Univerzitet u Beogradu

Boban Zarkov

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Seminarski rad na doktorskim studijama

Fiziki fakultet Beograd, 2010

Elektrohemijski senzori i biosenzori

SADRAJ

strana Uvod Tipovi biosenzora Karakteristike biosenzora Metode imobilizacije Elektrohemijski biosenzori Potenciometrijski pretvarai - pH metar Amperometrijski pretvarai - Klarkova elektroda Konduktometrijski pretvarai Biosenzori prve generacije - membrane Biosenzori druge generacije - medijatori, metalizovne elektrode i polimeri Biosenzori tree generacije - elektrode sa ugraenim enzimima Kalorimetrijski biosenzori Optiki biosenzori Literatura 2 6 7 8 9 9 15 17 19 21 23 24 26 28

Uvod
2

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Biosenzori se mogu definisati kao analitiki ureaji koji u sebi ukljuuju bioloki aktivnu komponentu u bliskom kontaktu sa fiziko-hemijskim pretvaraem i procesorom elektronskog signala []. Izraz biosenzor se esto upotrebljava za detekcione ureaje koji imaju za cilj da odrede koncentraciju supstance i drugih biolokih parametara od interesa ak i onda kada ne koriste bioloki sistem direktno. Biosenzori se koriste u irokoj oblasti reavanja analitikih problema u medicini, zatiti ivotne sredine, proizvodnji hrane, industrijskim procesima, sigurnosnoj zatiti i vojnoj industriji. Osobine koje ih ine toliko posebnim i znaajnim u ivotu ljudi su brzina i efikasnost. Naunik koji je prvi izneo ideju o konceptu biosenzora jeste Profesor Leyland D. Clark, koji je 1956 godine objavio rad vezan za kiseoninu elektrodu. Oslanjajui se na dugogodinje iskustvo i veliku elju da proiri oblast telesnih analita koji mogu biti mereni, napravio je prekretnicu kada je na konferenciji u Amerikoj akademiji nauka u Nju Jorku 1962 godine objasnio kako je mogue napraviti elektrohemijske senzore dodavanjem enzimskih pretvaraa umetnutih izmeu dve membrane. Koncept je izveden na eksperimentu u kojem je glukozna oksidaza bila umetnuta i fiksirana na Klarkovu kiseoninu elektrodu korienjem membrana za dijalizu. Smanjenje merene koncentracije kiseonika bilo je prorporcionalno poveanju koncentracije glukoze u uzorku. Kontinualno merenje laboratorijski nepripremljenih uzorka i produkata je bitno u kontroli biohemijskog procesa. Odnedavno mnogi biosenzori imaju razvijene i obezbeene metode za brzo i kontinualano merenje razliitih komponenti. Biosenzor je opte gledano enzim ili elija kojoj je onemogueno kretanje a koja u kombinaciji sa pretvaraem omoguava praenje promena parametara mikrookoline. Sam senzor je obino potopljen u tenost i on je u direktnom kontaktu sa procesom. Biosenzor (slika 1) se sastoji od: 1) bioloki aktivne komponente (enzim, antitelo, elija ...) 2) sistemom koji onemoguava kretanje biolokog sistema 3) pretvaraa (eng. Transducer) koji ima sposobnost da uoenu fiziku ili hemijsku promenu prevede u signal pogodan za obradu 4) ureaja za obradu elektronskog signala

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 1. Shema biosenzora

U blizini odreenog molekula bioloki sistem menja okruenje koju osetljiv merni ureaj registruje kao promenu i alje u signal. Takav signal se dalje moe konvertovati u neki pogodan merni parametar. Biosenzori su specifini jer koriste sistem imobilizacije i omoguavaju naprednu neprekidnu kontrolu merenja. Bioelementi koji se koriste u biosenzorima su najee enzimi i antitela mada mogu biti i mikroorganizmi, organele, elije, tkiva itd. Veliki molekuli proteina koji ubrzavaju hemijske reakcije i do nekoliko miliona puta i iz nje izlaze hemijski nepromenjeni nazivaju se enzimi. Osnovna ideja upotrebe enzima kod senzora jeste da se na enzim poveu molekuli reakcije na koju enzim deluje. Tom prilikom se stvara kompleks sastavljen od enzima i molekula reakcije koji nije dugoroan i iz te interakcije dobijamo sada nove produkte reakcije koje moemo meriti dok enzim izlazi iz reakcije potpuno nepromenjen (slika 2).

