Antitelo – struktura

Antitelo

 At specifično vezuje Ag

- i u fazi prepoznavanja
- i u efektornoj fazi humoralnog imuniteta

 Distribucija antitela

- u biološkim tečnostima: plazmi/serumu,

sekretima (mukus, mleko)
intersticijskoj tečnosti u tkivima

- u B limfocitima: u citoplazmatskim organelama (ER i Goldži kompleks)

na membrani

- vezuju se za površinu nekih ćelija (fagociti, NK i mast ćelije; imaju FcR)

 Izdvajanje (prečišćavanje) antitela

Krv (plazma) koagulacija

serum (antiserum; pojam titra)

Proteini plazme (seruma):

-albumini
-globulini

Elektroforezom: III frakcija globulina – gamaglobulini

Imunoglobulini =Antitela

Izdvajanje Ig iz bioloških tečnosti:

1. Precipitacija amonijum sulfatom
2. Hromatografske tehnike
 Struktura antitela
dva međusobno identična
kraća polipeptidna lanca
(laki lanci, eng. light, L,
oko 24 kDa)
i
dva međusobno identična
duža polipeptidna lanca
(teški lanci, eng. heavy, H,
od 55 do 70 Kda)

Lanci su aranžirani u obliku slova Y

Lanci su povezani disulfidnim vezama
 Domeni
 Rane studije su pokazale određenu
pravilnost u strukturi svih Ig
 I L i H lanci :
Svakih 100-110 AK ima 60AK
uvijenih u globularnu strukturu
(petlju) (S-S veze) DOMEN
Domeni nastaju
mnogostrukim savijanjem
lanca, ne u strukturu a-
heliksa, već tako da se od
niza antiparalelno
postavljenih lanaca stvaraju
dve površine (b-list ),
međusobno povezane
disulfidnim mostom
 Domeni
Varijabilnost u sekvenci je
ograničena na prvi domen L i H lanca

Varijabilni (V) domeni L i H lanca (VL,VH)

VL i VH formiraju antigen-vezujuće mesto

(paratop)

Ostali domeni su relativno konstantni

Konstantni (C) domeni L i H lanca (CL i CH)

CH domeni su odgovorni za ostvarivanje

efektorskih (bioloških) funkcija At

H lanci: 1 V domen i 3 do 4 C domena

L lanci: 1 V domen i 1 C domen
Varijabilni i hipervarijabilni regioni Ig
 Amino terminalna AK sekvenca (V domen, V
region) varira od jednog do drugog L i H lanca Ig
 Varijabilnost u AK sekvenci je koncentrisana u
određenim segmentima hipervarijabilni
regioni (HV regioni)
 Kabat i Wu su razvili plot varijabilnost da bi
merili distribuciju varijabilnih AK
 Nađena 3 HV regiona, dužine oko 10AK, i u L i u
H lancu
 Varijabilni i hipervarijabilni regioni Ig

 HV regioni = CDR (engl.complementarity determining

regions)

HV regioni su AK regioni koji ostvaruju kontakt sa

epitopom i u prostoru formiraju površinu koja je
komplementarna trodimenzionalnoj strukturi antigena

 Regioni između HV regiona koji čine ostatak V domena

pokazuju manju varijabilnost (eng. framework, okvirne
sekvence; postoje 4 u svakom V domenu)
 Definicija varijabilnosti

 Odnos broja različitih AK na datoj poziciji u

odnosu na učestalost najčešće AK na toj
poziciji se definiše kao VARIJABILNOST
 Primer: sekvencirano je 63 L lanaca i četiri
različite AK su nađene na poziciji 7.
Serin se pojavio 41 put, tj. učestalost
41/63=0.65. Otuda, 4/0.65=6.15 varijabilnost
Plot varijabilnosti
Plot varijabilnosti CDR Petlje
 Vezivanje antitela za antigen (globularni protein)

