ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.

HCM
KHOA CN HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BỘ MÔN: CN HÓA HỌC

THÍ NGHIỆM
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH CÔNG CỤ
(Tài liệu lưu hành nội bộ)

TH HCM, 03/2020

1
 BÀI 1:

PHƯƠNG PHÁP PHỔ TỬ NGOẠI- KHẢ KIẾN (UV-VIS)

XÁC ĐỊNH Fe TRONG THUỐC BẰNG 1,10-PHENANTROLIN

(PHƯƠNG PHÁP DÃY CHUẨN)
Để xác định sắt ở dạng Fe3+ người ta thường dùng phương pháp so màu với các thuốc thử
thiocyanat, acid salicylic hoặc acid sulfosalicylic; hoặc ở dạng Fe2+ với thuốc thử 1,10-phenantrolin.
Trong bài thực tập này, chúng ta sẽ xác định hàm lượng Fe2+ và Fe3+ trong thuốc bằng thuốc thử
1,10-phenantrolin.
I. NGUYÊN TẮC
Ion Fe2+ tạo phức màu đỏ cam với 3 phân tử 1,10-phenantrolin gọi tên là Ferroin.

2+

2+
Fe + 3 Fe
N N N N
3

Phức tồn tại dạng cation và tồn tại trong khoảng pH rộng từ 2.0 – 9.0, có hấp thu cực đại ở
508nm và hệ số hấp thu phân tử () tại đó bằng 1.1*104 L.mol-1.cm-1. Phức rất bền, có cường độ
màu không thay đổi trong nhiều tháng. Khoảng tuân theo định luật Beer là 0.13 – 5 g/mL.

 I 
Định luật Lambert Beer đuợc phát biểu dưới dạng biểu thức sau:  A  lg o   .l.c  với A là độ
 I 
hấp thu (mật độ quang), Io và I lần lượt là cường độ bức xạ trước và sau hấp thu;  là độ hấp thu
phân tử, l là chiều dày dung dịch mẫu cho bức xạ truyền qua và c là nồng độ chất phân tích trong
dung dịch mẫu đo.
Do chỉ có phản ứng màu chọn lọc giữa 1,10-phenantrolin với Fe2+ (tức là Fe3+ mặc dù cũng
phản ứng với 1,10-phenantrolin nhưng phức lại không có màu) nên ta có thể xác định được lượng
Fe2+ khi có mặt Fe3+. Để xác định được tổng hàm lượng sắt ta khử ion Fe3+ về Fe2+ bằng các chất
khử như hydroxylamin, hydrazin hoặc acid ascorbic.
Trong bài thực tập này, ta xác định Fe2+ và tổng hàm lượng Fe. Từ các dữ kiện đó ta tính được
hàm lượng Fe3+.
II. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ
1. Hóa chất
a. Dung dịch chuẩn gốc: 1000 ppm Fe

2
 Cách pha: Dung dịch Fe (II) tiêu chuẩn: cân chính xác khoảng 3.5110 g muối Mohr
(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O loại tinh khiết phân tích (chọn những tinh thể còn tốt, màu xanh
nhạt). Hòa tan trong 500 mL nước cất hai lần, thêm vào 5mL H2SO4 đậm đặc. Dung dịch
này có thể kiểm tra nồng độ Fe bằng phép chuẩn độ oxy hóa khử, chất chuẩn là K2Cr2O7 hay
KMnO4.
b. Dung dịch chuẩn trung gian: 50 ppm
c. Dung dịch 1,10-phenantrolin 0.5% pha trong ethanol: nước (1:9)
d. Dung dịch hydroxylamin 10% trong nước.
e. Dung dịch HCl 6 M
(Cán bộ PTN chuẩn bị dung dịch a)
Phân nhiệm vụ: SV chuẩn bị hóa chất các mục từ b-f;
Nhóm 1, 2, 3: Điều chế 100 mL dung dịch b đề sử dụng riêng.
Nhóm 1: Điều chế 100 mL dung dịch từ c dùng chung cho tất cả các nhóm
Nhóm 2: Điều chế 100 mL dung dịch từ d dùng chung cho tất cả các nhóm
Nhóm 3: Điều chế 500 mL dung dịch e dùng chung cho tất cả các nhóm (3 lớp)
Nhóm chỉ định: Điều chế 100 mL dung dịch f dùng chung cho tất cả các nhóm
2. Dụng cụ, thiết bị
Máy so màu UV-Vis, cuvet nhựa (mỗi nhóm 7 cuvét); bình định mức 100 mL, pipet các loại.
III. CÁCH TIẾN HÀNH.
1. Điều chế dãy dung dịch chuẩn.
Mỗi nhóm tự xây dựng đường chuẩn riêng cho nhóm.
Lấy vào 6 bình định mức 100 mL chính xác các thể tích Fe2+ 50 ppm theo bảng 1.
Bảng 1: Cách pha các dung dịch Fe2+ để xây dựng đường chuẩn

Nồng độ dãy chuẩn (ppm)

Thể tích (mL) Blank STD1 STD2 STD3 STD4 STD5

0 0.1 0.5 1.0 2.5 5.0

Dung dịch trung gian Fe 50 ppm 0 0.20 1.00 2.00 5.00 10.00

Hydroxylamin 10% (NH2OH) 1.0

Đệm pH 5 5.0

1,10 – phenantrolin 0.5% 1.0

Nước cất Thêm đến vạch mức fiol 100 mL

3
 Phức này ổn định sau 10 phút. Mỗi mẫu chuẩn bị 3 lần

2. Vẽ phổ hấp thu của phức để chọn max:

Mỗi nhóm tự thực hiện vẽ phổ hấp thu của phức để chọn max
Chọn một bình dung dịch chuẩn (STD5) để khảo sát phổ hấp thu của phức.
Chọn chế độ: Wavelength Scan
Sinh viên sẽ khảo sát phổ hấp thu của phức Fe(1,10-phenantrolin)32+ trong khoảng bước sóng
400-700 nm.
Vẽ đồ thị biểu diễn A theo bước sóng. Tìm giá trị bước sóng hấp thu cực đại max.
(SV sử dụng đĩa CD (Không dùng USB), copy số liệu từ máy tính, xử lý excel để vẽ phổ hấp
thu)
3. Xác định Fe trong viên thuốc
Nhiệm vụ của mỗi nhóm:
 Mỗi nhóm tự chuẩn bị một mẫu dược phẩm.
 Mỗi nhóm phân tích mẫu dược phẩm của nhóm mình đồng thời của các nhóm còn lại.
 Phòng thí nghiệm sẽ cung cấp 1 mẫu dược phẩm. Các nhóm cùng phân tích mẫu dược
phẩm này.
 Cung cấp các số liệu kết quả mẫu giữa các nhóm với nhau để báo cáo.
Lưu ý:
Để kết quả phân tích đáng tin cậy. Trong quá trình phân tích cần thực hiện các mẫu để kiểm
soát chất lượng như sau:
 Blank quy trình: thực hiện một mẫu blank theo quy trình phân tích để kiểm soát
nhiễm mẫu (kiểm soát hoá chất, dụng cụ thí nghiệm, môi trường…)
 Mẫu thêm chuẩn: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng,
phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, tính hiệu suất thu hồi. Sinh viên tự tính toán mẫu
thêm chuẩn và báo cáo đến GV trước khi tiến hành thí nghiệm.
 Phân tích mẫu lặp: Mỗi mẫu cần thực hiện 3 lần.
3.1. Lấy mẫu và đồng nhất mẫu:
- Cân ít nhất 10 viên thuốc. Từ đó suy ra giá trị trung bình của từng viên thuốc.
- Dùng cối giã nhuyễn 10 viên thuốc thành bột. Sau đó trộn lại cho đều.
3.2. Quy trình.
3.2.1. Điều chế dung dịch Fe gốc
- Bước 1: Cân chính xác mẫu đã đồng nhất với khối lượng khoảng 1 viên thuốc vào beaker
150mL.

- Bước 2: Thêm 25mL HCl 6M. Khuấy và đợi vài phút. Đậy beaker bằng mặt kính đồng hồ
và đun sôi 15 phút. Thêm nước cất nếu thể tích nhỏ hơn 15ml trong quá trình đun sôi.
- Bước 3: Để nguội khoảng 10 phút, chuyển định lượng vào fiol 100mL. Tráng rửa beaker
và mặt kính đồng hồ vài lần bằng nước ấm. Để nguội đến nhiệt độ phòng và định mức bằng nước
cất 2 lần.
4
 - Bước 4: Lọc dung dịch vào ống ly tâm hoặc giấy lộc, đậy nắp bảo quản phần dịch lọc. Dán
nhãn với thông tin “Dung dịch Fe gốc”

3.2.2. Điều chế dung dịch Fe

Dùng pipet lấy 5,00 ml dung dịch Fe gốc vào bình định mực 100 mL, thêm nước đề ion tới
vạch. Dán nhãn: “Dung dịch Fe pha loãng”

4. Các tiến hành xác định hàm lượng Fe trong viên thuốc
Cách tiến hành:
Với dung dịch Fe pha loãng: Dùng pipet lấy 10 mL mẫu đo vào bình định mức 100 mL được
đánh số 1a, 1b. Bình a dùng để xác định tổng hàm lượng Fe và bình b để xác định riêng Fe2+. Thêm
1.00 mL NH2OH vào bình a, bình b không thêm hydroxylamine, lắc đều, để yên 30 phút để phản
ứng khử diễn ra hoàn toàn, thêm tiếp 5 mL đệm acetat pH 5, 1 mL phenantrolin, dùng nước cất định
mức đến vạch mức. Các dung dịch này ổn định sau 10 phút.
Với mẫu trắng: mẫu xác định cần 2 loại dung dịch mẫu trắng khác nhau. Các dung dịch mẫu
trắng này đều không thêm Fe2+.
- Mẫu trắng cho dung dịch “a”: có hydroxylamin. Thực ra mẫu trắng này chính là mẫu trắng
của dãy chuẩn (bình 0)
- Mẫu trắng cho dung dịch “b”: không có hydroxylamin.
- Độ hấp thu các mẫu trắng được ghị nhận và được trừ với độ hấp thu của các dung dịch “a”
hoặc “b” tương ứng.
Chú ý: do phức Fe2+-1,10-phenantrolin khá bền nên có thể chuẩn bị dãy chuẩn và mẫu ở các
thời điểm khác nhau. Tuy nhiên để đảm bảo độ đúng của phép phân tích, nên chuẩn bị chuẩn và
mẫu đồng thời.