Slika 2. Grafiki prikaz interakcije enzima i molekula

Elektrohemijski senzori i biosenzori

U metabolizmu ivih bia enzimi razgrauju hranu, sintetiu hemijske supstance potrebne za normalano funkcionisanje organizma, vre reciklau razgraujui enzime koji vie nisu potrebni itd. Enzimi se takoe svakodnevno koriste u proizvodima kao to su deterdenti za sudove, ve i razne druge kune hemikalije. Do danas je poznato preko 5000 enzima. Nomenklatura enzima nam pomae pri imenovanju ovog velikog broja enzima i po njoj enzimima se daje ime koje se zavrava sa -za a prefiks je hemijska stupstanca koja transformie, odnosno na koju enzim utie. Da bi neki enzim mogao pretvoriti supstancu A u supstancu B a nikada u supstancu C on mora biti u stanju detektovati razliku atomske strukture molekula do na jedan atom. Enzimi se mogu koristiti u istom obliku ali mogu biti prisutni i u mikroorganizmima ili biljnom materijalu bez prethodnog izolovanja. Aktivnost mnogih enzima ukljuuje oksido redukcione reakcije koje mogu biti detektovane elektrohemijskim pretvaraima. Postoji pet glavnih klasa enzima koje emo samo nabrojati. To su oksidoreduktaze, transferaze, hidrolaze, liaze i izomeraze. Prednosti enzima sastoje se u tome to se veoma lako veu za odgovarajui supstrat, to su visoko selektivni i to imaju katalitiku aktivnost (brzo se aktiviraju). Mane enzima ogledaju se u gubljenu aktivnosti posle relativno kratkog vremenskog perioda i za vreme imobilizacije na pretvarau. Jedna od mane jeste i njihova visoka cena kotanja. Druga po upotrebi familija biomolekula jesu antitela. Antitela su proteini iz grupe imunoglobulina koje sintetiu B-limfociti kao odgovor na prisustvo stranog tela u organizmu kao to su virusi, bakterije, implanti i slino. Za razliku od enzima, antitela ne kataliziraju hemijske reakcije ve im je uloga da odreen strani materijal obelee, vrsto vezujui se za njih i na taj nain svojom selektivnou jasno pokau imunolokom sistemu koji antigen treba da bude napadnut i uniten. U praksi ako je antigen prisutan u uzorku, on e biti obavijen antitelom u formi velikog antigen-antitelo kompleksa. To dovodi do promene fiziko-hemijskih parametara (mase ili optikog parametra) u okolini povrine pretvaraa to se manifestuje detektovanjem signala. Prednosti antitela su visoka selektivnost i osetljivost kao i veoma snano vezivanje za antigen. Jedina mana im je to nemaju katalitiki efekat. Vrlo esto koritena metoda za poboljanje selektivnosti jeste prepoznavanje oblika molekula merene veliine (eng. Shape-specific recognition). Takava metoda se obino koristi kod biosenzora koji tako bivaju osetljiviji na odreene molekularne strukture. Prepoznavanje se potpomae filterom (slika 3) koji proputa samo odreene molekularne strukture tako da olakava aktivnom senzoru interakciju sa eljenom merenom veliinom.
5

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 3. Prepoznavanje oblika Upotreba elementa za bioloko prepoznavanje je jedna od osnovnih razlika u unutranjoj strukturi funkcionisanja biosenzora i ostalih hemijskih senzora. Element koji vri prepoznavanje izuzetno dobro prepoznaje molekule koje elimo meriti i to na principu molekularne strukture. Primarna merena veliina povezuje se sa svojim parom koji ima komplementarnu strukturu. Nakon toga se merenje svodi ili na merenje koncentracije novostvorenih parova (eng. Bio-affinity recognition) ili novo stvoreni parovi izazivaju neke od hemijskih reakcija iji e nusprodukti postati predmet merenja (eng. Biometabolic recognition). Selektivnost se unapreuje i koritenjem odgovarajuih enzima ili katalizatora. Njihova uloga je u smanjenju tzv. aktivacione energije, energije potrebne za indukovanje hemijske reakcije. U praksi to znai da e senzor imati mnogo krae vreme odziva to je vrlo traena karakteristika senzora. Prema principu detektovanja odreene veliine senzore je mogue klasifikovati na tri tipa:

Fizike senzore za merenje daljine, mase, temperature, pritiska Hemijske senzore koji mere hemijske supstance hemijskim ili fizikim odzivom Biosenzore koji mere hemijske supstance koristei bioloke detektujue elemente

Tipovi biosenzora
6

Elektrohemijski senzori i biosenzori

ovek poseduje najmanje pet senzora (nos, jezik, ui, oi, prsti) []. Oni predstavljaju glavne tipove senzora. U laboratoriji jedan od najpoznatijih tipova senzora jeste lakmus papir, tester za koncentraciju kiseline odnosno koncentraciju baze koji nam moe dati kvalitativnu indikaciju o prisutnosti ili odsutnosti kiseline. Mnogo precizniji metod za prikaz stepena kiselosti je merenje pH pomou pH metra. To je elektrohemijski ureaj koji daje elektrini odziv koji se moe oitati analogno preko kretnog kalema ili digitalno preko displeja. Prema nainu detektovanja koncentracije analita od interesa senzore moemo podeliti na dva tipa. Prvi su enzim-metaboliki biosenzori koji u sebi ukljuuju upotrebu enzimskih i elijskih elektroda. U reakciji supstrata sa enzimom dolazi do supstrat enzimskog komplaksa koji kao rezultat vraa enzim u izvornom obliku i produkte koji su proizvod reakcija. Kod ovakvog tipa biosenzora meri se odnos potronje substrata i osloboenih proizvoda to se dalje prevodi u kvantifikovani signal. Drugi tip predstavljaju tzv. bioafinitetni senzori koji se baziraju na interakcijama vezivanja imobilizovanih biomolekula i analita od interesa. Bitna karakteristika ovakvog tipa biosenzora je visoka selektivnost interakcija (slika 4). Primeri obuhvataju antitelo-antigen interakcije, nukleinske kiseline za komplementarne sekvence i lektin za eer.

