Genetika mikroorganizama

Genetika je naučna disciplina koja definiše i analizira svojstva

nasljeđivanja, postojanosti i promjenljivosti fizioloških funkcija koje
formiraju osobine živih organizama.

Proučavanje genetike mikroorganizama dovelo je do otkrića da se geni

sastoje od DNK, čime je postavljen temelj za osnivanje nove naučne
discipline— molekularne biologije.

Jedinica nasljeđivanja je gen, segment DNK, koji u redosljedu

nukleotida nosi informaciju za određenu biohemijsku ili fiziološku
osobinu.

Fenotip, je skup strukturnih i fizioloških osobina ćelije ili organizma.

Hemijska osnova za promjenljivost fenotipa je promjena genotipa, tj.
redosljeda nukleotida DNK lanca.

Genom je zbir svih genetskih informacija organizma.

Circular single-stranded DNA
6400 base pairs long
The genome codes for a total of 10 genes
 Struktura DNA

1. DNA se sastoji od dva polinukleotidna lanca, koji su

savijeni oko zajedničke ose u suprotnim smjerovima.

2. Purinske i pirimidinske baze nalaze se u unutrašnjosti

uzvojnice, dok se fosfatne i deoksiribozne jedinice
nalaze sa vanjske strane uzvojnice.

3. Dijametar uzvojnice je 2nm. Susjedne baze nalaze se

na rastojanju od 0,34 nm duž ose uzvojnice i
zarotirane su jedna u odnosu na drugu za 36 stepeni.

4. Dva lanca drže se na okupu hidrogenskim vezama

između parova baza. Adenin je uvijek sparan sa
timinom, a guanin sa citozinom.

5. Sekvenca baza u polinukleotidnom lancu nije

ograničena ni na koji način.
Genom prokariotske ćelije

Većina gena prokariotske ćelije nalazi se na bakterijskom

hromozomu koji ima oblik prstena, a sastavljen je od oko 4.000
Kbp (kilobaza parova). Mnoge bakterije imaju dodatne gene na
plazmidima, čija veličina varira od svega nekoliko do 100 Kbp.

DNK prstenovi (hromozomski ili plazmidski) koji imaju genetske

informacije za sopstvenu replikaciju zovu se replikoni. Kod
bakterija ne postoji membrana koja gene odvaja od citoplazme,
kao u slučaju eukariotskih ćelija. Osim kod nekoliko izuzetaka,
bakterijski geni su haploidni.
“Hromosom” bakterija je
prstenasta, gola, dvolančana
molekula DNA –nukleoid
Pored veoma velikog,
cirkulatornog DNK
hromosoma u nukleoidu,
bakterija sadrži jednu
ili više malih,
cirkulatornih DNK
molekula koje su
slobodne u citoplazmi.
Ovi ekstrahromozomski
elementi nazivaju se
plazmidi.

Plazmid je nezavisna
samoreplicirajuća čestica.
Plazmidi se repliciraju
neovisno o bakterijskom
kromosomu, a svaki
plazmid ima mali broj
gena.
Geni neophodni za rast i razmnožavanje bakterija smješteni su
na hromozomu, dok plazmidi nose gene koji kodiraju neke
specifične karakteristike.

Mnogi plazmidi posjeduju gene koji omogućavaju njihov transfer

iz jedne u drugu ćeliju, kao i gene koji rukovode procesom
rekombinacije DNK.
Postoje dvije funkcionalno različite vrste gena:
-strukturni geni (određuju strukturu i sintezu nekog specifičnog
proteina)
-regulacijski geni (određuju početak i kraj sinteze nekog
specifičnog proteina).

Aktivnost svakog strukturnog gena u ćeliji veoma precizno reguliše

njegov specifični operator-gen koji se nalazi uz njega u lancu
informacijske RNK (m-RNK).

Hromosom E.coli sadrži 4 638 858 baznih parova. Ovi bazni

parovi predstavljaju 4300 gena za proteine i 115 gena za
stabilne RNK molekule.
Operator gen je funkcionalno povezan sa proteinskom
citoplazmatskom supstancom koja se naziva represor. Za svaki
operator gen postoji specifičan represor.

Kada se operator gen veže sa svojim represorom, strukturni gen

koji se nalazi uz taj operator gen biće spriječen za sintezu
specifičnog proteina.