Chuẩn bị mẫu a Chuẩn bị mẫu b

Mẫu
Blank a Bình a Blank b Bình b
Dung dịch Fe pha loãng (mL) 0 10,00 0 10,00
NH2OH 1.00 1.00 0 0
Đệm pH 5 5.00 5.00 5.00 5.00
1,10-phenantrolin 1.00 1.00 1.00 1.00
H2O Thêm đến vạch mức fiol 100 mL
Phức này ổn định sau 10 phút.
Lưu ý: Blank a chuẩn bị tương tự Blank (Bảng 10, do đó không cần chuẩn bị nữa)

5. Chuẩn bị mẫu QC và đo
Mẫu QC do phòng TN chuẩn bị, đã biết trước nồng độ. SV thực hiện chuẩn bị mẫu tương tự
mẫu a và b nhưng pha loãng 20 lần
5
 Chuẩn bị mẫu QCa Chuẩn bị mẫu QCb
Mẫu
Blank QCa Bình QCa Blank QCb Bình QCb
Dung dịch Fe pha loãng (mL) 0 5,00 0 5,00
NH2OH 1.00 1.00 0 0
Đệm pH 5 5.00 5.00 5.00 5.00
1,10-phenantrolin 1.00 1.00 1.00 1.00
H2O Thêm đến vạch mức fiol 100 mL

6. Đo đuờng chuẩn và mẫu:

Đo độ hấp thu quang học của các dung dịch chuẩn và mẫu ở max xác định được theo thí nghiệm
trên, trong cuvet 1cm.
IV. TÍNH TOÁN VÀ XỬ LÝ KẾT QỦA
1. Dựng đồ thị sự phụ thuộc của A theo C.
Xác định lượng Fe(II) và tổng Fe và Fe (III).
Lượng Fe(III) tính từ hiệu hai giá trị Fe tổng và Fe(II).
Hãy biểu diễn lượng sắt ra mg/L hay ppm.
2. Tính toán kết quả theo phương pháp bình phương tối thiểu từ phương trình tuyến tính
bậc nhất (ISO-8466-1)
A = a + bC
Trong đó C là nồng độ tính theo µg/mL
a, b là các hệ số hồi quy.
Tính các hệ số a, b:

n Ci Ai   Ci  Ai
b
n C i2  ( Ci ) 2
2

a
C  A  C C A
i i i i i
2 2
n C  ( C ) i i

Tính phương sai dư:

2

S re2  A i  a  Ai  b  AiCi
 s y2
n2
n là số điểm trên đường chuẩn. f = n – 2 là số bậc tự do.
Tính độ lệch chuẩn cho các hệ số hồi quy a và b:

6
 n
S b  S re
n  C  ( C i ) 2
i
2

S a  S re
C i
2 2
n C  ( C )
i i

Sa
Biện luận về hệ số a: khoảng tin cậy a tính theo công thức:  a  t 0.95, f  và
n
Sb
 b  t 0.95, f  tra hệ số Student trong bảng ở xác suất 0.95 độ tự do f = n – 2.
n
Từ các giá trị trên, thiết lập phương trình hồi quy như sau:
A = (a ± a) + (b ± b)C
Tính nồng độ chưa biết của Cx theo công thức:
A a
Cx  x
b
Tính sai số của mẫu xác định theo phương pháp lan truyền sai số
S re 1 1 n( Ax  Ai ) 2
Sx   
b 
n m b 2 n C i2  Ci 2 
n: là số điểm trên đường chuẩn.
m: số lần đo mẫu xác định.
Ax ; giá trị trung bình của Ax của mẫu thử.
Ai : giá trị trung bình của A của các điểm trên đường chuẩn.
Nồng độ của chất phân tích trong mẫu đo đuợc biểu diễn như sau: Cmâu  C x  t0.95; n  2  S x
100
Nồng độ chất phân tích trong mẫu thực tế: C  Cmâu
V
Lưu ý: hệ số pha loãng (100/v); tùy thuộc vào đường chuẩn, mẫu đo mà có thể thay đổi hệ số
pha loãng, sao cho độ hấp thu A của mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn.

Đánh giá đường chuẩn (độ tuyến tính)

Y=ax+b

+ Đánh giá thông qua R2 (R2  0.995)

+ Đánh giá độ chệch tín hiệu thông qua hệ số QC (QC<5%)

+ Đánh giá độ chẹch nồng độ dựa vào giá trị i (i < 15%)

7
BÀI 2:

PHƯƠNG PHÁP PHỔ TỬ NGOẠI- KHẢ KIẾN (UV-VIS)

XÁC ĐỊNH Fe TRONG THUỐC BẰNG 1,10-PHENANTROLIN

(PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN)
I. NGUYÊN TẮC
Trong bài thực tập này, thực hiện việc xác định sắt cũng bằng thuốc thử 1,10-phenantrolin và đo
độ hấp thu quang học theo phương pháp thêm chuẩn.
Phương pháp thêm chuẩn đuợc sử dụng rộng rãi để xác định nồng độ đúng chất phân tích trong
mẫu đo. Có rất nhiều trường hợp phép đo bị ảnh hưởng bởi các yếu tố của nền mẫu như như độ
nhớt, tỷ trọng, lực ion, các ion cạnh tranh tạo phức…làm thay đổi độ nhạy phân tích. Trong khi đó,
các dung dịch chuẩn không có các ảnh huởng tương tự như mẫu, vì vậy việc xác định nồng độ mẫu
suy từ phương pháp dãy chuẩn hay phương pháp so sánh đều có thể cho kết quả sai lệch với giá trị
nồng độ thực tế trong dung dịch đo. Khắc phục điểm này, người ta thường tạo môi trường chuẩn và
mẫu giống nhau, lúc này những yếu tố gây nhiễu phép đo xuất hiện đồng thời trong chuẩn và trong
mẫu. Nếu nồng độ nền mẫu trong chuẩn và trong mẫu như nhau, mức độ ảnh hưởng trong chuẩn và
trong mẫu vì vậy cũng giống nhau và có thể bù trừ nhau. Lưu ý rằng phương pháp thêm chuẩn
không loại trừ (eliminate) ảnh hưởng của nền mẫu mà chỉ bù trừ (compensate) ảnh hưởng của nền
mẫu mà thôi.
Người ta cũng dùng phương pháp thêm chuẩn để đo những mẫu có nồng độ thấp, tuy nhiên
không nên hiểu sai và lạm dụng: phương pháp thêm chuẩn chỉ có ý nghĩa với những mẫu có nồng
độ chất phân tích nằm giữa giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOQ) của phương pháp.
Những mẫu có nồng độ chất phân tích nhỏ (<LOD) thì không dùng phương pháp thêm mà phải
dùng các biện pháp xử lý làm giàu mẫu trước khi định hoặc dùng phương pháp đo khác có giới hạn
phát hiện hay giới hạn xác định nhỏ hơn.
Các điều kiện tiên quyết khi áp dụng phương pháp thêm chuẩn:
- Nồng độ chất phân tích phải được ước lượng trước (ví dụ Cx).
- Nồng độ chất phân tích thêm vào phải trong khoảng 0.5Cx÷2Cx tức là đường thêm chuẩn
nên là Cx; Cx+Ca1; Cx+Ca2; Cx+Ca3; với Ca1 ≈ 0.5Cx; Ca2 ≈ Cx; Ca3 ≈ 2Cx.(Điều kiện *)
- Đường thêm chuẩn phải tuyệt đối tuyến tính (R2 > 0.9995).
II. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ:
1. Hóa chất (chuẩn bị tương tự trong phần 1-pp đường chuẩn)
a. Dung dịch chuẩn gốc: 1000 ppm Fe
- Cách pha: Dung dịch Fe (II) tiêu chuẩn: cân chính xác khoảng 3.5110 g muối Mohr
(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O loại tinh khiết phân tích (chọn những tinh thể còn tốt, màu xanh nhạt). Hòa
tan trong 500 mL nước cất hai lần, thêm vào 5mL H2SO4 đậm đặc. Dung dịch này có thể kiểm tra
nồng độ Fe bằng phép chuẩn độ oxy hóa khử, chất chuẩn là K2Cr2O7 hay KMnO4.
b. Dung dịch chuẩn trung gian: 50 ppm

8
 c. Dung dịch 1,10-phenantrolin 0.5% pha trong nước.
d. Dung dịch hydroxylamin 10% trong nước.
e. Đệm acetate pH = 5.
f. Dung dịch HCl 6M
Sinh viên đã chuẩn bị dung dịch từ b-f trong bài 1 nên không cần chuẩn bị nữa.
2. Dụng cụ:
 Bình định mức 100 mL,
 Pipet các loại: 2,5, 10 mL
 Máy quang phổ.
I. CÁCH TIẾN HÀNH VÀ TÍNH KẾT QUẢ :
1. Chuẩn bị mẫu và đo:
*Mẫu chứa nền: lấy dung dịch Fe pha loãng làm dung dịch mẫu với thể tích V (mL). Thể tích
V được lấy phải thõa mãn điều kiện * (phần nguyên tắc- tham khảo nồng độ Fe của phương pháp
đường chuẩn). Chuẩn bị sẵn 6 bình định mức 100 mL sạch, đánh số 0; 1; 2; 3; 4,5. Bình 0 là dung
dịch blank. Dùng pipet lấy V mẫu dung dịch chuẩn trung gian Fe 50 ppm (SV tự tính toán) vào các
bình định mức 15 sao cho nồng độ Fe thêm chuẩn trong các bình (sau khi định mức tới vạch) là
0,1;0,5; 1,0; 2,5; 5,0 ppm. Thêm vào 6 bình như sau: 1.00 mL NH2OH, lắc đều, để yên 30 phút để
phản ứng khử diễn ra hoàn toàn, thêm tiếp 5 mL đệm acetat pH 5, 1 mL phenantrolin, dùng nước
cất định mức đến vạch mức. Các dung dịch này ổn định sau 10 phút.
Lưu ý: V=10 mL,
*Đo độ hấp thu của các dung dịch trên ở max với dung dịch blank là bình 0.
Bảng pha dãy thêm chuẩn:
Thể tích (mL) Nồng độ dãy thêm chuẩn (ppm) [Fe]f
Blank 1 2 3 4 5
0 0.1 0.5 1.0 2.5 5.0
Dung dịch Fe pha loãng 0 V V V V V
Dung dịch trung gian Fe 50 0 ? ? ? ? ?
ppm
NH2OH 1.0
Đệm pH 5 5.0
1,10-phenantrolin 1.0
H2O Thêm đến vạch mức fiol 100 mL

2. Tính toán kết quả (theo hai cách sau)

2.1. Dùng công thức tính
Kết quả tính theo công thức sau:

9
 Ax
C x  Cai
Ax  ai  Ax

Trong đó :
Ax+ai : Độ hấp thu của các dung dịch thêm i.
Ax : Độ hấp thu của các dung dịch xác định.
Cai : Lượng Fe (μg) chuẩn thêm vào các bình định mức 100 mL.
Cx : Lượng Fe (μg) trong mẫu xác định trong bình định mức 10 mL, tương ứng 10 mL
mẫu.
Hãy tính hàm lượng Fe của mẫu ban đầu (mg/L hay ppm)
2.2. Dùng phương pháp đồ thị:
Dựng đồ thị A theo Ca thêm vào như hình vẽ dưới đây:

Hãy xác định Cx trên đồ thị, từ đó, tính hàm lượng Fe của mẫu ban đầu.
So sánh kết quả thu được từ 2 phương pháp trên: phương pháp tính và phương pháp đồ thị.

