PDF Advances in Virus Research 1St Edition Kielian Ebook Full Chapter

Advances in Virus Research 1st Edition
Kielian
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ADVISORY BOARD
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SHOUWEI DING
PETER C. DOHERTY
JOHN FAZAKERLY
HANS J. GROSS
BRYAN D. HARRISON
ROGER HENDRIX
KARLA KIRKEGAARD
BERNARD MOSS
ERLING NORRBY
JULIE OVERBAUGH
PETER PALUKAITIS
FELIX REY
JUERGEN RICHT
MARILYN ROOSSINCK
JOHN J. SKEHEL
GEOFFREY SMITH
MARC H.V. VAN REGENMORTEL
VERONIKA VON MESSLING
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125 London Wall, London, EC2Y 5AS, UK
First edition 2016
© 2016 Elsevier Inc. All rights reserved.
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ISBN: 978-0-12-804821-4
ISSN: 0065-3527
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CONTRIBUTORS
David C. Bloom
Department of Molecular Genetics & Microbiology, University of Florida College of
Medicine, Gainesville, Florida, USA
Abraham L. Brass
Department of Microbiology and Physiological Systems, University of Massachusetts
Medical School, Worcester, Massachusetts, USA
Teresa Hellberg
Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal
Research Institute for Animal Health, Greifswald-Insel Riems, Germany
Barbara G. Klupp
Paul Meraner
Thomas C. Mettenleiter
Lars Paßvogel
Jean-Pierre Perreault
Département de biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Pavillon de
recherche appliqueé sur le cancer, Université de Sherbrooke, Québec, Canada
Jill M. Perreira
Katharina S. Schulz
Gerhard Steger
Institut für Physikalische Biologie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf,
Germany
vii
CHAPTER ONE
Functional Genomic Strategies

for Elucidating Human–Virus
Interactions: Will CRISPR Knockout
RNAi and Haploid Cells?
Jill M. Perreira, Paul Meraner, Abraham L. Brass1
Department of Microbiology and Physiological Systems, University of Massachusetts Medical School,
Worcester, Massachusetts, USA
1
Corresponding author: e-mail address: abraham.brass@umassmed.edu
Contents
1. Introduction 2
2. Host–Virus Genetic Screens 2
3. RNAi Genetic Screening Technologies and Approaches 3
3.1 RNAi Pooled Screening 21
3.2 Arrayed RNAi Screening 23
3.3 RNAi Screening Problems and Some Solutions 28
4. Haploid Cell Genetic Screening Technology and Approach 31
5. CRISPR/Cas9 Genetic Screening Technologies and Approaches 32
6. Comparison of HRV-HF Screens: Arrayed MORR RNAi Versus Pooled CRISPR/Cas9 34
7. Future Directions 44
Acknowledgments 45
References 45
Abstract
Over the last several years a wealth of transformative human–virus interaction discover-
ies have been produced using loss-of-function functional genomics. These insights have
greatly expanded our understanding of how human pathogenic viruses exploit our cells
to replicate. Two technologies have been at the forefront of this genetic revolution, RNA
interference (RNAi) and random retroviral insertional mutagenesis using haploid cell
lines (haploid cell screening), with the former technology largely predominating. Now
the cutting edge gene editing of the CRISPR/Cas9 system has also been harnessed
for large-scale functional genomics and is poised to possibly displace these earlier
methods. Here we compare and contrast these three screening approaches for elucidat-
ing host–virus interactions, outline their key strengths and weaknesses including a com-
parison of an arrayed multiple orthologous RNAi reagent screen to a pooled CRISPR/Cas9
human rhinovirus 14–human cell interaction screen, and recount some notable insights
made possible by each. We conclude with a brief perspective on what might lie ahead
for the fast evolving field of human–virus functional genomics.
Advances in Virus Research, Volume 94 # 2016 Elsevier Inc. 1
ISSN 0065-3527 All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/bs.aivir.2015.11.001
2 Jill M. Perreira et al.
1. INTRODUCTION
The burden imposed upon the health of the world’s population by just
three of the major pathogenic viruses is staggering, with nearly 300 million
people chronically infected by either HIV-1 (36 million) or HBV (250 mil-
lion), and another 5–6 million severe infections by influenza A virus (IAV)
occurring transiently each year (Ortblad, Lozano, & Murray, 2013;
Schweitzer, Horn, Mikolajczyk, Krause, & Ott, 2015) (http://www.who.
int/immunization/topics/influenza/en/). Collectively these three viruses
cause the deaths of over 2.5 million people annually. These infections arise
because viruses must find and exploit the host’s cellular resources and
machinery to produce their progeny. Elucidating human pathogenic viral
dependencies has been a longstanding pursuit of health science researchers
whose goal is to use this knowledge to treat and cure infections. For decades,
mammalian in vitro tissue culture systems have proved tremendously useful
for studying host–virus interactions. Over this same period, loss-of-function
genetic screening produced an impressive number of discoveries and illumi-
nated gene and pathway function in multiple model systems. While loss-of-
function genetic screening proved extremely valuable in model systems,
such technologies did not exist for mammalian cells until the discovery
and implementation of RNA interference (RNAi) (Fire et al., 1998).
The initial technologic revolution of RNAi, and later the development
of haploid cell screening, resulted in a wave of discoveries that shed new light
on many vital human viral requirements (Brass et al., 2008; Hao et al., 2008;
Krishnan et al., 2008; Randall et al., 2007; Sessions et al., 2009). The ascen-
dance of CRISPR/Cas9 technologies, which can dramatically alter gene
expression, has heralded a new era in mammalian in vitro genetic screening
(Shalem, Sanjana, & Zhang, 2015). This review will discuss the available
functional genomics strategies, highlight their strengths and weaknesses
including a comparison of matched MORR RNAi and CRISRP/Cas9
screens, and provide some future perspectives on the use of mammalian
in vitro genetics to elucidate human host–virus interactions.
2. HOST–VIRUS GENETIC SCREENS

The numbers of host–virus functional genomic screens using these
technologies, particularly RNAi, have been increasing rapidly attesting to
Functional Genomic Strategies for Elucidating Human–Virus Interactions 3
their innovative discovery power, generalizability and remarkable ease of use

(Table 1). Drosophila cell in vitro RNAi screens were the first to detect novel
host factor interactions for several human pathogens with the practical focus
being on arboviruses, although an elegant approach using a recombinant
virus also made it possible to screen for IAV dependency factors in this sys-
tem (Arkov, Rosenbaum, Christiansen, Jonsson, & Munchow, 2008;
Cherry et al., 2005; Hao et al., 2008). RNAi screens using human cells have
now been done for the majority of major human pathogenic viruses
(Table 1); these efforts have largely used arrayed siRNA libraries combined
with high-throughput imaging or plate reader-based assays as readouts for
viral replication. Collectively these works have identified multiple previ-
ously unappreciated dependencies for each virus, as well as host cell defense
mechanisms. Recent publications covering viruses that have been function-
ally interrogated by multiple independent groups including HIV-1, IAV,
and HCV have been discussed elsewhere in detail (Bushman et al., 2009;
Hao et al., 2013; Stertz & Shaw, 2011; Zhu et al., 2014). In this work,
we focus on the functional genomic screening technologies and provide a
resource noting many of the published host–virus screens along with some
of their key attributes.
3. RNAi GENETIC SCREENING TECHNOLOGIES

