sfäriska molekyler har en mindre yta i kontakt med matrisen och därför tar längre tid på
sig att tränga djupare in i matrisen och eluera. Linjära molekyler har å andra sidan en större
yta i kontakt med matrisen och kan därför bara passera genom en liten del av matrisen och
lämna kolonnen, vilket resulterar i en snabbare eluering hastighet.

Den stationära fasen av kromatografin är matrisen själv, som i fallet med gelfiltrering utgörs
av gel matrisen. Den mobila fasen är bufferten eller elnueringsmedlet som används för att
transportera provet genom kolumnen.

Slutsats
Separationen av två färgämnen med olika molekylvikt observerades och analyserades i ett
laboratorium med gelfiltrering. Resultaten visade att det orangefärgade färgämnet, som hade
en lägre molekylvikt än det blå färgämnet, kunde tränga in i gelmatrisens porer och röra sig
långsamt genom kolonnen. Det blå färgämnet hade däremot en för stor molekylvikt för att
komma in i porerna och rörde sig istället genom gelmatrisen och eluerades mycket snabbare
än det orangea färgämnet.

Denna observation kan förklaras med hjälp av principen för gelfiltrering. Gelmatrisen består
av porösa partiklar där små molekyler kan ta sig in i porerna och stora molekyler inte kan det.
Det orangefärgade färgämnet hade förmågan att passera genom de små porerna i gelmatrisen
och diffundera in i porerna på grund av sin lilla molekylstruktur. Det orangefärgade
färgämnet passerade därför långsammare genom kolonnen.
Det blå färgämnet, å andra sidan, hade en molekylstruktur som var för stor för att passera
genom porerna och var tvungen att röra sig runt gel matrisen snarare än genom den. Denna
begränsade interaktion med gel matrisen resulterade i en snabbare eluering av blått färgämne
från kolonnen.

Slutsatsen av detta experiment är att gelfiltrering är en effektiv teknik för att separera
biomolekyler baserat på deras storlek. Resultaten visar att molekylens storlek direkt påverkar
restiden genom gel matrisen. Denna kunskap och förståelse för gelfiltreringens principer och
tillämpningar är värdefull inom biokemi och molekylärbiologi, särskilt vid separation och
karakterisering av biomolekyler i olika experiment och forskningsprojekt.