Slika 4. Visoka selektivnost bioafinitetnih senzora

Elektrohemijski senzori i biosenzori

U Tabeli 1 prikazani su najee korieni principi detekcije. U desnoj koloni tablice dati su i tipini predstavnici za svaki princip. Princip Konduktometrin i Potenciometrijski Kapacitivni Amperometrijski Kalorimetrijski Gravimetrijski Optiki Rezonantni Fluorescentni Merenje (fizika veliina) Otpor Napon Kapacitet Struja Toplota / Temperatura Masa Duina putanje / apsorpcija Uestanost Intenzitet Tipian senzor (detektor) Tanko oksidni gasni senzor Jon selektivni FET za pH Polimerni senzor vlage Elektrohemijska elija Pelistorni gasni senzor Piezo elektrini ili SAW senzor Infra crveni detektor za metan Povrinski plazmon Fiber

Tabela 1. Najee koriteni principi detekcije kod biohemijskih senzora

Karakteristike biosenzora
Osobine biosenzora se mogu opisati raznim parametara. Adekvatnim odabirom parametara moemo izabrati eljeni biosenzor koji u potpunosti ispunjava potrebne zahteve. Glavne karakteristike biosenzora najee se mogu opisati navedenim parametrima: Osetljivost - predstavlja odgovor senzora na jedininu promenu koncentracije analita. Selektivnost - je sposobnost senzora da da odgovor na ciljani analit. Visok stepen selektivnosti je najpoeljniji parametar biosenzora. Merni opseg to je onaj opseg merenih koncentracija za koji je osetljivost biosenzora dobra. Ponekad se ovaj parametar naziva dinamiki opseg ili linearnost. Vreme odziva je vremenski interval koji je potreban biosenzoru da registuje 63% maksimalne vrednosti merenog signala za step promenu koncentracije analita. Reproducibilnost - je preciznost sa kojom se moe dobiti izlazni signal sa senzora pri detekciji identine promene koncentracije analita.
8

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Granica detekcije predstavlja najmanju vrednost koncentracije analitaza za koju sistem moe detektovati merenje. Vreme ivota predstavlja vremenski period eksploatacije senzora za koji ne dolazi do znaajnog pada performansi (radnih parametara) senzora. Stabilnost je parametar koji nam pokazuje kako se menja osetljivost u toku vremena za konstantnu vrednost koncentracije analita.

Metode imobilizacije
Povezivanje selektivnih elemenata i njihova imobilizacija sa odgovarajuom elektrodom od velikog su znaaja za ispravan rad biosenzora. Postoji nekoliko naina vezivanja bioelemenata sa elektrodom i to su:

adsorpcijom selektivnog elementa na povrinu kovalentnim vezivanjem mikrokapsulacijom cross-linking-om gde se koristi bifunkcionalni agens da hemijski povee pretvara i selektivnu komponentu zarobljavanjem gde se selektivni element nalazi uhvaen unutar gela, paste, ili polimera

Elektrohemijski biosenzori
Elektrohemijski senzori su najrazvijenija grupa hemijskih senzora []. Prema elektrinoj veliini koju mere mogu se podeliti na: naponske (eng. Potentiometric sensors), strujne (eng.
9

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Amperometric sensor) i senzore koji mere otpor (eng. Conductometric sensor). Zajednika karakteristika im je da koriste posebne elektrode na kojima se odvijaju hemijske reakcije ili dolazi do modulacije prenosa naelektrisanja. Budui da je osnovna pretpostavka delovanja takvih senzora zatvoreno strujno kolo u praksi se koriste dve elektrode od kojih jednu zovemo povratna a drugu radna elektroda. U praksi esto se elektrohemijski senzori nazivaju i elektrohemijske elije.

Potenciometrijski pretvarai - pH metar

Princip rada ovakve vrste senzora zasniva se na merenju napona elektrohemijske elije []. Elektrohemijska elija se sastoji od dve poluelije. Svaku polueliju predstavlja elektroda uronjena u rastvor soli. Na kontaktu elektroda-elektrolit dolazi do spontane hemijske reakcije tzv. redoks reakcije. Redoks reakcije su reakcije razmene elektrona gde dolazi do promene oksidacionog broja supstanci koje uestvuju u procesu oksidacije i redukcije. Oksidacija je proces otputanja elektrona ili poveanja oksidacionog broja supstance. Redukcija je proces primanja elektrona ili smanjenja oksidacionog broja. Redukciona supstanca Red se oksiduje otputajui elektrone a oksidaciona supstanca Ox se redukuje primajui elektrone. Red1 Ox1 + ne Ox2 + ne Red2 Red1 + Ox2 = Ox1 + Red2 Anoda Katoda (1) (2) (3)

Razlikuju se hemijske i elektrohemijske redoks reakcije. Hemijske redoks reakcije se odigravaju u reakcionom medijumu bez posredstva elektroda dok se elektrohemijske redoks reakcije odigravaju iskljuivo posredstvom metalnih elektroda. Koncentracije supstanci koje uestvuju u redoks reakcijama mogu se odrediti merenjem potencijala elektroda uronjenih u rastvore elektrolita. Za neku elektrohemijsku reakciju redukcije: Ox + ne = Red veza izmeu elektrohemijskog potencijala Eox/red i koncentracije nekog redoks para u rastvoru daje Nernstova (W. Nernst) jednaina (4).