AND APPROACHES
Nearing a decade ago the Nobel Prize winning discovery of RNAi in
C. elegans and its mercurial extension into mammalian systems provided
virologists and geneticists alike with a powerful new tool for detecting viral
dependencies (Elbashir et al., 2001; Fire et al., 1998; Grishok & Mello,
2002). Academia and industry both quickly embraced RNAi and paired
it with the contemporaneous completion of the genetic annotation of the
entire human genome to create multiple large-scale libraries for functional
genomic screening (Paddison et al., 2004; Root, Hacohen, Hahn, Lander, &
Sabatini, 2006; Silva et al., 2005). Because the RNA-induced silencing
complex (RISC) machinery’s expression is ubiquitous, virtually all mamma-
lian cell lines can carry out RNAi, permitting host–virus screens to be car-
ried out with any tropic cell line and virus pairing (Elbashir et al., 2001).
Two major types of RNAi libraries, pooled and arrayed, have been con-
structed and dictate the two methods of screening discussed below.
Table 1 Functional Genomic Screens for Elucidating Host–Viral Interactions
Viral
Viral Viral Competitive
Viral Dependency Competitive or Restriction
Pooled/ Knockdown/ Challenge Dependency Factor Selection or Restriction factors Selection Main Stage of Viral Candidate Validation
Citation Virus Cell Line Arrayed Library Out Time Time Readout Factors Criteria Factors Criteria Candidates Lifecycle Impacted and Follow up Assays
Haploid Carette et al. Influenza virus Haploid Pooled Haploid cell N/A 2–3 weeks Survival Yes Multiple No N/A CMAS; Entry RT-PCR;
cells (2009) (PR/8/34; human Insertional independent SLC35A2 immunofluorescence;
H1N1) suspension mutagenesis integrations complementation with
cells with lentiviral cDNAs
KBM-7 exon trap
Carette et al. rVSV-GP-Ebola Haploid Pooled Haploid cell N/A Unknown Survival Yes Multiple No N/A NPC1, Entry, viral fusion Complementation with
(2011) virus human Insertional independent HOPS in lysosomal cDNAs; test against
adherent cells mutagenesis integrations complex compartment related viruses; small-
(HAP1) with lentiviral molecule U1866A and
exon trap imipramine;
immunofluorescence/
electron microscopy
viral entry assays;
primary cell lines
Jae et al. rVSV-GP-Lassa HAP1 Pooled Haploid cell Gene-Trap Unknown Survival Yes Multiple No N/A TMEM5; Entry, Null alleles TALENs;
(2013) virus Insertional independent B3GALNT2; presentation of rescue cDNAs; analysis
mutagenesis integrations B3GNT1; laminin-binding of know polymorphisms;
with lentiviral SLC35A1; carbohydrate flow cytometry;
exon trap SGK196 RT-PCR; clinical
comparison
Kleinfelter rVSV-Andes HAP1 Pooled Haploid cell N/A 8 days Survival Yes Multiple No N/A S1P; S2P; Entry S1P CRISPR/Cas9
et al. (2015) virus-GP Insertional independent SREBF2; gene editing in U2OS;
mutagenesis integrations SCAP; LSS; complementation with
with lentiviral SQLE; cDNA; small-molecule
exon trap ACAT2 inhibitor
siRNA
Haploid Petersen et al. rVSV-Andes HAP1 Pooled Haploid cell N/A 3 weeks Survival Yes Multiple No N/A SCAP; S1P; Entry Functionally deficient
cell and (2014) virus, either Insertional independent S2P; SREBF2 cells S1P, S2P, or SCAP
siRNA recombinant or mutagenesis integrations null CHO and SREBP2
pseudoparticles with lentiviral KD HEK293T;
expressing exon trap TALEN-mediated gene
Renilla luciferase disruption; small-
molecule PF-429242
and mevastatin
HEK29 Arrayed Ambion 72 h 24 h Renilla luciferase Yes In both pools: SREBF2 Entry 3 additional unique
druggable expression Z score for siRNAs screened with
genome library 210 dsRNAs; infection ANDV and VSV-G
(9102 genes) 112 genes <1.5 pseudoparticles;
(4 siRNAs/ reconfirmed (p < 0.009); validated by 1 siRNA
gene) viability <2 repeating finding two
(2 siRNAs/ times. 105 candidate
well) genes—33 validated—9
specific for ANDV
Brass et al. HIV-1-IIIB TZM-bl Arrayed Dharmacon 72 h 48 h % Infectivity Yes Decreased No N/A RAB6A Fusion Subcellular localization;
(2008) siARRAY (anti-HIV-1 p24) Infectivity by gene ontology (GO)
siRNA library 2 SDs; TNPO3 Cytosolic post- biological processes
(21,121 viability not RT–pre analysis; Expression
siRNA pools) decreased by integration Genomic Institute of the
>2 SDs Novartis Research Fund
MED28 Transcription
(GNF); individual
shRNAs; individual
siRNAs; infection with
VSV-g; other cell lines
Jurkat; qPCR
Hao et al. Influenza A virus DL1 Arrayed Ambion 48 h 24 h Renilla luciferase Yes Inhibition Yes Increase >3 COX6A1 PB2/ RT-PCR; reagent
(2008) Flu-VSV- Drosophila activity >2.4 SDs; SDs; viability PB1-F2-mediated redundancy; test human
G-GFP RNAi library Viability reduction functions homologues,
(13,071 genes) reduction Z score >3 knockdown in HEK293
176 candidate Z score >-3 123 candidate ATP6V0D1 Fusion cells; individual siRNAs;
genes—110 genes—11 small-molecule
confirmed genes NXF1 RNA export
inhibitors; related
confirmed pathway
viruses: WSN, H5N1
Influenza A/Indonesia/
7/05, VSV, VACV
Continued
Table 1 Functional Genomic Screens for Elucidating Host–Viral Interactions—cont'd
Viral
Krishnan West Nile virus HeLa Arrayed Dharmacon 72 h 24 h % Infectivity Yes Infection No NA CBLL1 Entry Individual siRNAs,
et al. (2008) WNV strain siARRAY (viral E-proteins) reduction of small-molecule:
2471 siRNA library >twofold MG132, cyclohexamide;
(21,121 colocalization;
Dengue virus siRNA pools) 30 h 283 candidates MCT4 Replication phase enrichment analysis
DENV New using Panther; gene
Guinea C strain expression—microarray;
protein interaction
network
Tai et al. Hepatitis C virus Huh7/Rep- Arrayed Dharmacon 72 h N/A Viral replication Yes Replicon Yes Increased PI1KA Replication Gene ontology;
(2009) Subgenomic Feo siARRAY (luciferase) expression replicon complex clustered; literature
genotype 1b human decreases by expression formation, review; other cell line:
replicon genome >2 SDs with threshold generation of OR6 replicon cell line,
siRNA library of q < 0.10 HCV UHCVcon57.3; protein
(21,094 genes) nonstructural expression; Western
protein-associated blot; small-molecule
membranes Wortmannin, brefeldin
A; reagent redundancy;
236 pools— 13 pools COPI- Early shRNAs; localization
186 Coatomer studies; virus: HCV-
replicated—96 JFH1
confirmed Hepcidin Cellular translation
Li et al. Hepatitis C virus Huh 7.5.1 Arrayed Dharmacon 72 h 48 h % Infectivity Yes Infectivity Yes Infectivity RAB9p40 Needed for both Individual siRNAs,
(2009) JFH-1 siARRAY (HCV Core <50% plate >150% pf plate HCV and HIV enrichment analyses for
siRNA library; Antibody 6G7) 407 candidate mean; cell 114 candidate mean; cell molecular function and
human pools number >50% pools number >50% biological process
genome of plate mean plate mean according to Panther
(19,470 genes) classification; network
analyses interactome
screens + HPRD;
RT-PCR
Sessions et al. Dengue virus Dipteran cells Arrayed Genome-wide 48 h 72 h Expression of Yes Inhibited No N/A FLJ20254; RNA Gene ontology; in vivo
(2009) DENV-S2 RNAi library envelope protein infection TAZ; accumulation mosquito Ae. aegypti;
DRSC 2.0 218 candidate 1.5-fold with EXDL2; validation of human
(22,632 dsRNAs— p < 0.05 CNOT2 homologue siRNAs in
dsRNAs) rescreen 179 Huh-7 cells; other
dsRNA— viruses: YFV 17D
identified 118 vaccine strain, Coxsackie
dsRNA ¼ 116 B3 (strain 20; CB3);
genes—111 RT-qPCR
novel
Brass et al. Influenza A virus U2OS Arrayed Dharmacon 72 h 12 h % Infectivity Yes <55% Yes >200% IFITM3 Early Rescreened candidates;
(2009) A/Puerto Rico/ siARRAY (anti-HA infectivity; infectivity; (GO) enrichment
8/34 siRNA library; antibody) 312 pools viability >40% 22 pools viability >40% analysis; other cell lines
human primary lung fibroblasts,
genome HeLa, A549, ChEFs,
(17,877 genes) MDCKs; other viruses:
HIV, PR8, H3N2 A/
Udorn/72, A/Brisbane/
59/07 H1N1, A/
Uruguay/716/07
H3N2, A/Aichi/2/68
H3N2, MLV, VSV-G;
pseudoparticles MLV
with the following
envelopes: H1, H3, H5,
H7, MACH,
MLVRescue construct;
overexpression; Western
blot;
immunofluorescence
Shapira et al. Influenza A virus HBECs Arrayed Dharmacon 72 h 48 h Viral particle Yes Change Yes Change WNT/p53 NS1 related Pathway analysis;
(2009) IAV PR8 SMARTpool production >twofold less >twofold pathway clustering of expression
(reinfection); replication more data; functional
IFN production compared to replication annotations; yeast 2
median compared to hybrid
median
Continued
Viral
Kolokoltsov, EBOV GP HEK293 Arrayed Kinase and 48 h 36 h Luciferase Yes Decrease 3 Yes Increase 3 PI3K Membrane Verified in Vero cells;
Saeed, (Zaire)— phosphorylase expression standard standard turnover redundant siRNA
Freiberg, pLENTI6-fluc subset of deviation deviation activity analysis;
Holbrook, Ambion CAMK2 Transcription Ingwnuity pathways
and Davey druggable knowledge base network
(2009) genome (720 analysis; small molecule:
genes) inhibitor drugs, KN-93,
KN-92, LY294002
Konig et al. Influenza A virus A549 Arrayed QIAGEN 48 h 12, 24, Luciferase Yes 2 siRNAs No N/A COPI coat Entry Reagent redundancy;
(2010) Recombinant A/ genome-wide 36 h activity Luciferase complex viability; enrichment
WSN/33 (19,628 genes) reduction analysis; protein
35% interactions; WT virus,
clustering;
pseudoparticles; GO
analysis; STRING
analysis; other virus IAV
A/Hamburg/04/2009,
A/Vietnam/1203/2004;
lifecycle assays;
localization assay
Karlas et al. Influenza A virus A549/293T Arrayed QIAGEN 48 h 24 h Nuclear protein Yes Robust Z No N/A CLK1 Splicing viral Reagent redundancy;
(2010) IAV A/WSN/33 staining/ score <2 mRNA viability assay;
luciferase replication analysis; gene
enrichment; network
analysis; Western blot;
lifecycle assay;
RT-qPCR; small
molecule: TG003; in vivo
assay
Smith et al. Human C33A/ Arrayed Dharmacon 72 h N/A Luciferase No N/A Yes Z score 2 SMCX E2-dependent Quantitative In-Cell
(2010) Papillomavirus BE2/18LCR human activity transcriptional Western; reagent
Stable expressing Clone 4 genome library EP400 repression redundancy; individual
HPV18LCR- (21,121 siRNAs; multiple
Brd4
Luc SMARTpools) different cell lines;
protein interaction
network; GO analysis;
transient DNA
transfections;
immunoprecipitation;
RT-qPCR
Moser, Jones, Poxvirus DL1 Arrayed Mini library 72 h 48 h % Infectivity Yes Robust Z score No N/A AMPK Entry Secondary dsRNAs;
Thompson, Drosophila (anti-B-gal of <2 RT-PCR; mammalian
Coyne, and kinase and antibody) 8 genes—7 cells—MEFs (null),
Cherry phosphate validated U2OS; VSV control
(2010) genes (440 virus; Northern blot for
genes) virus; AMPK inhibitor
Compound C; dextran
uptake
Panda et al. Vesicular HeLa Arrayed QIAGEN 52 h 18 h Green Yes >5 SDs from No N/A COPI; Viral gene RT-qPCR; cell
(2011) Stomatitis virus genome-wide fluorescence mean ARF1; GBF1 expression viability; clustering/
VSV-eGFP siRNA library protein (GFP) 233 genes enrichment analysis;
version 1 intensity reagent redundancy;
(22,909 genes) other viruses: HPIV3,
LCMV; lifecycle assay
Coyne et al. Coxsackievirus B HBMECs Arrayed Ambion 72 h 14 h % Infectivity Yes Robust Z Yes Robust Z score Akt1/Akt2 Akt/MAPK 3 unique siRNAs;
(2011) CVB druggable (viral VP1 score < 2; >2; viability signaling pathway enrichment;
genome library antigen) CVB 144; PV viability <30% CVB 31; PV <30% in cell MAP3K4; protein network analysis;
(5492 genes) 155; 38% in cell number 65; 38% number MAPK1 microarray analysis;
confirmation; confirmation; small-molecule Akt1/
Poliovirus PV 46 validation 17 validated TLR8/IRK1 Viral detection
Akt2 inhibitor SH-6,
overlap overlap
ADCYs cAMP mediated TOR inhibitor
rapamycin, ERK1/2
CREB-dependent
inhibitor FR180204;
transcription
dominant negative
mutant
Continued
Viral
Hussain, HEV71 RD cells Arrayed Dharmacon 48 h 12 h Primary anti- Yes Viral antigen No N/A AP2A1; Clathrin-mediated Dominant negative
Leong, Ng, human HEV17 antibody + cells <50% CLTC; endocytosis mutants; deconvolution
and Chu genome of control CLTCL1 of siRNAs; reagent
(2011) siRNA redundancy; dosage-
endocytic and MAP4K2; Signal dependent KD;
membrane PAK1; transduction at immunofluorescence
trafficking PIK3CG; viral entry entry assay; transmission
genes subset PIK3C2G; electron microscopy
library (119 ROCK1 entry assay; small
genes) molecule:
Chlorpromazine,
cytochalasin B, filipin,
nystatin, methyl-B-
cyclodextrin, EIPA
Liu et al. HIV-189.6R HeLa-CD4 Arrayed QIAGEN 72 h 48 h % Infectivity No N/A Yes GFP + Foci >3 PAF1 Innate defense Network pathway
(2011) human whole (GFP expression) SDs from mean complex analysis (IPA); individual
genome siRNAs; WT viral strains
HIV-18.2N siRNA Set 192 SETDB1 Preintegration NL4-3, 89.6wt; mRNA
V4.0 (19,121 candidates— levels; Western blot; cell
genes) 114 validated lines MDMs, CD4+
T cells; qPCR
Espeseth et al. HXB2 HIV HeLa P4/R5 Arrayed siRNA DNA 24 h 48 h β-galactoside Yes Inhibition No N/A Base-excision Integration cDNA rescue; lifecycle
(2011) repair factor activity >40% repair assays; qPCR; flow
library 41 siRNA pathway cytometry; GO
pools annotation; cell line:
murine embryonic
fibroblasts (MEFs)
Le Sommer, Yellow Fever Huh-7 Arrayed QIAGEN 51 h 42 h % Infectivity Yes Decrease % No N/A GRK2 Entry Individual siRNAs;
Barrows, virus human (4G2 antibody) infection comparison to WNV
Bradrick, YF-17D genome library 395 hits—98 twofold Genome + DENV screens;
Pearson, and (22,909 genes) candidates amplification Western blot; other cell
Garcia- lines: MEFs; other virus:
Blanco DENV-NGC, HCV-
(2012) JFH1; qRT-PCR;
lifecycle assays
Dziuba et al. HIV-1 strain CD4+/ Arrayed Dharmacon 48 h 48 h HIV-1 p24 capsid Yes 50% inhibition No N/A GTF2E1 Tat-dependent Rescue experiment;
(2012) LAV CCR5+/ siRNA production gene transcription infectivity of surviving
CXCR4+ SMARTpool clones; Western blot;
TZM-bl custom library DHX8 Release of spliced individual siRNA;
of trapped mRNA RT-PCR; ELISA; other
genes viral strains: SF162,
UBA3 Modification of ADA, 89.6 HIV-1;
HIV-1 proteins
pathway analysis
KALRN; Protein trafficking
HAP1
Arita, PV pseudovirus HEK293 Arrayed Thermo 96 h 7 hr Luciferase Yes Strongest No N/A VCP Viral RNA Rescue KD with mutant
Wakita, and Scientific activity novel hit replication protein;
Shimizu human immunofluorescence
(2012) membrane microscopy;
trafficking immunoprecipitation;
gene library Western blot; two-
hybrid assay; PLA; PV
mutant resistant to KD
Mercer et al. Vaccinia virus HeLa Arrayed QIAGEN 72 h 8h % Infectivity Yes Median No N/A Proteasome Late viral gene Reagent redundancy;
(2012) VACV-EGFP druggable (GFP) absolute subunits expression functional annotation
genome (7000 deviation clusters; protein
genes) <1.5 Cullin 3 vDNA replication interaction analysis;
immunofluorescence;
lifecycle assay; small
molecules: MG132,
UBEI-41, cytosine
arabinoside; Western
blot
Ward et al. Influenza A virus HBEC30-KT Arrayed Dharmacon 48 h 48 h Luciferase assay Yes 3 SDs below Yes 3 SDs above CDC2; Viral production Network analysis;
(2012) IAV A/WSN/33 library (21,125 mean mean CHEK1 comparison to other
genes) 182 candidates 53 candidates screens; literature
review; plaque assay;
small molecule:
SB218078, 3-IPEHPC;
Western blot;
immunofluorescence;
other cell line: A549
Continued
Viral
Ooi, Stiles, Sindbis virus U2OS Arrayed Ambion 48 h 24 h Luciferase Yes Robust Z Yes Robust Z FUZ Viral uptake Individual siRNAs;
Liu, Taylor, SINV-Luc Silencer intensity score < 3 score > 2 individual shRNAs;
and Kielian human 400 genes 59 genes TSPAN9 Viral fusion multicycle infectivity
(2013) genome assay; other cell lines:
siRNA library HeLa, primary
V3 (21,687 endothelial cells; other
genes) viruses: SFV, CHIKV,
VSV, DENV;
immunofluorescence
lifecycle assays; fusion
assay; endocytic pathway
assay; quantigene analysis
of mRNA
Sivan et al. Vaccinia virus HeLa Arrayed Ambion 48 h 18 h % Infectivity Yes <1.5 median Yes <1.5 median NUP62 Conversion of Gene network analysis
(2013) VACV IHD-J/ Silencer Select (GFP + cells) absolute absolute immature virion to (IPA); gene ontology
GFP human deviation; deviation; mature virion (GO); common seed
genome <50% <50% analysis; individual
siRNA library reduction in reduction in siRNAs; rescue
(21,500 genes) cell number cell number experiment; Western
blot; lifecycle evaluation;
Dharmacon 576 genes 530 genes viral gene expression;
siGENOME TEM
SMARTpool
siRNA
(18,120 genes)
Fusco et al. Hepatitis C virus Huh7.5.1 Arrayed Dharmacon 72 h 48 h % Infectivity Yes 3 median Yes 3 median 12 interferon Various Western blot; qRT-
(2013) HCV-JFH1 siGENOME (HCV anti-core absolute absolute effector genes PCR; shRNA KDs;
pooled siRNA antibody) deviation deviation overexpression;
library microarray analysis
Panda et al. Sindbis virus DL1 Arrayed Ambion 72 h 36 h % Infectivity Yes Robust Z Yes Robust Z SEC61A Entry/early stage Gene ontology (GO)
(2013) SINV (HRsp) Drosophila (GFP) score < 2; score > 2; enrichment analysis;
genome wide 57 genes <40% viability 37 genes <40% viability VCP dsTE12H strain;
validated decrease validated decrease independent dsRNAs;
small-molecule
Eeyarestatin 1, NH4Cl;
Western blot analysis;
in vivo assay; localization
microscopy
Lavanya, Junin virus GP U2OS Arrayed Ambion 72 h 48 h % Infectivity Yes Robust Z Yes Robust CACNA2D2 Entry Independent siRNAs;
Cuevas, pseudotyped druggable (anti-Lac-Z) score 1.5; Z score 1.5; luciferase assay;
Thomas, Moloney genome RNAi 89 genes viability Z 13 genes viability RT-qPCR; small
Cherry, and Leukemia virus library score Z score molecules—U73122,
Ross (2013) MLV-Lac-Z decrease < 2 decrease < 2 U73343, BCECF-AM,
BAPTAAM,
gabapentin, nifedipine,
verapamil, bafilomycin
A; binding assay; in vivo
assay C57BL/6 mice;
molecular function (GO)
analysis for enrichment;
KD-related proteins
Hopkins et al. Rift Vallety DL1 Arrayed Ambion 72 h 30 h % Infectivity Yes Robust Z Yes Robust Z Dcp2 Decapping Other RNA viruses
(2013) Fever virus genome-wide (anti-RVFV N) score 1.3; score 1.3; DCV, SINV, LACV,
RVFV (MP12) dsRNA library 7 validated viability Z 124 validated viability Z VSV; colocalization;
(13,073 genes) genes score > 2 genes score > 2 in vivo infectivity;
Northern blot;
RT-PCR; Aag-2 cells;
Western blot
Continued
Viral
Zhu et al. HIV-1-IIIB P4-P5 MAGI Arrayed Ambion 72 h 48 h % Infection (anti- Yes Infectivity Yes Infectivity UMPS; Pyrimidine and MORR analysis;
(2014) cells Silencer Select p24 capsid 50%; 200%; ATIC; RRM purine metabolism RIGER analysis; gene
(21,584 antibody) viability 50% viability 50% expression filtering;
siRNA pools) literature comparison;
reagent redundancy;
Sigma esiRNA THOC2 Replication enrichment analysis
(15,300 ConsensusPath
siRNA pools) COG Glycosylation DB-human; microarray
complex
analysis; genome-wide
enrichment of seed
Dharmacon GOLGI49 Entry
SMARTpool sequence matches
SEC13 Nuclear (GESS); network
RefSeq27,
analysis; lifecycle assays
Revision
Human 5
(4506 siRNA
pools)
Yasunaga West Nile virus DL1 Arrayed Ambion 72 h 48 h % Infection (anti- Yes Robust Z Yes Robust Z dRUVBL1 Antiviral Repeat for validation
et al. (2014) WNV Drosophila WSN-NS1) score < 2; Z score > 2; Z with dsRNA against
library (13,071 376 genes score < 2 161 genes score < 2 dXPO1 Innate immune different region of gene;
genes) response other viruses: WNV-
KUN, DENV, SINV,
VSV, RVFV MP12;
functional annotation
and clustering using
DAVID bioinformatics
resource; in vivo assay;
Northern blot;
RT-qPCR; small
molecule: Leptomycin
B, dichloroacetic acid,
hexokinase II; other cell
lines U2OS, Aag-2
Balistreri Semliki Forest HeLa Arrayed Dharmacon 72 h 6h % Infection No N/A Yes Top hit UPF1 Early cytosolic Specific validated
et al. (2014) virus human ON- (Zoanthus species shRNA; Western blot
SFV-ZsG TARGET plus G, ZSG) viability analysis; rescue with
(4 pooled (Hoechst) shRNA-resistant UPF1;
siRNAs/gene) immunofluorescence
microscopy of viral
components
Wen, Ding, HIV-1 HeLa Arrayed Dharmacon- 24 h 48 h Particle Yes Particle No N/A 24 genes Particle STRING—Search tool
Hunter, and NL4-3-EGFP Thermo Fisher production in output < 50%; overlap production for retrieval of
Spearman cellular supernatants viability > 60% interacting genes;
(2014) Mason-Pfizer Cos-1 membrane 24 overlap hits; control shRNA validation;
monkey virus trafficking HIV-1 Western blot analysis
pSARMX- genes (140 NL4-3
EGFP + pTMO- genes) 41 candidates
Env (8 known);
pSARMX
52 candidates
Kwon et al. Dengue virus Huh7 Arrayed Dharmacon 48 h 48 h % Infection (4G2 Yes 2 standard Yes +2 SDs from SHPK Macrophage 8 candidates—6 cherry
(2014) DENV2 (BR siGENOME antibody) deviations of mean polarization picks; individual
DEN2 01-01) kinase library mean siRNAs; U937
(G-003500-05) ETNK2 Entry/cellular DC-SIGN cell line; flow
(779 genes) trafficking cytometry; gene
(4 siRNA/ expression analysis;
gene) qRT-PCR
(2 siRNAs/
well) 22 candidates 8 candidates EIF2AK Unfolded protein 22 candidates—16
—6 cherry —6 cherry response cherry picks—6
picks picks validated; individual
SMAD7 Prolong cell siRNAs; Western blot;
survival flow cytometry; U937
DC-SIGN cell line; gene
expression analysis;
qRT-PCR
Continued
Viral
Pohl, Influenza A virus A549 Arrayed Custom library 48 h 30 h Renilla luciferase Yes 2 siRNA 50% No N/A PEPD Early endosomal Control VLPs (LASV
Edinger, and IAV VLP (169 siRNAs) reduction in block and MLV); compare to
Stertz (2014) 43 candidates infection, cell previous screens;
—22 related to viability 70% Western blotting; WT
entry virus (A/WSN/33);
strains: FPV/Dobson
(H7N7), A/Hong
Kong/68 (H3N2),
A/Netherlands/
602/2009 (H1N1),
A/Panama/2007/99
(H3N2); WI38 primary
cells; cell cycle assay;
fusion assay;
colocalization
Beard et al. Vaccinia virus HeLa Arrayed Dharmacon 48 h 48 h Infection (GFP Yes eGFP 2 Z Yes eGFP 2 Z AMPK Regulation actin RT-PCR; individual
(2014) VACV-A5eGFP druggable fluorescence) score; cell score; cell cytoskeleton siRNAs; comparison to
genome number > 2 number > 2 known data;
siRNA 153 SDs from plate 149 SDs from plate Septins; Unknown transcriptional profiling
SMARTpool candidates— mean candidates— mean MAZ; DNA comparison; pathway
library (6719 35 cherry 24 cherry replication/ analysis
genes) picks—24 picks—7 repair
(4 siRNAs/ validated validated pathway
gene)
Lee, Vesicular HeLa Arrayed Dharmacon 48 h 7h % Infectivity Yes > 3.0 SDs from No N/A GPR149 Entry Individual siRNAs;
Burdeinick- Stomatitis virus SMARTpools (EGFP+); EGFP mean for % Western blot; RNP
Kerr, and rVSV-EGFP (21,121 pools) intensity 405 infected or PSCA Entry cores
Whelan candidates— intensity; <3.0
(2014) 305 SDs alteration
confirmed— for viability
29 further
evaluated
Aydin et al. Human HeLa MZ Arrayed Qiagen 60 h 36 h % Infectivity Yes Reduction in Yes Increase in Z AURKB; Mitosis regulators Reagent redundancy;
(2014) Papillomavirus druggable (GFP) Z score > 3 score > 3 ANAPC; literature review;
HPV16-GFP genome INCENP enrichment analysis;
version 2 network analysis;
+siRNA#3 lifecycle assay; other cell
from Qiagen lines primary human
druggable keratinocytes; small
genome molecules: aphidicolin,
version 3 (6979 CPG74514A, NH4Cl;
genes) localization assays;
immunofluorescence
analysis
Schreiber Adeno- HeLa Arrayed SMARTpool Unknown 48 h Luciferase No N/A Yes 10-fold PHF5A; Transduction 12 candidate genes—3
et al. (2015) associated virus siRNA library: expression increase RAB40B; efficiency confirmed hits:
AAV9 CMV- Human PRICKLE4 Verification with distinct
Luc siGENOME siRNAs and lenti-
ubiquitin shRNAs; rescue with
conjugation PHF5A-HA-escape
subsets #1 vector; small-molecule
(89 genes), #2 meayamycin B;
(115 genes), immunoprecipitation
and #3 (396
genes)
Sivan, Vaccinia virus HeLa; Arrayed Ambion Unknown 18 h % Infection No N/A Yes 4 siRNAs >3% SAMD9; Unknown Immunoprecipitation;
Ormanoglu, VACV BS-C-1 Silencer Select (GFP) GFP+ cells WDR6; CRISPR/Cas9; rescue
Buehler, C7LK1L/ genome FTSJ1 of CRISPR; Western
Martin, and + GFP siRNA library blotting
Moss (2015) version 4
(21,500
genes)
(3 siRNA/
gene)
Arrayed Dharmacon
On-Target
Plus
SMARTpool
siRNA
(17,320 genes)
(4 siRNAs
pooled/gene)
Continued
Viral
de Wilde SARS- 293/ACE2 Arrayed Dharmacon 48 h 24 h GFP expression Yes Proviral hits Yes Antiviral hit PKR Translation Individual siRNAs;
et al. (2015) Coronavirus ON- <50% control; >150% initiation Western blot;
SARS-CoA- TARGET plus normalized control; 90 candidates—mapped
GFP SMARTpool viability > 0.85 normalized to cellular pathways
protein kinases viability > 0.85
siRNA library 90 candidates 40 candidates COPB2 COPI-coatomer Specific shRNAs; viral
(779 genes) protein expression; KD
(4 siRNAs of related/complex
pooled/gene) proteins; 40 candidates—
mapped to cellular
pathways
PRKCι Unknown Small-molecule sodium

