Monoklonska

onoklonska antitela (mAt)

mAt)
Definicija monoklonskih antitela za humanu upotrebu iz VI
Evropske farmakopeje:
Monoklonska antitela za humanu upotrebu su preparati
imunoglobulina ili njihovih fragmenata, npr. F(ab)2, sa tano
odredjenom specifinou, a produkti su jednog klona elija.
Mogu se koristiti sama ili konjugavana tj. vezana za druge
supstance. Mogu biti produkti elijske linije besmrtnih B
limfocita ili elijskih linija dobijenih rDNK tehnologijom.
Trenutno dostupna antitela dobijena rDNK tehnologijom su:
Himerna mAt
Humanizovana mAt
Humana mAt

Struktura i funkcije antitela

Imunog
globulini (Ig) = gama globulini = antitela
Prirodni, solubilni, visoko specifini produkti humoralnog
imunskog odgovora koji prepoznaju i eliminiu strane antigene
razliitim mehanizmima.
5 klasa Ig: IgM, IgG, IgE, IgA i IgD.
IgG se sastoji od:

2 identina teka lanca (50 kDa) (H-heavy)

2 identina laka lanca (25 kDa) (L-light)

Laki lanac: 1 varijabilni domen (VL) i 1 konstantni domen

(CL)
Teki lanac: 1 varijabilni domen (VH) i 3 konstantna domena
(CH1, CH2 i CH3).

Funkcionalno At sadri: 2 antigen-vezujua fragmenta (Fab)

1 konstantni region (Fc)
Fab-ovi i Fc su spojeni fleksibilnim zglobnim regionom.
VH i VL u Fab-u vezuju antigen.
U okviru svakog varijabilnog domena nalazi se 3
hipervarijabilna regiona koji su odgovorni za prepoznavanje i
vezivanje antigena.
Hipervarijabilni regioni se nazivaju regioni koji odredjuju
komplemntarnost izmedju At i Ag = CDRs (complementary
determining regions).
Dakle, ima 3 CDR u svakom varijabilnom domenu. VANO!

Fc region je vaan i za polu-ivot At u serumu.

Polu-ivot humanog IgG1 je oko 3 nedelje (uloga FcRn)
Polu-ivot nekih fragmenata At je samo par sati! VANO
Kada elimo da smanjimo polu-ivot At, np. kada je ono
konjugovano za radioaktivni element u cilju nekog radioimaging bolje je koristiti delove At umesto cele molekule IgG.

Fab region je vaan za efektorsku funkciju: neutralizaciju

(npr. vezivanjem mAt za citokin stvaraju se imunski kompleksi (Ig +
Ag) koji se uklanjaju u jetri i slezini posredstvom tkivnih
makrofaga)
Fc region je odgovoran za efektorske funkcije At:
1. Aktivacija komplementa i komplementom posredovana
citotoksi
citotoksinost (CDC)
2. Citotoksi
Citotoksinost zavisna od antitela (ADCC) - NK elije
3. Opsonizacija i fagocitoza - Makrofage

Kod 2. i 3. At se svojim Fc regionom vezuju za Fc receptore na NK

elijama i Mf, pri emu dolazi do citolize ili fagocitoze ciljne
elije.
Bilo koji mehanizam (1-3) da se aktivira rezultat je smrt elije za
koju se antitelo vezalo!

Tehnika dobijanja mi
mijih monoklonskih At - hibridoma tehnologija
1975. u Nature objavljen rad o dobijanju
mAt (Cohler i Milstein)
1984. Nobelova nagrada za otkrie
hibridoma tehnologije
1986. OKT3 prvo mije mAt u terapiji
2002. prvo humano mAt odobreno od
FDA
2009. 147 humanih mAt u razliitim
fazama klinikih studija
2010. 34 mAt se nalaze na tritu (45,4
bln dolara prihod od prodaje u 2009.)
2010. 96 kompanija u svetu se bavi
proizvodnjom mAt

Hibridoma tehnika se zasniva na injenici da svaki

aktivisani B limfocit sekretuje Ig specifine za jedan epitop na
antigenu. Meutim, ova antitela koja su produkt jednog klona B
limfocita (monoklonska antitela) nije bilo mogue dobiti,
obzirom da su normalni B limfociti kratkoivee elije. Ovo je
omogueno fuzijom aktivisanih B limfocita sa mijelomskim
elijama ime su dobijene hibridne elije (hibridomi) koje imaju
dva osnovna svojstva:
sposobnost produkcije specifi
specifinog antitela koja poti
potie
od B limfocita i
sposobnost kontinuiranog umno
umnoavanja, koju dobijaju
od maligne mijelomske elije.