•Sa globularnim proteinom, kontakt se ostvaruje duž velike ravne

površine; Višestruki kontakti sa Ag-om. Najjači kontakt je sa CDR3
•Prilikom vezivanja nekih antigena, jedan ili više CDR mogu biti
van regiona kontakta sa antigenom
•Neke AK okvirnog regiona takođe mogu formirati kontakt sa Ag
Antigeni variraju u veličini i kompleksnosti

Protein: Hapten:
Influenza haemagglutinin 5-(para-nitrofenil fosonat)-
pentanoična kiselina
Antitela reaguju sa
antigenima na različite
načine

Hapten se umeće
u džep antitela

Antigen
interreaguje sa
izduženom
površinom
antitela
 Konstantni (C) regioni Ig
 C regioni L i H lanca sastavljeni su od C domena

 Na osnovu razlika u strukturi C regiona H lanaca antitela

se mogu podeliti u različite klase (izotipove) i subklase

 Sličnosti u AK sekvenci, ali svaka klasa ima

jedinstvenu strukturu H lanca

 Postoji pet klasa: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM

 Kod čoveka:IgG ima 4 subklase (IgG1 do IgG4),

IgA ima 2 subklase (IgA1, IgA2)
kod miševa: IgG izotip je podeljen u IgG1, IgG2a, IgG2b i IgG3
 Klase humanih antitela

Klasa Ig Subklase Koncentracija Poluživot Sekretorna

u serumu u serumu forma
(mg/ml) (dani)
IgG IgG 1-4 13.5 23 monomer

IgM Nema 1.5 5 pentamer

IgA IgA1, 2 3.5 6 monomer,

dimer,
trimer
IgE Nema 0.05 2 monomer

IgD Nema U tragovima 3 Nema

 IgG subklase

 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4

 Imaju oko 90% homologije u AK sekvenci
 Razlikuju se u broju i rasporedu
interlančanih disulfidnih veza
 Ovo dovodi do razlika u funkcionalnim
osobinama subklasa
IgG subklase 2
 Teški lanci Ig

 Teški lanci se obeležavaju grčkim slovima koja odgovaraju imenu

klase: g, a, m, e, d (za IgG, IgA, IgM, IgE, IgD)

 H lanci IgM i IgE klase imaju 4 C domena

H lanci IgG, IgA i IgD klase imaju 3 C domena

 Ovi domeni su označeni kao CH domeni

Numerišu se počev od N- do C- terminalnog kraja lanca (npr. CH1, CH2 i td.)
U svakom izotipu, ovi regioni se mogu označiti još specifičnije (npr. Cg1, Cg2 i
Cg3 u IgG).

 Različite klase ili subklase antitela ostvaruju različite

efektorne funkcije.
 Laki lanci Ig
 Postoje dva tipa lakih lanaca, označenih kao k i l
 Razlikuju se po AK sekvenci konstantnih (C) domena

 Molekul antitela ima ili dva k lanca ili dva l lanca, ali
nikada po jedan od svakog

 Odnos kapa / lambda lanci

kod ljudi: 2:1
kod miševa: 20:1
 Zglobni region Ig
 g, d i a lanci imaju AK sekvencu (60
do 100 AK) između CH1 i CH2
domena koja nije homologna sa
ostalim domenima
 Obezbeđuje fleksibilnost IgG, IgD i
IgA molekula
 Bogat u cisteinu i prolinu
 Ostaci cisteina formiraju interlančane
disulfidne veze koje drže dva H lanca
zajedno

 Ig M i IgE nemaju zglobni region

 Struktura antitela
 Porter i Nisonoff su koristili enzime da
razgrade Ig; proučavali funkciju izolovanih
fragmenata
 Edelman je tretirao Ig redukujućim
agensima koji razgrađuju S-S veze;
proučavao rezultujuće polipeptidne lance
Fragmentacija Ig

Fab fragment vezuje antigen

Fc fragment kristališe
 Antigenske determinante (epitopi) Ig
• Izotipske determinante (grč. isos=jednak, isti)
su epitopi prisutni u C regionima lakih i teških lanaca.

*Na osnovu izotipske specifičnosti razlikuje se pet klasa humanih

imunoglobulina, potklase, klase lakih lanaca i imunoglobulini različitih
životinjskih vrsta.