aurothiomalate;
40 candidates—mapped
to cellular pathways
Williams, HIV-1 HeLa Arrayed Library against Unknown 96 h Intracellular p24 Yes Decrease all 3 No N/A DDX5; Viral replication Cherry picks screened
Abbink, VSV-G 59 RNA capsid levels; parameters DDX10; with WT-HIV-1 (pLAI)
Jeang, and pseudotyped helicases infectious virion 48 candidates >20% DDX17; virus; Western blot; cell
Lever (2015) (3 siRNAs/ production; —42 repeat— DDX28; viability
gene) luciferase 8 cherry DDX52
expression picks—5
confirm
WT-HIV-1
Poenisch Hepatitis C virus Huh7.5 Arrayed Ambion 48 h 72 h Luciferase Yes <2 Z score Yes >2 Z score for HNRNPK Entry/early Meta-analysis with other
et al. (2015) JcR2a Firefly Silencer Select expression; for 2/3 2/3 siRNAs replication studies; Dharmacon
luciferase extended production siRNAs validation screen;
druggable 78 candidates 29 candidates Production pathway enrichment
genome library —40 validate —16 validated analysis; known to
V3 (9102 interact with virus core
genes) 263 siRNA 130 siRNA and related proteins;
pools pools
(3 siRNAs/ RT-qPCR;
gene) IF/subcellular
localization
Perreira et al., Human HeLa-H1 Arrayed SMARTpool 72 h 14 h % Infectivity Yes Infectivity Yes Infectivity RNASEK Entry MORR analysis;
(2015) Rhinovirus Dharmacon (antibody to < 50%; > 150%; RIGER analysis; gene
HRV14 (21,121 pools, HRV14 V1 CA viability > 40% viability > 40% expression filtering;
3 oligos/pool) protein) pathway/complex
enrichment analysis;
Arrayed Ambion other viral analysis IAV
Silencer Select (X31H3N2) (WSN/33),
(21,584 pools, DENV (2, 3, 4), YF17D,
3 oligos/pool) MLV-VSV, HIV-1-
IIIB, MLV-CMV;
Arrayed Sigma esiRNA
lifecycle assay; mass spec;
(15,300 immunoprecipitation;
siRNA pools,
acidification studies;
complex pools)
immunofluorescence
Arrayed Dharmacon assay; cellular localization
RefSeq27 assay
Revision Pools
(4506 siRNA
pools/4 oligos/
pool)
shRNA Yeung, HIV-1 NL4-3 Jurkat Pooled SBI Feline 1 week 4 week Survival Yes Survival No N/A NRF1 Entry—Affects Reagent redundancy;
Houzet, immuno- co-receptor individual shRNAs;
Yedavalli, deficiency CXCR4 pathway analysis; qPCR;
and Jeang virus vector- flow cytometry; lifecycle
(2009) based shRNA STXBP2 Viral reverse assay
library (54,509 transcription
transcripts)
PRDM2; Transcription
NCOA2
EXOSC5 Gag-trafficking
Su et al. Influenza A virus A549 Pooled TRC RNAi 5 days 2 weeks Survival Yes Survival with 2 No N/A Itch Exit endosomes Western blot;
(2013) IAV A/WSN/33 Consortium unique immunofluorescence;
(81,925 110 genes—38 shRNAs per RT-qPCR; cellular
shRNAs) selected gene localization; ubiquitin
(16,368 genes) assay; EST analysis;
microarry analysis
Continued
Viral
Tran et al. Influenza A virus A549 Pooled 7 decode RNA 48 h 72 h Survival Yes Survival No N/A TNFSF12- Late viral Reagent redundancy;
(2013) IAV A/NY/ GIPZ lentiviral 13; TNFSF13 replication RT-qPCR; viability;
55/2004 positive lifecycle assay;
screening 1256 20 confirmed USP47 Entry immunofluorescence;
library pools candidates— flow cytometry; Western
(Thermo) 127 selected blot; other viruses: PR8
(H3N2), pandemic
California (H1N1); GO
analysis
CRISPR/ Ma et al. West Nile virus 293FT Pooled Custom array Expansion 12 days Survival Yes Multiple No No EMC2 WNV-induced sgRNA sequences
Cas9 (2015) WNV library oligo time independent death amplified w/nested
pool—PCR 28,429 sgRNAs EMC3 PCR + sequenced;
amplified- sgRNAs with Western blot; flow
reads more SEL1L
cloned into cytometry; other viruses
plasmids— than WNV-NY99, SLEV
lentiviral 10 identified
vectors—
transduced—
transfected
with Cas9
We searched the literature for large-scale genetic screens using human viruses (or components of human viruses) and any of the three functional genomic screening strategies covered in this review. We then provided some of the major characteristics of each individual screen, including the virus, cell line, format, library, screen timelines, selection criteria, any main candidate focused upon,
and the assays used for follow up and mechanistic validation if applicable. Not applicable (N/A).
3.1 RNAi Pooled Screening

