12/1/2022

Fluorescentni imunotestovi

Imunohistohemijske tehnike

Fluorescentni imunotestovi
obeleživači- fluorohromi

Fluorohromi- jedinjenja koja mogu da absorbuju svetlost određene talasne dužine

(ekscitacija) i konvertuju ovu energiju u svetlosat veće talasne dužine (emisija)

- najčešće korišćeni: fluorescein izotiocijanat (FITC) i fikoeritrin (PE), peridin hlorofil

protein (PerCP)

- detekcija fluorescence: fluorescentni mikroskop ili protočni citofluorimetar

1
 12/1/2022

Primena fluorescentnih tehnika:

- klinička imunologija (identifikacija i određivanje broja T i B limfocita, fenotipizacija

ćelija leukemija i limfoma, dokazivanje imunskih kompleksa u tkivima, dokazivanje
autoantitela u tkivima itd.)

- identifikacija mikroorganizama u tkivu ili direktnom kliničkom materijalu;

dokazivanje antitela na neke bakterije u infektivnim bolestima

Fenotipizacija (identifikacija) i brojanje limfocita

Identifikacija i brojanje T limfocita

- najčešće se koristi metoda imunofluorescencije (direktna ili indirektna tehnika) u kojoj se
primenjuju monoklonska antitela na CD3 antigen (ukupni T limfociti), CD4 antigen (Th) i CD8
antigen (CTL).
Identifikaciju i brojanje B limfocita
- detekcija membranskih imunoglobulina metodom direktne imunofluorescencije pomoću
anti-Ig antitela obeleženih fluorohromima.
- detekcija CD19 i CD20 molekula primenom tehnike direktne ili indirektne imunofluorescencije

Karakteristični površinski antigeni nekih imuskih ćelija (T, B i NK)

na osnovu kojih se radi imunofenotipizacija

CD2, CD3 – pan T ćelijski markeri

CD4 -Th (subpopulacija T limfocita)

CD8 - CTL (subpopulacija T limfocita)

CD19, CD20, površinski Ig - B ćelije

CD16, CD56 - NK ćelije

2
 12/1/2022

Protočna citofluorimetrija (engl. flow cytometry) i fluorescencom aktiviran

ćelijski sorter (engl. fluorescence activated cell sorter, FACS)

Protočni citofluorimetar- detektuje fluorescencu na ili u pojedinačnim ćelija u suspenziji;

- za određivanje broja ćelija i fenotipizaciju (dokazivanje prisustva
određenih antigena na površini ćelija ili u ćelijama-intracelularno bojenje)

Fluorescencom aktivirani ćelijski sorter (FACS)

- adaptirani protočni citofluorimetar; za izdvajanje ćelijskih populacija

tačkasti dijagram
5% 48.3%
CD8 PE CD4 FITC
CD8 PE

15.9% 30.8%

CD4 FITC

3
 12/1/2022

fotomultiplikatorska cev

mlaz ćelija
zeleni filter

narandžasti filter

ćelija obeležena
fluorescentnom probom

side scatter

laser forward scatter

kompjuterski
Šematski prikaz protočnog citofluorimetra sistem

https://www.youtube.com/watch?v=EQXPJ7eeesQ

https://www.youtube.com/watch?v=B2zreF2dnWk Intracelularno bojenje

FACS

4
 12/1/2022

IMUNOHISTOHEMIJSKE TEHNIKE

-za detekciju prisustva Ag na površini ćelije ili unutar ćelije, u tkivu ili na površini
mikroorganizama

Imunohistohemija - primena obeleženih At na tkivne preseke

Imunocitohemija - primena obeleženih At na razmaze ćelija, citospin preparate i kulture
od jednog sloja ćelija

Imunohistohemijske tehnike
- imunoenzimske direktne
- imunofluorescentne indirektne

enzim supstrat ___________ boja____________

alkalna fosfataza Fast Red / crvena
Fast Blue BB plava
peroksidaza H2O2 + diaminobenzidin (DAB) braon

Osnovna osobina enzima u imunohistohemiji je da u reakciji sa supstratom daju nerastvorljiv,

obojeni produkt koji se može videti pod svetlosnim mikroskopom

Imunoenzimsko bojenje

Enzimi u reakciji sa odgovarajućim supstratom daju:

- obojeni produkt, nerastvorljiv u vodi
- lako se može videti pod svetlosnim mikroskopom.

Najčešće korišćeni enzimi:

- peroksidaza (supstrat: smeša H2O2 i diaminobenzidina, DAB). DAB polimerizuje
nakon oksidacije sa H2O2 i nastaje proizvod braon boje koji se jasno uočljiva u kontrastu sa
plavom bojom jedra nakon bojenja hematoksilinom. Ponekad je pre početka bojenja neophodno
inhibirati endogenu peroksidazu kojom su neka tkiva bogata (preinkubacijom u metanolu sa
H2O2).

- alkalna fosfataza (supstrat: Fast Red so, Fast Blue BB so). Endogena alkalna
fosfataza se inaktivira uobičajenim metodama fiksacije preparata tj tkiva.

Prednost imunoenzimskih tehnika nad imunofluorescentnim:

- duža stabilnosti obojenih preparata

- korišćenje svetlosnog mikroskopa,
- pored bojenja vidi se i morfologija ćelija na grubom ćelijskom nivou.

5
 12/1/2022

Tehnike imunohistohemijskog bojenja :

direktna indirektna

primarno antitelo (specifično za antigen) primarno antitelo

obeleženo fluorohromom/enzimom (specifično za antigen)

sekundarno antitelo (anti-Ig antitelo)

obeleženo fluorohromom/enzimom

Imunofluorescentno bojenje- ANA

Antinukleusna antitela- ANA

(homogeni tip fluorescence)

Antinukleusna antitela- ANA ANA

(mrljasti tip fluorescence) (homogeno nukleolarni tip fluorescence)

6
 12/1/2022

Critidia luciliae- protozoa (poseduje kinetoplast koji sadrži

dsDNA)
detekcija anti-dsDNA IIF (indirektna imunofluorescenca)
indikacija: Lupus erythematodes

detekcija antitela na antigene štitne žlezde IIF

indikacije: Bazedovljeva bolest, Hashimoto thyreoiditis
(anti-TPO At daju granularno bojenje citoplazme epitelnih
ćelija folikula
anti-Tg At daju retilkularni tip fluorescene koloida folikula
TPO- tireoidna peroksidaza; Tg- tireoglobulin

IIF za detekciju antitela na Helicobacter pylori

IIF za detekciju antitela na Borellia burgdorferi

7
 12/1/2022

Višestruko (višebojno) imunofluorescentno bojenje

- za detekciju više različitih Ag u istom preparatu ćelija ili tkiva

primarna antitela
vezana za različite fluorohrome

Metod imunoalkalne fosfataze

citospin preparat dendritskih ćelija

Bojenje CD68+ ćelija
anti-MHC II antitelo
(CD68 marker Mf)

8
 12/1/2022

Metod imunoperoksidaze

histološki preparat
Pajerovih ploča
anti-CD8 mAt (OX-8)

Primer imunoperoksidaznog bojenja preseka appendix-a (crvuljak, slepo crevo)

kod sumnje na karcinoid (neuroendokrini tumor)

Hematoksilin-eozin bojenje (hematoksilin boji jedra plavo,

a eozin citoplazmu i ektracelularni matriks ružičasto)

appendix,
zdravo tkivo 4x

x200 x400
Bojenje na sinaptofizin
(panendokrini marker) Bojenje na hromogranin A (panendokrini marker)

x200 x400 x400