Univerza v Ljubljani

Fakulteta za farmacijo
Katedra za farmacevtsko kemijo

VLOGA PROTEINSKE
KRISTALOGRAFIJE V
ODKRIVANJU UČINKOVIN
Mentor:
prof. dr. Danijel Kikelj, mag. farm Skupina:
Metka Ašič
Sonja Balažek
Maja Bartol
Tjaša Bedene
Eva Bizjak
Tina Bedič
Urban Bernat
Nina Blagovič
RAZVOJ IN NAČRTOVANJE NOVIH UČINKOVIN NA
PODLAGI 3D STRUKTURE

 CILJ: ustvariti ligand, ki se z veliko afiniteto veže na proteinsko tarčo

 Identifikacija biološke tarče

 Razvoj učinkovine, ki se na tarčo veže, modulira njeno aktivnost in ima

hkrati sprejemljiv profil neželenih učinkov
RAZVOJ IN NAČRTOVANJE NOVIH UČINKOVIN NA
PODLAGI 3D STRUKTURE

 RENTGENSKA KRISTALOGRAFIJA:
 Najbolj razširjena tehnika za določanje 3D strukture bioloških
makromolekul
 Omogoča pridobivanje številnih strukturnih podatkov
 Rentgenska kristalografija visoke zmogljivosti
 Krajši čas za kreiranje kristalnih struktur
 Iskalna tehnika pri rešetanju (screening)
KRISTALOGRAFIJA NEKOČ IN DANES

 NEKOČ:
 “krvni kristali” – Hünefeld (l.1840)
 Prikaz molekularne narave encimov in virusov
 Difrakcijski podatki DNA, narejeni z rentgensko difrakcijsko metodo
 Določitev strukture mioglobina in hemoglobina (Kendrew in Perutz)
 DANES:
 50 000 kristalnih struktur dostopnih preko “Protein Data Bank”
 Možna raziskava proteinov, ki se slabo obnašajo in jih je težko pridobiti
v kristalni strukturi
PRISPEVKI PROTEINSKE KRISTALOGRAFIJE
PRI ODKRIVANJU ZDRAVIL

 Prva proučena zdravila z rentgensko kristalografijo: zdravila za zdravljenje

anemije srpastih celic
 Prvo odobreno zdravilo: DORZOLAMID - inhibitor ogljikove anhidraze II
(zdravljenje glavkoma)
 Drugo odobreno zdravilo: OSELTAMIVIR (Tamiflu)-inhibitor nevraminidaze
virusa gripe (zdravljenje ptičje gripe)
 Inhibitorji proteaze HIV-1 (največja skupina)
 Inhibitorji kinaz
KRISTALIZACIJA (tvorba proteinskih kristalov)

CILJ: dobiti 3D kristalno strukturo proteinov

Molekule v kristalu so simetrično razporejene in orientirane v enaki smeri→
kristali delujejo kot ojačevalec → dovolj velika intenziteta sipanih rentgenskih
žarkov, da jih lahko izmerimo.

PRI IZVEDBI KRISTALIZACIJE MORAMO UPOŠTEVATI:

- predpisane kristalizacijske pogoje
- kemijsko in konformacijsko čistost/homogenost
- ustrezen pH, ionsko moč
- količino proteinskega vzorca (5-10mg)
- topnost proteina
- strukturo proteinov (čim manj kompleksnih zaporedij v proteinu; odstranitev
dolgih, nefunkcionalnih zank; čim manj posttranslacijskih sprememb)
Proteinski kristali nastanejo s prenasičenjem raztopine proteinov
(supersaturacija). To lahko dosežemo na več načinov:

- z obarjalnimi sredstvi (anorganske soli ((NH4)2SO4), organska topila, linearni

polimeri (PEG))
- sprememba T, pH
- metoda parne difuzije (viseča, sedeča kapljica)
- kristalizacija z oljem
- kristalizacija v agaroznem gelu, v kapilarah…
METODE PARNE DIFUZIJE (viseča kapljica)

1. Standardni postopek:
• kapljica raztopine proteina + kristalizacijski
pufer (razmerje 1:1)
• kapjico prenesemo v rezervoar s kristalizacijskim
pufrom
• koncentracijski gradient → prehod vode iz kapljice
→↑c proteina v kapljici→ supersaturacija,obarjanje

2. “Soaking” oz. namaknje

• priprava konc.razt.liganda (50-100mM) v DMSO

• redčenje s pufrom (0,5-5,0mM)
• namakanje proteinskih kristalov v razt. liganda→
difuzija liganda v notranjost, vezava na aktivno
mesto
3. Kokristalizacija, standardni postopek
• mešanje presežka liganda s proteinom → nastanek kompleksa
protein-ligand
• kadar kristalizacija poteče dovolj hitro

4. Kokristalizacija, metoda “ligand-fishing”

• velik presežek liganda

• kadar so ligandi zelo slabo topni v kristalizacijskem pufru
• dlje časa, večja količina reagentov
PROTEINSKA KRISTALOGRAFIJA (poskus)
 80-110 K
 zanka iz najlona
 tekoči dušik
 krioprotektant (glicerol, nizkomolekularen PEG, soli).