Retroviral expression of complex cDNA libraries in tissue culture cells
predated the arrival of RNAi and was readily adapted to stably express short
hairpin RNAs (shRNAs) that were subsequently processed into dsRNAs
suitable for directing the destruction of target mRNAs by RISC. Three
major pooled retroviral shRNA libraries were initially constructed, the
Hannon–Elledge Open Biosystems shRNA library (Paddison et al., 2004;
Silva et al., 2005), the RNAi Consortium (TRC) library (Root et al.,
2006), both of which are lentiviral and have whole-genome coverage,
and a smaller subgenomic gamma-retroviral library, the Bernards shRNA
library (Berns et al., 2004), with additional libraries following
(Boettcher & Hoheisel, 2010). While differing in their design (Hannon–
Elledge-OB being comprised of microRNA-context shRNAs vs. TRC
and Bernards being made up of simple shRNAs) these reagents all produce
siRNAs resulting in alterations in target gene mRNA expression. Each gene
is typically targeted by three or more distinct shRNAs resulting in library
complexities of 100K+ unique shRNAs. These pooled shRNA retroviral
vectors are then packaged into complex populations of retroviruses
(Fig. 1). A population of cells is transduced with the retroviral pools and then
the cells are placed under selection to identify any modulations in viral rep-
lication conferred by the integrated provirus shRNA. For all pooled library
screens, a key point is that each distinct shRNA vector should be over-
represented by 1000-fold in the selected cell population to minimize bot-
tle neck effects during the screening process; this tenet is also important for
the pooled CRISRP/Cas9 screens to be discussed below.
Pooled shRNA screens for host–virus interactions include an early effort
to identify HIV-1 host factors required for replication in a T cell line, as well
as two screens for IAV host factors (Su et al., 2013; Tran et al., 2013; Yeung
et al., 2009). Advantages of pooled screening are its relative low cost and the
higher knockdown efficiencies realized using retroviral transduction of cell
types that are not readily transfected with siRNAs, e.g., primary cells or sus-
pension cells. In addition longer term screening assays that may require
weeks to run are best performed with stably expressed shRNA libraries since
transient transfection of siRNAs in dividing cells peaks and falls quickly
>7 days posttransfection. The lack of published pooled shRNA screens
for virus–host interactions is noticeable and likely stems from the limitations
in readout when using a pooled strategy, as well as the issue of phenotypic
penetration in the setting of partially decreased gene expression or
Figure 1 Functional genomic strategies for elucidating host–virus interactions. Sche-

