ANTIGEN-ANTITELO

REAKCIJE
(imunološki testovi)
 Ag-At reakcije (opšte osobine)
Antigen-antitelo (Ag-At) reakcije čine osnovu mnogih in vitro testova koji se
obavljaju u laboratorijskim uslovima u dijagnostičke ili istraživačke svrhe

Ispituje se prisustvo antigena ili antitela u odgovarajućem uzorku (serumu,

likvoru, tkivu, ćelijskoj kulturi...)

Detekcija Ag (korišćenjem poznatog At):

- infektivni agens ili njegov deo (npr. HbsAg...)

- drugi molekuli (npr. citokini, komponente komplementa, hormoni,
tumor markeri, proteini akutne faze...)

Detekcija At (korišćenjem poznatog Ag ili sekundarnog anti-imunoglobulinskog At):

- ukupni imunoglobulini (pojedine klase ili potklase, npr. IgM ili IgG3)

- specifična At za određeni Ag (patogena ili sopstvenih ćelija)

 Ag-At reakcije (opšte osobine)
Mogu da budu: Rezultat:

1. Kvalitativne POZITIVAN
NEGATIVAN
2. Kvantitativne Ag - KONCENTRACIJA (npr. 2 μg/ml ili IU)
Ukupna At - KONCENTRACIJA (npr. IgG 13,5
mg/ml)
Koncentracija se određuje poređenjem sa standardima (pomoću standardne ili
kalibracione krive)

3. Semi-kvantitativne Gradacija
(npr. slabo pozitivan, umereno pozitivan ili jako pozitivan)
Specifična At - TITAR (npr. 1/64 ili 64)

TITAR je mera količine specifičnih antitela i predstavlja (recipročnu) vrednost

najvećeg razblaženja uzorka koji daje pozitivnu reakciju
 Princip određivanja titra

Diluent

Kontrola
Uzorak

Rezultat + + + + + - -

Titar je 32 (1/32)
Princip dijagnostike infektivnih bolesti pomoću specifičnih antitela
(na osnovu klase antitela – jedan uzorak)
Susret
sa patogenom
Prisustvo IgM antitela (sa ili bez IgG)
Količina antitela u serumu (titar)

ukazuje na akutnu infekciju

I
IgG (eventualno IgA i IgE)
IgM,I IgG
I
IgG
I
IgM

Vreme (nedelje)
Princip dijagnostike infektivnih bolesti pomoću specifičnih antitela
(na osnovu titra antitela – dva uzorka)
Susret
sa patogenom
Količina antitela u serumu (titar)

I
IgG

IgG
I
Titar 2
Titar 1

Vreme (nedelje)
Princip dijagnostike infektivnih bolesti pomoću specifičnih antitela
(na osnovu titra antitela – dva uzorka)
Susret
sa patogenom
Količina antitela u serumu (titar)

I
IgG

IgG
I
Titar 2 Titar 1

Vreme (nedelje)
Princip dijagnostike infektivnih bolesti pomoću specifičnih antitela
(na osnovu titra antitela – dva uzorka)
Susret
sa patogenom
Količina antitela u serumu (titar)

Antitela visokog
aviditeta

IgG
I I
IgG
Titar 21

Vreme (nedelje)
Princip dijagnostike infektivnih bolesti pomoću specifičnih antitela
(na osnovu titra antitela – dva uzorka)
Susret
sa patogenom
Četvorostruka ili veća promena titra
Količina antitela u serumu (titar)

ukazuje na akutnu infekciju

I
IgG

IgG
I
Titar 2

≥4x
Titar 1

Vreme (nedelje)
 Ag-At reakcije (opšte osobine)
Pouzdanost testa

Kontrole - pozitivna
Bez validnih kontrola test nema značaj
- negativna

Osetljivost (senzitivnost) Udeo lažno negativnih

(npr. u testu čija je osetljivost 97%, može se očekivati 3% lažno negativnih)

Specifičnost Udeo lažno pozitivnih

(npr. u testu čija je specifičnost 95%, može se očekivati 5% lažno pozitivnih)

 Ag-At reakcije (opšte osobine)

Podela na osnovu načina detekcije Ag-At (imunskih) kompleksa:

1. Formiranjem velikih kompleksa koji se detektuju golim okom ili fotometrijski

- Imunoaglutinacija
- Imunoprecipitacija

2. Obeležavanjem jednog reagensa (obično At) nekim obeleživačem (markerom) i

detekcijom kompleksa golim okom ili pomoću odgovarajućeg aparata

- Enzimski imunotest
- Radio-imuno test
- Imunofluorescencija
- Brzi imunološki (imunohromatografski) testovi
IMUNOAGLUTINACIJA
 Imunoaglutinacija
IMUNOAGLUTINACIJA je test baziran na reakciji između nerastvorljivog Ag (deo neke
velike čestice, npr. ćelije) i odgovarajućih specifičnih At

Rezultat reakcije je formiranje velikih imunskih kompleksa koji se vide kao aglutinat
(zrnca vidiljiva golim okom na pločici)
 Imunoaglutinacija
(rezultat testa)