 Oprema:
-goniometer (tj. naprava, ki nadzira
vrtenje kristala pri temperaturi 80-110K
in prepihavanju s suhim dušikom)
-vir X-žarkov (rotirajoče anode ali
sinhrotronsko rentgensko žarčenje)
-detektor (IP ali CDD)
-računalnik
SVETLOBNA MIKROSKOPIJA IN
RENTGENSKA KRISTALOGRAFIJA
 iste osnove, a je praktična uporaba različna zaradi različnih lastnosti obeh valovanj
(mikroskop - leče!, kristalografija - ni leč, rentgenski difraktometer posname odbite
žarke in z pomočjo računalniške opreme prikaže povečano sliko vzorca)

Braggov zakon
Žarek pade pod kotom φ in se pod tem
kotom tudi odbije. Razlika v poti, ki jo
opravita žarek 1 in 2 je 2dsinφ = nλ.
(ali 2l). Intenziteti žarkov se seštejeta, ko
je razlika v poti 2l = nλ. Objekti na
Braggovi ravnini sipajo v fazi, tisti vmes
pa iz faze.
 Cilj je opisati porazdelitev elektronov okoli enega atoma (Fourierjeva
transformacija)! Potrebno poznavanje amplitud (izmerimo) in faz (»phase
problem«). Problem se reši z uporabo sledečih tehnik:
 MIR (multiple isomorphus replacement)
 Anomalno sipanje (AS),
 Molekularna zamenjava

Postavljanje modela
 izpeljava modela iz mape elektronske gostote (Fo-Fc, 2Fo –Fc) → model
proteina → izboljševanje modela (“refinement”) → optimalna struktura
proteina
INFORMACIJE V KRISTALNI STRUKTURI

MAJHNA MOLEKULA PROTEIN

 Dolžina vezi  Nižja resolucija

 Razlikovanje med atomi  Ne opazimo molekul
 Torzijski koti topila
 Ne razločimo atomov in
vezi
VPLIVI NA KAKOVOST SLIKE ELEKTRONSKE
GOSTOTE

 RESOLUCIJA
 POPOLNOST PODATKOV
Ne upoštevamo vseh ojačitev

 R-SYM
razlike pri istih ojačitvah pri ponavljajočih meritvah
KAKOVOST MODELA

Iz elektronske gostote dobimo neko strukturo proteina, ki jo

primerjamo s postavljenim modelom z izračunom faktorjev:

 R-faktor
 Prosti R-faktor
 Odstopanja od idealnih
dolžin kotov in vezi
 Ramachandranov
diagram
NAPAKE V KRISTALNI STRUKTURI
Ko analiziramo proteinski kristal z rentgensko kristalografijo
so pogoste napake, ki vplivajo na različne strukture:

1. NA PROTEINSKI MODEL
 Nezmožnost oblikovanja “nereda”
 Ne zaznamo H atomov in ne ločimo med posameznimi
vrstami atomov

2. NA LIGAND
 Nejasna orientacija ligandov

3. NA MODEL TOPILA
 Identifikacija molekul “vode”
FLEKSIBILNOST

 Delno je fleksibilnost ohranjena tudi v kristalni strukturi

 Fleksibilni deli imajo visoke temperaturne B-faktorje in so
zato v elektronski gostoti slabo definirani oz. sploh niso
 Takšne dele postavimo v konformacijo z najnižjo energijo
ali jih izbrišemo

Primer so stranske verige

Asn, Gln,Glu in Lys
 LAŽNO POZITIVNI LAŽNO NEGATIVNI
REZULTATI REZULTATI

 Namesto liganda vezane  Majhna afiniteta ligand-protein

druge molekule
(npr. molekule pufra)  Protein-protein interakcije

 Izvajamo meritve brez liganda  Pogoji kristalizacije: pH, konc.

ali samo z ligandom da vidimo Soli, glicerol, PEG
razliko
 Slaba topnost molekul pri
uporabljenih pogojih
PRAKTIČNA UPORABA 1. IDENTIFIKACIJA
TARČE:
 Novo-odkrite tarče:
I. Strukturni genomski
• hitra identifikacija, pristopi (3-D analiza strukture
proteina)
• razumna selekcija, II. Strukturni kemijsko-biološki
• ustrezna validacija. pristopi
 Klasika: znana tarča-iščemo
učinkovino;
 alternativa: znana aktivna
učinkovina-iščemo tarčo →
screening, reverse docking in
docking algoritem
2. VALIDACIJA TARČE
 Kemijska genetika: katera
tarča bo sprožila želen
farmakološki efekt →
ustvarjanje proteinskih
mutantov, posebej občutljivih
za določene inhibitorje
 Določanje vloge proteina in
validacije tarčnih učinkovin
3. SELEKCIJA TARČE
 TARČA:
 Protein (mesto vezave!)
 Molska masa vezane molekule do 500
Da
 Ustrezna lipofilnost (logP < 5)
 Potencial tvorbe H-vezi (manj kot 5
akceptorjev in manj kot 10 donorjev H-
vezi)
 Alosterična mesta in različne strukturne
konformacije – problematično iskanje
učinkovin
 Jakost in selektivnost: z optimizacijo
liganda
RENTGENSKA KRISTALOGRAFIJA VISOKE
ZMOGLJIVOSTI (High throughput X-ray crystallography)