matic of the workflow for each of the three functional genomic screening strategies dis-
cussed in this review, RNAi (left) using either arrayed (siRNA) or pooled (shRNA)
approaches, haploid cells with retroviral gene trapping (haploid cells, middle), and
CRISPR/Cas9, using conventional catalytic (Cas9), CRISPR activators (CRISPRa, Cas9a),
or CRISPR repressors (CRISPRi, Cas9i, right). Typical validation and mechanistic studies
are outlined at bottom.
hypomorphism. Two prevailing readouts have been used for pooled

shRNA screening, flow cytometry-based sorting of cell populations, e.g.,
high and low expression of viral proteins or a fluorescent marker protein,
as a surrogate for infection, as well as survival screens where a cytopathic
virus destroys all of the cells that it can infect and spares any cells which are
missing a critical host factor, with the survivors undergoing expansion and
gene enrichment. The complete loss of gene expression (null phenotype) is
unlikely to be achieved using RNAi, and in particular in a population of cells
stably transduced with complex shRNA library. This stems from each cell in
the screened population expressing only a single shRNA-expressing provi-
rus. Even if a cell is transduced by more than one shRNA-expressing virus, it
is highly improbable that both shRNAs will have the same target. It is dif-
ficult for a single proviral shRNA to have enough expression to efficiently
deplete the mRNA for its intended target. Accordingly, a pooled shRNA
screen using a cytopathic virus and cell survival as a means of gene enrich-
ment might not find the host receptor for the virus because there will be
some low level of receptor expression remaining (hypomorphism) that
could render the cell susceptible to infection and death.
Detecting the shRNAs enriched for at the end of a pooled screen is done
using next-gen sequencing technologies which specialize in short reads,
combined with informatics programs such a bowtie to assign and quantitate
the number of sequencing reads per shRNA in comparison to the starting
population. Candidates are selected for follow up based on novelty and
on the reagent redundancy principle which states that the likelihood of a
gene being a true positive increases as the number of enriched orthologous
shRNAs targeting that gene increases (Echeverri et al., 2006). For example,
a gene targeted by three independent shRNAs that are enriched in the next-
gen sequencing readout is more likely to be a true positive than a gene
targeted by only one enriched shRNA. As we will see, the reagent redun-
dancy principle is also important for selection of candidates using all of these
functional genomic screening strategies, including the haploid cell screens
(number of independent retroviral insertions) (Carette et al., 2009).
3.2 Arrayed RNAi Screening

The high-throughput transfection of arrayed cDNA libraries into mamma-
lian cells for screening predates RNAi and this approach was readily emu-
lated once large-scale arrayed RNAi reagents and appropriate transfection
lipids were developed. Pioneering work defining human pathogen interac-
tions was done first using insect cell lines and arrayed siRNA libraries
targeting the Drosophila mRNA transcriptome (Cherry, 2011; Hao et al.,
2008; Sessions et al., 2009). Advantages in using the Drosophila system are
that the insect cells take up the siRNAs without the need for transfection
reagents and that their simpler genetic repertoire may lack functional
redundancies which could resist resolution in the more complex human sys-
tem. Obvious shortcomings are that the findings in the fly cell screens
require confirmation in human cells by targeting homologs and that there
are human pathogenic viruses that cannot infect fly cells. Thus, a need arose
for arrayed RNAi reagents for investigating human pathogenic cells using a
human cell-based in vitro system. This need was addressed by four life sci-
ences companies; Dharmacon, Ambion, Sigma, and Qiagen, which each
introduced their own independently designed whole-genome siRNA
libraries.
Methods for performing an arrayed siRNA library screen have been
reviewed by us and others in detail elsewhere (Barrows et al., 2014;
Chin & Brass, 2013; Panda & Cherry, 2015). Briefly, the project begins with
optimizations of both siRNA transfection and infection conditions in the
plate format chosen for the screen, with 384-well plates being strongly pre-
ferred due to lower amounts of siRNA library needed and the decreased
costs and work load using this smaller scale. Once optimized the screen
begins with the transfection of the arrayed library in either duplicate or trip-
licate (Fig. 1); this is usually done in a reverse transfection format with the
siRNAs and lipid mixture added to the well first, followed by the cells added
in suspension. Target mRNA depletion and decreased protein expression
occurs over 1–4 days depending on assay conditions. The longer knock-
down periods prior to viral challenge likely improve the observed pheno-
types because of increased levels of target protein decay and the dilution
effect of added cell divisions. The siRNA-transfected cells are then infected
with virus for typically one or two viral lifecycles followed by an assessment
of viral replication using either a microscope or plate reader. After the pri-
mary arrayed whole-genome screen, the individual siRNAs in the pools of
select candidate genes are then rescreened individually in the validation
round and the reagent redundancy principle used to select higher confidence
genes for follow up.
Arrayed siRNA screening has several advantages over a pooled shRNA
approach. For instance, employing an arrayed siRNA library permits shorter
term transient transfection-based screens (Fig. 1; Table 2). Additionally the
introduction of large effective concentrations of siRNAs into the cells using
high efficiency lipid-mediated transfection improves target mRNA deple-
tion producing enhanced phenotypic penetrance. Moreover, by depleting
just one-gene-per-well an arrayed screen permits the selection of candidate
genes based on more subtle gradations in phenotypes than when using
pooled screening readouts. For instance using this format, readouts of viral
Table 2 Strengths and Weaknesses of Functional Genomic Screening Strategies for Human–Virus Interactions
RNAi Arrayed (siRNA) RNAi Pooled (shRNA) Haploid Cells Pooled CRISPR/Cas9 Pooled
Strengths • Can use diverse cell lines • Can use diverse cell lines • Finds receptors, entry • Can use diverse cell lines
• High transfection • Viral transduction works factors, and associated • High specificity: less off-
efficiency of adherent better for suspension cells genes target effects
cells • Good format for • High specificity: less false • Generates null phenotype
• Increased sensitivity: suspension cells positives • Viral transduction works
arrayed format permits • Long-term screens • Generates null phenotype better for suspension cells
selection of a gradation of (>10 days) • Long-term screens than transfection
phenotypes • Lower cost than siRNA (>10 days) • Good format for
• Library key permits rapid once the shRNA library is • Low cost to perform suspension cells
gene identification purchased survival screens • Finds receptors, entry
• Arrayed format permits factors, and associated
screening for viral genes
budding/production • High specificity
• Can perform image-based • Long-term screens
screens and investigate (>10 days)
cell biology phenotypes • Can inhibit or activate
• Creates hypomorphs gene expression
permitting many essential (CRISPRa and CRISPRi)
genes to be screened • Active in the nucleus
• Readily validated using • Can remove large sections
reagent redundancy of a targeted locus (e.g.,
• Short-term screens inactivate lncRNA genes)
<10 days • First-generation reagents
graciously shared at low
cost on Addgene
• Low cost to perform
survival screens
Continued
Table 2 Strengths and Weaknesses of Functional Genomic Screening Strategies for Human–Virus Interactions—cont'd
RNAi Arrayed (siRNA) RNAi Pooled (shRNA) Haploid Cells Pooled CRISPR/Cas9 Pooled
Weaknesses • Off-target effects • Off-target effects • Random insertion • PCR/next-gen
• False negatives • False negatives mutagenesis cannot sequencing needed to
• Hypomorphs can • PCR/next-gen specifically target a gene identify hits
produce false negatives sequencing needed to • Only two available • Relatively slower
• Loss-of-function only identify hits haploid cell lines validation
• RISC has questionable or • Loss-of-function only • PCR/next-gen • Cannot do cell biology or
limited activity in the • RISC has questionable or sequencing needed to imaging screens
nucleus limited activity in the identify hits • Arrayed lentiviral format
• Difficult to transfect nucleus • Loss-of-function only will be cumbersome
primary cells or • Cannot do cell biology or • Retroviral insertion bias • Arrayed transfectable
suspension cells imaging screens may not permit saturation CRISPR components
• Difficult to use suspension • Target knockdown more • Cannot do cell biology or (sgRNAs, Thermo, and
cells in an arrayed format difficulty due to only one imaging screens IDT) are subgenomic at
• Expensive to purchase, shRNA-producing • Arrayed format is present with whole-
use, and maintain libraries provirus per cell subgenomic and requires genome reagents likely
• Requires expensive high- long-term culturing and obtained at high cost
throughput microscope storage of many
or plate reader for analysis thousands of cell lines
with likely high cost
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de ces conversions à la Dostoïewsky et abandonnant les erreurs
qu’il croyait vérités, sinon la vérité qu’il croit erreur, en un
foudroiement final… Nulle part, certes, les vicissitudes du pouvoir
(arbitral, tyrannique, renversé), — les superstitions qui
accompagnent le doute, — d’un côté les soubresauts de la
conscience populaire, d’un autre l’anxiété d’attendre, — les
désespoirs et leurs blasphèmes, — l’espérance, jusqu’au dernier
souffle, vivace, — la brutalité aveugle du fait réveilleur — que sais-
je !… ne peuvent se condenser et éclater avec autant de force que
dans cette première situation, de nos jours méconnue…
L’enthousiaste sympathie que la France a ressentie durant la moitié
de ce siècle pour la Pologne, celle qu’elle a manifestée, en tant de
circonstances, à l’Écosse, puis à l’Irlande, trouveraient ici leur
expression tragique ; le cri d’humanité avec lequel ce prêtre, au
massacre de Fourmies, a rallié à l’Église une fraction de la France
révolutionnaire, — le culte des morts, cette dernière, primitive et la
plus indestructible forme du sentiment religieux, — l’agonie, drame
qui nous attend tous, l’agonie se traînant vers un coin d’ombre
comme une bête forcée, — et ce profondément humilié désir de
l’homme qu’un meurtre a privé de ce qu’il avait de plus cher,
supplication misérable, à deux genoux, qui fit pleurer même, en sa
sauvage rancune, le dur Achille et lui fit oublier son serment, — eh
quoi ! toutes ces fortes émotions, d’autres encore, sont dans cette
situation première, elles ne sont pleinement que là, — et notre art
oublie cette situation…
II e SITUATION
Le Sauveur
(Techniquement : Infortuné — Menaçant — Sauveur)
… La réciproque, en quelque sorte de la Ire, où le faible se