10
 SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM BÀI 1 VÀ BÀI 2

Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3

Pha dung dịch Fe 50ppm Pha dung dịch Fe 50ppm Pha dung dịch Fe 50ppm
Pha dung dịch 1,10 phenatroline 0.5%. Pha dung dịch hydroxylamin 10% Pha pH 5 và acid HCl 6M
Chuẩn bị mẫu dược phẩm số 1 Chuẩn bị mẫu dược phẩm số 2 Chuẩn bị mẫu dược phẩm số 3

Xây dựng đường chuẩn, tìm max

Xử lý mẫu các mẫu dược phẩm số 1,2,3
Xử lý mẫu dược phẩm số 4 (PTN)

Đo quang để xác định Fe(II) và Fe tổng

của các mẫu dược phẩm. Trao đổi số liệu
giữa các nhóm.

Thực hiện đường thêm chuẩn trên mẫu Thực hiện đường thêm chuẩn trên mẫu Thực hiện đường thêm chuẩn trên mẫu
dược phẩm số 1 để xác định Fe tổng dược phẩm số 2 để xác định Fe tổng dược phẩm số 3 để xác định Fe tổng

Báo kết kết quả

11
 Sơ đồ bố trí vị trí ống nghiệm trên giá để ống nghiệm (Làm 3 lần với PP đường chuẩn)
Mẫu
STD1 STD2 STD3 STD4 STD5
Blank a Bình a Qca Blank b Bình b
Mẫu
STD1 STD2 STD3 STD4 STD5
Bình a QCa Blank b Bình b
Mẫu
STD1 STD2 STD3 STD4 STD5
Bình a QCa Blank b Bình b

Blank 1 2 3 4 5

12
 BÀI THỰC HÀNH ĐIỆN HÓA
BÀI 3: HIỆU CHUẨN VÀ SỬ DỤNG MÁY ĐO pH

PHẦN I: GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP

pH là một trong những chỉ số quan trọng được lưu ý trong nhiều đối tượng khác nhau.
Theo định nghĩa pH = -log[H+] (hay chính xác hơn là -logaH+ ), điều này có nghĩa là pH biểu
hiện cho độ acid hoặc baz của dung dịch khảo sát. Theo thời gian, nhiều phương pháp xác định
pH đã ra đời, tuy nhiên cho đến nay phương pháp đo pH trực tiếp trên máy pH đã trở thành gần
như phương pháp duy nhất được sử dụng.
Có nhiều loại điện cực để đo pH khác nhau như điện cực antimoni, điện cực
quinhydron... nhưng thông dụng nhất hiện nay là điện cực thủy tinh.
Điện cực thủy tinh là loại điện cực màng chọn lọc ion H+, với màng chọn lọc là màng
thủy tinh. Điện cực này đã được ứng dụng rộng rãi để xác định pH của dung dịch từ những năm
30, hiện nay những điện cực thủy tinh trên thị trường cho phép xác định giá trị pH trong khoảng
0 -14 với độ chính xác 0.1, 0.01 hoặc 0.001 tùy loại máy. Hiện nay nhiều điện cực được chế tạo
với kích thước rất nhỏ (vi điện cực) cho phép xác định với những thể tích mẫu khoảng vài L.
Những điện cực thủy tinh ban đầu có điện trở rất lớn (thường lớn hơn 100 M) và đòi hỏi máy
đo pH có điện trở nội rất lớn, ngày nay với kỹ thuật và vật liệu mới người ta đã tạo ra những điện
cực có điện trở chỉ vài chục k và giải quyết được nhược điểm trên.
Việc đo giá trị pH thực chất là việc đo thế của dung dịch, từ đó suy ra nồng độ của H+
trong dung dịch, vì thế phương pháp đo pH thực chất là một trường hợp đặc biệt của
phương pháp điện thế trực tiếp và chuẩn độ pH thực tế là chuẩn độ điện thế. Phương pháp
này được tách riêng ra do ưu điểm cho phép xác định trực tiếp pH mà không cần lập một loạt
dung dịch chuẩn nhưng vẫn đạt được độ chính xác rất cao.
Nếu gọi hoạt độ H+ dung dịch bên trong màng là a1, ngoài màng là a2, khi này thế màng,
Em, có thể biểu diễn như sau:

a2
Em  0.058 log  b  0.059 pH
a1
với pH là pH của dung dịch ngoài màng (dung dịch khảo sát) và nồng độ của H+ trong
màng đã biết (thường là 0.1N hoặc 1 N)
Thế điện cực chỉ thị khi này sẽ là: Eind = Em + Ess2 + Enối
Thế điện cực so sánh (qui chiếu) là một hằng số (gọi là ss2 vì đây là điện cực so sánh
trong của điện cực thủy tinh), còn thế nối rất nhỏ, do đó ta viết lại: Eind = b1 -0.059 pH
Thế đo được trên máy sẽ là Eđ = Eind - Ess1 = Const - 0.059 pH
Trong đó điện cực so sánh 1 là điện cực so sánh ngoài. Dựa vào thế đo được và dựa vào 2
dung dịch đệm để chỉnh máy ta sẽ có giá trị pH của dung dịch cần đo. Các giá trị pH đều được
ghi trên thang đo do đó ta có thể đọc ngay giá trị mà không cần bất cứ phép biến đổi nào.

13
 Phương pháp chuẩn độ acid - baz trong trường hợp sử dụng máy pH còn được gọi là
phương pháp chuẩn độ pH vì điểm tương đương của quá trình chuẩn độ được nhận biết không
phải bằng sự chuyển màu của chỉ thị (phát hiện gián tiếp sự thay đổi đột ngột pH dung dịch) mà
giám sát trực tiếp sự thay đổi đột ngột của giá trị pH tại điểm tương đương. Đồ thị biểu diễn quá
trình biến đổi pH theo thể tích thuốc thử thêm vào cho ta thấy được dạng của đường cong chuẩn
độ, vì vậy để nắm vững phương pháp này cần phải nắm vững lý thuyết của phương pháp chuẩn
độ acid - baz. Thực chất của quá trình chuẩn độ ở đây là quá trình theo dõi sự biến đổi của pH
theo thể tích thuốc thử thêm vào.
PHẦN II: HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG MỘT SỐ LOẠI MÁY pH THÔNG DỤNG VÀ BẢO
TRÌ ĐIỆN CỰC
I. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG MÁY
Hiện nay tồn tại song song nhiều loại máy pH khác nhau của nhiều hãng khác nhau, tuy
nhiên ta có thể chia làm 3 loại ứng với độ phân giải 0.1, 0.01 và 0.001 đơn vị pH. Các máy có độ
phân giải 0.1 đơn vị pH thường chỉ chỉnh với một đệm duy nhất và giá trị pH đo chỉ chính xác
trong khoảng pH đệm  2 đơn vị pH, những máy này chỉ dùng cho những công việc không đòi
hỏi độ chính xác cao.
Những máy pH dạng này có thể hướng dẫn sử dụng chung như sau:
- Rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô và nhúng điện cực vào dd đệm pH cần chỉnh.
- Bật nút chức năng về vị trí pH (trên nút này sẽ còn các vị trí zero, đo +mV và đo -mV),
chờ cho giá trị ổn định (thường các máy này dùng kim).
- Đo nhiệt độ dung dịch đệm, dùng nút 0C để chỉnh nhiệt độ về nhiệt độ đo.
- Chỉnh nút Calibration (hoặc buffer hoặc một tên nào khác tương tự tùy theo máy) để giá
trị pH trên máy về đúng giá trị của dung dịch đệm.
- Bật nút chức năng về vị trí zero, lấy điện cực ra khỏi dung dịch đệm, rửa bằng nước cất
và lau khô.
- Nhúng điện cực vào dung dịch khảo sát (cần đo pH hoặc cần chuẩn độ) và tiến hành đo
bằng cách bật nút chức năng về vị trí pH.
Các máy đo pH thông dụng nhất hiện nay thường có độ phân giải 0.01 đơn vị pH, sử
dụng hệ 2 hoặc 3 đệm. Có một số máy vẫn còn dùng kim và chỉnh nhiệt độ của dung dịch bằng
một nút riêng, song phần lớn các máy đều sử dụng màn hình tinh thể lỏng hoặc ghép nối với máy
tính và có điện cực đo nhiệt độ để tự điều chỉnh nhiệt độ. Với loại máy này chúng tôi chỉ hướng
dẫn sử dụng 2 loại máy tiêu biểu đều sử dụng màn hình tinh thể lỏng còn máy dùng kim xin
tham khảo phần chuẩn độ điện thế.
 Cách hiệu chuẩn máy SI analysis
A. Giới thiệu về máy đo pH- Model Lab 855

Lab 855. máy đo chính xác kỹ thuật số cho phép bạn tiến hành các phép đo pH và ORP nhanh và
tin cậy.

14
Lab 855 cung cấp tối đa sự tiện lợi khi vận hành, các phép đo chắc chắn và tin cậy cho tất cả các
ứng dụng.

1. Bàn phím.
2. Màn hình.
3. Các lổ cắm.
* Bàn phím.

Phím Ký hiệu Ý nghĩa

<On/Off> Tắt và mở máy.
<On/Off__> Thiết lập lại các
dữ liệu hiệu
chuẩn.
<M> Chọn tham số
<M__> đo.
Mở các thiết lập
phép đo.
<CAL> Gọi thủ tục hiệu
<CAL__> chuẩn.
Hiển thị dữ liệu
hiệu chuẩn.
< >< > Tăng và giảm
< __>< __> một đơn vị.
Tăng và giảm
liên tục.
<ENTER> Xác nhận.
<ENTER__> Mở menu thiết
lập hệ thống.

Màn hình hiển thị.

1 Thông tin trạng thái

2 Giá trị đo (với đơn vị)

3 Tham số đo

4 Ký hiệu cảm biến (đánh giá và khoảng thời gian hiệu chuẩn)

5 Nhiệt độ đo (với đơn vị)

Thông tin trạng thái.

Hiển thị Ý nghĩa

[AutoCal TEC] Hiệu chuẩn với sự tự động nhận dạng dung dịch chuẩn, vd: với bộ dung
[AutoCal DIN] dịch chuẩn Technical.
[ConCal] Hiệu chuẩn với bất kỳ dung dịch chuẩn nào.
[CalError] Một lổi xảy ra trong khi hiệu chuẩn.
[AR] Chức năng kiểm soát độ ổn định dược kích hoạt.