Fuzija se vri pomou polietilenglikola (PEG) koji omoguava

spajanje membrana elija koje su u bliskom kontaktu i formiranje
jedne hibridne elije. Poto je fuzija nasumian i relativno redak
dogaaj, to je za uspean postupak neophodan veliki broj
aktivisanih limfocita i mijelomskih elija (najee se koriste mije
mijelomske elijske linije), pri emu najvei broj njih ostaje
nefuzionisan.

Elektrofuzija

Problem uklanjanja nefuzionisanih elija iz kultura je reen

zahvaljujui izboru mutantnih mijelomskih elija sa defektom u enzimu
hipoksantin guanin fosforibozil transferaze (HGPRT) i tkz. HAT
medijuma koji sadr
sadri aminopterin, hipoksantin i timidin.
Aminopterin je blokator sinteze DNK i RNK. elije koje poseduju
HGPRT mogu da koriste zaobilazni put sinteze nukleinskih kiselina u
prisistvu hipoksantina i timidina. Obzirom da mijelomske elije nemaju
HGPRT one ne mogu da preive u HAT medijumu i za nekoliko dana
spontano uginu. Nasuprot njima, hibridomi dobijaju enzim HGPRT od
limfocita i mogu uspeno da preive i razmnoavaju se u kulturi.
Nefuzionisani limfociti su, kako je ve ranije istaknuto, kratkoivee
elije i za nekoliko dana spontano umiru. Prema tome, HAT medijum
selektivno omogu
omoguava pre
preivljavanje samo hibridoma, to
predstavlja klju
kljuni momenat u tehnologiji produkcije
monoklonskih antitela.

Zahvaljujui ovoj tehnologiji mogue je dobiti monoklonska antitela

na bilo koji eljeni antigen. Pri tome antigen moe biti poznat i
jasno okarakterisan ili nepoznat, ali se moe definisati pomou ve
dostupnih monoklonskih antitela, zahvaljujui specifinosti koja je
njihovo osnovno svojstvo. U prvom sluaju za imunizaciju se
najee koriste hapteni (koji se moraju vezati za nosa), manji
peptidi (hormoni, citokini) ili proteini dobijeni genetskim
inenjeringom. U drugom sluaju za imunizaciju se koristi
nepreien antigen ili kada su u pitanju antigeni elija ili tkiva onda
se mogu koristiti cele elije, izolovane membrane elija ili
homogenati elija ili tkiva. Produkovana monoklonska antitela
omoguavaju izolaciju i identifikaciju antigena prema kome su
usmerena.

Procedura:
Za poetak fuzije neophodno je da budu pripremljene mijelomske
elije koje se inae uvaju u tenom azotu i po odmrzavanju se lako
kultiviu. Iz imunizovane ivotinje najee se koristi slezina kao
izvor aktivisanih B limfocita, pri emu nije potrebno da se B
limfociti posebno izdvajaju, ve se vri fuzija ukupnih splenocita i
mijelomskih elija. Kao to je ve reeno, fuzija se vri pomou
PEG-a. Nakon fuzije sve elije se postavljaju u ploe za kulturu sa
96 ili 24 mesta u klasinom medijumu koji sadri HAT. HAT
omoguava selektivno preivljavanje samo uspeno fuzionisanih
hibridoma. Oni hibridomi koji produkuju antitela odabiraju se
pogodnim skrining testovima. Obino je dovoljno da proe 10-14
dana da narasli klonovi hibridoma produkuju dovoljnu koliinu
antitela u supernatantima kultura. Izbor skrining testova zavisi od
prirode antigena. Ako su u pitanju solubilni antigeni najee se
koriste ELISA ili RIA, a za elijske ili tkivne antigene
imunohistohemijske metode.