E ox/ red = E o x/ red

RT

a red nF a ox ln
10

(4)

Elektrohemijski senzori i biosenzori

gde je: E ox/red RT/F

standardni potencijal elektrohemijske reakcije Konstanta ( R = 8,315 J/mol K; T = 298,1 K ; F = 9,65 104 C/mol; prilikom prelaska sa prirodnog na dekadni logaritam konstanta ima vrednost od 0,059 V ) broj elektrona koji uestvuju u reakciji aktivnost supstance u redukovanom i oksidovanom obliku

n ared i aox

U sluaju kada je koncentracija supstanci manja od 0,1 mol/dm3 aktivnost se moe zameniti koncentracijom:
c 0 ,059 log red n c ox

E ox / red = E / red ox

(5)

Nernstova jednaina omoguava izraunavanje i procenu sledeih veliina bitnih za hemijske i elektrohemijske redoks procese:

izraunavanje elektrohemijskih potencijala izraunavanje koncentracije jona na osnovu elektrodnog potencijala izraunavanje elektromotornih sila procenu tipa elektrohemijske elije odreivanje smera redoks reakcija u elijama odreivanje konstanti ravnotee na osnovu izmerenih EMS elija

Elektrode mogu da budu indikatorske kada potencijal elektrode direktno zavisi od koncentracije jona u rastvoru i referentne koje imaju konstantan potencijal. Indikatorske elektrode su: vodonina (H+-jon), staklena (H+-jon), srebrna (Ag+-jon) i druge. Referentne elektrode su: zasiena kalomelova elektroda, standardna vodonina elektroda, srebro-srebrohloridna elektroda (Ag/AgCl) i druge. Elektromotorna sila E

11

Elektrohemijski senzori i biosenzori

predstavlja

razliku

elektrodnih

potencijala

elektroda

unutar

elektrohemijske

elije.

Elektromotorna sila elije se moe izraunati kao: E = Ekatoda Eanoda (6)

Elektrohemijska elija ili spreg jeste ureaj koji se sastoji od dve metalne elektrode uronjene u rastvore odgovarajueg elektrolita koje su meusobno odvojene polupropustljivim pregradama. Metalne elektrode zajedno sa svojim rastvorima (poluelije) su tako odabrane da je potencijal u jednoj polueliji vii od potencijala u drugoj polueliji. Poluelije su povezane preko rastvora solnim mostom (eng. salt bridge) to je prikazano na slici 5.

Slika 5. Skica elektrohemijske elije Elektrodu na kojoj je potencijal vii zovemo anodom a elektrodu kojoj je potencijal nii nazivamo katodom . Otputeni elektroni anode dolaze na katodu i tamo ponovno redukuju jone katode. Smanjenje jona na elektrodi katode neutralie se jonima suprotnog predznaka iz solnog mosta. Analogno u polueliji katode otputeni joni metalne elektrode u rastvoru predstavljaju viak naelektrisanja koji se neutralie jonima suprotnog naelektrisanja iz solnog mosta. Na taj nain strujno kolo se zatvara.
12

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 6. Merna i referentna pH elektroda Kod potenciometrijskih senzora izmereni potencijal na selektivnoj memembrani ili elektrodnoj povrini koja je u kontaktu sa rastvorom povezan je sa koncentracijom jona u analitu. Potencijal (relativni) se meri pri nultoj struji i prema referentnoj elektrodi. U sluaju merenja pH vrednosti tenosti (negativni logaritam koncentracije vodonikovih jona) merna elektroda se najee realizuje kao staklena elektroda ija membrana proputa samo vodonikove jone (slika 6). Merna elektroda je tzv. jonski osetljiva elektroda koja daje odziv proporcionalan koncentraciji jona koji merimo. Elektrolit unutar staklene kugle merne elektrode je rastvor hloridne kiseline u kojoj je stavljena elektroda od srebra sa prevlakom od srebro hlorida (AgCl). Ono to se eli postii sa takvom mernom elektrodom je da napon koji se javlja izmeu rastvora hlorovodonine kiseline (HCl) i srebrne elektrode bude mali i nepromenjiv. Na taj nain merna elektroda zavisi samo od napona na polupropusnoj membrani koji je odgovor pH vrednosti rastvora, tj. razliite koncentracije vodonikovih jona unutar staklene kugle. Prilikom merenja koncentracija drugih jona moe se razlikovati tip membrane na mernoj elektrodi kao i rastvor u kojoj je potopljena merna elektroda ali krajnji cilj ostaje isti: uiniti napon jonski selektivne merne elektrode zavisan samo od koncentracije merenih jona u rastvoru kvantitativno izraenom Nernstonovom jednainom.
13

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Referentna elektroda se sastoji od vlastitog kuita i elektrolita u koji je uronjena elektroda. U sluaju pH metra to je obino elektroda sa ivom i ivinim hloridom (HgCl2) prikazana na slici7.

Slika 7. Setup mernog sistema potenciometarskog senzora Uslov za konstantnim naponom postavljen je unutar referentne elektrode kao i na mestu dodira referentne elektrode sa tenou iju koncentraciju jona merimo. Za merenje koncentracija jona drugih hemijskih elemenata princip je isti dok se sama realizacija referentne elektrode izmenjena. Merenje pH vrednosti je u sutini utvrivanje stepena kiselosti nekog vodenog rastvora. Kiselost je odreena koncentracijom vodonikovih H+ (OH-) jona. Neutralan rastvor ima podjednaku koncentraciju H+ i OH- iona. Konstanta disocijacije K je definisana na preko jednaine (7):

(7) Kako je koncentracija nedisosovane vode mnogo vea od koncentracije disosovane vode (koncentracije slobodnih H+ i OH- iona) mogue je deljenik izraza u jednaini (7) smatrati konstantnim pa ga takoe staviti pod konstantu Kw koja pri 25C iznosi 10-14 mol2dm-6 prikazano u jednaini (8):
14

Elektrohemijski senzori i biosenzori

[ H+ ][ OH- ] = KW = 10-14 mol2 dm-6 [ H-] = [ OH+ ] = 10-7 mol dm-3 neutralan rastvor (8)

