Professional Documents
Culture Documents
Thlyl Lkrbwhydrt
Thlyl Lkrbwhydrt
Carbohydrate Analysis
مقدمة
تعد الكربوهيدرات من المصادر الرئيسية للطاقة التي يحصل عليها
اإلنسان من غذائه ،ولها صفاتها الطبيعية ودورها الوظيفي الهام في
المنتجات الغذائية كما تلعب دورًا حيويًا في العمليات الفسيولوجية في جسم
اإلنسان .وتمثل الطاقة التي يحصل عليها اإلنسان من الكربوهيدرات
وحدها ،على مستوى العالم حوالي .%70وينصح تغذويًا أن يكون النشا
هو المصدر الرئيسي للطاقة التي يحصل عليها اإلنسان من الكربوهيدرات.
وتشمل الطرق التحليلية للمركبات الكربوهيدراتية الطرق الوصفية اللونية ،ثم
طرق التقدير الكمي سواء الكيميائية ،أو اللونية ،أو الكرماتوجرافية ومنها
الوصفية أو الكمية لكروماتوجرافيا الورق ،وكروماتوجرافيا الغاز GD
لمشتقات السكريات ،وكروماتوجرافيا الطبقة الرقيقة ،TLCوأيضًا الطرق
اإلنزيمية ،وطرق اإللكتروفوريسيس ،باإلضافة لطرق كروماتوجرافيا
السائل ذات األداء العالي .HPLC
تجهيز العينة :Sample Preparation
كمية التجهيزات المطلوبة لتجهيز عينة لتحليل الكربوهيدرات تعتمد
على طبيعة الغذاء المحلل .المحاليل المائية ،مثل عصائر الفاكهة والشراب
syrupوالعسل .تتطلب عادة قليًال من التجهيز قبل التحليل .من الناحية
األخرى ،تحتوي العديد من األغذية على الكربوهيدرات التي ترتبط طبيعيًا
أو كيميائيًا بمكونات أخرى ،ومثال على ذلك :المكسرات ،محاصيل
الحبوب ،الفاكهة ،الخبز والخضروات .في هذه األغذية ضروري عادة
فصل الكربوهيدرات من بقية الغذاء قبل أن يتم التحليل .تعتمد الطريقة
المحددة لتقدير الكربوهيدرات على نوع الكربوهيدرات ،نوع نظام الغذاء
وغرض التحليل ،على أية حال ،هناك بعض اإلجراءات الشائعة للعديد من
تقنيات الفصل على سبيل المثال ،تجفف األغذية عادة تحت التفريغ (لمنع
الهدم الحراري) ،تطحن إلى مسحوق ناعم (لتحسين استخالص المذيب)
وبعد ذلك نزع الدهن defattedبمذيب استخالص.
وعادة ما تكون الخطوة األولى في إعداد العينات في أغلب المواد
الغذائية للتحليل هي عملية التجفيف ،والتي يمكن االستفادة منها أيضًا في
تقدير المحتوى الرطوبي للمادة الغذائية .وتتم عملية التجفيف فيما عدا
السوائل بوضع كمية مناسبة من المادة الغذائية في فرن تجفيف تحت تفريغ
على 55م وضغط 100مم زئبق.
وتلي عملية التجفيف طحن العينة لتصبح مسحوق ناعم ،ثم تستخلص الليبيدات
من العينة باستخدام مخلوط الكلوروفورم والميثانول ( 5:95ح/ح) في جهاز
سوكسلت .ويؤدي استخالص الليبيدات من عينة المادة الغذائية قبل تحليل
الكربوهيدرات لسهولة واكتمال استخالص الكربوهيدرات .ويوضح شكل
( )1-6رسم تخطيطي إلعداد العينة للتحليل واستخالص السكريات األحادية
والثنائية.
شكل ( :)1-6رسم تخطيطي إلعداد العينة للتحليل واستخالص
.السكريات األحادية والثنائية
طحن
استخدام الليبيدات
:D-Glucose/D-Fructose
هذه الطريقة تستعمل سلسلة من الخطوات لتقدير تركيز كًال من الجلوكوز
والفركتوز في العينة .أوًال ،يحول الجلوكوز إلى الجلوكوز – 6فوسفات
G6Pبإنزيم hexakinaseو ،ATPثم ،يؤكسد G6Pبواسطة
+NADPفي وجود ).G6P-dehydrogenase (G6P-DH
G6P + NADP+ gluconate-6-phosphate + NADPH + H+
كمية NADPHالمتكونة تتناسب مع تركيز G6Pفي العينة ويمكن أن تقاس
لونيًا spectrophotometricallyعند 340نانومتر .يمكن تقدير
تركيز الفركتوز بتحويله إلى جلوكوز ،باستعمال إنزيم آخر متخصص ،ثم
يكرر إجراء التجربة السابقة.