Produkcijom represora upravljaju regulacijski geni koji time

određuje početak i kraj sinteze proteina enzima i svakog drugog
dijela bakterijske ćelije.

Strukturni i regulacijski geni mogu se mjenjati odnosno mutirati

što može dovesti do određenih fenotipskih promjena.
Modifikacije

Promjene manifestnih osobina bakterija nastaju pod uticajem

raznih najčešće hemijskih agenasa. Smjer, vrsta i obim tih
promjena određeni su i ograničeni genotipom date vrste bakterija.

Interakcija između nasljednih determinanti-gena i uticaja vanjske

sredine može uzrokovati pojavu različitih fenotipova uprkos
postojanju jednog istog nepromjenjenog genotipa.

Fenotipske osobine bakterija jednog genotipa mogu se mijenjati u

ovisnosti od: pH sredine, osmotskog pritiska, uticaja mehaničkih
sila, kvantiteta i kvaliteta hrane, aktivnosti njihovih enzima i
drugih agenasa u njihovoj sredini.
Fenotipske varijacije mogu izazvati privremene promjene
mnogih osobina bakterija, kao što su njihova veličina, oblik,
boja kolonija, sposobnost sporulacije.

Ove promjene su najčešće rezultat sposobnosti bakterija da

produkuju inducibilne enzime.

Fenotipske varijacije zahvataju odjednom sve ćelije jedne

bakterijske populacije koja je dospjela u izmjenjene uslove
sredine.

Vraćanjem takve populacije u prvobitne uslove života brže ili

sporije spontano nestaju i sve promjene na živim ćelijama.
Mutacije

Mutacija je genetska varijacija koju karakterišu skokovite i

nasljedne promjene jedne ili više osobina bakterija ili drugih
živih bića.

Mutacija je rezultat promjena u redosljedu nukleotida u DNK u

jednom genu ili u više gena. Rezultati tih promjena se manifestuju
fenotipski.

One se ispoljavaju samo na malobrojnim pojedinačnim ćelijama.

Mutacijom stečene osobine u tih malobrojnih ćelija su stabilne i
prenose se na iduće generacije.
Fenotipski izrazi mutacije mogu biti različiti:

-mutante s povećanom ili potpunom otpornošću prema raznim

inhibitornim agensima (hemioterapijska sredstva);

-mutante kod kojih se promjenila njihova antigena struktura;

-mutante koje steknu sposobnost produkcije toksina;

-mutante sa povećanom ili smanjenom sposobnosti izazivanja

infekcije ili zarazne bolesti;

-mutante koje se izražavaju morfološkim promjenama kao što su

gubitak flagela, kapsule ili formiranja spore.
Molekulska baza mutacija je rezultat promjena u redosljedu
nukleotida unutar jednog gena ili više njih što ima za posljedicu
produkciju izmjenjenog proteina odnosno proteina sa izmjenjenom
sekvencom aminokiselina.

Najvažniji i najčešći mehanizmi izmjene i promjene nukleotida su

sljedeći:

-pogrešno vezivanje baza;

-insercija-dodatak jednog novog para baza dvolančanoj DNK;

-delecija-gubitak para baza iz dvolančane DNK;

-prekidanje veze dezoksiriboza-fosfat

(gubitak većih segmenata parova baza).
Mutacija može biti spontana i indukovana.

Spontane mutacije (selekcija) u bakterijskoj ćeliji su genetske

promjene čiji uzroci nisu poznati. Dešavaju se veoma rijetko
odnosno jedna ćelija koja je spontano mutirala dolazi na 106-1010
djeljenja ćelija.
One veoma rijetko dovode do uočljivih promjena u fenotipu.

Indukovane mutacije izazivaju razni fizički ili hemijski agensi

(mutageni: 5-brom-uracil, aminopurini, azotna kiselina, ultraljubičaste zrake ) .

Ovi agensi samo povećavaju učestalost spontanih mutacija.

Plazmidi su identifikovani kao mali genetski elementi u ćelijama
bakterija i gljiva, koji se replikuju nezavisno od hromozomske
DNK.

Mnogi plazmidi posjeduju gene koji omogućavaju njihov

transfer iz jedne u drugu ćeliju, kao i gene koji rukovode
procesom rekombinacije DNK.
Transpozoni su genetski elementi koji sadrže nekoliko Kbp,
uključujući i informaciju za njihovo premještanje sa jednog
genskog lokusa na drugi.