15
[TP] Phép đo nhiệt độ được kích hoạt.
[Time] Thiết lập khoảng thời gian hiệu chuẩn.
[LoBat] Pin gần cạn.

B. Hiệu chuẩn

* Hiệu chuẩn tự động (AutoCal).

Dùng bất kỳ một trong ba dung dịch chuẩn của bộ dung dịch chuẩn đã chọn theo thứ tự tăng dần
hoặc giảm dần.

Bên dưới đây, sự hiệu chuẩn với các dung dịch (TEC) được mô tả. Khi các bộ chuẩn khác được
dùng, các giá trị dung dịch chuẩn bình thường khác sẽ được hiển thị. Còn các thủ tục thì tương tự
nhau.

1. Bắt đầu hiệu chuẩn với phím <CAL>.

Màn hình hiệu chuẩn cho dung dịch đầu tiên xuất hiện.

2. Khi đo mà không có cảm biến nhiệt độ: giữ ổn định dung dịch chuẩn hoặc đo nhiệt độ hiện tại.

3. Nếu cần, nhấn phím <CAL> để chọn bộ chuẩn được dùng ([AutoCal TEC], [AutoCal DIN]).

Ct1 hoặc Cd1 được hiển thị.

4. Rửa kỹ điện cực pH với nước khử ion.

5. Nhúng điện cực pH vào trong dung dịch chuẩn thứ nhất.

6. Khi đo mà không có cảm biến nhiệt độ: nhập nhiệt độ của dung
dịch chuẩn với phím <▲><▼>.

7. Bắt đầu đo với phím <ENTER> .

Giá trị đo được kiểm tra độ ổn định.

Chỉ báo [AR] nhấp nháy.

Điện thế của điện cực (mV) hoặc giá trị danh nghĩa của dung dịch chuẩn được hiển thị.

8. Chờ phép đo với chức năng kiểm soát độ ổn định hoàn tất hoặc bỏ
qua chức năng kiểm soát độ ổn định với phím <ENTER>.

Màn hình hiệu chuẩn cho dung dịch chuẩn tiếp theo xuất hiện.

Ct2 hoặc Cd2 được hiển thị.

9. Nếu cần, kết thúc quá trình hiệu chuẩn như là một sự hiệu chuẩn
một điểm với phím <M>.

16
Kết quả hiệu chuẩn sẽ được hiển thị.

Đối với hiệu chuẩn một điểm, thiết bị sẽ dùng độ dốc Nernst (-59.2 mV/pH tại 25 °C) và xác
định điểm zero của điện cực pH.

hoặc Tiếp tục sự hiệu chuẩn với dung dịch kế tiếp bằng phím <ENTER>.

Tiếp tục với sự hiệu chuẩn hai điểm.

10. Rửa kỹ điện cực pH với nước khử ion.

11. Nhúng điện cực pH vào trong dung dịch chuẩn thứ hai.

12. Khi đo mà không có cảm biến nhiệt độ: nhập nhiệt độ của dung dịch chuẩn với phím
<▲><▼>.

13. Bắt đầu đo với phím <ENTER> .

Giá trị đo được kiểm tra độ ổn định.

Chỉ báo [AR] nhấp nháy.

Điện thế của điện cực (mV) hoặc giá trị danh nghĩa của dung dịch chuẩn được hiển thị.

14. Chờ phép đo với chức năng kiểm soát độ ổn định hoàn tất hoặc bỏ qua chức năng kiểm soát
độ ổn định với phím <ENTER>.

Màn hình hiệu chuẩn cho dung dịch chuẩn tiếp theo xuất hiện.

Ct3 hoặc Cd3 được hiển thị.

15. Nếu cần, kết thúc quá trình hiệu chuẩn như là một sự hiệu chuẩn
hai điểm với phím <M>.

Kết quả hiệu chuẩn sẽ được hiển thị.

hoặc Tiếp tục hiệu chuẩn với dung dịch kế tiếp với phím
<ENTER>.

Tiếp tục với sự hiệu chuẩn 3 điểm.

16. Rửa kỹ điện cực pH với nước khử ion.

17. Nhúng điện cực pH vào trong dung dịch chuẩn thứ ba.

18. Khi đo mà không có cảm biến nhiệt độ: nhập nhiệt độ của dung dịch chuẩn với phím
<▲><▼>.

19. Bắt đầu đo với phím <ENTER> .

Giá trị đo được kiểm tra độ ổn định.

Chỉ báo [AR] nhấp nháy.

Điện thế của điện cực (mV) hoặc giá trị danh nghĩa của dung dịch chuẩn được hiển thị.

17
20. Chờ phép đo với chức năng kiểm soát độ ổn định hoàn tất hoặc bỏ qua chức năng kiểm soát
độ ổn định với phím <ENTER>.

Kết quả hiệu chuẩn sẽ được hiển thị.

* Hiệu chuẩn bằng tay (ConCal).

Dùng bất kỳ dung dịch chuẩn nào để chuẩn một điểm. Sự hiệu chuẩn sẽ chính xác hơn nếu giá trị
của dung dịch chuẩn càng gần với mẫu thử.

Sử dụng các dung dịch chuẩn sau để chuẩn hai điểm:

• một dung dịch chuẩn là pH 7.0 ± 0.5

• bất kỳ dung dịch chuẩn nào khác

1. Bắt đầu hiệu chuẩn với phím <CAL>.

Màn hình hiệu chuẩn cho dung dịch thứ nhất xuất hiện.

2. Khi đo mà không có cảm biến nhiệt độ: giữ ổn định dung dịch chuẩn hoặc đo nhiệt độ hiện tại.

3. Nếu cần, nhấn phím <CAL> để chọn bộ dung dịch chuẩn ([ConCal]). ASY được hiển thị.

4. Rửa kỹ điện cực pH với nước khử ion.

5. Nhúng điện cực pH vào dung dịch chuẩn thứ nhất (pH 7.0 ± 0.5
cho hiệu chuẩn hai điểm).

6. Khi đo mà không có cảm biến nhiệt độ: nhập nhiệt độ của dung
dịch chuẩn bằng phím <▲><▼>.

7. Bắt đầu đo với phím <ENTER> .

Giá trị pH của dung dịch chuẩn được hiển thị.

Giá trị đo được kiểm tra độ ổn định.

Chỉ báo [AR] nhấp nháy.

8. Chờ phép đo với chức năng kiểm soát độ ổn định hoàn tất.

9. Thiết lập giá trị pH danh định của dung dịch chuẩn với phím
<▲><▼>.

10. Chấp nhận giá trị hiệu chuẩn với phím <ENTER>. SLO được
hiển thị.

11. Nếu cần, kết thúc thủ tục hiệu chuẩn như là hiệu chuẩn một
điểm với phím <M>.

Bản ghi hiệu chuẩn được hiển thị.

hoặc Tiếp tục hiệu chuẩn bằng dung dịch chuẩn kế tiếp với phím <ENTER>.

18
Tiếp tục với hiệu chuẩn hai điểm.

12. Rửa kỹ điện cực pH với nước khử ion.

13. Nhúng điện cực pH vào trong dung dịch chuẩn thứ hai.

14. Khi đo mà không có cảm biến nhiệt độ: nhập nhiệt độ của dung dịch chuẩn với phím
<▲><▼>.

15. Bắt đầu đo với phím <ENTER> .

Giá trị pH của dung dịch chuẩn được hiển thị.

Giá trị đo được kiểm tra độ ổn định.

Chỉ báo [AR] nhấp nháy.

16. Chờ phép đo với chức năng kiểm soát độ ổn định hoàn tất.

17. Thiết lập giá trị danh định pH của dung dịch chuẩn với phím <▲><▼>.

18. Chấp nhận giá trị hiệu chuẩn với phím <ENTER>. Bản ghi hiệu chuẩn được hiển thị.

* Các điểm hiệu chuẩn.

Tùy vào số dung dịch chuẩn được dùng, máy sẽ xác định các giá trị sau và tính đường chuẩn:

Hiệu chuẩn Các giá trị được xác định Dữ liệu hiệu chuẩn được hiển thị
1 điểm Asy  Điểm zero = Asy
 Slope = Nernst slope (59.2mV/pH tại 25°C)
2 điểm Asy  Điểm zero = Asy
Slo  Slope = Slo
Đường chuẩn đi qua hai điểm chuẩn.
3 điểm Asy  Điểm zero = Asy
Slo  Slope = Slo
Đường chuẩn được tính từ đường cong tuyến tính.

Bạn có thể hiển thị slope theo đơn vị mV/pH hoặc %.

*Dữ liệu hiệu chuẩn.

Hiển thị dữ liệu hiệu chuẩn.

1. Hiển thị dữ liệu hiệu chuẩn theo màn hình giá trị đo với phím
<CAL__>.

Giá trị của asymmetry (ASY) được hiển thị.

Trong khi điểm được hiển thị (ASY) bạn có thể chuyển đơn vị của điểm zero với phím
<▲><▼>.

2. Nhấn phím <ENTER> để hiển thị các dữ liệu hiệu chuẩn thêm.

19
Giá trị slope (SLO) được hiển thị.

Trong khi slope được hiển thị (SLO) bạn có thể chuyển đơn vị slope
với phím <▲><▼>.

Đánh giá hiệu chuẩn (pH).

Sau khi hiệu chuẩn, máy sẽ tự động đánh giá sự hiệu chuẩn. Điểm
zero và slope được đánh giá riêng. Sự đánh giá tồi tệ của cả hai sẽ
nhập thành một. Sự đánh giá xuất hiện trên màn hình.

Hiển thị Điểm zero [mV] Slope[mV/pH]

-15 ... +15 -60.5 ... -58.0

-20 ... <-15 >-58.0 ... -57.0

hoặc
>+15 ... +20

-25 ... <-20 -61.0 ... <-60.5

hoặc hoặc
>+20 ... +25 >-57.0 ... -56.0

-30 ... <-25 -62.0 ... <-61.0

hoặc hoặc
->+25 ... +30 >-56.0 ... -50.0

[CalError] <-30 <-62.0

hoặc hoặc
>+30 > -50.0
Tóm lại

- Khởi động máy

- Nhấn Cal; máy sẽ hiện thị CL1; nhúng điện cực vào dung dịch chuẩn pH =10; enter; đợi
AR giữa nguyên
- Máy tự động chuyển qua CL2; nhúng điện cực (sau khi rửa sạch, lau khô), enter; đợi AR
giữa nguyên
- Máy tự động chuyển sang CL3; nhúng điện cực (sau khi rửa sạch, lau khô), enter; đợi AR
giữa nguyên.