• Alotipske determinante (grč. allos=drugačiji, drugi)

su epitopi (alotopi) u konstantnim (C) regionima lakih i teških
lanaca

*Na osnovu alotipske specifičnosti razlikuju se imunoglobulini jedinki u

okviru iste vrste, te su alotipovi genetski markeri jedinki.

• Idiotipske determinante (grč. idios=svoj, vlastiti)

su epitopi (idiotopi) smešteni u hipervarijabilnim regionima.

*Idiotipska specifičnost razlikuje molekule imunoglobulina u okviru istog

izotipa i istog alotipa, a na osnovu specifičnosti za odgovarajući antigen.
 Izotipske determinante Ig
 Determinante u konstantnim regionima koje definišu svaku
klasu i subklasu teškog lanca i svaki tip lakog lanca unutar
vrste

 Svaki izotip je kodiran odvojenim genima za C region, i svi

članovi vrste nose istu kolekciju gena za C regione. Unutar
vrste, svaka normalna individua će imati sve izotipe u serumu

 Različite vrste nasleđuju različite gene za C region i zbog

toga ispoljavaju tj imaju različite izotipove.

Zbog toga, kada se antitela

iz jedne vrste ubrizgaju u
drugu vrstu, izotipske
determinante će biti
prepoznate kao strane
ANTI-IZOTIPSKA antitela
 Alotipske determinante Ig
 Mada svi članovi jedne vrste nasleđuju isti set
izotipskih gena, za neke gene postoje različiti aleli

 Ovi aleli kodiraju fine razlike u AK sastavu,

nazvane alotipske determinante, koje postoje u
nekim, ali ne u svim članovima vrste

 Alotip antitela: zbir svih individualnih alotipskih

determinanti na jednom antitelu
 Alotipovi Ig
 Kod čoveka alotipovi su okarakterisani za:

sve četiri IgG subklase (Gm markeri, preko 25 različitih alotipa)

jednu IgA subklasu (za IgA2 ; Am markeri, 2 različita alotipa)
k lanac (Km, 3 različita alotipa)

 Koriste ih forenzičari

 Alotipovi pružaju biološku prednost na neke infektivne agense tj.

imaju efekat u infekciji

Npr. Km (1) alotip je efikasniji od drugih Km alotipova kapa

lanaca u odbrani od H. influenze tipa B
 Idiotipske determinante Ig
 Su epitopi (idiotopi) u hiperV regionu Ig
 Obezbeđuju prirodni mehanizam za
regulisanje nivoa At
 Anti-idiotipska antitela se rutinski nalaze i
smanjuju produkciju At
 Sekretorna i membranska forma Ig
 Razlikuju se u AK sekvenci karboksi-terminalnog kraja
C regiona H lanaca.

 Sekretorna forma
Ima hidrofilne AK u karboksi-terminalnom kraju (“rep”)
Dužina repa se razlikuje među različitim klasama
(m lanac - 21 AK, g3 - 3 AK)

 Membranska forma
Transmembranski region od hidrofobnih AK i
citoplazmatski domen koji se značajno razlikuje između
različitih izotipova
 Citoplazmatski deo samo od 3 AK

- ima 21 AK

Citoplazmatski deo je od 28 AK

- ima 3 AK

*Kod membranskih IgM (slika) i IgD molekula, citoplazmatski deo H lanca je

kratak, samo 3AK;
* Kod membranskih IgG (slika) i IgE molekula nešto je duži, do 30 AK
 Monomerni i polimerni Ig

 IgG, IgE, IgD, i svi membranski Ig su monomerni.

 IgM i IgA mogu formirati polimere
Ovi polimeri se formiraju interakcijom između repnih delova.
m lanac ima dugi “rep” (21 AK) koji je uključen u formiranje
pentamera.