Jednostavni transpozoni, insercione sekvence, posjeduju samo tu

genetsku informaciju.

Složeni transpozoni imaju i određene funkcionalne gene, kao što

su, geni za rezistenciju na antibiotike, koji su sa obje strane
ograničeni insercionim sekvencama.

Za razliku od plazmida, transpozoni ne mogu da se replikuju

samostalno, što znači da njihova propagacija zavisi od integracije u
bakterijski replikon.

Ova asocijacija je potpomognuta sposobnošću transpozona da

formiraju sopstvene kopije, koje mogu biti prisutne u istom
replikonu ili se mogu integrisati u drugi replikon. S obzirom da
mnoge insercije presjecaju gene, transpozoni često izazivaju
mutacije.
REPLIKACIJA

Dvolančana DNK se sintetiše semikonzervativnom replikacijom.

Pošto se roditeljski dupli lanac DNK odvije i razdvoji, svaki od
lanaca služi kao model (tj. informacija za redosljed baza) na kome
se sintetišu novi komplementarni lanci.

Novi lanci se, dakle, sintetišu, tako da je redosljed baza u njima

komplementaran sekvenci roditeljskih lanaca. Kada se sinteza
završi, svaki replikovani dvostruki lanac DNK sastoji se iz jednog
roditeljskog i jednog novosintetisanog lanca.
Replikacija prokariota vezana je za ćelijsku membranu, a
razdvajanje kopija hromozoma i plazmida odvija se zajedno sa
izduživanjem membrane.

Replikacija bakterijskog hromozoma je strogo kontrolisana, a

broj hromozoma u ćeliji koja raste kreće se od 1 do 4.

Neki bakterijski plazmidi mogu imati i do 30 kopija u jednoj

bakterijskoj ćeliji, a mutacije koje smanjuju efikasnost
kontrole plazmidske replikacije imaju kao rezultat čak i veći
broj kopija.
Replikacija kružnog dvostrukog lanca bakterijske DNK počinje
na ori lokusu, segmentu DNK za koji se vjeruje da je povezan sa
ćelijskom membranom.

Replikacija hromozomske DNK odvija se u dva smijera počev od

ori lokusa, a završetak procesa na najudaljenijoj tački dovodi do
formiranja dvije kopije hromozoma koje se razdvajaju.

Na sličan način se replikuje i plazmidska DNK, osim što je u

nekim slučajevima replikacija jednosmjerna.
Replikacija bakterijskog hromozoma prema modelu Jacob-a i Brenner-a.
(a) Hromozom je pričvršćen za mezozom na mestu ori lokusa koji služi
kao pokretač.
Jedan od lanaca je otvoren.
(b) 5' kraj otvorenog lanca vezuje se za novo mesto na membrani.
(c) Hromozom rotira u smeru suprotnom od kazaljke na satu,
prolazeći kroz mezozomalnu poziciju na kojoj je lociran set
enzima za replikaciju. Mjesta spajanja se udaljavaju
izduživanjem membrane (osjenčena zona).
(d) Replikativni ciklus je završen. Poslednji korak biće spajanje
slobodnih krajeva DNK lanca novog hromozoma (puna linija).
 TRANSFER DNK

Međućelijski prenos DNK široko je rasprostranjen kod prokariota i

predstavlja glavni doprinos naglašenoj promjenljivosti bakterijskog
genoma.

Genetska rekombinacija kod bakterija potpuno se razlikuje od fuzije

zigota koja se odigrava kod eukariota.

Genetska razmjena kod bakterija predstavljena je prenosom relativno

malih fragmenata donorskog genoma u recipijentnu ćeliju.

Za uspješnu genetsku rekombinaciju neophodno je da se

donatorska DNK replikuje u recipijentnoj ćeliji.
 Replikacija se može postići ili
integracijom donorske DNK u recipijentni replikon ili
formiranjem samostalnog replikona od donorske DNK.
Bakterijska ćelija ima razvijene mehanizme kojim se štiti od ulaska
strane DNK. To su restriktivni enzimi (restriktivne endonukleaze)
koji razgrađuju DNK koja nije u ćeliji obrađena na odgovarajući
način.