Nakon fuzije sledi proces kloniranja pozitivnih hibridoma. Ono se

najee izvodi metodom grani
graninog razbla
razblaenja.
enja Cilj ove metode
je da se iz potencijalno heterogene populacije hibridoma, koji su
umnoeni u jednom bazeniu u ploi za kulturu, izdvoje
pojedinani hibridomi. Metodom graninog razblaenja elije
eljenog hibridoma se zasauju dovoljno retko, tako da na kraju u
jednom bazeniu na ploi bude jedna hibridna elija. Njenim
umnoavanjem formira se samo jedan klon. Ponovnim skriningom
jo jednom se proverava njegova sposobnost produkcije antitela.

Umnoene elije hibridoma se smrzavaju i uvaju u tenom

azotu. S druge strane u zavisnosti od potrebne koliine antitela,
hibridomi se mogu gajiti u boicama za elijske kulture u ijim
supernatantima ima oko 10 mg/ml monoklonskog antitela. Vee
koliine antitela se dobijaju ubrizgavanjem hibridoma u
peritonealnu upljinu ivotinje iste vrste iz koje su mijelomske
elije i splenociti, gde rastu u obliku ascitnog tumora. Ascit je
jako bogat specifinim antitelom (10-20 mg/ml).
Preiavanje monoklonskih antitela iz ascita ili supernatanta
kultura hibridoma vri se isoljavanjem pomou amonijum sulfata
(delimino preiavanje) ili afinitetnom hromatografijom na
koloni protein A sefaroze (potpuno preiavanje).
Karakterizacija antigena pomou monoklonskog antitela moe
se vriti brojnim metodama pri emu se najee koristi
imunoprecipitacija ili Western blot tehnika.

10

Monoklonska antitela su nala primenu gotovo u svim oblastima

imunologije i medicine. Monoklonska antitela prema hormonima,
enzimima, citokinima, virusnim, bakterijskim i parazitarnim
antigenima, primenjuju se u dijagnostici brojnih oboljenja.
oboljenja
Zahvaljujui panelu monoklonskih antitela mogue je odrediti broj i
funkciju pojedinih podvrsta limfocita i akcesornih elija imunskog
sistema. Naime, elije imunskog sistema na svojoj povrini ispoljavaju
odreene antigene. Ovi antigeni se otkrivaju pomou monoklonskih
antitela. Posebnu dijagnostiku vrednost predstavljaju monoklonska
antitela usmerena prema diferencijacijskim antigenima limfoidnih i
hematopoetskih elija koja su nezamenljiva u fenotipizaciji leukemija i
limfoma.

Razvoj monoklonskih antitela za terapiju

Sve do sada opisane funkcije At ine ih monim sredstvom za terapijske
svrhe ( magic bullets).
Za terapijske svrhe najvanija osobina mAt je specifino prepoznavanje
antigena.
OKT3 prvo mAt primenjeno u terapiji je bilo produkt mijih hibridoma.
Problemi sa primenom mijih mAt kod ljudi:
1. ponovljena primena mijih mAt dovodi do imunskog odgovora kod
ljudi i razvoja humanih anti-mijih At (HAMA) to spreava dalju
primenu ovih mAt.
2. efektorske funkcije koje zavise od Fc regiona nisu dovoljno efikasne
Reenje: humana mAt

11

12

Dobijanje hibridoma od humanih B elija koje produkuju At eljene

specifinosti nije bilo uspeno!
Mnogi drugi metodi i pristupi su razvijeni da bi se dobila At koja su
vie humana (himerna, humanizovana) ili kompletno humana.

Himerna At
Princip: geni koji kodiraju funkcionalne teke i lake lance eljenog
mijeg mAt mogu da se izoluju iz hibridoma.
Funkcionalni geni koji kodiraju teki i laki lanac humanih Ig mogu da
se izoluju iz humanih B elija. Zamenom varijabilnih regiona u genima
za humane teke i lake lance Ig genima dobijenim iz mia dobijaju se
himerni geni. Kada se oni ubace u eukariotske elije (obino CHOelije jajnika kineskog hrka) dobijamo himerno At koje je 75%
humano.
Antigenska specifinost je ista kao kod roditeljskog mijeg At ali su
polu-ivot i efektorske funkcije kao kod humanih At.

