Module 7: Antimicrobial Susceptibility

Testing (AST) – Kháng đồ

Page  1

1
Mục tiêu học (1)

Kết thúc bài, học viên có thể :

 Mô tả kỹ thuật KSĐ (AST)
 Mô tả các bước làm KSĐ khoanh khuếch tán từ chọn môi
trường, chuẩn bị huyền dịch, cấy thạch, đặt khoanh, ủ
đĩa
 Mô tả sử dụng độ đục 0.5 McFarland phù hợp
 Danh sách VK không làm được KSĐ
 Mô tả quy trình chọn KL cho KSĐ

Page  2
Mục tiêu học tập (2)

 Chọn khoanh KS phù hợp theo CLSI (theo VK và bệnh

phẩm)
 Phiên giải, báo cáo kết quả
 Mô tả phương pháp sàng lọc sẵn có khi làm KSĐ
Staphylococcus aureus
 Mô tả phương pháp QC cần thiết của KSĐ khoanh
khuếch tán theo CLSI
 Danh sách các mục của CLSI M100 S20
 Mô tả sử dụng các bảng tra cứu của CLSI M100 S20

Page  3
Các nội dung bài

 Các phương pháp KSĐ

 Quy trình KSĐ khoanh khuếch tán
 Đọc và diễn giải kết quả KSĐ trên đĩa
 Các test sàng lọc cho Staphylococcus
 CLSI Guidelines - Document M100-S20

Page  4
Các phương pháp KSĐ

 Pha loãng thạch

 Pha loãng canh thang

Đây là các phương pháp định lượng - minimal

inhibitory concentration (MIC)
 Disk diffusion: Kirby-Bauer (KB) – khoanh
khuếch tán
Kirby-Bauer là phương pháp định tính

Page  5
Phương pháp khoanh khuếch tán (Kirby
Bauer)

 KB là phương pháp tiêu chuẩn cho làm KSĐ

khoanh khuếch tán
 Một nồng độ tiêu chuẩn VK được cấy lên bề
mặt đĩa thạch Mueller-Hinton (MH) bằng kỹ
thuật tiêu chuẩn
 Kết quả được phiên giải nhạy – trung gian –
kháng dựa trên bảng tiêu chuẩn hóa đường
kính vô khuẩn

Page  6
6
Quy trình thực hiện phương pháp
khoanh khuếch tán

Page  7

7
Chuẩn bị huyền dịch

 Phương pháp tăng sinh

 Chọn 3 – 5 KL giống nhau cấy vào 4 - 5 ml canh
thang, ủ 35ºC đến khi độ đục tương đương 0.5
McFarland
 Phương pháp pha KL trực tiếp
 Chọn 4 – 5 Kl riêng rẽ có hình dạng giống nhau
trộn vào 5 ml nước muối vô khuẩn đến khi độ đục
tương đương 0.5 McFarland

0.5 McFarland là gì???

Page  8
8
McFarland Standards (1)

 McFarland standards được sử dụng để đối

chiếu và điều chỉnh độ đục của huyền dịch VK,
vì vậy nồng độ VK sẽ ổn định
 0.5 McFarland tương đương 108 CFU/ml (CFU =
colony forming units)
 Có thể so bằng mắt thường giữa độ đục tiêu
chuẩn với độ đục của huyền dịch VK hay canh
thang

Page  9
9
McFarland Standards (2)

The 0.5 McFarland standard có thể được mua

hoặc Barrium Sulfate standard có thể được pha
theo hướng dẫn của CLSI

Page  10
10
Cấy vào thạch – Mueller-Hinton (1)

 Cấy trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch VK.
 Dùng que tăm bông vô khuẩn nhúng vào huyền dịch sau đó
xoay ép vào thành ống để loại bỏ bớt dịch thừa.
 Cấy vào toàn bộ đĩa thạch có bề mặt khô ráo
 Ria theo đường zic zac sát nhau đến nửa đĩa thì xoay 60 độ và
ria tiếp, làm tiếp tục như vậy với 60 độ nữa.
 Cuối cùng, dùng que tăm bông khoen 1 vòng quanh đĩa thạch

Page  11
11
Cấy trên thạch – Mueller-Hinton (2)

Page  12
12
Đặt khoanh kháng sinh vào đĩa (1)

 Sau ria cấy, có thể để ngửa đĩa thạch 3-5 phút (không
quá 15 phút) để ráo bề mặt thạch trước khi đặt khoanh
KS
 Đặt khoanh KS cần thiết lên bề mặt thạch trong vòng 15
phút.
 Khoanh kháng sinh cần được ấn nhẹ cho bề mặt tiếp xúc
hoàn toàn với thạch.
 Đặt các khoanh khoảng cách đều, cách nhau không dưới
24mm tính từ trung tâm mỗi khoanh.