 Polimerni IgM i IgA molekuli takođe sadrže dodatni polipeptidni

lanac (137 AK, 15 kDa) označen kao J lanac (eng. joining chain)
 J lanac je disulfidno vezan za “repove” i stabilizuje multimerni
kompleks.
Monomerni i polimerni Ig
 Sinteza Ig

 Laki i teški lanci Ig se sintetišu u ER

 Savijanje i asocijacija lanaca je kontrolisana proteinima iz ER koji se

nazivaju čaperoni (kalneksin i BiP, eng. vezujući protein).

 Kovalentno vezivanje pomoću disulfidnih veza i glikozilacija takođe

se odvijaju u ER.

 Posle formiranja, molekuli Ig se oslobađaju čaperona i usmeravaju u

Goldži kompleks, gde se mogu modifikovati ugljeni hidrati.

 Zatim se antitela usmeravaju ka plazma membrani, gde se vezuju za

membranu ili bivaju sekretovana procesom egzocitoze.
 Funkcije antitela

 Vezivanje antigena (posredovano Fab fragmentom)

 Efektorne funkcije (posredovane Fc fragmentom)

 Vezivanje antitela za antigen:
nekovalentne veze
Elektrostatičke sile privlačenje između suprotnih naelektrisanja
Vodonične veze H između elektronegativnih atoma
Van der Waal’s veze Fluktuacije u elektronskim oblacima oko molekula
suprotno polarizuju susedne atome
Hidrofobne veze Hidrofobne grupe se približavaju i isključuju
vodu (uključuju Van der Waal’s veze)
• Afinitet: Jačina veze između jednog antigen-vezujućeg
mesta antitela i epitopa antigena

Afinitet se uobičajeno predstavlja konstantnom

disocijacije (Kd), koja ukazuje na koncentraciju
antigena koja je neophodna da bi antigen-vezujuća
mesta polovine svih molekula antitela prisutnih u
rastvoru bila zauzeta.

Mala Kd ukazuje na visoko-afinitetne interakcije

• Avidnost: Ukupna jačina vezivanja između

viševalentnog antitela i multivalentnog antigena
 Strukturne karakteristike antitela
vezane za prepoznavanje antigena
• Specifičnost
Nekada antitela produkovana protiv jednog antigena
mogu da se vežu za drugi antigen koji je strukturno
(hemijski) srodan prvom antigenu (unakrsna reakcija).

• Raznolikost
Svaka individua pravi neverovatno veliki broj strukturno
različitih antitela, možda i do 109, pri čemu svako
antitelo ima različitu specifičnost.
• Afinitet i avidnost
*Sazrevanje afiniteta
 Zašto antitelima treba Fc region?

F(ab)2 fragment može

• Detektovati Ag
• Precipitirati Ag
• Neutralisati Ag tj. blokirati aktivna mesta toksina ili molekula
vezanih za patogen
• Blokirati interakciju između domaćina i molekula vezanih za
patogen

ali ne može aktivirati

• Inflamatorne i efektorske funkcije vezane za ćelije
• Inflamatorne i efektorske funkcije komplementa
 ANTIGENI

• Antigen; bilo koja supstanca koja se može vezati za

specifično At ili TĆR

• Imunogen; makromolekuli koji izazivaju imuni odgovor

• Hapten; obično jedinjenja male MM; nemaju

sposobnost da izazovu imuni odgovor, ali se vezuju za
At ili T limfocite. Vezivanjem za nosač postaju
imunogena

Imunogenost; antigenost
 Uslovi imunogenosti

• Stranost
• Relativna molekulska masa
• Hemijska složenost (homopolimeri, kopolimeri, prisustvo aromatičnih
AK)
• Osetljivost na preradu i prezentaciju (polimeri D-AK su slabi
imunogeni jer se ne prerađuju u APĆ)
• Oblik unošenja
• Put unošenja antigena i doza
• Genetski faktori (Ir geni=MHC geni); npr.polisaharid izolovan iz
kapsule pneumokoka imunogen je za čoveka i miša, a nije imunogen
za kunića
 Prirodni i veštački antigeni
A. Prirodni antigeni

-Proteini; najbolji imunogeni, bez obzira da li su sami ili su u

kompleksu sa drugim jedinjenjima (lipoproteini , glikoproteini)