 Proces določevanja kristalnih struktur kompleksov

protein-ligant se je avtomatiziralčas analize se je
skrajšalveliko več struktur določenih

 Ekspresija, čiščenje in karakterizacija: največ časa

 AK zaporedjedoločitev domen primernih za ekspresijo

 Se zvija samostojno, je topen
 Brez nefunkcionalnih zank
 Ćim manj posttranslacijskih modifikacij
 Ekspresijski sistem najpogosteje E. coli

 Čiščenje: Histidinski repekafinitetna kromatografija

 Kristalizacija: dobro poznavanje pogojev kristalizacije

manj proteina potrebnegaustrezni kristali v tekočem
dušiku meritve elektronska gostota

 Cilj: avtomatizacija interpretacije elektronske gostote

 Prihodnost: celoten postopek določevanja 3D strukture

robotiziran
 ISKANJE ZADETKOV (HIT) IN SPOJIN VODNIC
(LEAD)

STRUCTURE-BASED DE NOVO DRUG DESIGN

(strukturno podprto de novo načrtovanje učinkovin)

 Osnova je interakcija med ligandom in tarčo

 Računalniški program poišče molekule, ki tvorijo z aktivnim mestom tarče

najugodnejše interakcije

 Kandidatov za učinkovine je zelo veliko, zato je pomemben prispevek pri

iskanju znanje posameznih raziskovalcev, ki zožijo nabor potencialnih
učinkovin

 Primeri učinkovin odkritih z de novo : inhibitorji HIV-1 proteaze in HIV-1

reverzne transkriptaze
IN SILICO SCREENING

 Virtualno rešetanje visoke zmogljivosti (»high-throughput docking«, HTD)

 Algoritmi za napovedovanje možnih načinov vezave ligandov

 Učinkovitost HTD-ja je sorazmerna s količino in kakovostjo strukturnih

informacij, ki so na voljo za tarčo

 Pomembno je, temeljito razumevanje ustreznih konformacijskih stanj

receptorja, in da so vezavna mesta »hot spots« identificirana

 Pomanjkljivost metode: plastičnost receptorja

 Prednost metode: visoka zmogljivost, nizki stroški, vsestranskost

 Primeri učinkovin odkritih s HTD: inhibitorji ß-laktamaz in kinaz

FRAGMENT-BASED SCREENING –FBS
(rešetanje na osnovi fragmentov)

 Pristopi iskanja s fragmenti zahtevajo znatno manj spojin za

rešetanje in sintezo

 Izhodiščni fragmenti imajo nizko molekulsko maso

 Rentgenska kristalografija se uporablja za določitev fragmentov, ki

naj bi jih vseboval inhibitor in za natančno določitev interakcije med
fragmentom in proteinom

 Primeri učinkovin odkritih s FBS: inhibitorji urokinaze

OPTIMIZACIJA SPOJINE VODNICE
Tarčni encim Aktivno mesto

Razpoložljiv prostor Vodnica Optimalnejša struktura

Proteinska kristalografija razkriva:

 Strukturo in fiz.-kem. lastnosti tarče
 Biološko aktivno konformacijo spojine vodnice
 Intramolekularne interakcije znotraj kompleksa
OPTIMIZACIJA SPOJINE VODNICE
 Vezava liganda
Proteinska kristalografija ne kaže prave slike kompleksa protein-ligand.
Vezavo liganda na protein lahko bolje razložimo z encimsko kinetiko in FBS

 Optimizacija učinkovitosti
Dober začetek za optimizacijo so majhni fragmenti z veliko učinkovitostjo.
Za povečanje učinkovitosti je potrebna identifikacija interkacije v vezavnem
mestu z FBS

 Optimizacija selektivnosti
Selektivnost lahko dosežemo z izkoriščanjem vezavnih mest, ki so blizu
glavnemu vezavnemu mestu, a ne vplivajo na delovanje biološke tarče

 Optimizacija ADME lastnosti

Pravilo Lipinskega oz. pravilo petic
PRIMERI: ALISKIREN

 substratna selektivnost in ključna vloga v RAAS sistemu razlog številnih

raziskav inhibitorjev renina

 prva struktura humanega renina leta 1989, kmalu zatem tudi struktura
kompleksa z inhibitorjem


sledi odkritje velikega števila inhibitorjev, peptidomimetikov

 problem strukture prvotnih inhibitorjev rešili s pomočjo proteinske

kristalografije, podprte z računalniško simulacijo
PRIMERI: IMATINIB

 razvoj inhibitorjev protein kinaze na ATP vezavnem mestu dolgo

nepremostljiva ovira zaradi kompleksne strukture le-te

 struktura Abl kinaze v kompleksu z imatinibom leta 2000


po imatinibu plaz novih raziskav rezultira v odkritju nilotiniba