:Maltose/Sucrose
يمكن أن يقدر تركيز المالتوز والسكروز (سكريات ثنائية) في عينة بعد تقدير تركيز
الجلوكوز والفركتوز حسب الطريقة السابقة .المالتوز والسكروز تكسر إلى وحداتهم من
السكريات األحادية بواسطة إنزيم :a-glucosidase
في كروماتوجرافيا الطور العادي يكون الوسط الثابت قطبي polarويتم عملية إزاحة
مخلوط السكريات باستخدام طور متحرك تزداد قطبيته بالتدرج ،وهذه الطريقة من الطرق الشائعة
االستخدام في كروماتوجرافيا السائل ذات األداء العالي .ويتم في هذه الطريقة إدخال مجموعة أمين
مع السليكا جيل باستخدام أحد الجواهر الكشافة ويطلق على الوسط الثابت حينئذ الوسط المرتبط
باألمين amino-bonded stationaryوتتم إزاحة السكريات باستخدام وسط سائل متحرك من
األسيتوينتريل والماء بحيث يتراوح تركيز األسيتونيتريل بين .%80-50ويكون ترتيب خروج
المركبات المزاحة من عمود السليكا جيل – المرتبط باألمين كالتالي :سكريات أحادية – سكر كحولي
– سكر ثنائي – ثم األوليجوسكريدات .وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في تعريف وتقدير
الكربوهيدرات في منتجات :المشروبات ،عسل النحل ،واآليس كريم ،والمخبوزات ،ومنتجات حبوب
اإلفطار ،وأغذية األطفال ،والفواكه والخضروات ،ومنتجات الحبوب.
ويعاب على أعمدة السليكا جيل – المرتبطة باألمين (عند فصل السكريات) أن السكريات المختزلة تتفاعل
وترتبط مع مجموعة األمين المرتبطة بالوسط الثابت مما يؤدي لتدهور أداء العمود وفقدان صالحيته
بمرور الوقت .ويمكن التغلب على تلك المشكلة بإضافة نسبة ضئيلة من مواد تعرف بالمواد المعدلة
modifiersللطور السائل .وتتكون المواد المعدلة من مجموعتي أمين على األقل ،تدمص أحدهما
على السليكا جيل واألخرى تكون حرة لترتبط مع الشق الكربوهيدراتي ،وألن المواد المعدلة تكون
في محلول اإلزاحة لذلك يعاد تجديد الطور الثابت باستمرار دون أن يفقد مجاميع األمين المرتبطة به.
كروماتوجرافيا التبادل الكاتيوني
:Cation Exchange Chromatography
في هذا النظام من أنظمة الفصل يكون الوسط الثابت هيدروفوبي ،والوسط المتحرك
غالبيته من الماء .ويعد الوسط الثابت بالتفاعل بين السليكا جيل مع مادة تضيف سلسلة
ألكيل .فعندما تضاف سلسلة ألكيل من 18ذرة كربون (يعرف العمود حينئذ بعمود )C18
وتستخدم كروماتوجرافيا الوسط العاكس لفصل السكريات األحادية والثنائية والثالثية إلى
مجموعات ،فعلى سبيل المثال يمكن تقدير السكروز ،والرافينوز ،والستاكيوز في فول
الصويا ومنتجاته ،كما يقدر السكر المحول ،والسكروز ،والمالتوز ،والمالتوتريوز في
العصائر والمشروبات الكحولية.
ويعد قصر زمن االحتجاز retention timeللسكريات األحادية هو العيب الرئيسي في
طريقة الطور الثابت ،ويمكن عالج تلك المشكلة نسبيًا بإضافة األمالح ككلوريد الصوديوم
فتؤدي لزيادة زمن االحتجاز.
وتتميز أعمدة الطور العادي والعاكس بطول فترة صالحيتها ،وثباتها الجيد كما يمكن أن تعمل
مع عديد من األوساط المتحركة في مدى كبير من أرقام الـ ( pHمن 2إلى .)10ويعيب
على األطوار الثابتة التي تعتمد في تركيبها على السليكا ،واحتمال ذوبان السليكا لحد بسيط
في سوائل اإلزاحة الغنية بالماء.