Ovako zapisano, kiselost rastvora se moe odrediti koncentracijom vodonikovih katjona H+ gde je u kiselim rastvorima koncentracija velika ( vea od 10-7) a u baznim mala (manja od 10-7). Iz praktinih razloga se pH vrednost rastvora oznaava eksponentom prema jednaini (9): pH = - log [H+] pH < 7 pH > 7 pH = 7 Iako se oekuje da jon-selektivna elektroda reaguje samo na primarne jone ne postoji ni jedna koja nee reagovati na prisustvo drugih jona. Iz ovoga proizilazi da e u prisustvu interferujuih jona potencijal elektrode zavisiti i od koncentacije primarnih i koncentracije interferujuih jona. Kod merenja glukoze koristimo jodid selektivnu elektrodu. Reakcije koje se deavaju uz prisutvu enzma oksidaze su glukoza + O2 glukozna kiselina + H2O2 (10) + H2O2 + 2 I + 2 H I2 + 2 H2O (11) Jodid-selektivna elektroda prati smanjenje koncentracije jodida to je prouzrokovano dejstvom vodonik-peroksida. kiselo bazno neutralno (9)

Amperometrijski pretvarai Klarkova elektroda

Kod amperometrijskih pretvaraa elektrodni potencijal se dri na konstantnoj vrednosti dovoljnoj za oksidaciju ili redukciju vrste od znaaja []. Ovaj tip senzora meri jainu struje kroz elektrohemijsku eliju uslovljenu koncentracijom merene veliine. Princip merenja sastoji se u proputanju kiseonika iz okoline kroz polupropusnu membranu do same elektrode. Porast vrednosti struje uslovljen koncentracijom proputenog kiseonika kroz membranu rezultat je redoks reakcije u dva koraka: O2+2H2O+2e- H2O2+2OH15

(12)

Elektrohemijski senzori i biosenzori

H2O2+2e- 2OH-

(13)

Kod ovih reakcija prati se potronja kiseonika ili proizvodnja vodonik peroksida. Prvi razvijeni biosenzor bazirao se na korienju kiseonine elektrode. Clark je prouavao redukciju kiseonika na metalnim platinskim elektrodama. U toku rada je doao na ideju da uz povrinu platine postavi enzime koji reaguju sa kiseonikom. Oekivao je da e aktivnost enzima moi pratiti promenom koncentracije kiseonika oko elektrode. Konkretno odabrani enzim je tzv. glukoza oksidaza senzor (GOD). Slika 8 prikazuje pojednostavljeni prikaz delovanja GOD-a.

Slika 8. Princip delovanja GOD-a Glukoza reaguje sa GOD-om i pretvara se u glukoznu kiselinu ali pri tome ostavlja dva elektrona i dva protona redukujui tako GOD. Zatim kiseonik iz rastvora reaguje sa GODom prihvaajui dva protona i dva elektrona i gradi H 2O2 (vodonik peroksid) pa se tako regenerie (oksidirajui) GOD koji je sada ponovno spreman za reakciju s glukozom. Clark je pokazao u svojim eksperimentima da potronja kiseonika zavisi od koliine glukoze. to je bilo prisutno vie glukoze to se troilo vie kiseonika na elektrodama (alternativa je detektovati H2O2 umesto potronje kiseonika budui da je sistem manje osetljiv na promene kiseonika u uzorku). Na taj nain se uspostvila veza izmeu koncentracije glukoze i potencijala Clarkovih elektroda.

16

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 9. Primer Klarkove elektrode [] page 509. Na gornjoj slici prikazan je principijalni izgled Clarkove elektrode. Merna elektroda predstavljena u obliku epa plemenitog metala platine (Pt) i referentna elektroda srebrosrebrohlorida (Ag-AgCl) u obliku ice uronjene su u rastvor kalijum hlorida (KCl). Jaina struje koja protie izmeu elektroda proporcijonalna je koncentraciji analita to je analitiki prikazano jednaom (14): (14)

gde je F-Faradayeva konstanta, A-povrina elektrode, -konstanta membrane, D-difuziona konstanta membrane, p-parcijalni pritisak kiseonika i x - debljina membrane. Produkt reakcije vodonik peroksid (H2O2) se oksiduje na + 650 mV u odnosu na referentnu electrodu. Zbog toga se primenjuje potencijal od + 650 mV i meri oksidacija vodonik peroksida. Ispostavlja se da je jaina struje direktno proporcionalna koncentraciji glukoze (slika 10).

17

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 10. Zavisnost jaine struje od koncentracije glukoze Mana kiseoninih senzora je to su veoma skloni smetnjama od strane spoljanjeg kiseonika. Zbog toga je poeljnije pratiti koncentraciju proizvedenog vodonik peroksida a ne koncentraciju kiseonika koji se troi u reakciji.

Konduktometrijski pretvarai
Kod ove vrste pretvaraa cilj je izmeriti provodljivosti elektrolita u elektrohemijskoj eliji []. U homogenom elektrolitskom rastvoru provodljivost elektrolita G je inverzno proporcionalana duini segmenta elektrolita L du elektrinog polja a direktno proporcionalna povrini poprenog preseka A upravnog na smer polja, jednaina (15):

(15) gde je -specifina provodljivost [-1cm-1] elektrolita povezana sa koncentracijom merenih jona u rastvoru. Prema Kohlarausch-u postoji direktna veza izmeu provodljivosti i koncentracije data jednainom (16) G = G0 c 0,5 (16)