Page  13
13
Đặt khoanh kháng sinh (2)

 NOTE: Không quá 12 khoanh khi đặt đĩa d=150

mm và không quá 5 khoanh ở đĩa d=100 mm

 Một số kháng sinh khuếch tán ngay khi tiếp

xúc, do vậy không được di dời khoanh kháng
sinh khi nó đã tiếp xúc với bề mặt thạch
Để thay thế, đặt một khoanh khác ở vị trí khác
của đĩa thạch

Page  14
14
Đặt khoanh kháng sinh (3)

Page  15
15
Ủ đĩa

 Đĩa thạch nên được đặt ngửa trong tủ 35ºC trong

vòng 15 phút trước khi đặt khoanh kháng sinh
 Ngoại trừ Haemophilus, N. gonorrhoeae, &
streptococci, các vi khuẩn khác không nên dùng
môi trường tăng CO2. Việc sử dụng khí trường
tăng CO2 sẽ làm thay đổi đáng kể đường kính ức
chế của một số kháng sinh với một số vi khuẩn

Page  16
16
Page  17
17
Đọc và phiên giải kết quả đĩa KSĐ

Page  18

18
Đọc đĩa sau ủ ấm

 Đọc đĩa sau ủ 16-18h, đĩa đủ tiêu chuẩn có đường

ria phù hợp, huyền dịch VK đủ theo quy định, các
khuẩn lạc sát nhau, vòng vô khuẩn tròn ranh giới rõ.
 Nếu các khuẩn lạc thưa, riêng rẽ do nồng độ huyền
dịch thấp, cần test lại.

*Đĩa được để đến 24h trước khi báo cáo kết quả
nhạy với: a) staphylococci với oxacillin hoặc, b)
enterococci to vancomycin

Page  19
19
Đọc kết quả trên đĩa (1)

 Đĩa được để trên nền đen không phản xạ, dưới

ánh sáng gián tiếp
 Đo đường kính vùng ức chế hoàn toàn nhìn thấy
bằng mắt thường, bao gồm cả đường kính
khoanh
 Đường kính được đọc ở mm gần nhất khi sử
dụng thước cặp trượt và đo phía sau của đĩa (trừ
đĩa đục)

Page  20
20
Đọc đĩa (2)

Đường kính được so với hướng dẫn của

Page  21
CLSI để phiên giải
21
Đọc đĩa (3)

 Phần mọc nhẹ chỉ nhìn thấy qua kính lúp ở rìa
của vòng vô khuẩn không cần lưu ý
 Nếu có các khuẩn lạc rời rạc mọc vào trong vùng
vô khuẩn (thành vùng răng cưa), phải test lại với
chủng thuần hoặc chuyển thuần 1 KL từ đĩa ban
đầu. Nếu vẫn còn hiện tượng đó, cần đo vòng vô
khuẩn phía trong các khuẩn lạc

Page  22
Đọc đĩa (4)

Page  23
Đọc đĩa (5)

 Ánh sáng thẩm thấu (đọc phía sau đĩa) được

dùng để đọc vòng của oxacillin & vancomycin để
phát hiện kháng methicillin hoặc vancomycin.
Sự phát triển của vi khuẩn trong vùng ức chế là
biểu hiện của kháng methicillin hoặc
vancomycin.
 Chủng Proteus spp, có thể lan ra vùng ức chế
của một số kháng sinh. Với Proteus spp, có thể
đọc được trên vùng có mọc nhưng rất mỏng

Page  24
Đọc đĩa (6)

 Khi dùng môi trường có máu (VD cho

streptococci), đường kính được đo trực tiếp từ
bề mặt thạch khi mở nắp đĩa trên ánh sáng gián
tiếp
Khi sử dụng MT có máu
và VK gây tan máu,
đường kính đo thực tế
từ chỗ khuẩn lạc, không
phải đường kính của
vòng tan máu