Trong quá trình đo thì nhúng điện cực vào dung dịch, nút AR đứng yên, ghi giá trị pH

 Cách hiệu chuẩn máy PH 12000

Giới thiệu về máy pH 12000

20
1. Màn hình

1. HOLD 2. WAIT
Cái này sẽ chỉ ra rằng giá trị đọc được ổn định Cái này sẽ hiển thị khi thiết bị thì vẫn đang chờ
trong suốt chế độ AUTOCLOCK cho giá trị đọc ổn định

3. LOBAT 4. MAN
Dấu hiệu pin yếu Hiển thị nếu đầu dò nhiệt độ không được kết nối

5. ATC 6. CAL
Báo hiệu ATC (bù nhiệt độ tự động) sẽ được hiển Cái này sẽ được hiển thị khi thiết bị đi vào chế độ
thị nếu một điện cực nhiệt độ được kết nối hiệu chuẩn

7. SECONDARY DISPLAY 8. C/F

Cho nhiệt độ hiển thị C hoặc F Đơn vị nhiệt độ

9. AUTO 10. mV
Biểu thị chế độ AUTOCLOCK. (nếu sự khác biệt Đơn vị đo và các biểu thị chế độ
giữa một giá trị đọc ở giây đầu tiên và giây thứ 10
ít hớn 0.01 pH hoặc 0.2 mV thì thiết bị sẽ “lock”
giá trị đọc 10)

11. pH 12. EFF. /%

Đơn vị đo và các biểu thị chế độ Cái này sẽ được hiển thị nếu người sử dụng đang
xem hiệu năng của điện cực. Đề nghị sử dụng điện

21
 cực mới khi giá trị hiệu năng ít hơn 75%

13. Buffer selection

Chỉ báo này sẽ nhấp nháy nếu thiết bị chưa được
hiệu chuẩn. Chỉ báo này sẽ duy trì sáng nếu thiết bị
đã được hiệu chuẩn

2. Phím

On/Off
Nhấn và giữ khoảng 5 giây để bật và tắt thiết bị. Một khi thiết bị được bật lên, nhấn để
bật hoặc tắt đèn màn hình

Mode
Lựa chọn chế độ hiển thị. Nhấn phím này thay đổi màn hình để hiển thị một cách tuần
tự pH-AUTO, mV-AUTO, pH và mV. Các giá trị hiệu chuẩn sẽ không bị ảnh hưởng
bởi việc thay đổi các chế độ màn hình. Trong quá trình hiệu chuẩn pH, nhấn phím
Mode để thoát chế độ hiệu chuẩn

Clear (không hoạt động trong chế độ mV)

Sử dụng để xóa đơn vị khi một lỗi tín hiệu xuất hiện. Nó xóa tất cả các giá trị hiệu
chuẩn lưu trữ trong bộ nhớ nội. Dưới sự sử dụng bình thường, phím sẽ không được kích
hoạt trừ khi được nhấn và giữ khoảng 2 giây để tránh tình cờ xóa mất bộ nhớ đã lưu
Khi phím Clear được nhấn, tất cả các phân đoạn của LCD sẽ được bật lên. Sau khoảng
2 giây thiết bị sẽ đi vào chế độ pH-AUTO. “AUTO” và “CAL” sẽ được bật lên và một
trong số các buffer trong cài đặt buffer đã chọn sẳn sẽ bắt đầu nhấp nháy. Thiết bị phải
được hiệu chuẩn lại trước khi sử dụng

Up/Down
Hai phím được sử dụng để nhập vào giá trị nhiệt độ một cách thủ công. Chúng không
ảnh hưởng trên thiết bị khi hoạt động trong chế độ ATC

Stand/ Slope
Các phím “Stand” và “Slope” được sử dụng cho hiệu chuẩn pH của thiết bị. Nhấn và
giữ phím Stand trong khi bật nguồn thiết bị, sẽ thay đổi buffer cài đặt

Meas./ Effic
Phím này được dùng để mang thiết bị ra khỏi tình trạng AUTO khi hoạt động trong chế
độ pH-AUTOCLOCK hoặc mV-AUTOLOCK.
Nhấn và giữ phím này khoảng 3 giây, LCD sẽ hiển thị hiệu năng của điện cực

+ Hiệu chuẩn
pH1200 có hai bộ buffer: 7.00, 4.01, 10.01 và 6.86, 4.00, 9.18. Máy đo được cài trước với 7.00,
4.01 và 10.01. Để thay đổi bộ buffer, tắt thiết bị, sau đó nhấn và giữ phím “Stand” trong khi bật
nguồn thiết bị lại
Chú ý: không cần thiết lặp lại quá trình này mỗi lần bật thiết bị trừ khi các thiết lập buffer cần
thay đổi
pH1200 có thể thực hiện một, hai hoặc 3 điểm hiệu chuẩn
Chú ý: nếu thiết bị sử dụng 2 hoặc 3 điểm hiệu chuẩn, điểm đầu tiên phải là 6.86/7.00. Điểm thứ
2 có thể hoặc là 4.00/4.01 hoặc 9.18/10.01

22
+ Hiệu chuẩn với đầu đò ATC/TEMP trong chế độ PH-AUTOLOCK
1. Bật thiết bị. Nhấn phím “Clear” khoảng 2 giây, máy đo xóa tất cả dữ liệu hiệu chuẩn lưu trữ
trong bộ nhớ
2. Kết nối điện cực pH tới bộ kết nối BNC và đầu dò ATC/Temp tới bộ kết nối ATC/Temp của
thiết bị: “ATC” sáng lên. “pH” và “AUTO” sẽ sáng lên. Một trong số các buffer trong bộ buffer
sẽ nhấp nháy.
3. Tráng rửa các đầu đò pH và ATC/Temp trong nước cất và nhúng chúng vào dung dịch buffer
đầu tiên (6.86/7.00 nếu hiệu chuẩn nhiều điểm). Để cho nhiệt độ đọc ổn định, sau đó nhấn và giữ
phím “Stand” khoảng 2 giây để hiệu chuẩn. Biểu tượng “WAIT” sẽ nhấp nháy cho tới khi thiết
bị phát hiện giá trị đọc ổn định. Một khi thiết bị hiệu chuẩn điểm đầu tiên, buffer đã chọn sáng
lên trong khi buffer còn lại thứ 2 nhấp nháy. Thiết bị thì sẵn sàng để tạo slope tại buffer thứ 2.
Chú ý: nếu dung dịch buffer đầu tiên là 6.86/7.00, tại thời điểm này, nhấn phím “Mode”. Thiết bị
sẽ lưu sự hiệu chuẩn và thoát khỏi chế độ hiệu chuẩn. Hiệu chuẩn một điểm hoàn tất. Nếu dung
dịch buffer đầu tiên là 4.00/4.01, 9.18/10.00, tại thời điểm này, thiết bị sẽ lưu sự hiệu chuẩn và
thoát khỏi chế độ hiệu chuẩn một cách tự động. Hiệu chuẩn một điểm hoàn tất.
4. Tráng rửa điện cực pH và ATC/Temp trong nước cất và nhúng chúng trong dung dịch buffer
thứ 2 (4.00/4.01 hoặc 9018/10.01). Để cho giá trị đọc nhiệt độ ổn định, sau đó nhấn phím
“Slope” để hiệu chuẩn. Biểu tượng “WAIT” sẽ nhấp nháy cho tới khi thiết bị phát hiện một giá
trị đọc ổn định. Một khi thiết bị hiệu chuẩn điểm thứ 2, buffer thứ 2 đã chọn sáng lên và buffer
còn lại bắt đầu nhấp nháy. Thiết bị sẵn sàng để tạo slope tại buffer thứ 3.
Chú ý: tại thời điểm này nhấn phím “Mode” và thiết bị sẽ lưu sự hiệu chuẩn và thoát khỏi chế độ
hiệu chuẩn. Hiệu chuẩn 2 điểm hoàn tất.
5. Tráng rửa các điện cực trong nước cất và nhúng vào trong dung dịch buffer thứ 3 (9.18/10.01
hoặc 4.00/4.01). Để cho giá trị đọc nhiệt độ ổn định, sau đó nhấn phím “Slope” để hiệu chuẩn.
Biểu tượng “WAIT” sẽ nhấp nháy cho tới khi thiết bị phát hiện một giá trị đọc ổn định. Một khi
thiết bị hiệu chuẩn điểm thứ 3, thiết bị sẽ lưu sự hiệu chuẩn và tự động thoát khỏi chế độ hiệu
chuẩn. Quá trình hiệu chuẩn điểm thứ 3 hoàn tất.
6. Thiết bị tính toán và bù đắp cho độ lệch slope của điện cực pH tương ứng với các giá trị của 3
buffer hiệu chuẩn. Sau khi hiệu chuẩn, nhấn và giữ “Meas./Effic” khoảng 3 giây để hiển thị hiệu
năng của điện cực
+ Phép đo pH
Để thực hiện các phép đo pH, bộ dung dịch buffer lựa chọn trước phải sáng lên, cho biết thiết bị
đã hiệu chuẩn một điểm, hai hoặc 3 điểm và sẵn sàng cho các phép đo. Nếu bộ dung dịch buffer
nhấp nhấy, thực hiện hiệu chuẩn pH trước khi tiến hành đo
Đo với đầu đò ATC/TEMP trong chế độ pH-AUTOLOCK
1. Kết nối điện cực pH tới bộ kết nối BNC và đầu dò ATC/Temp tới bộ kết nối ATC/Temp của
thiết bị: “ATC” sáng lên.
2. Nhấn phím “Mode” cho tới khi “pH” và “AUTO” sáng lên
3. Tráng rửa điện cực pH và đầu đò ATC/Temp bằng nước cất và nhúng vào trong mẫu. Loại bỏ
bong bóng khi bằng cách lắc/ khuấy điện cực.
4. Nhấn phím “Meas”. “WAIT” sẽ nhấp nháy. Thiết bị đang chờ cho giá trị đọc ổn định. Màn
hình sẽ theo dõi giá trị pH được cảm biến bởi điện cực pH và đầu dò ATC/Temp
5. Khi “WAIT” biến mất, giá trị đọc thì sau đó trong chế độ “HOLD” và sẽ không phản hồi với
sự thay đổi khác từ mẫu. Giá trị pH đưa ra là giá trị pH của mẫu tại nhiệt độ mẫu được hiển thị.