réfugiait auprès d’une puissance indécise, tandis que c’est, à
présent, au-devant du faible, sans espoir, le Protecteur inattendu qui,
de lui-même, se dresse subitement.
A — Condamné, voir apparaître un sauveur
chevaleresque : — Andromèdes de Sophocle, d’Euripide et de
Corneille. Ex. fragm. : 1er acte de Lohengrin, 3e acte du Tancrède de
Voltaire, rôle du patron généreux dans Boislaurier (M. Richard, 1884.
Ce dernier exemple et le suivant montrent particulièrement l’honneur
du faible en jeu). Ex. hist. : Daniel et Suzanne ; divers exploits de la
chevalerie. Ex. ord. : l’assistance judiciaire. Le dénouement de
Barbe-Bleue (la parenté s’y ajoute, sous la condition la plus normale,
celle de frères défendant leur sœur, et grandit le pathétique par un
moyen des plus simples, mais oublié des dramaturges).
B 1 — Être remis sur le trône par ses enfants (voir la
donnée « Retrouver ») : — Égée et Pélée de Sophocle, Antiope
d’Euripide. Ces enfants ont été jadis abandonnés dans : Athamas I
et Tyro de Sophocle aussi (ce goût du futur auteur d’Œdipe à Colone
pour les fables où l’Enfant joue ainsi un rôle de sauveur et de
justicier ne forme-t-il pas un assez amer contraste avec le sort qui
attendait le poète dans son ultime vieillesse ?).
2 — Être secouru par des amis ou des étrangers
recueillis : — Œnée, Iolas, Phinée de Sophocle. Ex. fragm. : 2e
partie d’Alceste d’Euripide. — Être protégé par l’hôte qui donna
asile : — Dictys d’Euripide.
Rien qu’à parcourir ces subdivisions, on aperçoit ce que nos
écrivains auraient dû tirer de la IIe des données. Elle doit être,
franchement, quelque peu attrayante, pour qu’une fois de plus
l’humanité l’ait choisie, cette histoire du Sauveur, il y a deux mille
ans bientôt, et depuis lors ait tant souffert, aimé, pleuré, à chacun
des souvenirs qui lui en reviennent. Cette Situation, c’est aussi la
Chevalerie, l’héroïsme si original et individuel du moyen-âge ; — et
c’est la Révolution française devant les peuples ! Malgré cela, l’art, si
l’on excepte l’aristophanerie de Cervantès et l’éblouissant et unique
éclair jailli de l’armure d’argent de Lohengrin, l’art, à peine encore, y
songea…
III e SITUATION
La Vengeance poursuivant le crime.
(Techniquement : Vengeur — Coupable)
La vengeance est une joie divine, dit l’Arabe ; et elle fut celle plus
d’une fois, en effet, du Tout-Puissant d’Israël. Les deux poèmes
homériques se dénouent chacun par une enivrante vengeance, de
même que la légende des Pandavas, à l’orient des littératures ; pour
les races latine et espagnole, c’est le plus satisfaisant spectacle
toujours que celui de l’individu capable de se faire justice légitime,
encore qu’illégale. Tant il est vrai que vingt siècles de christianisme,
après cinq siècles de socratie, n’ont pu substituer à cette base de
l’honneur le pardon. Et ce dernier, même sincère (chose rare !),
qu’est-il, — sinon la subtile quintessence de la vengeance, sur terre,
en même temps que la réclamation d’une espèce de wergeld, vis-à-
vis du ciel ?
A 1 — Venger un ascendant assassiné : — La Chanteuse
(drame chinois anonyme), la Tunique confrontée (de la courtisane
Tchang-koué-pin), les Argiens et les Épigones d’Eschyle, Alétès et
Érigone de Sophocle, les deux Foscari de Byron, Attila de Werner, le
Crime de Maisons-Alfort (M. Cœdès, 1881. La vengeance en ces
deux derniers cas, ainsi que pour le sujet suivant, s’accomplit par la
fille et non le fils). — Ex. romanesque et ordinaire : Colomba de
Mérimée ; la plupart des vendette. Dans le Prêtre (M. Buet, 1881), la
lutte psychologique entre le pardon et la vengeance est
spécialement représentée.
2 — Venger un descendant assassiné : — Nauplius de
Sophocle. La fin de l’Hécube d’Euripide. Ex. épique : Neptune
poursuivant Ulysse à cause de la cécité de Polyphème.
3 — Venger un descendant déshonoré : — Le meilleur
alcade, c’est le Roi (Lope de Véga), l’Alcade de Zalaméa (Calderon).
Ex. hist. : la mort de Lucrèce.
4 — Venger épouse ou époux assassiné : — Pompée de
Corneille. Ex. contemporain : les tentatives de Mme Vve Barrême.
5 — Venger épouse déshonorée ou que l’on tenta de
déshonorer : — Ixions d’Eschyle, de Sophocle et d’Euripide ; les
Perrhœbides d’Eschyle. Ex. historique : le lévite d’Ephraïm. —
Même cas, où l’épouse n’a été qu’insultée : — la Chevelure
renouée de Bhatta Naragma, les fils de Pandou outragés de
Radjasekhara. Ex. ord. : un bon nombre de duels.
6 — Venger sa maîtresse assassinée : — Aimer après la mort
(Calderon), Amhra (M. Grangeneuve, 1882), Simon l’enfant trouvé
(M. Jonathan, 1882).
7 — Venger son ami assassiné, tué : — Les Néréides,
d’Eschyle. Ex. contemporain : Ravachol. — Cette vengeance est
perpétrée sur la maîtresse du vengeur : — La Casserole (M.
Méténier, 1889).
8 — Venger sa sœur séduite : — Clavijo de Gœthe, les
Bouchers (Icres, 1888), la Casquette au père Bugeaud (M. Marot,
1886). Ex. romanesques : la Kermesse rouge dans le recueil de M.
Eekhoud, la fin du Disciple de M. Bourget.
B 1 — Se venger d’avoir été dépouillé sciemment : — La
Tempête de Shakespeare (et l’opéra qui en est issu en 1889). Ex.
contemp. : Bismarck dans sa retraite de Varzin.
2 — Se venger d’avoir été dépouillé parce que disparu : —
Les Joueurs d’osselets et Pénélope d’Eschyle, le Repas des
Achéens de Sophocle.
3 — Se venger d’avoir été assassiné : — Le ressentiment de
Te-oun-go par Kouan-han-king. Même cas et sauver, à la fois, un
être aimé d’une erreur judiciaire : La Cellule no 7 (M. Zaccone,
1881).
4 — Se venger d’une fausse accusation : — Les Phrixus de
Sophocle et d’Euripide, Monte-Cristo de Dumas, la Déclassée (M.
Delahaye, 1883), Roger-la-Honte (M. Mary, 1881).
5 — Se venger d’un viol : — Térée de Sophocle, les Cenci de
Shelley (parricide pour punir et faire cesser l’inceste).
6 — Se venger d’avoir été dépouillé des siens : — Le
Marchand de Venise, un peu Guillaume Tell, et (en rentrant dans
l’« Adultère ») le triomphe de M. Armingaud.
7 — Trompé, se venger sur tout un sexe : — Jack
l’Éventreur (MM. Bertrand et Clairian, 1889) ; héroïnes fatales des
romans et pièces « second Empire » : l’Étrangère, etc. Cas
symétrique appartenant à la nuance A : — le mobile, peu
vraisemblable, de la corruptrice du Possédé de Lemonnier.
Elle offre une première apparition ici du personnage grimaçant
qui forma clef de voûte au drame noir et extraordinaire, — du
« traître ». Dès le début de notre troisième donnée, nous aurions pu
les évoquer à chaque pas, ce traître et sa politique profonde qui fait
parfois sourire : don Salluste présidant à Ruy-Blas, Iago à Othello,
Guanhumara aux Burgraves, Homodei à Angelo, Mahomet à la
tragédie de ce nom, Léontine à Héraclius, Maxime à la Tragédie de
Valentinien, et à celle d’Aétius, Émire à Siroès, Ulysse aux
Palamèdes grecs.
Si remaniée qu’ait été de nos jours la IIIe Situation, maint cas
ancien attend son rajeunissement ; et surtout d’innombrables
lacunes persistent : en effet, parmi les liens qui peuvent unir le
« Vengeur » à la « Victime », plus d’un degré de parenté fut omis,
ainsi que la majorité des attaches sociales ou contractuelles ; la liste
des torts qui peuvent provoquer ces représailles est bien loin d’être
épuisée, comme on s’en assurera en énumérant les variétés de
délits possibles contre les personnes et les propriétés, les nuances
d’opinions et de partis, et les diverses manières dont s’accommode
une insulte ; enfin combien et quelles sortes de relations existent,
d’autre part, entre le « Vengeur » et le « Coupable » ! Et il ne s’agit
jusqu’à présent que des prémisses de l’action.
Que l’on y mette, maintenant, toutes les allures, lentes ou
foudroyantes, tortueuses ou directes, sûres ou éperdues, que va
prendre le châtiment, les mille ressources dont il dispose (car, recuit
en son désir concentré, il se choisit les plus chatoyants effets), puis
les points qu’il peut viser, de sa meurtrière ; ensuite les obstacles qui
surgiront du hasard ou de la défensive… Introduisez les figures
secondaires, allant chacune à son but, comme dans la vie, s’entre-
croisant, et croisant le drame…
J’estime assez le lecteur pour ne pas développer davantage.
IV e SITUATION
Venger proche sur proche
(Souvenir de parent victime — Parent vengeur — Parent