Page  25
Phiên giải kết quả

 Bằng đối chiếu bảng tiêu chuẩn của CLSI,

báo cáo định tính là Nhạy -S- susceptible,
Trung gian -I – intermediate hoặc Kháng – R-
resistant
 Cần cập nhật CLSI hàng năm (Bản M100 S)

Page  26
26
VD về tiêu chuẩn phiên giải

Enterobacteriaceae
Antibiotic Conc. Susceptible Intermediate Resistant
Amikacin 10 g > 17 15 – 16 < 14
Ampicillin 10 g > 17 14– 16 < 13
Ceftazidime 30 g > 21 18 – 20 < 17
Ceftriaxone 30 g > 23 20– 22 < 19
Chloramphenicol 30 g > 18 13– 17 < 12
Ciprofloxacin 10 g > 21 16– 20 < 15
Clotrimazole 10 g > 16 11 - 15 < 10
Gentamicin 10 g > 15 13– 14 < 12
Tetracycline 30 g > 15 12– 14 < 11
Nitrofurantoin 300 g > 17 15– 16 < 14
Nalidixic acid 30 g > 19 14– 18 < 13

Page  27
Phiên giải kết quả

 Nhạy (S): Ngụ ý rằng nhiễm khuẩn do tác nhân phân lập được có
thể điều trị được với liều lượng phù hợp kháng sinh đã thử test để
báo cáo, trừ khi có các chỉ định khác.
 Trung gian (I): Ngụ ý răng nhiễm khuẩn do tác nhân phân lập
được có thể được điều trị khi ở vị trí cơ thể có thể tập trung nồng
độ cao kháng sinh hoặc khi sử dụng kháng sinh liều cao. Nó cũng
chỉ ra một “vùng đệm” để đề phòng những yếu tố đề kháng không
kiểm soát được.
 Đề kháng (R): Các chủng đề kháng không bị ức chế bởi nồng độ
thông thường trong huyết thanh khi sử dụng liều thông thường
hoặc nằm trong các báo cáo lâm sàng đề kháng và cơ chế đề
kháng tự nhiên.

Page  28
28
CLSI Guidelines
Document M100-S20

Page  29

29
Lựa chọn kháng sinh cho thử nghiệm (1)

 Lựa chọn kháng sinh phù hợp nhất cho thử

nghiệm và báo cáo độ nhạy tùy thuộc mỗi cơ sở
y tế
 Các Labo lâm sàng phải thỏa thuận với bác sỹ
điều trị và dược sỹ để cung cấp loại kháng sinh
cho thử nghiệm và báo cáo

Page  30
30
Lựa chọn kháng sinh cho thử nghiệm (2)

Nhóm A –
kháng thử
nghiệm và báo
cáo thường quy

Nhóm B – Có thể
thích hợp cho thử
nghiệm thường
quy, nhưng báo
cáo có chọn lọc.
VD khi VK kháng
các thuốc khác
cùng lớp hoặc lý
do khác
Page  31
31
Lựa chọn kháng sinh cho thử nghiệm (3)

Nhóm C – Kháng sinh báo cáo thay thế hoặc bổ sung với các
lý do:
 Cơ sở y tế đó có các chủng gây bệnh kháng lại các KS nhóm ưu tiên
lựa chọn (nhóm A)
 Thay thế cho BN dị ứng với nhóm ưu tiên
 Điều trị các nhiễm khuẩn không thường gặp

Page  32
32
Lựa chọn kháng sinh cho thử nghiệm (4)

Nhóm U (“urine”) – Sử dụng ưu tiên cho các nhiễm

khuẩn đường niệu. KHÔNG báo cáo thường quy cho
các nhiễm khuẩn ở vị trí khác ngoài đường niệu(e.g.
Sulfonamides & nitrofurantoin)
Nhóm O (“other”) – Các kháng sinh có chỉ định điều
trị cho một nhóm vi khuẩn trên lâm sàng nhưng chưa
có hướng dẫn cho thử nghiệm và báo cáo ở Mỹ
Nhóm Inv. (“investigational”) - Các kháng sinh
được sử dụng cho nghiên cứu với 1 nhóm vi khuẩn
nào đó nhưng chưa được chấp thuận sử dụng ở Mỹ
Page  33
33
Cảnh báo (1)

“WARNING”: Các kháng sinh dưới đây có thể có

tác dụng trên ống nghiệm nhưng không có hiệu
quả lâm sàng và không nên báo cáo là nhạy
cảm.