Restriktivni enzimi hidrolizuju DNK lanac na specifičnom mjestu

gdje prepoznaju određeni redosljed baza u dužini od 4-13
susjednih nukleotida. Restriktivne endonukleaze uočavaju kratke
DNK sekvence i razbijaju dvostruko upredene DNK lance koji se
nalaze u ovoj sekvenci, ili se graniče sa njom.

Direktna biološka posljedica restrikcije je razgradnja donorske

DNK prije nego što dobije priliku da postane dio rekombinantnog
replikona.
Mehanizmi rekombinacije

Donorska DNK koja ne posjeduje informaciju za sopstvenu

replikaciju mora se replikovati sa recipijentskom DNK da bi opstala
u funkcionalnom stanju u recipijentnoj ćeliji.

Rekombinacija može biti legitimna, tj. kada postoji visok stepen

sličnosti između sekvenci donorske i recipijentne DNK, ili
nelegitimna, tj. kada je riječ o enzimski katalizovanoj
rekombinaciji između raznolikih DNK sekvenci.

Legitimna rekombinacija skoro uvijek uključuje razmjenu između

gena istog porijekla, pa se zbog toga često zove i homologna
rekombinacija.
Proces rekombinacije kontroliše set gena označenih sa rec,
i poremećaj funkcije ovih gena ima za posljedicu da genom
takve bakterijske ćelije može da sadrži visoko homologne
gene a da ne dolazi do rekombinacije.
Mehanizmi prenosa gena

Na osnovu forme donorske DNK kod prokariota se razlikuju tri

osnovna mehanizma genetske razmjene.

Konjugacija
Transdukcija
Transformacija
Konjugacija

Bakterijska konjugacija je proces genetičke rekombinacije pri

kome dolazi do privremenog spajanja dvije bakterijske ćelije.
Plazmidi su genetski elementi koji se najčešće prenose
konjugacijom.

Samoprenosivi (konjugovani) plazmidi posjeduju genetske

informacije za prijenos. Neki od njih mogu da mobilišu i druge
plazmide ili dijelove hromozoma bakterija i tako omoguće njihov
transfer. Ovi plazmidi se nazivaju F plazmidi, a ćelije koje ih
posjeduju F(+) ćelije. F plazmidi, bakterijskoj ćeliji koja ih
posjeduje, daju karakteristike donora. Ove ćelije mogu da se
spajaju sa F(-) ćelijama i da u njih unesu F plazmide.
F-plazmidi se sastoje od cirkularne, dvolančane DNK. U njima se nalazi 20 i više
gena. Među ovim genima se nalaze oni koji regulišu sintezu seksualnih ili F pila
koji determinišu prijenos plazmida.

F-pile su ekstracelularni, proteinski izraštaji, koji omogućavaju da se ćelija

donor pričvrsti na ćeliju recipijenta. Most koji predstavljaju F pile, omogućava
da jedan lanac F plazmida iz donorske ćelije pređe u ćeliju recipijenta, gdje se
formira komplementarni lanac DNK. Nakon konjugacije obje ćelije posjeduju F
plazmid.
Konjugaciona cijev prema
Zasječeni plazmid u ćeliji recipijentnoj ćeliji
donoru

Formira se konjugaciona cijev

DNA plazmida počinje da se
između ćelije donora i recipijenta.
replicira, odvaja. Slobodni
Enzim otvara prsten plazmida.
lanac DNA kreće se kroz
konjugacionu cijev.

U ćeliji recipijentu počinje Ćelije se razdvoje i u svakoj ostaje

replikacija transportovane cirkularna molekula DNA plazmida.
DNA.
F-plazmid može ostati autonoman u citoplazmi ćelije, kao
ekstrahromozomski genetski materijal, ili se može integrirati u
hromozom.

F-plazmid se može vezati na raznim mjestima ćelijskog hromozoma.

Integrirani F-plazmid daje novu karakteristiku bakterijskoj ćeliji,
koja se označava kao
Hfr - (high frequency recombination)
(rekombinacije visoke frekvencije).

Pokretanje integriranog F-plazmida omogućava prijenos i dijela

hromozomske DNK u drugu ćeliju. Prijenos se vrši počevši od mjesta
insercije F-plazmida u smijeru, koji određuje orijentacija insercionog
fragmenta.
Postoje tri vrste plazmida:
F-plazmid je jedan od transfer faktora, sposoban da
prenese dio genoma ćelije donatora u ćeliju recipijenta.