23
Chú ý: đối với các mẫu mà vốn đã không ổn định, thiết bị sẽ không AUTOLOCK. Trong trường
hợp này, sử dụng chế độ pH-NON-AUTOLOCK để đo.
Lưu ý: Tùy theo khoảng pH cần đo là acid, baz hay trung tính mà ta chọn dung dịch đệm là
4.00 (hoặc 4.01) hay 10.01 (hoặc 9.21 hoặc 9.18) trung 7.00. Nếu phép đo thực hiện trong 3
vùng pH thì phải hiệu chuẩn bằng 3 đệm. Nếu chỉ 1 vùng pH thì chỉ cần hiệu chuẩn ít nhất 1 đệm
của vùng đó.
II. BẢO TRÌ ĐIỆN CỰC:
Điện cực mới sử dụng hoặc sau một thời gian không sử dụng cần phải hoạt hóa lại bằng
cách ngâm qua đêm với dung dịch HCl 1M để hoạt hóa.
Khi không sử dụng cần giữ điện cực như sau:
- Với điện cực kép: ngâm trong dung dịch KCl có nồng độ giống nồng độ dung dịch
KCl của điện cực so sánh trong thường là 0.1, 1 M hoặc bão hòa 3M.
- Với hai điện cực riêng rẽ:
+ Điện cực so sánh được ngâm trong dung dịch KCl có nồng độ tương ứng dung
dịch bên trong điện cực.
+ Điện cực thủy tinh được ngâm trong dung dịch KCl 3M
- Không ngâm điện cực quá lâu trong nước cất, đặc biệt với những điện cực thủy tinh làm
bằng vật liệu mới sau này.
- Điện cực bị nhiễm bẩn bởi dầu mỡ nên làm sạch với eter dầu hỏa (petroleum ether), nếu
bị nhiễm bẩn bởi các abuminoid cần ngâm trong dung dịch 5% pepsin trong HCl 0.1M, sau đó
rửa lại bằng nước cất.

24
BÀI 4: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ACID SULFURIC VÀ ACID PHOSPHORIC
BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ PH
I. Nguyên tắc:
Khi trung hòa một acid (đơn hay đa acid) bằng một baz mạnh, pH tăng dần trong quá
trình trung hòa. Đường pH = f(V) với V là thể tích dung dịch NaOH thêm vào có những dạng
khác nhau tùy theo acid được trung hòa là acid mạnh hay yếu. Với acid đa chức, nếu các chức
của acid có pKa khác nhau quá 4 đơn vị ta có thể lần lượt trung hoà từng chức acid một. Từ thể
tích ở mỗi điểm tương đương (Vtđ) ta suy ra nồng độ đương lượng của acid.
II. Nội dung:
Trong bài thực tập này sinh viên sẽ làm quen với việc chuẩn độ H2SO4 - một acid hai
chức có nấc thứ 1 là acid mạnh và nấc thứ 2 là một acid tương đối mạnh- và H3PO4 – là acid 3
chức có nấc 1 là acid tương đối mạnh, nấc 2 là 1 acid tương đối yếu và nấc 3 là một acid rất yếu.
Sinh viên sẽ chuẩn độ H2SO4 và H3PO4 riêng lẻ sau đó chuẩn độ hỗn hợp của chúng. Cả hai
H2SO4 và H3PO4, sinh viên chuẩn độ đến hết nấc 2 bằng dung dịch NaOH chuẩn. Từ số liệu thu
được vẽ các đường pH ~ f(V) cho từng dung dịch acid riêng lẻ và cho dung dịch hỗn hợp hai
acid. Đường pH ~ f(V) của H2SO4 sẽ chỉ có một điểm uốn rõ ràng với 1 bước nhảy ứng với điểm
tương đương khi chuẩn độ cả 2 nấc 1 và 2. Đường pH ~ f(V) của H3PO4 có hai điểm uốn tại hai
bước nhảy ứng với hai điểm tương đương khi chuẩn độ nấc 1 và 2. Từ các Vtđ ta sẽ tính được
nồng độ đương lượng của H2SO4 và H3PO4 trong các dung dịch chứa các acid này, riêng lẻ cũng
như trong hỗn hợp. Theo lý thuyết từ các pH bán tương đương ta sẽ suy ra các giá trị pKa1 và
pKa2 của H2SO4 và H3PO4 .
Để việc xác định Vtđ được chính xác hơn ta dựa vào đồ thị pH/V theo f(Vtb), trong đó:

E = E2 - E1 V = V2 -V1 Vtb = (V1 + V2)/2

Trên đồ thị này ta thu được hai đỉnh (peak) ứng với 2 điểm tương đương.
Phương pháp này giúp chúng ta loại trừ được các sai số do chỉ thị gây ra, đồng thời giúp
xác định được đối với cả các dung dịch có màu là những dung dịch mà phương pháp xác định
điểm tương đương bằng chỉ thị màu không thực hiện được.
III. Thực hành:
1. Thiết bị và dụng cụ:
- Máy đo pH.
- Điện cực 3 trong 1 (điện cực thủy tinh + điện cực so sánh + điện cực đo nhiệt độ), hoặc
điện cực kép (điện cực thủy tinh + điện cực so sánh).
- Máy khuấy từ, cá từ.
- Buret 25 mL, pipet các loại.
- Becher 150 mL hoặc 250 mL.
- Erlen 250 mL, bình xịt nước cất .

25
2. Hóa chất:
- Dung dịch NaOH khoảng 0.1N
- Dung dịch H2C2O4 chính xác 0.1000N (Sv tự chuẩn bị)
- Dung dịch H3PO4 khoảng 0.1M
- Dung dịch HCl khoảng 0.1 M
- Dung dịch H3PO4 + HCl kiểm tra
- Dung dịch chỉ thị phenolphtlein 0.1%.
- Chỉ thị methyl da cam
3. Thực nghiệm:
3.1. Pha chế hóa chất
 Sinh viên tự chuẩn bị dung dịch chuẩn H2C2O4 0,1000 N theo các bước sau:
- Tính số gam H2C2O4.2H2O cần lấy để pha 100 mL dung dịch H2C2O4 0,1000 N
(mtheo =)
- Cân chính xác khối lượng H2C2O4.2H2O, mrel =
Hòa tan vào cốc có mỏ sạch, thêm nước cất, lắc đều cho đến khi tan hết, sau đó chuyển
vào bình định mức 100 ml (tráng cốc nhiều lần bằng nước cất và đổ tất cả vào bình định
mức), thêm nước cất cho tới vạch, lắc kỹ.
- Tính hệ số hiệu chính Kcor và nồng độ thực của H2C2O4  0.95
 Các hóa chất còn lại sẽ pha loãng từ dung dịch dự trữ; riêng NaOH 0,1 N mỗi nhóm
chuẩn bị 1000 mL để sử dụng trong suốt quá trình chuẩn độ
3.2. Chuẩn máy pH
Chuẩn máy với dung dịch đệm: tiến hành chuẩn máy như đã hướng dẫn ở phần trên 3
dung dịch đệm 7.00, 4.00 và 10.00.
3.3. Chuẩn hóa dung dịch NaOH bằng H2C2O4 0.1000 N
 Thí nghiệm 1: Chuẩn độ dùng chỉ thị phenolphthalein (chuẩn độ ít nhất 3 lần lặp)
Chuẩn độ lại nồng độ dung dịch NaOH  0.1N bằng H2C2O4 0.1000 N với chỉ thị
phenolphtalein. Nạp dung dịch NaOH vào buret 25 mL, dùng pipet bầu lấy 10 mL dung dịch
H2C2O4 0.1000 N vào erlen 250 mL và thêm 1-2 giọt phenolphtalein. Chuẩn độ bằng dung dịch
NaOH đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt bền vững trong 30 giây, ghi thể tích tiêu tốn.
Lặp lại thí nghiệm ít nhất 3 lần, lấy kết quả trung bình, từ đó tính ra nồng độ chính xác của dung
dịch NaOH.
Thí nghiệm 2: Chuẩn độ trên máy pH (thực hiện 3 lần)
Tương tự như trên, thay erlen 250 mL bằng becher 250 mL. Lấy 10,0 mL dung dịch H2C2O4
0.1000N vào một becher 250 mL và thêm 1-2 giọt phenolphtalein. Thêm nước cất vào đến
khoảng 100 mL, sau đó cho cá từ vào và khuấy trộn đều bằng máy khuấy từ. Sinh viên tiến hành

26
chuẩn độ trên máy pH đồng thời theo dõi sự đổi màu của chỉ thị phenolphtalein và ghi lại thể tích
NaOH tiêu tốn khi dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt.

 Hướng dẫn cách chuẩn độ trên máy pH:

Nhúng điện cực vào dung dịch này sao cho dung dịch phải ngập lỗ của điện cực so sánh
nhưng điện cực không quá thấp để tránh thanh khuấy từ va vào làm bể màng thủy tinh, nếu dung
dịch quá ít không đảm bảo an toàn cho điện cực ta thêm nước cất vào vừa đủ để tạo khoảng cách
an toàn.
Trước khi tiến hành chuẩn độ, sinh viên phải tính toán dựa theo lý thuyết để biết đuợc pH
tại điểm tương đương và khoảng bước nhảy pH khi chuẩn độ tương ứng với nồng độ acid cần
xác định trong mẫu (nồng độ acid trong dung dịch chuẩn độ).
Bật máy khuấy từ và thêm 0.5 mL (hoặc 1 mL) dung dịch NaOH vào, khuấy trộn đều (vài
giây) và để yên dung dịch cho đến khi pH ổn định (trong vòng 10s) và ghi thể tích NaOH thêm
vào cùng với giá trị pH tương ứng. Khi quan sát thấy pH của dung dịch mẫu khoảng trước pH
tương đương 2 đơn vị pH nếu mẫu là acid mạnh và 1 đơn vị pH nếu mẫu là acid yếu thì giảm thể
tích NaOH mỗi lần thêm xuống 0.05 hay 0.1 mL (tùy theo buret sử dụng).
Sau khi thấy pH qua điểm tương đương 1 đơn vị thì nên tăng thể tích NaOH mỗi lần thêm lên
0.5 hay 1 mL.
Chuẩn độ cho đến khi giá trị pH đọc trên máy khoảng 11.5 thì dừng (nếu chưa đến pH này mà
để hết cột buret thì nên bổ sung NaOH, lần chuẩn độ lặp kế tiếp nên giảm thể tích mẫu để thể
tích NaOH tiêu tốn không quá 25 mL).
Đối với phép chuẩn độ này:
Ngoài việc ghi nhận giá trị pH trên máy, sinh viên cũng phải ghi nhận sự chuyển màu của chỉ
thị phenolphthalein trong suốt quá trình chuẩn độ.
Khi kết thúc chuẩn độ: ghi thể tích NaOH tiêu tốn.
Tính toán nồng độ đương lượng chính xác của dung dịch NaOH theo hai cách chuẩn độ: dùng
chỉ thị và chuẩn độ trên máy pH. Từ đây rút ra nhận xét về độ chính xác của kết quả chuẩn độ
từng phương pháp.
 Tính toán kết quả chuẩn độ trên máy pH:
- Từ các số liệu thu được vẽ hai đường cong pH = f(V) và (pH/V) = f(Vtb).
- Các bước nhảy pH trên đuờng tích phân pH = f(V) sẽ trùng với các đỉnh peak của đuờng
vi phân pH/V= f(Vtb) biểu thị các điểm tương đương của các phản ứng trung hòa
tương ứng.
- Từ thể tích V tương ứng với các điểm cuối này và nồng độ của 1 tác chất đã biết, tính
nồng độ đương lượng của tác chất còn lại.
3.4. Chuẩn độ riêng dung dịch HCl và dung dịch H3PO4
3.4.1. Thí nghiệm 3: Chuẩn độ bằng buret (thực hiện 3 lần)

27
 Sinh viên xem lại bài thực hành Hóa phân tích trong cuốn “Thực hành Phân tích định
lượng”- TS Hồ Thị yêu Ly (đã học từ học kỳ trước) để chủ động bố trí thí nghiệm và
thực hành

3.4.2. Thí nghiệm 4: Chuẩn độ pH (thực hiện 1 lần)

Dùng pipet lấy 10 mL dung dịch HCl hay H3PO4 để sẵn trên bệ thí nghiệm, cho vào một
becher 150 mL hoặc 250 mL sạch. Thêm nước cất vào đến khoảng 100 mL. Thực hiện các thao
tác chuẩn độ tiếp theo tương tự như hướng dẫn bên trên. Mỗi thí nghiệm chỉ làm 1 lần.