18

Elektrohemijski senzori i biosenzori

gde je -karakteristika elektrolita, G0-provodljivost elektrolita uz upotrebu idealnog rastvora (eng. infinite dilution). Praktino merenja provodljivosti elektrolita vri se upotrebom Wheatston-ovog mosta gde je otpor u jednoj grani mosta zamenjen elektrolitskim rastvorom. Pri merenjima se po pravilu elektrode polarizuju niskonaponskim i niskofrekvetnim strujama. Primena jednosmerne struje za polarizaciju elektroda moe da dovede do elektrohemijskih promena (elektrolize) koja menja prirodu elektroda (modifikuje povrinu) ili dovodi do redoks reakcija koje menjaju sastav i koncentraciju elektrolita. Zbog toga se otpor elektrolita odnosno specifina provodljivost menjaju odmah po ukljuivanju kola jednosmerne struje. Ove promene su vee i bre ukoliko su napon i jaina jednosmerne struje vei a vreme merenja due. Pored toga pri merenju provodljivosti naizmeninom strujom treba obratiti panju na zagrevanje elektrolita ukoliko se upotrebe jae struje. Potrebno je upotrebiti slabije struje polarizacije a eliju ukljuivati samo u toku merenja. Provodljivost elektrolita zavisi pre svega od njegove koncentracije a koncentracija zavisi od stepena disocijacije molekulskog oblika supstance. Prema Ohm-ov zakonu jednaina (17), struja kroz otpornik iznosi: (17) U R Elektrini otpor homogenog provodnika dat je jednainom (18), gde je k - specifini otpor, l
I=

-duina, S - povrina
l S

R=k

(18)

Specifina provodljivost elektrolita data je jednainom (19), gde je C-otporni kapacitet posude, R-otpor.
C R

(19)

Specifina provodljivost elektrolita meri se na udaljenosti od 1cm izmeu elektroda od platina ija je povrina 1x1cm. Otporni kapacitet posude C se uvek odreuje eksperimentalno merenjem otpora elektrolita iju specifinu provodljivost znamo iz rastvora kalijum-hlorida.
19

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Hronoloki gledano moemo napraviti podelu po generacijama na osnovu mehanizma dejstva biosenzora []. Tako je:

prva generacija senzori bazirani na kiseoninim elektrodama druga generacija senzori bazirani na medijatorima trea generacija elektrode sa ugraenim enzimima

Fiziko - hemijskim modifikacijama preduzeti su razliiti pristupi za poveanje selektivnosti detektujue elektrode korienjem membrana, medijatora, metalizovanjem elektroda i upotrebom polimera.

Prva generacija biosenzora

Kao to je pomenuto, prva generacija glukoznih biosenzora je bila bazirana na merenju koncentracije vodonik peroksida na elektrodi []. Elektroda koje su obino od metala ili ugljenika ima ulogu pretvaraa gde tok elektrona moe proizvesti merljivu struju. Ovakvo reenje ima i svojih nedostataka. Kao prvo praenje koncentracije vodonik peroksida zahteva visok radni potencijal. Drugo, nepoeljne bioloki elektroaktivne supstance koje mogu biti zastupljene u okruenju kao to su urin ili druge kiseline mogu reagovati sa elektrodom, prouzrukujui interferenciju u merenju. Kiseonik ima ogranienu rastvorljivost u mnogim biolokim fluidima koji ograniavaju enzimsku reakciju a samim tim i odgovor biosenzora. Unapreene verzije prve generacije biosenzora su razvijene sa zadatkom da odstrane ove efekte. Jedna od primera jeste upotreba ugljenine elektrode presvuene grafitnom pastom u kojoj su dispergovane metalne estice. Za metale kao to su ruthenium, rhodium, platinum i iridium se pokazalo da proizvode poboljanje rezultata u odnosu na standardne uljenine paste i da legure kao to je ruthenijum platina dodatno unapreuju osetljivost biosenzora. Elektrode konstruisane na ovaj nain smanjuju radni potencijal potreban za redukciju vodonik peroksida na elektrodama to eliminie neeljene reakcije drugih elektroaktivnih supstanci koje se nalaze u okolini.

20

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Gore pomenute grafitne paste nanose se na elektrode u obliku meavine grafitnog pudera i meavine organskih tenosti. Kiseonik ima rastvorljivost mnogo puta veu u odreenim organskim rastvaraima nego u vodi i koristei pojedine fluorohemikalije kao meavinu tenosti za grafitne paste dobijamo poboljanje odziva biosenzora prve generacije do take gde su mogu porediti sa biosenzorima druge generacije po karakteristikama. Organske tenosti takoe poveavaju stabilnost biosenzora tokom dugog vremenskog perioda a posebno termostabilnost. Razlog za to jeste to su enzimi zarobljeni unutar organske tenosti mnogo stabilniji nego kada su potopljeni u vodi. Dehidrirani enzimi imaju veoma krutu konfiguraciju i u kontaktu sa slobodnim molekulima vode dolazi do deaktivacije enzima. Ovakvo poboljanje biosenzora dovelo je do njihove masovne proizvodnje i primeni u razliitim aplikacijama. Membrana je tanak polupropusni film koji omoguava izdvajanje odreenih komponenti iz tene faze rastvora jer deluje kao selektivna barijera za transfer suspendovanih i rastvorenih materija. Koja e materija biti proputena a koja nee zavisi od fiziko-hemijskih karakteristika te materije i od dimenzija pora i elektro-hemijskih svojstava membrane. Vano je uoiti da membrana nije pasivna ve funkcionalna barijera transferu rastvorenih supstanci ija propusnost zavisi od fiziko-hemijskih interakcija izmeu membrane i rastvorenih materija. Razvijene su razliite permiselektivne membrane koje kontroliu vrste koje stiu do elektrode na bazi naelektrisanja i veliine. Tako na primer upotrebom membrane od celuloze acetata moemo kontrolisati i naelektrisanje i veliina proputene materije, nafionom samo naelektrisanje dok membranom od polikarbonata samo veliinu. Nedostatak membrana prilikom upotrebe je njihov veliki uticaj na difuziju.

