PCR- Polymerase Chain Reaction

Datum: 11/11-2022
Laborant: Michaela Björk
Medlaborant: Lora Boyanova Encheva
Klass: KFSci20

Inledning
Polymerase Chain Reaction (PCR) är en laboratorieteknik som används för att amplifiera specifika
DNA-sekvenser i ett prov. Det innebär att man använder enzymer för att göra många kopior av en specifik
region av DNA, som sedan kan analyseras eller användas för andra ändamål. PCR är ett viktigt verktyg inom
molekylärbiologi och har ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive diagnostisk testning, genkloning och
DNA-sekvensering.

PCR är en snabb och känslig metod som kan användas för att amplifiera små mängder DNA, vilket gör det
möjligt att detektera och analysera även spårmängder av DNA i ett prov.

De grundläggande stegen för PCR är:

1. Denaturering: DNA-provet värms upp till en hög temperatur, vilket gör att de två strängarna i
dubbelhelixen separeras.
2. Glödgning: Primers (korta bitar av DNA som är komplementära till målregionen) läggs till provet
och tillåts binda till deras komplementära sekvenser.
3. Förlängning: Ett enzym som kallas polymeras läggs till provet tillsammans med nukleotider
(byggstenarna i DNA). Polymeraset syntetiserar nya DNA-strängar med hjälp av primrarna och
mallsträngarna som vägledning, vilket skapar kopior av målregionen.
4. Upprepa: Processen upprepas flera gånger, där antalet kopior av målregionen ökar exponentiellt
med varje cykel.

Efter att ha genomfört PCR-proceduren på reaktionslösningarna är det vanligt att man vill analysera
resultatet. Gelelektrofores kan användas för att separera de olika DNA-sekvenserna från varandra. Denna
teknik drar fördel av det faktum att molekyler med olika storlekar och former kommer att röra sig med olika
hastigheter genom en gel när de utsätts för ett elektriskt fält. Hastigheten med vilken de olika
DNA-sekvenserna rör sig påverkas av deras storlek och elektriska laddning.

Gelelektrofores är en laboratorieteknik som används för att separera och analysera molekyler, såsom DNA
eller proteiner, baserat på deras storlek och laddning. De grundläggande stegen för gelelektrofores är:
 1. Beredning av gelén: En gelmatris framställs genom att blanda en polymer, såsom agaros eller
polyakrylamid, med en buffertlösning. Gelén hälls i en speciell bricka och får stelna.
2. Ladda proverna: Proverna som ska analyseras, som kan innehålla DNA, RNA eller proteiner,
blandas med en laddningsbuffert och laddas i brunnar som har skurits eller formats till gelén.
3. Applicering av ett elektriskt fält: Gelbrickan placeras i en elektrofores kammare och ett elektriskt fält
appliceras. Detta gör att molekylerna i proverna migrerar mot motsatt laddning. Mindre molekyler
kommer att röra sig snabbare genom gelmatrisen än större molekyler.
4. Separation av molekylerna: När molekylerna rör sig genom gelén kommer de att separeras baserat på
deras storlek och laddning. Större molekyler kommer att röra sig långsammare och kommer att
separeras mot botten av gelén, medan mindre molekyler kommer att röra sig snabbare och kommer
att separeras mot toppen av gelén.
5. Analys av de separerade molekylerna: När elektroforesen är klar kan gelén visualiseras med hjälp av
olika tekniker, såsom färgning med färgämnen eller autoradiografi (exponering för radioisotoper).
Detta gör att de separerade molekylerna kan visualiseras och analyseras.

Detta experiment syftar till att avgöra om DNA-templatet i de olika lösningarna kommer från möss som är
homozygota eller heterozygota för en specifik gen. Genen som undersöks är känd som Wild Type (WT) och
finns i duplikat i vilda möss, vilket betyder att vilda möss är homozygota för Wild Type-allelen. Hos genetiskt
modifierade laboratoriemöss har en del av genen tagits bort, och denna allel brukar kallas Knock-Out (KO).
Genetiskt modifierade laboratoriemöss har två kopior av Knock-Out-allelen, vilket betyder att de är
homozygota för denna allel. Men det finns också möss som har en allel för Wild Type och en för Knock-Out,
vilket gör dem heterozygota.

Experimentbeskrivning
Experimentet inleddes med att fyra provrör, vars storlek var 0,2 ml, ställdes i ett provrörsställ och
numrerades 1-4. En pipettspets till en pipett, som har möjlighet att pipettera volymer mellan 10 µl och
100 µl, ställdes in för att pipettera volymer av 12,5 µl och 12,5 µl 2xGREENTAQ pipetterades i varje
provrör med pipetten. Pipettspetsen byttes ut till en ny och ren efter pipetteringen.
Pipetten byttes ut mot en annan med möjlighet att pipettera volymer mellan 1 och 10µl. En pipettspets
sattes på pipetten samt ställdes pipetten in för volymen 9,0 µl. 9,0 µl vatten pipetterades i provrören
numrerade 1-3. Pipettspetsen avlägsnades och en ny sattes på. En pipett, med möjlighet att pipettera volymer
mellan 10µl och 100µl, ställdes in för att pipettera 10,5 µl. 10,5 µl vatten pipetterades i det fjärde provröret
och pipettspetsen avlägsnades.
Pipetten, med möjlighet att pipettera mellan 1µl och 10µl, ställdes in för att pipettera volymer av 1,0 µl.
1,0 µl Primer P1 [10 µM] pipetterades i varje provrör. Pipettspetsen byttes ut och 1,0 µl P2 [10 µM] i varje
provrör. Pipettspetsen byttes ut i preparation för att pipettera nästa lösning