- Vẽ các đuờng chuẩn độ (pH= f(Vtb) và pH/V= f(Vtb) ( và tính nồng độ đương lượng
(CN) và nồng độ mol/L (CM) của HCl và H3PO4 trong các bình hóa chất trong phòng.
- Nếu có thể thì dựa vào đường cong pH = f(V) tính pKa1 và pKa2 của H3PO4 .
- Tại mỗi điểm giao nhau tương ứng với điểm cuối của một phản ứng trung hòa. Từ thể
tích V tương ứng với các điểm cuối này và nồng độ của 1 tác chất đã biết, tính nồng độ
đương lượng của tác chất còn lại.
3.5. Chuẩn độ hỗn hợp HCl + H3PO4
3.5.1. Thí nghiệm 5: Chuẩn độ bằng buret (thực hiện 3 lần)
Sinh viên xem lại bài thực hành Hóa phân tích trong cuốn “Thực hành Phân tích định
lượng”- TS Hồ Thị yêu Ly (đã học từ học kỳ trước) để chủ động bố trí thí nghiệm và thực
hành

3.5.2. Thí nghiệm 6: Chuẩn độ pH (thực hiện 1 lần)

Dùng pipet lấy 10 mL dung dịch hỗn hợp HCl và H3PO4 để sẵn trên bệ thí nghiệm, cho vào
một becher 150 mL hoặc 250 mL sạch. Thêm nước cất vào đến khoảng 100 mL. Thực hiện các
thao tác chuẩn độ tiếp theo tương tự như hướng dẫn bên trên. Mỗi thí nghiệm chỉ làm 1 lần.
Nạp dung dịch NaOH vào buret 25 mL. Tiến hành chuẩn độ giống như trường hợp chuẩn
độ riêng rẽ HCl hay H3PO4 ở trên. Thực hiện thí nghiệm này 1 lần.
- Vẽ các đuờng chuẩn độ (pH= f(Vtb) và pH/V= f(Vtb) và tính nồng độ đương lượng
(CN) và nồng độ mol/L (CM) của HCl và H3PO4 trong các bình hóa chất trong phòng.
- Nhận xét về kết quả các thí nghiệm này và các kết quả chuẩn độ riêng HCl và H3PO4. Từ
đó rút ra nhận xét về các yếu tố có thể gây ảnh hưởng đến độ chính xác của phép chuẩn
độ hỗn hợp.
Lưu ý:
- Giá trị pH được coi là ổn định khi nó dao động không quá  0.01 đơn vị pH (với điện
cực sử dụng lâu có thể chấp nhận  0.02 đơn vị pH).
- Sinh viên nên thao tác khẩn trương để có đủ thời gian thực hiện toàn bộ thí nghiệm trong
bài. Thí nghiệm chuẩn độ trên mẫu kiểm tra chứa hỗn hợp 2 acid nên được thực hiện tối
thiểu 3 lần.

28
 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP

1. Tại sao phải tiến hành chỉnh đệm pH trước khi đo pH hoặc chuẩn độ pH?
2. Vì sao dung dịch đệm thứ nhất luôn là pH 7.00 hoặc 6.86 ?
3. Cách tính pKa từ đường cong chuẩn độ pH theo V ?
4. Tại sao phải chỉnh nhiệt độ của máy theo nhiệt độ dung dịch trước khi chỉnh đệm?
5. Tại sao theo lý thuyết Vtđ2 = 2Vtđ1 nhưng trên thực tế Vtđ2 > 2 Vtđ1 ?
6. Tại sao ta không chuẩn đến điểm tương đương thứ 3 của acid phosphoric ?
7. Tính pHtđ1 và pHtđ2, so sánh với kết quả thực tế.
8. Tại sao phải hoạt hóa điện cực bằng cách ngâm qua đêm với dung dịch HCl 1M?
9. Mục đích của hiệu chuẩn điện cực là gì?

29
 BÀI 5: XÁC ĐỊNH HỖN HỢP CAFFEIN VÀ PARACETAMOL TRONG MẪU DƯỢC
PHẨM BẰNG HPLC-UV
1. MỤC ĐÍCH

– Sinh viên hiểu về hoạt động của máy HPLC

- Sinh viên thực hiện được các bước pha chế dung dịch, lọc mẫu, chuẩn và dung môi.
– Sinh viên giải thích được các điều kiện thiết lập cho quá trình chạy sắc ký.
– Sinh viên đọc được kết quả phân tích và xử lý kết quả.
2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một công cụ phân tích quan trọng để tách và định
lượng các thành phần trong hỗn hợp chất lỏng phức tạp. Trong sắc ký lỏng gồm pha động là
chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn. Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động, cho
qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên
bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha động với ]tốc độ khác
nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh – pha động – chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác
nhau, các thành phần mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định
lượng. Tùy thuộc vào cơ chế lưu giữ có thể phân loại HPLC thành nhiều loại.

2.1. Cách thức chuẩn bị pha động trong HPLC

2.1.1. Yêu cầu của pha động

– Pha động phải trơ với pha tĩnh đang sử dụng.

– Chất phân tích trong mẫu phải tan được trong pha động thì mới rửa giải được.
– Khi thay đổi pha động phải lưu ý tính tan lẫn giữa các dung môi khác nhau trong các pha
động khác nhau. Đặc biệt các pha động là nước có các muối vô cơ đóng vai trò làm dung dịch
đệm ổn định pH, các muối này trong môi trường hữu cơ thường hay bị tủa làm nghẹt cột.
– Pha động phải bền vững theo thời gian: Càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là pha động
không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu.
– Pha động phải có độ tinh khiết cao: Dung môi sử dụng trong HPLC phải dùng đúng
loại dành cho HPLC và có xuất xứ đáng tin cậy.
– Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
– Phải phù hợp với loại detector: Nếu là đầu dò UV – VIS thì dung môi phải có
UV cutoff thấp hơn bước sóng đang làm việc. Nếu là đầu dò huỳnh quang thì dung môi
không được phát quang. Nếu đầu dò MS thì pha động phải dễ hóa hơi.
– Các dung môi có mặt trong pha động càng rẻ và càng thân thiện với môi trường càng tốt.

2.1.2. Làm sạch dung môi

Pha động phải được lọc qua màng lọc, thông qua hệ thống lọc áp suất thấp, thường
dùng màng lọc có lỗ xốp 0,45µm trong sắc ký. Các loại màng lọc thông dụng bao gồm:

30
 – Màng lọc celluloseacetate: Được sử dụng với mẫu nước chứa ít hơn 10% dung môi hữu
cơ. Với các dung môi nhiều thành phần hữu cơ hơn, màng lọc sẽ bắt đầu hòa tan và
nhiễm bẩn mẫu.
– Màng lọc Teflon: Được sử dụng cho dung môi hữu cơ với ít hơn 75% nước. Khi dùng
màng lọc Teflon với dung môi có tỷ lệ hữu cơ cao, trước tiên làm ướt màng lọc bằng dung môi
hữu cơ tinh khiết, rồi với dung môi nước, sau đó mới bắt đầu lọc.
– Màng lọc nylon: Có thể sử dụng cho cả dung môi nước và dung môi hữu cơ. Tuy nhiên
nên tránh dùng khi dung môi quá acid hay quá kiềm, vì màng lọc sẽ hỏng.
Nếu tiến hành sắc ký theo chế độ đẳng dòng 1 kênh thì phải phối trộn pha động theo
đúng tỷ lệ và thành phần mong muốn, sau đó lọc bằng hệ thống lọc chân không với màng lọc
0,45µm.
Nếu tiến hành sắc ký theo chế độ chế độ đẳng dòng đa kênh hoặc gradient thì lọc
riêng từng loại dung môi. Các loại dung môi này khi phối trộn vẫn có khả năng sẽ tủa (đặc biệt
là đệm phốt phát trong môi trường hữu cơ). Vì thế phải phối trộn với tỷ lệ muối đệm cao nhất
(theo chương trình gradient đã nghiên cứu) trước ít nhất một ngày để quan sát, nếu dung dịch
trong suốt bình thường thì mới được tiến hành sắc ký theo chương trình gradient trên.
2.1.3. Đuổi khí

Trong dung môi sau khi lọc sẽ còn khí, các bọt khí này khi vào cột sẽ ảnh hưởng đến quá
trình sắc ký. Vì vậy, phải đuổi khí bằng cách đặt chai chứa pha động vào trong bể siêu âm
thường là khoảng 15 phút (đối với dung môi hữu cơ) và 35 phút (đối với dung môi nước).

2.2. Định danh

Khi tiêm mẫu vào cột sắc ký, chất tan sẽ di chuyển dọc theo cột và sẽ có thời gian lưu giữ nhất
định trong cột sắc ký. Mỗi chất sẽ có thời gian lưu cố định trong một điều kiện sắc ký, cho nên
thời gian lưu là đại lượng để định danh các chất.
Có thể thực hiện định danh bằng hai cách:
– Cách 1: Tiêm chuẩn hỗn hợp rồi sau đó tiêm chuẩn đơn.
– Cách 2: Tiêm chuẩn hỗn hợp. Tiếp theo tiêm chuẩn hỗn hợp trong đó có một chuẩn đã tăng
nồng độ lên. Sắc ký đồ cho thấy peak nào cao lên thì đó chính là chuẩn đã pha với nồng độ tăng
lên.
2.3. Kỹ thuật tính toán

Trong sắc ký, diện tích peak tỷ lệ với nồng độ chất phân tích tiêm vào cột. Diện tích
peak được xác định bằng tay hoặc tự động bằng phần mềm. Tùy thuộc vào kỹ thuật tiến hành
mà cách tính toán thay đổi phù hợp.
2.3.1. Kỹ thuật so sánh một chuẩn
Tiêm một mẫu chuẩn vào máy và có diện tích peak (S) ứng với nồng độ C.
Ta có S = K.C  K = S/C.