Pozitivan Negativan

Pozitivan Negativan
 Imunoaglutinacija
IMUNOAGLUTINACIJA je test baziran na reakciji između nerastvorljivog Ag (deo neke
velike čestice, npr. ćelije) i odgovarajućih specifičnih At

Rezultat reakcije je formiranje velikih imunskih kompleksa koji se vide kao aglutinat
(zrnca vidiljiva golim okom na pločici)

Vidljivi aglutinat se javlja ako je odnos antitela i antigena približno jednak (optimalan
odnosno ekvivalentni odnos)
 Mogući ishodi reakcije imunoaglutinacije
EKVIVALENTAN
(OPTIMALAN)
VIŠAK ANTITELA ODNOS VIŠAK ANTIGENA

Ag-At KOMPLEKSI: MALI VELIKI MALI

AGLUTINACIJA: NE POSTOJI POSTOJI NE POSTOJI

REZULTAT: NEPOUZDAN POUZDAN NEPOUZDAN

(LAŽNO NEGATIVAN) (POZITIVAN) (LAŽNO NEGATIVAN)
FENOMEN PROZONE
 Imunoaglutinacija
IMUNOAGLUTINACIJA je test baziran na reakciji između nerastvorljivog Ag (deo neke
velike čestice, npr. ćelije) i odgovarajućih specifičnih At

Rezultat reakcije je formiranje velikih imunskih kompleksa koji se vide kao aglutinat
(zrnca vidiljiva golim okom na pločici)

Vidljivi aglutinat se javlja ako je odnos antitela i antigena približno jednak (optimalan
odnosno ekvivalentni odnos)

Može biti direktna (Ag je deo velike čestice) i indirektna (Ag je solubilan molekul
vezan za nerastvorljivu česticu)
 Direktna imunoaglutinacija
(identifikacija bakterija)

Ag je deo
bakterije

Bakterija
 Direktna imunoaglutinacija
(npr. identifikacija bakterija)

IgM antitelo

Ag je deo
bakterije

Bakterija
 Widal-ova reakcija
Pravljenje serijskih razblaženja seruma
Ukloniti 25μl iz
poslednje epruvete

Serum

O antigen
H antigen
Salmonella

+ + + - - - -
 Indirektna imunoaglutinacija
(detekcija reumatoidnog faktora - RF)

Vezujuće mesto

Fc fragment IgG antitela

Struktura reumatoidnog faktora

Indirektna imunoaglutinacija
(detekcija reumatoidnog faktora - RF)
 Indirektna imunoaglutinacija
(npr. detekcija reumatoidnog faktora - RF)

Fc fragment IgG antitela

 Indirektna imunoaglutinacija
(npr. detekcija reumatoidnog faktora - RF)

Fc fragment IgG antitela

IgM antitelo
 Imunoaglutinacija
IMUNOAGLUTINACIJA je test baziran na reakciji između nerastvorljivog Ag (deo neke
velike čestice, npr. ćelije) i odgovarajućih specifičnih At

Rezultat reakcije je formiranje velikih imunskih kompleksa koji se vide kao aglutinat
(zrnca vidiljiva golim okom na pločici)

Vidljivi aglutinat se javlja ako je odnos antitela i antigena približno jednak (optimalan
odnosno ekvivalentni odnos)

Može biti direktna (Ag je deo velike čestice) i indirektna (Ag je solubilan molekul
vezan za nerastvorljivu česticu)

Test može da bude kvalitativan ili semi-kvantitativan (npr. titar)

Najčešće se koristi za identifikaciju krvnih grupa, dijagnostiku infektivnih bolesti

(detekcija Ag ili At na patogene) i autoimunskih bolesti (detekcija autoreaktivnih At)

Poseban vid ovog testa je antiglobulinski ili Kumbsov test (engl. Coombs)
 ABO antigeni
• Eksprimirani su na Er, ćelijama endotela i N-acetilgalaktozamin

mnogim drugim tipovima ćelija

• Sastoje se od glikanskog jezgra koje može
imati dodatnu šećernu grupu
• O krvna grupa – samo glikansko jezgro, Galaktoza

bez terminalnog šećera

• Nosioci O krvne grupe imaju i anti-A i
anti-B At koja se stvaraju na Ag
mikroorganizama u crevima i unakrsno
reaguju sa ABO antigenima Lipid ili protein
 ABO antigeni
Krvna
grupa A B AB O

Eritrociti

Ag na
površini

At u
serumu
 Eritrociti osoba sa različitim krvnim grupama

Serumi osoba sa
različitim krvnim O A B AB
grupama

O
Anti A i anti B antitela

A
Anti B antitela

B
Anti A antitela

AB
Nema antitela
 Direktni antiglobulinski (Kumbsov) test
(npr. za detekciju anti-eritrocitnih At kod hemolizne anemije)

Ag na eritrocitima Anti-eritrocitna At Anti-humana At (Kumbsov reagens)

Uzorak pacijenta Pozitivan rezultat

 Indirektni antiglobulinski (Kumbsov) test
(npr. za detekciju anti-Rh At kod Rh negativne majke)