coupable)
Au moyen de l’énergie âpre de la situation qui précède,

augmenter l’horreur de la XVIIe (« Découvrir le déshonneur des
siens »), c’est créer l’action présente, — laquelle s’enferme dans la
vie privée, devenue un enfer pire que le cachot du Puits et du
Pendule d’Edgar Poe. L’atrocité en est telle que la foule, terrifiée,
n’ose intervenir ; elle semble assister, de loin, à quelque scène
démoniaque, se silhouettant dans une maison en flammes.
… Et la foule des dramaturges semble ne pas oser, non plus,
intervenir pour modifier une fois la tragédie grecque, telle quelle
depuis trente siècles d’épouvante…
A nous il est facile, du haut de la « plateforme » retrouvée après
le mot de Gozzi, de supputer les variations infinies à écrire, — en
multipliant les combinaisons que nous venons de voir pour la IIIe
donnée par celles que nous produira la XVIIe.
Mais d’autres germes de fécondité nous arrivent à leur tour avec
les circonstances qui auront déterminé le justicier à agir ; ce serait
un désir spontané chez lui (motif le plus simple) ; — la volonté de la
victime agonisante ou du mort mystérieusement apparu ; — un
serment imprudent ; — le devoir professionnel (quand le Vengeur est
magistrat, etc.) ; — la nécessité de sauver d’autres parents, un être
aimé (c’est ainsi que Talien a vengé les Dantonistes) ou ses
concitoyens ; — l’ignorance de la parenté qui rattache le « Vengeur »
au « Coupable »… Il y aurait encore le cas où cet acte du Vengeur
frapperait le Proche criminel, sans que le Vengeur le reconnût (dans
une salle sombre, je suppose). Il y aurait le cas où ce prétendu acte
de vengeance ne serait que le résultat d’une erreur : le Parent dit
coupable serait découvert innocent, et le pseudo-Exécuteur, trop
stoïque, apprendrait qu’il n’est qu’un criminel détestable. Il y aurait…
On a traité :
A 1 — Venger son père sur sa mère : — Les Choéphores
d’Eschyle, les Électres de Sophocle, d’Euripide, d’Attilius, de Q.
Cicéron, de Pradon, de Longepierre, de Crébillon, de Rochefort, de
Chénier et l’opéra de Guillard, les Orestes de Voltaire et d’Alfieri ;
puis les Épigones de Sophocle, les Eriphyles de Sophocle et de
Voltaire ; et enfin Hamlet, où se reconnaît si bien la méthode
constante dont le poète rajeunissait ses sujets : par un changement
presque antithétique des caractères et du milieu.
2 — Venger sa mère sur son père : — Zoé Chien-Chien (M.
Matthey, 1881), où le parricide s’équilibre d’une passion incestueuse
et se perpètre par la fille au lieu du fils. Saluons, en passant, cet
unique effort original de notre drame devant la Situation IV.
B — Venger ses frères sur son fils (mais sans
préméditation et presque en tombant dans la donnée
« Imprudence ») : — Atalante d’Eschyle et Méléagre de Sophocle.
Sur 20 œuvres, 18 donc de la même nuance, 17 de la même
sous-nuance, 13 sur le même sujet. Deux nuances et une sous-
nuance en tout d’employées. Amusons-nous seulement à compter
celles qu’on oublia :
Le père du justicier sera vengé par celui-ci sur son propre frère.
Sur sa sœur. Sur sa maîtresse (ou sur son amant, car chacun des
cas ci-énumérés se dédouble, selon le sexe du vengeur). Sur sa
femme (ou son mari). Sur le propre fils du justicier. Sur sa fille. Sur
son oncle paternel. Sur son oncle maternel. Sur sa tante paternelle.
Sur sa tante maternelle. Sur son grand’père paternel, ou maternel ;
sur sa grand’mère paternelle, ou maternelle. Sur son frère utérin, sur
sa sœur utérine, etc. Sur tel allié de la famille (beau-frère, belle-
sœur, etc.) ou collatéral. — Cette cinquantaine de variations dont
une vingtaine au moins sont pathétiques se répétera
successivement pour chacun des cas : venger un frère, une sœur,
un époux, un fils, un aïeul, et ainsi de suite.
On fera, pour changer, assouvir ces vindictes, non sur la
personne du coupable, mais sur un être qui lui soit cher (c’est de
cette manière que Médée et Atrée frappèrent Jason et Thyeste sur
les enfants de ceux-ci) ; des objets insensibles, quelquefois, tiennent
aussi lieu de victimes.
V e SITUATION
Traqué
(Châtiment — Fugitif)
La IIe situation était la réciproque de la Ire ; la situation traqué

représente aussi une transposition au passif des IIIe et IVe et de
toutes celles, en somme, où un danger poursuit une tête. Pourtant
une démarcation reste creusée : dans Traqué l’élément sévisseur
se tient au second plan ou n’en n’occupe, voire, aucun, pouvant être
invisible, abstrait… Seul, le Fugitif nous intéresse, parfois innocent,
toujours excusable ; car la faute, — s’il y en eut une — ainsi reculée
dans le vague antérieur, apparaît fatale, acquise ; nous ne la
discutons plus ni ne la reprenons, ce serait oiseux, mais
sympathiquement nous en subissons les conséquences avec notre
héros, qui n’est plus, quel qu’il soit, qu’un Homme en danger, c’est-
à-dire un de notre parti, de notre bande, un moi. On se souvient de
la vérité jetée à la face des hypocrisies par Wolfgang Gœthe :
qu’ayant chacun en nous, à l’état de puissance, tous les crimes qui
se commirent jamais, il ne s’en produit pas un qu’il ne nous soit
loisible d’imaginer, très bien, accompli par nous-mêmes. Nous nous
sentons, on dirait, complices des pires attentats. Ce qui s’explique
d’ailleurs en pensant que nous en avons de bien autres parmi la
ligne de nos hérédités ; et la valeur d’une vertu consisterait, peut-
être, dans ce blasement d’instruite devant les fautes qui lui font
antithèse ; auquel cas, hérédité et milieu, loin d’être des fatalités
oppressives, deviendraient les germes de la sagesse qui, la satiété
venue, en triomphe : voilà pourquoi le génie (non plus une névrose,
mais l’inattendue victoire sur les névroses) naîtrait surtout dans des
familles qui lui transmirent l’expérience de la folie ou parmi des
malheureux qui lui en montrèrent, dans leur destruction mentale,
l’anatomie entière. C’est à acquérir d’une façon moins coûteuse
cette expérience de l’erreur et des catastrophes, c’est à en évoquer
vivement pour mieux dire les innombrables souvenirs qui dormaient
dans notre sang, afin d’en purifier à force de répétitions et y
accoutumer nos âmes ombrageuses, que paraît correspondre le
besoin d’une littérature à personnages et à émotions ; comme la
musique, elle finit, exorcisme divin, par « adoucir les mœurs » et
nous douer de cette force dans le sang-froid, base de toute vertu…
— Le caractère d’isolement, propre à la situation V donne une
singulière unité à l’action et un champ très net pour l’observation
psychologique ; la variété des décors et le romanesque des
évènements n’y font non plus défaut.
A — Traqué par la justice pour brigandage, politique,
etc. : — Louis Pérez de Galice et la Dévotion à la Croix de
Calderon, les Brigands de Schiller. Ex. historique : les
conventionnels proscrits ; la duchesse de Berry. Ex. roman. :
Rocambole, romans de Gaboriau. Ex. ord. : histoires de police.
B — Poursuivi pour une faute d’amour : — Très injustement :
Indigne ! (M. Barbier, 1884) ; — d’une façon plus juste : Don Juan de
Molière et Le Festin de Pierre de Th. Corneille (sans parler des
œuvres de Tirso de Molina, Tellez, Villiers, Sadwell, Zamora,
Goldoni, Grabbe, Zorilla, Dumas père, etc.) ; — pour des raisons très
justes : Ajax Locrien de Sophocle. Ex. ordinaires : depuis les
mariages imposés aux séducteurs jusqu’aux rafles policières sur les
trottoirs.
C — Héros en lutte contre une puissance : — C’est le
Prométhée enchaîné d’Eschyle, le Laocoon de Sophocle ; puis le
rôle de Porus dans les Alexandres de Racine et de Métastase,
Nicomède, Gœtz de Berlinchingen, en partie Egmont, Caton de
Métastase, Adelghis de Manzoni et un côté de son Comte de
Carmagnola, la mort d’Hector au fond de ce Troïlus et Cressida, où
Shakespeare se posait déjà, d’une attitude si significative, en contre-
pied d’Homère ; c’est de nos temps Nana-Sahib de Richepin (1883),
Édith (M. G. Bois, 1885), et la tétralogie des Nibelungen ; c’est
l’Ennemi du Peuple.
D — Un pseudo-fou en lutte contre un aliéniste
iagique [6] : — La Vicomtesse Alice (M. Second, 1882).
[6] Tiré de Iago ; néologisme qui me paraît utile.
VI e SITUATION
Désastre
(Ennemi vainqueur ou Messager — Puissant frappé)
La Peur même, l’inattendu et la catastrophe, et le grand