31
 Tiêm mẫu xác định vào máy sắc ký và có diện tích peak SX  CX=SX/K
2.3.2. Kỹ thuật đường chuẩn

Dựng một dãy chuẩn, tiêm vào máy sắc ký có các diện tích peak Si tương ứng với nồng độ C
của chất phân tích trong mẫu thứ i. Thiết lập mối tương quan S = f(Ci) bằng phương trình hồi
quy tuyến tính. Thực hiện tương tự trên mẫu, có tín hiệu SX. Thế giá trị SX vào phương trình hồi
quy suy ra giá trị Cx

3. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

3.1. Dụng cụ và thiết bị

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng
cụ cụ thể sau:

- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,001 g.

- Bể siêu âm

- Giấy lọc, loại trung tính, tốc độ chảy trung bình.

- Bộ lọc dung môi, với màng lọc có cỡ lỗ 0,45 m.
3.2. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao

- Cột phân tích HPLC C18, kích thước cột 250 mm x 4màng diot (DAD), Bình chứa
dung môi, Hệ thống bơm mẫu, máy tính xử lý dữ liệu.

3.3. Hóa chất

STT Tên Hóa chất Xuất xứ

1 Chuẩn caffein

2 Chuẩn Paracetamol

3 Methanol for HPLC

4 Nước cât hai lần

Phân chia nhóm chuẩn bị hóa chất

1. Chuẩn bị pha động: (1 nhóm) sẽ được giao nhiệm vụ chuẩn bị pha động
2. Dung dịch chuẩn gốc (1 nhóm)
- Chuẩn gốc caffeine 100 ppm: điều chế 100 mL Dd chuẩn caffeine 100 ppm (mg/L)
- Chuẩn gốc paracetamol 100 ppm: điều chế 100 mL DD chuẩn paracetamol 100 ppm
(mg/L)

32
 Dung dịch chuẩn gốc, sau khi điều chế xong, cho vào chai đượng, bảo quản trong tủ lạnh
được 4 tháng.

Chai được được dãn nhãn, thời gian pha, người pha. Sau khi làm xong, nhóm có trách
nhiệm pha sẽ đưa vào tủ lạnh để lưu trữ ngăn mát.

3. Dung dịch chuẩn làm việc (Sử dụng cho thí nghiệm 4.2.2; 4.2.3) (1 nhóm)
Chuẩn hỗn hợp (A): Pha 100 mL chuẩn hỗn hợp caffeine 10ppm và paracetamol
2,5ppm từ chuẩn gốc là 100 ppm bằng nước cất hai lần.

Chuẩn đơn caffeine (B): 100 mL chuẩn đơn caffeine 10 ppm từ dd chuẩn gốc 100
ppm bằng nước cất hai lần

Chuẩn đơn paracetamol (C): 100 mL chuẩn đơn paracetamol 2,5 ppm từ 100 ppm
bằng nước cất hai lần
Chuẩn hỗn hợp trung gian (D): Pha 100 mL hỗn hợp chuẩn caffeine 100ppm và
paracetamon 25 ppm từ chuẩn gốc 1000ppm (dung dịch D)

Các dung dịch chuẩn làm việc A, B, C, D sau khi pha xong, lọc bằng xy lanh và màng
lọc 0,45µm, chuyển phần lọc vào ống nghiệm đã được dán nhãn theo đúng tên của dung
dịch đó.

4. Dãy chuẩn.
Đường chuẩn được pha theo bảng sau:

Viết nhãn Blank STD1 STD2 STD3 STD4 STD5

Nồng độ dãy CAF: 0 CAF: 1 CAF: 2 CAF: 5 CAF:10 CAF:20
chuẩn (ppm) PAR: 0 PAR: 0,25 PAR: 0,50 PAR: 1,25 PAR: 2,5 PAR: 5
Thể tích dung
0 1.00 2.00 5.00 10.00 20.00
dịch D (mL)
Định mức Định mức tới vạch 100mL bằng nước cất 2 lần.
Các dãy dung dịch chuẩn sau khi pha xong, lọc bằng xy lanh và màng lọc 0,45µm (PTFE
(Poly Tetra Fluoro Thylene- filter), chuyển phần lọc vào ống nghiệm đã được dán nhãn
theo đứng tên của dung dich đó.

4. THỰC NGHIỆM

4.1. Nguyên tắc

Caffeine và paracetamol là các dược phẩm được xác định bằng HPLC- UV. Tối ưu quá
trình tách trên các chuẩn, dựng đường chuẩn và định lượng trên mẫu thuốc.

4.2. Qui trình

4.2.1. Tối ưu quá trình tách

33
 Do thời gian thực tập có hạn nên sinh viên không tiến hành khảo sát tốc độ dòng, mà
chọn theo điều kiện tối ưu ở tốc độ dòng là 1mL/phút.

4.2. 2 Khảo sát thành phần pha động

Chọn bước sóng 263nm để khảo sát sơ bộ quá trình tách. Dùng chuẩn hỗn hợp
A để khảo sát thành phần pha động. Thành phần pha động sẽ khảo sát lần lượt theo tỉ lệ
dung môi (V:V) như sau hoặc thay đổi tùy theo thực nghiệm.

MeOH: H2O = 50: 50

MeOH: H2O = 30: 70

MeOH: H2O = 20: 80

Lưu ý: Với máy HPLC-DAD, chọn CH1: 272nm; CH2: 207 nm

4.2.3. Định danh peak và khảo sát bước sóng

Caffein có được thành phần pha động phù hợp, tiến hành tiêm chuẩn đơn B và C để định
danh peak (tR) của từng chất.

Caffein: bước sóng 272 nm

Paracetamol: bước sóng 207 nm

4.2.4. Xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính – Xác định LOD, LOQ

– Tiến hành tiêm các dung dịch vào hệ thống HPLC. Đầu tiên là mẫu trắng rồi đến các
dung dịch chuẩn có nồng độ từ thấp đến cao của chuẩn hỗn hợp caffeine và Paracetamol.

– Xác định LOD, LOQ với mẫu trắng là nước cất. Sau đó, chạy các dung dịch chuẩn sao
cho S/N ~ 3. Sau khi đã xác định được S/N ~ 3 của 2 chất thì sinh viên thực hiện pha chuẩn
hỗn hợp tại điểm chuẩn mà sinh viên xác định được và thực hiện chạy thêm 3 lần để xác
nhận LOD. Từ đó tính ra LOQ

Nguyên tắc xác định LOD trong bài thực tập:

Có nhiều cách xác định LOD khác nhau tuỳ thuộc vào phương pháp xác định như: xác
định dựa trên độ lệch chuẩn, dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, dựa trên đường chuẩn…Trong
bài thực tập này, sinh viên sẽ tiếp cận cách xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu.
Cách xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu chỉ áp dụng đối với quy trình sử
dụng các công cụ có nhiễu đường nền. Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến cho các
phương pháp sắc ký, điện di.
Cách xác định:

34
 Chạy mẫu, mẫu thêm chuẩn hoặc chuẩn ở nồng độ thấp nhất để còn tín hiệu của chất
phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio),
Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích,
N là nhiễu đường nền
Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận
hai bên của píc, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của peak tại nửa chiều cao.
LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền,
thông thường thường lấy S/N =3.

Hình 1: Xác định LOD bằng cách tính S/N

4.2.3. Phân tích mẫu thuốc
Mỗi nhóm sẽ phân tích một mẫu thuốc nhóm chuẩn bị và 1 mẫu PTN cung cấp:

Cân 10 viên thuốc rồi nghiền thành bột mịn. Cân chính xác khoảng 500mg vào cốc thêm
khoảng 50mL MeOH, đánh siêu âm rồi chuyển hết vào bình định mức 100mL, định mức
bằng nước cất, lọc bằng hệ thống áp suất kém hoặc lọc áp suất thường, sau đó lọc qua màng
lọc 0,45μm. Tiêm vào hệ thống HPLC. Căn cứ vào hàm lượng paracetamol và cafein trong
viên thuốc và hệ số đáp ứng của paracetamol cũng như caffeine mà pha loãng sao cho phù
hợp. Từ đó xác định hàm lượng paracetamol và caffein trên 1 viên thuốc
Lưu ý
Để kết quả phân tích đáng tin cậy. Trong quá trình phân tích cần thực hiện các mẫu để
kiểm soát chất lượng như sau:
 Blank quy trình: thực hiện một mẫu blank theo quy trình phân tích để kiểm soát
nhiễm mẫu (kiểm soát hoá chất, dụng cụ thí nghiệm, môi trường…)
 Mẫu thêm chuẩn: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu
trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, tính hiệu suất thu hồi. Sinh viên tự tính toán
mẫu thêm chuẩn và báo cáo đến GV trước khi tiến hành thí nghiệm.
 Phân tích mẫu lặp: Mỗi mẫu cần thực hiện 3 lần.
(Sinh viên tự tính toán, dự tính và báo lại cho GV biết, ghi lại báo cáo trong phần kết
quả)

35
 Các dung dịch mẫu thử sau khi pha xong, lọc bằng xy lanh và màng lọc 0,45µm (PTFE
(Poly Tetra Fluoro Thylene- filter), chuyển phần lọc vào ống nghiệm đã được dán nhãn
theo đứng tên của dung dich đó.
5. YÊU CẦU BÁO CÁO

5.1. Tính kết quả

Từ dữ liệu có được trong quá trình đo:

– Định danh được các chất trong sắc ký đồ, giải thích thứ tự rửa giải của paracemol và
cafein.

– Nhận xét kết quả thu được khi thay đổi thành phần pha động.

– Nêu được điều kiện chạy tiến hành sắc ký với hổn hợp paracemol và cafein

– Xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính (tính với ppm chuẩn; tính với số µg trong bình
định mức chứa mẫu tiêm vào máy HPLC).

– Tính LOD, LOQ.

– Hàm lượng caffeine và paracetamol trong mẫu khi tính với kỹ thuật đường chuẩn, kỹ thuật
so sánh một chuẩn, so sánh hai chuẩn.

36
 TRẢ LỜI CÂU HỎI

Câu 1. Trình bày cấu tạo một hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao.

Câu 2. Trình bày cơ chế hoạt động của van tiêm mẫu trong sắc kí lỏng

Câu 3. Trình bày nguyên tắc hoạt động của đầu dò UV.

Câu 4. Trình bày cách xác định LOD, LOQ trong bài.

Câu 5. Trình bày cách xác đinh phương trình hồi quy tuyến tính trong bài.

Câu 6. Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa trên các thông số nào của sắc ký đồ? Giải thích.

37