- Polisaharidi; mogu biti imunogeni; mogu biti u kompleksu sa

proteinima i lipidima

- Lipidi i nukleinske kiseline generalno nisu imunogeni, ukoliko

nisu u kompleksu sa proteinima ili polisaharidima

za stimulaciju B ćelijskog imunog odgovora lipidi se koriste kao

hapteni; tako su dobijena antitela za prednizon, leukotriene, HCG,
vitamin E itd;
Za ćelijski-posredovan imunitet, imunogeni su proteini i neki lipidi
i glikolipidi (npr. neki T limfociti (npr. gd+T Ly i NK-T Ly)
prepoznaju lipide u sklopu CD1 (nepolimorfan, sličan klasi I
MHC, ali nije kodiran MHC genima)
Ćelijski antigeni (antigeni membrane, citozola,
organela i jedra) i tkivni antigeni

Najčešće kompleksi proteina, ugljenih hidrata i

lipida. Najviše su proučavani antigeni eritrocita,
limfocita i bakterija.
B. Veštački antigeni

• Sintetski antigeni
- u celini proizvedeni u laboratoriji
- homopolimeri i kopolimeri; sintetski polipeptidi su uglavnom
polimeri lizina, glutaminske kiseline, tirozina i alanina

*postoji mogućnost da se sintetišu najimunogeniji antigeni

mikroorganizama ili njihovi epitopi i da se koriste kao vakcine

• Konjugovani antigeni (hapten+nosač)

- sastav haptena mora biti poznat
- kao nosač najčešće se koristi protein ili ćelija
- Vezivanje za nosač može biti in vitro i in vivo (vezivanje lekova za
proteine u organizmu može dovesti do alergijskih reakcija)
 ANTIGENSKE DETERMINANTE (EPITOPI)

• Antigenske determinante su delovi makromolekularnih

antigena za koje se vezuju antitela

• U slučaju proteinskih antigena koje prepoznaju T limfociti,

epitopi su peptidni fragmenti vezani za MHC molekule

• Polivalentni (multivalentni) antigeni

- imaju identične epitope koji se ponavljaju
- uglavnom ugljeni hidrati i nukleinske kiseline, i površine
ćelija
- globularni proteini nisu multivalentni, ukoliko nisu u
agregatima
 B ćelijski epitopi
• At se vezuje za epitop slabim NEKOVALENTNIM
interakcijama, koje funkcionišu na maloj udaljenosti. Za jaku
vezu, Ag-vezujuće mesto i epitop moraju imati
komplementarne oblike koji omogućavaju da grupe koje
reaguju budu blizu jedna drugoj

• Mali ligandi (kao što su mali oligonukleotidi, peptidi i

hapteni) se smeštaju džep Ag-vezujućeg mesta

• Globularni proteini reaguju sa antigenom na drugačiji način:

At ostvaruju kontakt sa ovakvim antigenima duž velike ravne
površine
B ćelijski epitopi

- Na nativnom proteinu generalno se sastoje od

hidrofilnih AK na površini proteina koje su topografski
pristupačne membranski vezanim ili slobodnim At

- AK sekvence koje su sakrivene u unutrašnjosti

proteina često se sastoje od pretežno hidrofobnih AK,
i mogu funkcionisati kao B ćelijski epitopi tek kada se
protein denaturiše
B ćelijski epitopi

• Nepreklapajuće determinante - prostorno

su odvojene, pa se dva ili više molekula At
može vezati za jedan antigen

• Preklapajuće determinante - blizu jedna

drugoj, pa vezivanje At za jednu
determinantu može sterički ometati
vezivanje At za drugu determinantu
B ćelijski epitopi
mogu sadržavati sekvencijalne ili nesekvencijalne AK

• Linearne (sekvencijalne, kontinualne) determinante -

epitopi formirani od susednih AK rezidua; približno 6 AK

• Konformacione (nesekvencijalne) determinante -

formiraju se od AK rezidua koje su udaljene u primarnoj
AK sekvenci, ali su prostorno približene uvijanjem
molekula proteina

Sekvencijalne i nesekvencijalne determinante generalno

se ponašaju drugačije kada je protein denaturisan (ili
redukovan) !