Samma pipett som använts för att pipettera P1 och P2 ställdes in för att pipettera 1,5 µl. 1,5 µl av templat A
pipetterades i provrör 1. Pipettspetsen byttes ut till en ny. Processen repeterades med templat B och C som
pipetterades i provrör 2 respektive 3. Provrör 4 fick inget templat då det användes som en kontroll.
Provrören placerades i en centrifug i syfte att få lösningen i botten på provrören. Provrören placerades i en
PCR-maskin, vilken programmerades av handledare; 94℃ i 2 minuter, därefter 30x (94℃ i 30 sekunder,
56℃ i 30 sekunder, 72℃ i 1 minut), slutligen 72℃ i 7 minuter

Provrören placerades i ett provrörsställ då PCR-cyklarna var färdiga. En gelelektrofores med tillhörande
gjutplatta och 1,2% Agaros-gel ställdes iordning. En pipett ställdes in för att pipettera 3 µl och 3 µl 50 bp
ladder, pipetterades i den första brunnen. Pipettspetsen byttes ut och 3 µl av lösningen från provrör 1
pipetterades ner i brunn 10. Pipettspetsen byttes ut till en ny och processen upprepades på samma sätt där
lösningen från provrör 2 pipetterades i brunn 11, lösning från provrör 3 i brunn 12 samt lösning från
provrör 4 i brunn 13.

Gelelektroforesplattan kopplades till en spänningskälla som ställdes in på 146 V. En UV- kamera sattes över
gelelektrofores för att kunna följa PCR-produkternas separation via en dator.

Resultat

Bild: Början av gelelektroforesen

Bild: Gelelektroforesen som är avlsutad. Första provbrunnen (1) är referenslösningen. Provbrunnarna 10-13
är laboranternas för denna laborationsrapport

Diskussion

Det är troligt att DNA-mallen i vår första lösning, som pipetterades i brunn 10, kom från en mus som är
homozygot för Wild Type allelen. Detta beror på att Wild Type-allelen har fler baspar (ca 744 bp) och därför
är längre än Knock-Out-allelen (som har ca 300 bp). Bandet av DNA-sekvenser från vår första lösning i
brunn 10 flyttade sig det kortaste avståndet från startpunkten, vilket är förenligt med tanken att längre
DNA-sekvenser kommer att röra sig kortare avstånd i en gel.

Det är troligt att DNA-mallen i vår andra lösning, som pipetterades in i brunn 11, kom från en mus som är
homozygot för Knock-Out allelen. Detta beror på att bandet av DNA-sekvenser från denna lösning reste en
längre sträcka i gelén än bandet från DNA-sekvenserna i lösningen i brunn 10. Enligt teorin betyder det att
DNA:t måste ha kommit från en mus med Knock-out allel.

Det är troligt att DNA-mallen i vår tredje lösning, som pipetterades in i brunn 12, kom från en mus som är
heterozygot, vilket betyder att den innehåller både Wild Type allelen och Knock-Out allelen. Detta kan ses
på bilden i form av två band av DNA-sekvenser som dyker upp efter varandra, vilket motsvarar positionerna
för de individuella alleler som ses i de andra två lösningarna. Detta beror på att de olika allelerna i
DNA-mallen har olika antal baspar, vilket gör att banden vandrar olika avstånd i gelén.

Brunn 13 innehöll vår fjärde lösning, som var tänkt som en kontrollösning. Denna lösning innehöll ingen
DNA-mall eftersom den endast användes för att säkerställa att ingen kontaminering hade inträffat.

Felkällor
När vi försökte pipettera 2xGREENTAQ i kontrolllösningen mötte vi luftbubblor i pipettspetsen. Vi
försökte att ta bort dessa bubblor genom att återföra lösningen till behållaren med 2xGREENTAQ och det
resulterade i att bubblorna även kom in i den behållaren, vilket gjorde den oanvändbar. Vi använde sedan en
frusen behållare med 2xGREENTAQ, men medan den tinade så pipettera vi andra lösningar i de andra tre
provrören. Vi använde av misstag samma pipettspets som hade använts för den ursprungliga,
2xGREENTAQ, vilket sannolikt resulterade i kontaminering av kontrollösningen. Detta resulterade i de
svaga band som observerats i kontrolllösningen. Det är då de fria nukleotiderna från
GREENTAQ-lösningen som kan aktivera etidiumbromiden.

Ett sätt att förbättra säkerheten och noggrannheten av resultaten är att förlänga varaktigheten av
gelelektrofores. Detta skulle producera mer distinkta band.