Col –plazmidi određuju produkciju bakteriocina

(bakterijskih antibiotika), bakterijama koje ih posjeduju.
Oni se autonomno replikuju i nikad se ne integrišu u bakterijski
hromozom.
R-plazmidi sa setom svojih gena određuju otpornost
bakterija prema antibioticima, hemioterapeuticima, teškim
metalima i drugim antimikrobnim sredstvima. Oni se takođe
autonomno replikuju, ali se mogu integrisati u bakterijski
hromozom.
Transdukcija

Transdukcija je fagom (bakterijskim virusima) posredovana

genetska rekombinacija kod bakterija. Oni prenose manji ili
veći fragment hromozomske DNK bakterija domaćina u ćeliju
bakterije koja je na dati fag osjetljiva.

Najjednostavnije rečeno, transdukciona partikula je bakterijska

DNK u omotaču faga. Takve populacije se koriste za transfer
gena iz jedne bakterijske ćelije u drugu.

glava

rep

fibrile
Nukleinska kiselina bakteriofaga okružena je proteinskim omotačem.
Izuzetno, neki fagi imaju i lipidnu komponentu.
Utvrđeno je da organizacija genoma bakteriofaga varira.

Mnogi fagi sadrže dvolančanu DNK, neki posjeduju jednolančanu

DNK, a neki jednolančanu RNK. U sastavu nukleinskih kiselina
bakteriofaga mogu se naći neuobičajene baze, kao što je
hidroksimetil citozin.

Mnogi fagi imaju posebnu strukturu koja podsjeća na brizgalicu

kojom se oni vezuju za receptore na površini osjetljivih ćelija i koja
ubrizgava nukleinsku kiselinu u unutrašnjost ćelije domaćina.
Fagi se mogu razlikovati na osnovu načina razmnožavanja.

Umjereni fagi uspostavljaju nelitički — profag — status u kome je

replikacija virusne nukleinske kiseline direktno povezana sa
replikacijom DNK ćelije domaćina.

Bakterijska ćelija, koja je inficirana profagom, označena je kao

lizogena zbog toga što određeni fiziološki signal može da aktivira
litički ciklus, što izaziva smrt ćelije domaćina i oslobađa veliki
broj kopija faga.
 Litički fagi
proizvode
veliki broj
sopstvenih
kopija i
ubijaju ćeliju
u kojoj
parazitiraju.
Transformacija

Direktno preuzimanje donorske DNK od strane recipijentnih ćelija

zavisi od njihove kompetentnosti da se transformišu.

Prirodno ispoljavanje ovog svojstva nije baš često među bakterijama,

a neke od njih mogu da se transformišu jedino u prisustvu faktora
kompetencije, koji se proizvode samo u određenom trenutku tokom
ciklusa razmnožavanja.
 Mnoge bakterije postižu prirodnu transformaciju i
podesne su za genetski inžinjering zbog lakoće s
kojom inkorporiraju modifikovanu DNK u svoj
hromozom.

Do ove rekombinacije može doći samo kod DNK

srodnih bakterijskih vrsta jer u DNK ćelije donatora
i recipijenta mora postojati specifičan i homologan
redosljed nukleotida.

Prirodna transformacija je aktivni proces koji

zahtijeva prisustvo specifičnih enzima koje sintetiše
recipijentna ćelija.
Mnoge bakterije koje nisu u stanju da se prirodno transformišu
mogu se »prisiliti« da inkorporiraju plazmide tretiranjem sa
CaCl2 i primjenom temperaturnog šoka.
Odbačeni dio DNK ćelije donatora da bi stigao u ćeliju recipijenta,
hidrolitički razgradi dio njene ćelijske ovojnice. U ćeliji jedan lanac DNK
donora se hidrolitički razgradi, a drugi se integriše sa odgovarajućim
komplementarnim segmentom DNK recipijenta.

Tako nastaje rekombinovani hromozom, merozigot. Merozigot se sastoji od

dvostrukog lanca DNK recipijenta i jednog lanca DNK donatora. Zatim biva
razgrađen jedan lanac DNK recipijenta, koji je simetričan sa DNK lancem
donatora. Preostali lanac donatora se ugradi na mjesto gdje su bili nukleotidi
recipijenta.

Kada se ćelija sa rekombinovanim hromozomom podijeli, ćelije kćerke će imati

po rekombinovani hromozom.