Druga generacija biosenzora

Druga generacija biosenzora pokuala je izbei nedostatke i ogranienja ureaja prve generacije zamenom kiseonika sa spoljanjim posrednikom elektron akceptorskim molekulom koji je u stanju da prenese elektron od enzima do pretvaraa []. Problem sa malom rastvorljivou enzima i fluktuacijom nivoa kiseonika izbegnut je primenom ove generacije biosenzora. Ostali nedostaci su ostali prisutni, biosenzori su jo uvek osetljivi na prisustvo
21

Elektrohemijski senzori i biosenzori

kiseonika iz supstanci u okruenju koji interferira sa merenim nivoom kiseonika u analitu. Drugi nedostatak je to je veina mediatora veoma toksina pa ograniava primenu merenja in vivo. Mnogi oksidaza enzimi mogu da koriste vetake elektron akceptorske molekule koji se nazivaju medijatori. Medijator je niskomolekulski redoks par koji moe da prenese elektrone sa aktivnog mesta enzima na povrinu elektrode i na taj nain da uspostavlja elektrini kontakt izmau njih. Ovi medijatori imaju irok opseg struktura a samim tim i osobina, ukljuujui i opsege redoks potencijala. Kao medijatori se koriste katjoni prelaznih metala i njihovi kompleksi. Jedan od boljih medijatora je ferocen (Fc) sendvi kompleks gvoa i dva ciklopentadienil (Cp) anjona. Princip dejstva medijatora na bazi ferocena sa odgovarajuim hemijskim reakcijama jednaine (20), (21) i (22) dat je na slici 11.

Slika 11. Princip dejstva medijatora na bazi ferocena glukoza + GODOx glukonolakton + GODR + 2H+ GODR + 2Fc+ GODOx + 2Fc 2Fc 2e- 2Fc+ Dobri medijatori kao to je Ferocen bi trebalo da:

(20) (21) (22)

brzo reaguju sa enzimima

22

Elektrohemijski senzori i biosenzori

reverzibilno izvode transfer elektrona imaju mali nadpotencijal pri regeneraciji da su nezavisni od pH vrednosti stabilni i u oksidovanom i u redukovanom obliku ne reaguju s kiseonikom nisu otrovni

Svrha korienja metalizovanih elektroda je u tome da se steknu uslovi pri kojima se oksidacija enzimski generisanog H2O2 moe postii na niem primenjenom potencijalu stvarajui jako osetljivu katalitiku povrinu. Pored toga smanjujui efekat smetnji zbog nieg primenjenog potencijala odnos signal-um raste zbog poveanja elektrohemijski aktivne povrine. Metalizacija se postie taloenjem odgovarajueg plemenitog metala na stakleno ugljeninu elektrodu korienjem cikline voltametrije. Uspeni rezultati postignuti su sa nekoliko plemenitih metala kao to su platina, paladijum, rodijum i rubidijum od kojih se najvie moe oekivati.

Slika 12. Zavisnost odgovora detektora od potencijala Glass Carbon elektrode (ne katalizuje oksidaciju H2O2 )

Slika 13. Zavisnost odgovora detektora od potencijala Metalizovane Glass Carbon elektrode

Identino kao i membrane, polimeri imaju ulogu da spree ometajue vrste da stignu do povrine elektrode i izvedu diferencijaciju na osnovu veliine i naelektrisanja. Polimeri koji se najee koriste u praksi su: polipirol, politiofen, polianilin, diaminobenzen i polifenol.
23

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Trea generacija biosenzora - Elektrode sa ugraenim enzimima

Trea generacija biosenzora realizovana je u direktnoj vezi izmeu enzimske reakcije i pretvaraa bez potrebe za difuzijom stim to je enzimima onemogueno kretanje na samoj elektrodi []. Na ovaj nain moe se na lak nain neprekidno meriti nivo glukoze u krvi bez potrebe za unoenjem bilo koje supstance u analit od interesa. Direktna veza izmeu enzima do elektrode moe biti postignuta tzv. elektrinim vodom (eng. Wiring) preko nosioca elektronskog prenosa kao to je dugolanani polimer. Prilikom hemijskih reakcija ne dolazi do redukcije ili oksidacije enzima direktno na elektrodi ime se spreava gubitak enzimske aktivnosti. Kod ove visoko tehnoloke generacije biosenzora neophodno je ugraditi medijator zajedno sa enzimom u elektrodu. U tom sluaju ne dolazi do redukcije ili oksidacije enzima direktno na elektrodi ime se spreava gubitak enzimske aktivnosti.