Page  34
34
Cảnh báo (2)

Page  35
35
Cảnh báo (3)
Vi khuẩn Các kháng sinh không được báo cáo là
NHẠY

VK sinh ESBL: Klebsiella Penicillins, Cepahalosporins, &

pneumoniae, K.oxtytoca, E. Aztreonam
coli & P.mirabilis
1st & 2nd generation
Cephalosporins, Cephamycins, &
Salmonella spp., Shigella Aminoglycosides (Gm,An,Net)
spp.
Oxacillin-Resistant Penicillins, B-lactams/B-lactamase
Staphyloccus spp. inhibitor combinations, cephems, &
Carbapenems

Enterococcus spp. Aminoglycosides (exc. High

concentrations), Cephalosporins,
Clindamycin, & SXT

Page  36
36
Cảnh báo (4)

Các kháng sinh dưới đây không nên báo cáo

thường quy cho các tác nhân phân lập từ dịch não
tủy
Đây là các kháng sinh không được lựa chọn và có
thể không có hiệu quả điều trị nhiễm khuẩn màng
não
 Kháng sinh chỉ dùng đường uống
 1st and 2nd cephalosporin
 (VD. Cefuroxime)
 Clindamycin
 Macrolides (Erythromycin, azithromycin, Clarithromycin
 Tetracyclines
 Fluoroquinolones (Ciprofloxacin)
Page  37
37
Tìm hiểu thêm

 Phát triển đề kháng & test kiểm tra lại

 Các chủng nhạy cảm có thể trở thành trung gian hoặc kháng
thuốc sau khi bắt đầu điều trị
 Do đó, nuôi cấy tiếp theo của cùng một loài từ một vị trí cơ thể
nên được thực hiện để phát hiện sự kháng thuốc có thể đã
xuất hiện
 Đề kháng có thể xảy ra trong ít nhất là 3 - 4 ngày
 Một số trường hợp nhất định, việc nuôi cấy phân lập tiếp tục
để phát hiện kháng thuốc có thể đã xuất hiện có thể được
thực hiện sớm hơn 3-4 ngày
 Thực hiện vấn đề này cần có kiến thức về tình huống cụ thể
và tình trạng bệnh nhân (ví dụ: Enterobacter phân lập từ cấy
máu của trẻ sơ sinh non tháng)
Page  38
38
Test sàng lọc cho Staphylococcus

Page  39

39
Methicillin-resistant S. aureus (MRSA)- Vấn đề lớn

 85% các chủng kháng penicillin do sinh beta-

lactamases
 Điều trị bằng penicillin kháng beta-lactamase :
penicillin – nafcillin
 Sự gia tăng kháng nafcillin do thay đổi tại
penicillin binding proteins (PBP) - hầu hết do 1
gen được gọi là mecA. Có nhiều test sàng lọc
phát hiện gen này.
 Điều trị nhiễm MRSA bằng vancomycin

Page  40
Test mec-A Mediated Oxacillin Resistance

 Chỉ định:
Cho tất cả các chủng Staphylococcus
 Phương pháp:
Cefoxitin 30ug, khoanh khuếch tán trên MH, ủ 33-35oC, khí
trường thường (16-18 hours)
“Nếu ủ > 35oC có thể không phát hiện được MRSA”
 Phiên giải kết quả:
S. aureus : ≤ 21mm = mecA positive
≥ 22mm = mecA negative
Coag-negative : ≤ 24mm = mecA positive
Staph ≥ 25mm = mecA negative
Page  41
41
Báo cáo mec-A Mediated Oxacillin Resistance sử dụng
Cefoxitin

 Báo cáo:
- Cefoxitin được sử dụng làm chất thay thế báo cáo
kháng Oxacillin qua trung gian mec-A
- Các chủng dương tính với mecA phải được báo cáo là
Kháng Oxacillin (không phải Cefoxitin); các kháng sinh
B Lactam khác phải được báo cáo là kháng hoặc không
nên báo cáo
- Các cơ chế kháng oxacillin hiếm khi xảy ra ngoài mecA,
nhưng với chủng mecA âm tính nhưng có Oxacillin MIC
MIC 4 ug / ml nên được báo cáo là kháng Oxacillin

Page  42
42
Summary

Page  43