13

Iako je imunogenost himernog mAt smanjena u odnosu na originalno

mije, i himerna At mogu da dovedu do imunskog odgovora stvaranja
HACA (humana anti-himerna antitela).
Brojna himerna mAt se nalaze na tritu i koriste se u terapiji
kancera, reumatoisnog artritisa, infarkta miokarda i spreavanja
odbacivanja transplantata.

14

Humanizovana antitela
Kao to je napomenuto rezidue amino kiselina koje ostvaruju
kontakt sa Ag nalaze se u okviru CDR, tako da je mogue umesto
celih varijabilnih regiona u humanom molekulu At zameniti samo
CDR sa mijim.
Dobijeno humanizovano At je vie od 90 % humano.
Iako ovaj tzv. grafting CDR moe dovesti do smanjivanja afiniteta
At i nije uvek efikasno kod svih misjih mAt ova antitela se nalaze
na trzistu.

Humana antitela
Krajnji cilj u imunoterapiji je da se postigne kompletna
biokompatibilnost to u sluaju At znai da ona budu
kompletno humana.
Postoje dva naina da se to postigne:
1. Tehnika uz pomo faga ili ispoljavanja na fagima (phage
display)
2. Tehnika korienja mia dobijenog genetikim inenjeringom
Humani varijabilni regioni tekog lanca nastaju kombinacijom
V(65), D (27) i J (6) segmenata pri emu moe da nastane
10000 razliitih varijabilnih regiona tekog lanca.
Iako su V regioni tekog i lakog lanca u molekuli At delovi
razliitih polipeptidnih lanaca mogue ih je eksprimirati i kao
deo istog polipeptida i na taj nain kreirati funkcionalni
antigen-vezujui protein.

15

Ta tzv. mini At se nazivaju jednolanani varijabilni fragmenti (single

chain variable fragmants (scFv). V segmenti su povezani (tzv.
linker-om) to im omoguuje da CDR fragmenti budu usmereni ka
Ag kao kod prirodnog At.
VL-linker-VH segment se kai za deo gena koji kodira jedan od
konstitutivnih proteina spoljanjeg omotaa faga (gP3), tako da se
scFv ispoljava na membrani bakteriofaga.
Replikacijom bakteriofaga u bakterijskim elijskim kulturama koje
sadre scFv-gp3 biblioteku, itav spektar moguih scFv proteina
bie ispoljen kao deo spoljanjeg proteinskog omotaa bakteriofaga.

16

Ako je biblioteka kreirana tako da sadri sve mogue kombinacije

varijabilnih regiona tekih i lakih lanaca mogue je dobiti oko 2
miliona razliitih molekula.
Kada takvu biblioteku bakteriofaga testiramo vezivanjem za
imobilisani Ag mogue je selektovati tj. izolovati odgovarajui
scFv-fag iz te biblioteke.
Nakon izolacije scFv visokog afiniteta, VL i Vh regioni mogu se
izolovati i koristiti za rekonstrukciju kompletnog At, slino kao to
je opisano kod nastajanja himernih At.
Nastalo At je HUMANO!

17

Humana antitela iz mi
mia dobijenog geneti
genetikim in
inenjeringom
Jedan od elegantnijih nacina da se proizvedu kompletna humana At je upotreba
mia dobijenog genetikim inenjeringom.
Prvo se napravi mi kome se uklone geni koji kodiraju teke i lake lance At (knock
out mievi) tako da oni ne mogu da proizvode At i nemaju zrele B celije.
Zatim se u te mieve ubace DNK segmenti koji sadre veliki deo gena za humane
teke i lake lance, koji su u miu potpuno funkcionalni.

Ovako dobijeni mievi koji produkuju humana At (HuMab naziv od strane jedne
kompanije koja ih proizvodi) mogu se imunizovati antigenima i dobiti visoko
afinitetna At hibridoma tehnologijom kao to je ve ranije opisano.