Kalorimetrijski biosenzori
Mnogo katalitikih enzimskih reakcija je egzotermno. Osloboena energija u vidu toplote moe biti iskorienja kao osnov za merenje brzine reakcije i koncentracije analita. Ovo predstavlja najoptiji tip primenjenih biosenzora koji se zovu kalorimetrijski biosenzori. Promena temperature obino je odreena vrednostima otpora na termistorima koji se nalaze na ulazu i izlazu male cilindrine kapsule u kojoj se nalazi imobilizovani enzim. Kapsula je temperaturno izolovana od okruenja. Pod tako strogo kontrolisanim uslovima moe se registrovati ak 80% proizvedene toplote prilikom protoka jedininog uzorka kroz zapreminu kapsule. Promena temperature moe se kvantitativno izraunati promenom entalpije izolovanog sistema. Ako 1 molM reaktanta kompletno bude prevedeno u produkt reakcije proizvodei pri tome 100 KJ/mol onda svaki mmolM proizvodi 0,1 J toplote. Sa 80% efikasnosti to e prouzrokovati promenu temperature u konanom iznosu od aproksimativno 0,02 C. Da bi kalorimetrijski biosenzor bio upotrebljiv, mora ispuniti uslov da rezolucija promene temperature bude reda 0,0001 C.
24

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Reaktant Cholesterol Esters Glucose Hydrogen peroxid Penicillin G Peptides Starch Sucrose Urea Uric acid

Enzim Cholesterol oxidase Chzmotrypsin Glucose oxidase catalase Penicillinase Trypsin Amylase Invertase Urease uricase

Koliina toplote kJ/mole 53 4-16 80 100 67 10-30 8 20 61 49

Tabela 2. Detektovana promena toplote za razliite reaktante i odgovarajue enzime

Slika 14 Shematski dijagram kalorimetrijskog biosenzora Na slici 14 vidimo kako uzorak (a) protie kroz spoljnji temperaturni izolator (b) do izmenjivaa toplote (c) unutar aluminijumskog bloka (d). Odatle, reaktant prolazi kroz referentni termistor (e) i enzimsku kapsulu ( zapremine 1 ml ) koja sadri biokatalizator u kojoj se odvija reakcija. Promena temperature odreuje se preko termistora (g) a preko izlaznog
25

Elektrohemijski senzori i biosenzori

otvora (h) reaktant naputa merni ureaj. Spoljanja elektronika (i) odreuje promenu opora, odnosno promenu temperature meu termistorima. Termistori se koriste za detekciju promene temperature tako to im elektrina provodnost, odnosno otpornost zavisi od temperature po sledeoj zavisnosti: =B (23)

Gde su

R1 i R2 otpornosti termistora na apsolutnim temperaturama T1 i T2 dok je B

karakteristina temperaturna konstanta termistora. Kada je promena temperature veoma mala kao u navedenom sluaju B << 1 i datu relaciju moemo uprostiti. Uzimajui

aproksimaciju kada je x<<1 da je ex >> 1+x ; x je ovde B R1=R2

(24)

Relativno smanjenje eletrine otpornosti termistora proporcionalno je poveanju temperature (T). Tipina konstanta propocionalnosti je . Promena otpornosti prevodi se pomou

balansiranog Wheatstone-ovog mosta u propocionalnu promenu napona.

Optiki biosenzori
Optiki biosenzori se baziraju na detekciji promene optikih karakteristika (apsorpcija, emisija, polarizacija, indeks prelamanja) odreenog dela spektra zraenja. Princip rada sastoji se u prostiranju svetlosti odreene talasne duine kroz merni uzorak usled ega dolazi do promena optikih karakteristika svetlosti. Imamo dve metode detekcije: direktnu i indirektnu (eng. competetive binding). Kod direktne metode merena veliina i senzorski materijal se vezuju u parove ili nusprodukte koji su dalje odgovorni za promenu neke od optikih karakteristika. Indirektna metoda opisuje postojanje tzv. analognih molekula koji pre izlaganju svetlosti grade parove sa senzorskim materijalom. Kada se takav par sada izloi dejstvu svetlosti odreene talasne duine dolazi do raskidanja veza izmeu parova analognih molekule i senzirajueg materijala i na mesto analognih molekula dolazi merna veliina. To znai da porast slobodnih analognih molekula, menja optike karakteristike upadne svetlosti (slika 15).
26

Elektrohemijski senzori i biosenzori

U veliini tih promena se nalazi informacija o koncentraciji merene veliine jer je ona direktno odgovorna za stvaranje slobodnih analognih molekula.

Slika 15. Optiki senzor - indirektna metoda Na slici 16, prikazan je principijalna shema optike detekcije CO2 pomou foto otpornika. Fotootpornici koji su deo Wheatsonovog mosta izloeni su dejstvu infracrvenog zraenja. Kada se izmeu izvora zraenja i fotootpornika nae molekul CO 2 dolazi do apsorpcije zraenja to se manifestuje kao neravnoteno stanje mosta. Razliit intenzitet svetlosti koji se detektuje na fotootporniku, proporcionalan je koliini apsorbovane svetlosti odnosno koncentraciji CO2.

27

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 16. Optika detekcija CO2 Optiki senzori nude odreene prednosti u odnosu na elektrohemijske senzore. Nije potrebna referentna elektroda (koristi se referentni nivo svetlosti). Optiki kablovi su imuni na elektronski um ali su jako osetljivi na svetlost okoline. Mogue je izvesti viestruko merenje vie veliina na razliitim talasnim duinama. Mana im je relativno usko podruje linearnosti (dva reda veliine koncentracije) u odnosu na elektrohemijske senzore kao i cena.

Literatura:
1. Advances in Biosensors, Volume 5, Elsevier Science B.V. Chapter 1, pages 1-

36, Designing a simple biosensor, P.Shantilatha, Shailly Varma and Chanchal K. Mitra 2. B.Eggins, Chemical sensors and biosensors,Wilay, 2006
3. Handbook of modern physics, Jacob Fraden, Chapter 17, Chemical sensors,

page 499-530
4. ELEC3042 Introduction to Nanobiotechnology, Assignment: The Glucose

Biosensor, Michael Ball

28