تحليل السكريات بكروماتوجرافيا الغاز :Gas Chromatography
يتم اختزال السكريات المتعادلة المستخلصة من مستخلص االيثانول %80أو من
جراء تحليل السكريدات بواسطة كمية من بروهيدريد الصوديوم الذائب في محلول
هيدروكسيداألمونيوم .وبعد تمام حدوث التفاعل على درجة حرارة الغرفة يضاف
حامض الخليك الثلجي نقطة نقطة حتى يتوقف إنبعاث غاز الهيدروجين ،وتؤدي تلك
المعاملة لتحطيم الزيادة من بروميد الصوديوم .يتم تبخير المحلول المحمض حتى
الجفاف ،وتزال أيونات البورات على صورة بورات الميثيل بإضافات متتالية من
الميثانول وتبخيره أوًال بأول .يضاف أنهيدريد حامض الخليك Acetic
anhydrideثم يقفل الدورق جيدًا ويسخن إلى 121م ويبرد بعد ذلك ،ويضاف
الماء لتحليل الزيادة من أنهدريد حامض الخليك ثم تبخر محتويات الدورق حتى
الجفاف .تذاب المحتويات الجافة في الدورق في كلوروفورم نقي ،ثم تحقن في جهاز
الـ GLCعلى أن تكون درجة الحرارة أثناء الفصل ثابتة .isothermally
يتم التعرف على المركبات من أزمنة خروجها من الجهاز منسوبة إلى مركب
سداسي خالل اإلنيسيتول inisitol hexacetateكمعيار داخلي أيضًا للجهاز.
وتفضل معايرة جهاز الـ GLCباستخدام مخلوط Internal standardقياسي من
المركبات المفصولة بنفس تركيزاتها ومقارنة الناتج.
تحليل النشا :Analysis of Starch
يعد النشا أكثر السكريات المتعددة القابلة للهضم شيوعًا الموجودة في
األغذية ،ولذا يعتبر مصدر الطاقة الرئيسي في غذائنا .يوجد النشا في شكله
الطبيعي كحبيبات غير ذائبة في الماء ( 60-3ميكروميتر) .ولكن في العديد
من األغذية المصنعة ،النشا لم يعد في هذا الشكل بسبب المعامالت
التصنيعية (مثل :التسخين) .يتكون النشا من خليط من اثنين من جلوكوز
سكريات متعددة متجانسة :homopoysaccharidesأميلوز
500-2000( amylaseوحدات جلوكوز) .والذي يكون مستقيمًا
،linearواألميلوبكتين ( amylopectinأكثر من 1000000وحدات
جلوكوز) ،والتي تكون متفرعة بشكل واسع .هذان النوعان من النشا لهما
خصائص فيزوكيميائية physiochemicalمختلفة ،ولذا من المهم في
أغلب األحيان تقدير تركيز كل مكون فردي من النشا ،باإلضافة إلى تركيز
النشا الكلي.
تجهيز العينة :Sample Preparation
المحتوى النشوي ألكثر األغذية ال يمكن أن يقدر مباشرة ألن النشا محتوى ضمن نظام
غذاء معقدة بشكل هيكلي وكيميائيًا .النشا في أغلب األحيان موجود في شكل شبه بلوري (نشا
حبيبي أو متراجع) ،مما يجعله صعب الوصول بواسطة المذيبات الكيميائية المستعملة لتقدير
تركيزه .ولذا من الضروري عزل النشا من المكونات األخرى الموجودة في النظام الغذائي قبل
إجراء التحليل.
في األغذية الطبيعية ،مثل البقول أو محاصيل الحبوب أو الدرنات ،حبيبات النشا عادة تفصل من
المكونات الرئيسية األخرى بالتجفيف ،الطحن ،النقع في الماء ،الترشيح ثم الطرد المركزي .إن
حبيبات النشا غير ذائبة في الماء ولها كثافة عالية نسبيًا ( 15,00كيلوجرام/م ،)3ولذا سوف
تميل إلى االنتقال إلى قاع األنبوبة أثناء عملية الطرد المركزي ،وبذلك يمكن أن يفصل من
المواد الذائبة في الماء والمواد األقل في الكثافة .عينات الغذاء المصنعة عادة تجفف ،تطحن ثم
ترطب بااليثانول الساخن ( . )ethanol %80السكريات األحادية والمحددة قابلة للذوبان في
محلول االيثانول ،بينما النشا عديم الذوبان ،ولذلك ،يمكن أن يفصل النشا من السكريات
بالترشيح أو الطرد المركزي للمحلول .إذا وجد أي نشا شبه بلوري ،يمكن للعينة أن تنشر في
الماء وتسخن إلى درجة حرارة الجلتنة (يحدث تجلتن للنشا) >65م .إضافة حامض
البيروكلوريك perchloric acidأو كلوريد الكالسيوم إلى الماء قبل التسخين يسهالن عملية
ذوبان النشا الذي صعب استخالصه.
طرق التحليل :Analysis Methods
عندما يستخلص النشا فإن هناك عدد من الطرق لتقدير تركيزه:
اإلنزيمات المتخصصة تضاف إلى محلول النشا لتكسير النشا إلى الجلوكوز .ثم يحلل تركيز
الجلوكوز بالطرق المشروحة سابقًا (مثل :الطرق الكروماتوجرافيا واإلنزيمية) .يمكن حساب تركيز
النشا من تركيز الجلوكوز.