• Neoantigenske determinante - epitopi koji nastaju

promenom kovalentne strukture proteina (npr. putem
fosforilacije ili proteolize)
 T ćelijski epitopi
- 1959.god:
1o imunizacija sa nativnim proteinom: samo nativni protein, a ne
denaturisani, može izazvati 2o h.i.o.
Suprotno, i nativni i denaturisani protein mogu izazvati 2o ćelijski i.o.
1980. god.:
postalo je jasno da T Ly ne prepoznaju nativni protein, već protein prerađen
do peptida

• Većina T limfocita prepoznaje samo peptide vezane za APĆ u sklopu

MHC molekula što znači da T ćelijski imuni odgovor izazivaju samo
proteinski antigeni (jer se jedino peptidi vezuju za MHC)

• Epitopi koje prepoznaju T Ly su često “unutrašnji” tj. nalaze se

“unutar” proteinskog molekula

• T limfociti su specifični za AK sekvencu peptida tj. prepoznaju samo

linearne determinante (a ne konformacione, jer se za žleb MHC
molekula mogu vezati samo peptidi u linearnoj konformaciji, a takvi
peptidi ne mogu formirati konformacione determinante)
 Timus (T) - zavisni antigeni

 Proteini

 Prepoznaju ih i T i B limfociti

 T i B limfociti prepoznaju različite

epitope proteinskog antigena
 Timus (T)-nezavisni antigeni

 Neproteinski antigeni: polisaharidi, lipidi i nukleinske

kiseline

 Aktiviraju B limfocite i stimulišu produkciju At u odsustvu

T limfocita

 Ne mogu da se prerađuju i prezentuju u sklopu MHC

molekula

 Većina T-nezavisnih antigena su polivalentni

mogu izazvati maksimalno povezivanje tj. grupisanje IgR na
B Ly, što dovodi do aktivacije B Ly u odsustvu T Ly;

Pored toga mnogi polisaharidi aktiviraju komplement

alternativnim putem (stvara se C3d koji se vezuje za Ag i
obezbeđuje drugi signal za aktivaciju B limfocita)
Humoralni imunski odgovor na
proteinske (T-zavisne) i
neproteinske (T-nezavisne)
antigene se razlikuje !
 Praktični značaj T- nezavisnih antigena:

 Mnogi polisaharidi ćelijskog zida bakterija pripadaju ovoj

grupi antigena, pa je humoralni imunitet glavni mehanizam
odbrane protiv infekcija izazvanih ovim bakterijama.

 Zbog toga, osobe sa urođenim ili stečenim deficijencijama

humoralnog imuniteta su posebno osetljive na infekcije
izazvane pneumokokom, meningokokom i Haemophilus-om

 Prirodna antitela u cirkulaciji zdravih osoba su antitela na T-

nezavisne antigene (polisaharide). Ova antitela su
niskoafinitetna (primer: antitela na A i B glikolipidne
antigene krvnih grupa).
IMUNOGENOST PROTEINSKIH ANTIGENA

Ako se na primer neka osoba imunizuje multideterminantnim proteinskim

antigenom, obično su T limfociti koji odgovaraju na takav antigen
specifični za jednu ili nekoliko linearnih AK sekvenci. Ovi epitopi se
nazivaju IMUNODOMINANTNI epitopi ili determinante.

Imunogenost proteinskih antigena određena je MHC molekulima:

1. Imunodominantni epitopi su najverovatnije oni koji se

najbolje vezuju (sa najvećim afinitetom) za MHC molekule.

2. Ekspresija određenih alela II klase MHC u nekoj osobi

određuje sposobnost te osobe da odgovori na pojedine
antigene. Kao što je poznato, ovo je uslovljeno time što se
različiti aleli II klase razlikuju u svojoj sposobnosti da vežu
različite antigenske peptide i zbog toga stimulišu specifične Th
ćelije.