renversement des rôles, le puissant est jeté bas et le faible exalté !
Refrain des livres bibliques et immortelle clameur de la chute d’Ilios,
dont nous pâlissons comme d’un pressentiment.
A 1 — Subir une défaite : — Les Myrmidons et les Perses
d’Eschyle ; les Pasteurs de Sophocle. Roman : la Débâcle de Zola.
L’histoire n’est faite que de récits de ce genre.
2 — La patrie détruite : — Les Xoanéphores de Sophocle,
Sardanapale de Byron (se confond avec B et rappelle aussi vers le
dénouement la Ve). Histoire : la Pologne, les grandes Invasions.
B — Un roi renversé (réciproque passive de la VIIIe) — Henri
VI et Richard II de Shakespeare — Histoire : Charles Ier, Louis XVI,
Napoléon, etc. ; et en leur substituant un puissant quelconque :
Colomb, Lesseps et tous les ministres disgrâciés. Romans : fin de
Tartarin, l’Argent, César Birotteau.
C 1 — Subir l’ingratitude. — De toutes les attaques du
Malheur, naturellement la plus poignante : Archélaüs d’Euripide (sauf
le dénouement où l’action se renverse), Timon d’Athènes et le roi
Lear de Shakespeare, début de son Coriolan, Marino Faliero de
Byron, un côté du Comte de Carmagnola de Manzoni. M. de
Bismarck renvoyé par M. de Hohenzollern fils. Les martyres, les
dévouements méconnus par la stupide vanité de ceux qui après
avoir bénéficié de ces sacrifices s’y croient supérieurs, les trépas les
plus magnanimes se sont dessinés sur ce triste fond : la mort de
Socrate et la Passion n’en sont que les exemples les plus célèbres.
2 — Subir un injuste ressentiment. — (Se confond avec
l’« Erreur judiciaire ») : les Salaminiennes d’Eschyle, Teucer de
Sophocle, etc.
3 — Subir un outrage : — Ier acte du Cid, Ier acte de Lucrèce
Borgia. Le point d’honneur offre mieux que ces simples épisodes : le
roman russe de l’Esprit Souterrain l’a comme pressenti. Qu’on
imagine après sa bastonnade un Voltaire plus sensible encore, plus
« hermine » et réduit à l’impuissance, jusqu’à mourir de désespoir.
D 1 — Être abandonné par son amant ou son époux : —
Faust, Ariane de Th. Corneille, début des Médées.
2 — Enfants perdus par leurs parents : — Le Petit Poucet.
Mais si les nuances tout individuelles B, C et D n’ont pas été
développées de beaucoup autant qu’il était facile de le faire, que dire
des cas de Désastres Sociaux (comme la nuance A) ? Shakespeare
n’a pu aller assez loin dans cette voie grandiose. Chez les Grecs
seuls, une telle œuvre édifiée présenta du même coup cette
conception des événements humains, grande, fatale et poétique,
avec laquelle Hérodote devait un jour créer l’histoire.
VII e SITUATION
En Proie
(Maître ou Malheur — Faible)
Ici se voit qu’il n’y a aucune limite dans l’infinie douleur : au fond
de la détresse en apparence la pire, s’en ouvrira une plus affreuse.
Point de pitié dans les cieux qui au-dessus de nos nuées sont
démontrés complètement noirs et vides. On dirait un dépècement
savant et féroce du cœur que cette VIIe situation, celle du
pessimisme par excellence.
A — L’innocence victime d’ambitieuses intrigues : — La
Princesse Maleine ; La Fille naturelle de Gœthe, les Deux Jumeaux
de Hugo.
B — Dépouillée par ceux qui devaient la protéger : — Les
Convives et le début des Joueurs d’Osselets d’Eschyle (au premier
frémissement du grand arc aux mains du Mendiant inconnu, quel
souffle d’espérance devait s’élever, enfin !), les Corbeaux de
Becque.
C 1 — La puissance dépossédée et misérable : — Débuts des
Pélées de Sophocle et d’Euripide, du Prométhée enchaîné, de Job ;
Laërte dans son jardin.
2 — Favori ou familier se voit oublié : — En détresse (M.
Fèvre, 1890.)
D — Des malheureux sont dépouillés de leur seul espoir :
— Les Aveugles de Maeterlinck.
Et que de cas encore ! les Juifs en captivité, la Case de l’oncle
Tom, les horreurs de la guerre de cent ans, les ghettos envahis,
l’appareil qui attire la foule aux reproductions du bagne et des
scènes de l’Inquisition, l’attrait des Prisons de Pellico, de l’Enfer du
Dante, l’amertume enivrante du Gautama, de l’Ecclésiaste, de
Schopenhauer.
VIII e SITUATION
Révolte
(Tyran — Conspirateur)
Réciproque partielle, comme j’ai dit, de B de la VIe.

L’intrigue, si chère au public de ces trois derniers siècles, est du
moins fournie par la nature propre du sujet que nous abordons.
Mais, par un étrange hasard, on l’a presque toujours traité, au
contraire, avec la plus grande candeur. Une ou deux péripéties,
quelques surprises vraiment trop faciles à prévoir et étendues
uniformément à tous les personnages de la pièce, voilà les
agréments presque invariables qu’on a attachés à cette action, — si
propice pourtant aux doutes, à l’équivoque, l’« entre chien et loup »,
crépuscule dont la vague incertitude ne prépare que mieux l’aurore
de la révolte et de la liberté !
A 1 — Conspiration d’un individu surtout : — La Conjuration
de Fiesque de Schiller, Cinna de Corneille, un peu du Catilina de
Voltaire (cette tragédie appartient à « Ambition », XXXe), Thermidor ;
la Conspiration du général Malet (M. Augé de Lassus, 1889).
2 — Conspiration de plusieurs : — La Conspiration des Pazzi,
d’Alfieri ; le Roman d’une Conspiration (d’après le roman de M.
Ranc, par MM. Fournier et Carré, 1890).
B — Révolte. 1, d’un individu qui entraîne les autres : —
Egmont de Gœthe (et avec ce drame l’espèce de parodie qui en fut
jouée naguère à Paris sous l’euphémisme bien connu d’adaptation),
Jacques Bonhomme (M. Maujan, 1886), la Mission de Jeanne d’Arc
(M. Dallière, 1888). Roman : Salammbô. Histoire : Solon feignant la
folie.
2, de plusieurs : — Fontovéjune de Lope de Véga ; Guillaume
Tell de Schiller, Germinal de Zola, les Tisserands de Silésie de M.
Hauptmann (drame interdit en 1893 avec l’approbation d’un
Parlement peu après dissous), et l’Automne de MM. Paul Adam et
Gabriel Mourey (drame interdit en 1893 avec l’approbation d’un
autre Parlement dès avant dissolu). — Roman : partie de la Fortune
des Rougon de Zola. Histoire : la prise de la Bastille et les
nombreuses émeutes de ce siècle.
Particulier, comme on voit, aux scènes modernes, ce genre
d’action a donné de beaux drames virils à l’Angleterre, à l’Espagne,
à l’Italie et à l’Allemagne, d’un caractère autoritaire et violent dans
les deux premiers pays, généreux et jeune dans les deux derniers.
La France, à coup sûr, mieux qu’aucune est faite pour comprendre
et rendre de telles émotions.
Mais… Thermidor fut interdit « de peur » qu’il ne froissât des
amis, centenaires apparemment, de Maximilien ; le Pater « de peur »
qu’il ne déplût à des communistes ; Germinal de Zola, l’Automne
d’Adam et de Mourey (deux tableaux peints en nuances quelque peu
différentes, les titres l’indiquent assez) furent arrêtés « de peur »
d’insurger quelques conservateurs ; l’Argent d’autrui de M. Hennique
le fut un certain temps de « peur » de choquer des gens de finance,
actuellement sous les verrous ; Lohengrin (sujet celtique), longtemps
de « peur » d’irriter six chauvins français illettrés ; un nombre infini de
drames « de peur » de fâcher l’Allemagne, ou nos diplomates de
salon qui en parlent… D’autres encore « de peur » de vexer le Grand
Turc [7] !
[7] Historique. Qu’on se rappelle l’aventure du
Mahomet de M. de Bornier, qu’a fait interdire dans notre
république « franco-russe et libre-penseuse » un individu
que nos lois jugeraient digne des travaux forcés à
perpétuité.
Et pourtant y a-t-il un exemple d’une pièce de théâtre amenant

une calamité nationale, comme on nous en menace ?
Ce prétexte n’est vraiment pas plus sincère que ceux allégués,
par exemple, pour répudier du théâtre toute peinture nette de
l’amour. Il suffirait en effet à nos pudibonds de faire refuser aux
contrôles les enfants (qui d’ailleurs s’y présentent bien rarement
sans être accompagnés). Est-ce donc qu’elle trouve plus dangereux,
notre Bourgeoisie éprise du seul roman, d’écouter en public que de
lire, seule, d’une main, comme disait le XVIIIe siècle ?… Car à notre
art dramatique, demeuré, notez-le, malgré son épuisement, le grand
moyen de propagande, sans rival quoique envié, de la langue et de
la pensée françaises dans l’Europe, — voici qu’on interdit, peu à
peu, de toucher directement : à la théologie (notre libre originalité
depuis le XIIe jusqu’au XVIIIe siècle), — à la politique, — à la
sociologie, — au langage de la Foule pour laquelle il est fait et qui y
assiste, refoulée et tassée de par l’architecture néo-
louisquatorzième, dans l’obscurité étouffante de l’amphithéâtre, —
aux personnes, — aux mœurs criminelles, sauf (pourquoi ? oui,
dites-moi pourquoi ?) à l’adultère, — dont vit, ce qui était fatal, notre
personnel théâtral, au moins deux jours sur trois.
… Les anciens disaient que l’homme en esclavage perd la moitié
de son âme : un dramaturge est un homme.

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3.2 Arrayed RNAi Screening

(Techniquement : Infortuné — Menaçant — Sauveur)

… La réciproque, en quelque sorte de la Ire, où le faible se

(Techniquement : Vengeur — Coupable)

(Souvenir de parent victime — Parent vengeur — Parent

Au moyen de l’énergie âpre de la situation qui précède,

La IIe situation était la réciproque de la Ire ; la situation traqué

(Ennemi vainqueur ou Messager — Puissant frappé)

La Peur même, l’inattendu et la catastrophe, et le grand

(Maître ou Malheur — Faible)

Réciproque partielle, comme j’ai dit, de B de la VIe.

Et pourtant y a-t-il un exemple d’une pièce de théâtre amenant

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