اليود يمكن أن يضاف إلى محلول النشا لتكوين معقد من النشا واليود غير الذائب ،والذي يمكن
تقديره وزنيًا gravimetricallyبجمع وتجفيف ووزن الراسب المتكون أو بالمعايرة
titrimetricallyبتقدير كمية اليود الالزمة لترسيب النشا.
إذا لم يكن هناك مكونات أخرى موجودة في المحلول يمكن أن تتداخل مع التحليل .فإن تركيز النشا
يمكن أن يقدر باستعمال الطرق الطبيعية ،مثل :الكثافة ،معامل االنكسار والبوليميتر
.polarimetry
تركيز األميلوز amyloseواألميلوبكتين amylopectinيمكن أن يقدر باستخدام نفس الطرق التي وصفت
للنشا عندما يتم فصل األميلوز من األميلوبكتين .هذا يمكن أن يتحقق بإضافة مواد كيميائية لها القدرة
على تكون معقد غير ذائب مع أحد المكونات ،ولكن ليس مع األخرى ،مثال :بعض الكحول ترسب
األميلوز ولكن ال ترسب األميلوبكتين .بعض الطرق المذكورة سوف ال تقدر تركيز النشا المقاوم
الموجود في العينة .إذا كان تركيز النشا المقاوم مطلوب فإن خطوة إضافية يمكن أن تضاف إلى
الطريقة ،حيث يضاف محلول ( )DMSO( )dimethylsulfoxideلتذويب النشا المقاوم قبل
إجراء التحليل.
قياس درجة جلتنة النشا :Degree of Gelatinization of Starch
عندما تسخن حبيبات النشا في الماء إلى درجة حرارة معينة تنتفخ
حبيبات النشا ،وتفقد تبلورها وتصبح أكثر قابلية للتحلل اإلنزيمي ويزداد
قوامها كثافة ،ويطلق على هذه الظاهرة عملية الجلتنة.
ولقياس الجلتنة يستفاد من الحقيقة العلمية إن هناك إنزيمات يمكن أن تعمل على
النشا المطبوخة وليست لها القدرة على تحليل حبيبات النشا غير
المطبوخة.ويتميز مخلوط إنزيمي البوللوناز pullulanaseوالبيتا أميليز
-amylaseأنها ليست لها القدرة على تحليل حبيبات النشا غير
المطبوخة .أما مع النشا المجلتنة فكال اإلنزيمين لهما القدرة على تحليل
النشا ،فإنزيم البوللوالناز يحطم الرابط 6-1وبذلك يمنع تفرع األميلوبكتين
أما البيتا أميليز فيعمل على السالسل المستقيمة ويحولها إلى مالتوز وتقاس
درجة الجلتنة بقياس كمية السكريات المختزلة المتكونة بعد المعاملة
اإلنزيمية.
المركبات غير النشوية كالصموغ والمركبات الغروية:
Non-Starch Food Gums / Hydrocolloids
تشكل السكريات العديدة باإلضافة للجيالتين (بروتيني األصل) مجموعة مكونات تعرف
بالصموغ الغذائية أو المركبات الغروية .ولذلك للمركبات استخدامات عديدة في منتجات غذائية
كثيرة كاللحوم واللحوم المصنعة ،ومنتجات الشوكوالتة ،اآليس كريم ،والمخبوزات ..الخ.
ومن األهمية بمكان التعرف على تلك المركبات والتيقن من طرق تحليلها لتقدير نقاوتها ،ولضمان
سالمة بيانات البطاقة الغذائية،وللكشف عنها في المنتجات الغذائية التي ال يصرح باستخدامها.
وييصاحب تحليل تلك المركبات مشاكل عديدة ألن لهذه السكريدات العديدة تركيبات كيميائية ،ودرجات
ذوبان ،وأوزان جزيئية متعددة ،كما أن تركيبها غير متجانس ،باإلضافة إلى تباين تركيب نفس
المجموعة بتباين الظروف البيئية ومصدرها النباتي .وهناك من السكريات العديدة أنواع متعادلة
وأخرى أنبوبية ،وبعضها يكون سلسلة مستقيمة واآلخر يكون سلسلة متفرعة ،وتحتوي بعض
السكريدات العديدة على مجموعات إثير ،أو إستر مجموعات أسيتايل حلقية .وتوجد أنواع من
السكريدات العديدة تذوب في الماء البارد ،وبعضها يذوب فقط في الماء الساخن ،ومنها ما يتطلب
ذوبان محاليل أحماض وقلويات ،أما السليلوز على سبيل المثال ،فال يذوب إال بطرق إذابة خاصة
به وتعتمد طرق التحليل على استخالص الصموغ ثم فصلها إلى مكوناتها وبعد ذلك تقدر تلك
المكونات.