Anti-eritrocitna At Ag na eritrocitima Anti-humana At (Kumbsov reagens)

Uzorak Pozitivan rezultat

pacijenta
 Primena imunoaglutinacije
• U MIKROBILOŠKOJ DIJAGNOSTICI:
- Klasifikacija streptokoka u odgovarajuće grupe (A, B, C, D, F ili G) nakon kultivacije
(lateks kuglice obložene antitelima na specifične karbohidratne antigene
streptokoka specifične za svaku grupu)
- Detekcija rota virusa u uzorku stolice (lateks kuglice obložene antitelima na antigen
rota virusa)
- Serotipizacija salmonele

• U DIJAGNOSTICI AUTOIMUNSKIH I INFLAMATORNIH BOLESTI:

- Detekcija reumatoidnog faktora (veliki broj autoimunskih bolesti)
- Detekcija anti-eritrocitnih antitela (autoimuska hemolizna anemija - direktni
Kumbsov test)

• OSTALO:
- Određivanje krvnih grupa
- Detekcija anti-Rh antitela (indirektini Kumbsov test)
IMUNOPRECIPITACIJA
 Imunoprecipitacija
IMUNOPRECIPITACIJA je test baziran na reakciji precipitacije (taloženja) solubilnog
Ag pomoću odgovarajućih specifičnih At

Rezultat reakcije je precipitat (talog) koji nastaje zbog formiranja Ag-At kompleksa u
zoni optimalnih odnosa njihovih koncentracija

Imunoprecipitacija se obavlja u gelu ili tečnoj sredini

- u gelu nastaju veliki kompleksi u vidu precipitacijske linije koja se vidi golim okom

- u tečnoj sredini nastaju mali kompleksi, tj. mikroprecipitati koji se detektuju

fotometrijski (nefelometrom)

Dvostruka imunodifuzija je kvalitativan test i koristi se za detekciju autoantitela

Dvostruka imunodifuzija
(princip)

Ag X Ag Y

Uzorak
pacijenta

Pojava precipitacijske linije

ukazuje na postojanje ispitivanog
autoantitela u uzorku
 Imunoprecipitacija
IMUNOPRECIPITACIJA je test baziran na reakciji precipitacije (taloženja) solubilnog
Ag pomoću odgovarajućih specifičnih At

Rezultat reakcije je precipitat (talog) koji nastaje zbog formiranja Ag-At kompleksa u
zoni optimalnih odnosa njihovih koncentracija

Imunoprecipitacija se obavlja u gelu ili tečnoj sredini

- u gelu nastaju veliki kompleksi u vidu precipitacijske linije koja se vidi golim okom

- u tečnoj sredini nastaju mali kompleksi, tj. mikroprecipitati koji se detektuju

fotometrijski (nefelometrom)

Dvostruka imunodifuzija je kvalitativan test i koristi se za detekciju autoantitela

Radijalna imunodifuzija (RID) i nefelometrija su kvantitativni testovi i koriste se za

merenje količine imunoglobulina i drugih proteina (npr. komponenti komplementa)
u telesnim tečnostima
Radijalna imunodifuzija – RID test
(princip)

Kvantifikacija na osnovu površine

kruga (tj. kvadrata prečnika
kružne precipitacijske linije)
 Radijalna imunodifuzija – RID test
(princip)

S2 At u gelu

S3 S1 Ag u rupice

S1 standard poznate koncentracije

RID S2 standard poznate koncentracije

IgG
S3 standard poznate koncentracije

P1 uzorak pacijenta 1
P1 P2
P2 uzorak pacijenta 2
 Radijalna imunodifuzija – RID test
(princip)

Standardna (kalibraciona) kriva

D2 (mm2)
S3

S2

S1

P1 P2 Ag – koncentracija (mg/ml)
Nefelometrija

Veoma precizna i pouzdana

Relativno skupa

CRP
Ig (IgE)
Komponente sistema komplementa
 Nefelometrija
Laser – izvor
(princip) svetlosti

Fokusiranje
svetlosnih zraka

Ag + At

Sočivo
Kvantifikacija na osnovu
rasipanja laserskog zraka na
mikroprecipitatima
Detektor
 Primena imunoprecipitacije

- Detekcija komponenti komplementa u sistemskom eritemskom lupusu,

angioedemu, urtrikariji, kutanim vaskulitisima (C1q, C2, C3, C4)

- Detekcija potklasa IgG i ostalih klasa imunoglobulina (IgM, IgA) u humoralnim

imunodeficijencijama

- Detekcija reaktanata akutne faze (C-reaktivni protein)

- *RID test manje osetljiv od nefelometrije, ne može da se primenjuje za

određivanje količine proteina koji imaju nisku koncentraciju u krvi (npr. IgE)
 Sledeća nedelja
Antigen-antitelo reakcije II deo

Predavanje: Osnovni mehanizmi odbrane protiv intracelularnih

i ekstracelularnih bakterija. Izbegavanje mehanizama odbrane od
strane bakterija.

Vežba: Enzimski imunotest (EIA), radio-imunotest (RIA),

imunofluorescencija, brzi hromatografski testovi i njihova
praktična primena.