18

Nacionalni registar za lekove 2010 godine

monoklonska antitela
ACTEMRA (tocilizumab
(tocilizumab)) inhibitor receptora za IL-6 (reumatoidni artritis RA)
AVASTIN (bevacizumab)
bevacizumab) blokira protein koji se zove faktor rasta vaskularnog
endotela (VEGF) (karcinom kolona i rektuma, karcinom dojke)
ERBITUX (cetuksimab
(cetuksimab)) inhibira receptor za epidermalni faktor rasta
(kolorektalni carcinom, karcinom skvamoznih elija vrata i glave)
HERCEPTIN (trastuzumab
(trastuzumab)) inhibira receptor za humani epidermalni faktor
rasta 2 (HER2+) (karcinom dojke)
HUMIRA (adalimumab
(adalimumab)) blokira TNF (faktor koji dovodi do nekroze tumora)
(RA, Kronova bolest)
MABCAMPATH (alemtuzumab
(alemtuzumab)) vezuje se za CD52 (hronina limfoidna
leukemija)

19

MABTHERA (rituksimab
(rituksimab)) vezuje se za CD20 na B limfocitima i uklanja ih (neHokin limfom, RA)

REMICADE (infliksimab
(infliksimab)) blokira TNF (faktor koji dovodi do nekroze tumora)
(RA, Kronova bolest)
SIMULECT (baziliksimab
(baziliksimab)) vezuje se za alfa lanac receptora za IL-2 (CD25) na
aktivisanim T limfocitima (nakon transplantacije bubrega)
STELARA (ustekinumab
(ustekinumab)) blokiraju IL-12 i IL-23 (psorijaza)
SYNAGIS (palivizumab
(palivizumab)) specifini Ig protiv respiratornog sincicijskog virusa
(RSV) u prevenciji infekcija RSV
XOLAIR (omalizumab
(omalizumab)) vezuje se za humane IgE (teke alergijske astme)
ZENAPAX (daklizumab
(daklizumab)) - vezuje se za alfa lanac receptora za IL-2 (CD25) na
aktivisanim T limfocitima (profilaksa akutnog odbacivanja organa kod bolesnika sa
transplantiranim bubregom)

20

Derivati antitela
At imaju dva funkcionalno odvojena dela: Fab i Fc.
Prisustvo oba dela nije neophodno za sve terapijske primene At.
Npr. Za neutralizaciju hormona, citokina ili toksina dovoljan je samo Fab fragment

21

Druge efektorske funkcije

Nekada molekuli At mogu da se koriste kao nosai razlicitih

supstanci do mesta u organizmu gde se specifian antigen nalazi.
Primeri; toksini, radioizotopi, citokini, lekovi
Toksini vezani za At se koriste da ubiju
tumorske elije koje na svoj povrini
ispoljavaju specifine Ag.
Nakon vezivanja za eliju kompleks Attoksin ulazi u eliju odvaja se od At i vri
svoju funkciju.
Najee se koriste Ricin-A i
calichaemicin.

22

Radioizotopi u zavisnosti od prirode i doze mogu da se koriste i u

dijagnostici i u terapiji tumora (niske doze gama emitera ili visoke
doze alfa i beta emitera).
Najee se koriste za detekciju tumorkih masa i mikrometastaza
koje je teko otkriti drugim dijagnostikim metodama.
Koriste se manji derivati At jer bolje penetriraju u tkiva i bre se
uklanjaju iz organizma.
Bispecifi
Bispecifina antitela
Dva razliita Fab fragmenta
spojena u jedno At!
Ideja je bila da se elije imunskog
sistema dovedu u blizak kontakt
(npr. CTL i tumorska elija).

ta dalje?
Sva antitela koja su trenutno na tritu se dobijaju iz elijskih
kultura sisara.
Klasina mija mAt dobijaju se direktno iz originalnog hibridoma
Himerna, humanizovana i dobijena pomou faga nastaju iz
rekombinantnih gena koji moraju da se ubace u elije sisara da bi
bilo mogue odgovarajue uvrtanje i glikozilacija.
Humana At iz mieva dobijenih genetikih inenjeringom takodje
se mogu dobiti direktno iz hibridoma.
Dobijanje je skupo to poveava i cenu leenja.
Reenje bi moda bilo u razvoju veih transgenih ivotinja kao to
su na primer koze ili krave jer bi tada antitela mogla u veoj
koliini da se izoluju iz mleka!
Agonisti
Agonistika antitela

23