11/17/2022

IMUNOTESTOVI SA OBELEŽIVAČIMA

IMUNOTESTOVI- metode u kojima se kao reagensi koriste At za kvantitativno

određivanje Ag u uzorcima; mogu se određivati i At pri poznatima konc. Ag
cilj: detekcija kompleksa Ag-At

- metoda koja se koristi za detekciju Ag-At kompleksa je obično i naziv datog imunotesta:
ako se kao obeleživač koristi radioizotop, imunotest se naziva radioimunotest;
ako se koristi enzim- enzimimunotest
ako se koristi fluorohrom- fluorescentniimunotest).

- obeleživači: radioizotopi (125 I)

enzimi
fluorescentni obeleživači (fluorohromi)
hapteni
ostali (feritin, čestice koloidnog zlata, hemiluminiscentne čestice...)

1
 11/17/2022

Enzimski imunotestovi (engl. Enzyme immunoassay- EIA)

enzim supstrat____________________________
alkalna fosfataza p- nitro-fenil-fosfat
peroksidaza H2O2 + ortofenilen diamin (OPD) ili tetrametilbenzidin (TMB)

ELISA (engl. Enzyme Linked immuno Sorbent Assay)

- za određivanje koncentracije Ag ili At

- kompleks Ag-At se detektuje nakon reakcije enzima sa supstratom pri čemu nastaje
rastvorljiv, obojeni proizvod reakcije;
intenzitet boje meri se spektofotometrijski

Nekompetitivne ELISA tehnike

- antigenom obložena ploča za ELISA test
- antitelom obložena ploča za ELISA test (sendvič ELISA)

Komplet za izvođenje ELISA testa

(ELISA kit)

2
 11/17/2022

Nekompetitivni ELISA testovi

Antigenom obložena ploča za ELISA test

- za određivanje konc. At protiv stranih ili sopstvenih Ag (npr. anti-DNK antitela,

anti-HIV antitela, anti-TPO antitela….)

anti-Ig antitelo
antitelo iz uzorka obeleženo enzimom supstrat

E E
S

antigen
vezan za bazen

3
 11/17/2022

Antitelom obložena ploča za ELISA test

- za određivanje konc. Ag (npr. citokini, površinski antigeni virusa)

antitelo specifično
za antigen
antigen iz uzorka obeleženo enzimom supstrat

E E
S

antitelo
vezano za bazen

http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/main.html
https://www.youtube.com/watch?v=ojYHnZZbwz8
https://www.youtube.com/watch?v=lUWpWKVcmc4

4
 11/17/2022

Imunohromatografski testovi (engl. later flow assays)

- za kvalitativnu analizu uzorka, rezultat se dobija nakon 10-15 min (brzi testovi)
(mogu biti i kvantitativni)
- oni su kombinacija hromatografije i imunohemijske reakcije
- izvode se najčešće na test traci
- Delovi na test traci su:
DEO ZA UZORAK (engl. sample pad) – tu se nanosi uzorak; čini ga najčešće
celulozna traka koja obezbeđuje kontiuirani i homogen protok uzorka ka drugim
delovima trake
DEO SA KONJUGATOM (engl. conjugate pad) – nalaze se konjugovana At ili Ag
što zavisi od namene testa; konjugati nisu fiksirani, oni bivaju oslobođeni i započinju
„kretanje“ prema drugom kraju test trake nakon kontakta i interakcije sa uzorkom
(tada nastaju imunski kompleksi); najčešće se kao obeleživač (konjugat) koriste
nanočestice zlata
DEO SA TEST i KONTOLNOM TRAKOM- čini ga nitrocelulozna membrana
za koju su fiksirane probe (najčešće At) koje hvataju imunske komplekse nastale u
prethodnom delu
DEO ZA APSORPCIJU- krajnji deo trake koji služi za apsorpciju viška uzorka;
ima ulogu u održavanju protoka uzorka kroz membranu ka kraju trake i sprečavanju
povratnog kretanja uzorka
- Svi delovi su fiksirani ili montirani na čvrstoj podlozi;

5
 11/17/2022

https://www.youtube.com/watch?v=yZnwyJ9FSK0

Primer imunohromatografskog testa za detekciju anti-SARS-Cov2 antitela

IgM i IgG klase jednog od proizvođača

6
11/17/2022

7
 11/17/2022

Procedura i prinip testa za detekciju anti-SARS-Cov2 antitela IgM i IgG klase jednog od
proizvođača:
1. Uzorci pune krvi (može kap krvi iz prsta), seruma ili plazme se unose u bunarić. Dodaje se i
pufer (fosfatni PBS)
2. Uzorak prolazi naniže ka membrani
3. Kapilanim silama uzorak putuje bočno kroz membranu i najpre stiže do dela koji sadrži Ag
virusa konjugovan sa nanočesticama zlata (AuNP). Ukoliko postoje antitela na virus, ona će se
vezati za Ag-AuNP konjugat.
U ovom delu test trake se nalazi I zečiji IgG konjugovan sa AuNP. Ova antitela služe kao kontrola
testa I ona nastavljaju da “putuju” sa uzorkom dalje kroz membranu.
4. Uzorak dalje “putuje” kroz membranu i stiže do delova membrane gde su imobilisana anti-
humana IgM, anti-humana IgG i anti-zečija antitela (C- kontrolna traka). Ova područja su
odvojena.
5. Prvo područje tj. Traka je ona na kojoj se nalaze imobilisana anti-humana IgM. IgM antitela iz
uzorka će se ovde vezivati, ali će samo specifična za virus dati obojenu traku jer nose sa sobom
AuNP.
6. Drugo područje tj. traka je ona na kojoj se nalaze imobilisana anti-humana IgG. IgG antitela iz
uzorka će se ovde vezivati, ali će samo specifična za virus dati obojenu traku jer nose sa sobom
AuNP.
7. Kontrolna linija je poslednja u nizu. Sadrži imobilisana anti-zečiji IgG antitela. Ona vezuju
kontrolna zečija IgG konjugovana AuNP. Ovo je kontrola testa i ova linija treba da se pojavi. Ona
pokazuje da je tok uzorka kroz membranu bio odgovarajući i da je korišćena dovoljna količina
uzorka. Ova linije je uvek pozitivna – I onda kada se druge trake ne pojavljuju.
8. Rezultati testa se očitavaju nakon 10 minuta.

8
 11/17/2022

Princip imunohromatografskog testa za detekciju SARS-Cov2 virusa

(antigenski test)