Uvod v mikrobiologijo – osnovni koncepti in področja preučevanja

Molekularna biologija je nastajala vzporedno z biokemijo ter genetiko. Ugotovli so, da se geni
prevajajo v proteine.

»One gene – one enzyme« ~Beadle & Tatum, 1941

Velja za začetek molekularne biologije, čeprav se je ta začela že prej.

Ljudje niso vedeli, da DNA prenaša dedne informacije. Mislili so, da to funkcijo opravljajo
proteini, in da se DNA napiše iz njih, ne pa obratno.

Teza ni bila ustrezna, saj so nekateri encimi

sestavljeni iz več podenot. Torej je en gen del
(DNA), ki narekuje verigo enega polipeptida.

DEDNI MATERIAL

NUKLEINSKE KISLINE
Nukleinske kisline so polimeri nukleotidov, in sicer
dveh tipov:

● dezoksiribonukleinska kislina (DNA)

● tri vrste ribonukleinskih kislin: ribosomalna
rRNA, informacijska mRNa, prenašana tRNA

Dva nukleotida med seboj povezuje

FOSFODIESTRSKA VEZ (2x zaestren fosfor). Te
povezave so med 3'-C enega in 5'-C drugega nukleotida. S tem je določena smer poteka
verig nukleinskih kislin. Podaljševanje verige poteka na 3' koncu. Pri tem se hidrolizirala dve
fosfatni vezi, saj se prihajajoči nukleozid tri-fosfat
pirofosfatno razcepi (anhidridna vez se pretrga) in
hkrati esterificira (nastane energijsko nižja estrska
vez).

DNA
DNA molekule so temeljne informacijske molekule
v živem svetu, ki iz roda v rod ohranjajo
identičnost vrst.

DNA je dvojna, komplementarna in antiparalelna

vijačnica, pri kateri so baze v notranjosti, sladkorji
in fosfati pa na površini. 3D strukturo molekule
DNA omogočajo vodikove vezi med ustreznimi
pari baz sosednjih verig, hidrofobne interakcije
med sosednjimi bazami iste verige in na površini
elektrostatski odboji disociiranih fosfatnih skupin.

1
Zato je molekula DNA rigidna, v
raztopini zelo viskozna molekula.

Pri vzdrževanju nativne konformacije

molekule DNA sodelujejo tudi
molekule vode. Dehidracija povzroči
drugačno konformacijo (B, A, Z).

KOMPLEMENTARNOST DNA

Vedno sta komplementarni purinska

baza v eni verigi in pirimidinska baza v sosednji verigi. To je sterično in strukturno pogojeno.
Komplementarna sta A—T in C—G.

Zaporedje nukleotidov v eni verigi je lahko poljubno, po principu komplementarnosti je

zaporedje na nasprotni verigi avtomatično določeno.Zaradi načela komplementarnosti se
DNA molekule podvojujejo semi-konservativno. To pomeni, da se dvojna vijačnica razpre in
ob vsaki verigi se vgradi nova. Vsaka hčerinska celica ima zato polovico molekule od
starševske, druga polovica pa je nova.Encim HELIKAZA razpre DNA na mestu ORI in tako
nastanejo podvojevalne vilice. Na vodilno verigo se na začetku veže PRIMER RNA, katerega
sintetizira encim primaza. Prepis se nadljuje s pomočjo encima DNA polimeraza, ki
podaljšuje verigo DNA. Deluje samo v smeri 5' proti 3' koncu (encimi delujejo samo v eno
smer).

Zastajajoča veriga nastaja po fragmenih imen. OKAZAKIJEVI FRAGMENTI. Najprej nastaje

RNA primer, nato pa DNA polimeraza podljšuje verigo. Polimeraza 2.reda zamenja RNA
nukleotide z DNA nukleotidi. Nastale fragmente LIGAZA zlepi skupaj. GIRAZA omogoča
zvijanje DNA.

DNA molekule lahko tvorijo tudi drugačne, manj stabilne, 3D strukture, pri katerih
sodelujejo spremenjene baze, nenavadne baze ali pa se nenavadno parijo.

2
3
SUPERZVITJE

DNA molekule se v celicah kompaktno

pakirajo s pomočjo različnih beljakovin
(histoni).

DENATURACIJA DNA

Raztopina DNA je izpostavljena ekstremnemu

pH in T nat 80, viskoznost pade, pride do
fizikalnih sprememb, razlitje vodikovih vezi,
razpad na dve enojni verigi (popolnoma ali
delno), kovalentne vezi se ne pretrgajo.

Tališče molekule DNA (Tm) je T, pri

kateri se absorbnost njene raztopine pri 260
nm poviša na polovico maksimalne
(hiperktomni efekt). Odvisno je od vsebnosti
baznih parov C—G.

RENATURACIJA DNA

Je hiter enostopenjski proces, dokler je

delna denaturacija. Če sta vijačnici popolnoma
ločeni, poteka v dveh stopnjah:

1. (počasna) vijačnici se s slučajnim srečanjem najdeta in tvorita kratek segment

komplementarnega dvojnega heliksa
2. (hitra) ustvarijo se pari med
bazami, vijačnici se do konca
združita

RNA

So enoverižne molekule, ki se
prostorsko zvijejo v stabilnejše
konformacije. Pri tem lahko sedelujejo tudi
beljakovine.

4
rRNA

Sestavljajo ogrodje ribosomov (60% njihove mase). Na to ogrodje se vežejo beljalovinske

molekule, enojno verižna rRNA pa tvori predele dvojne vijačnice, ločene z zankami.

mRNA

Je enoverižni prepis DNA, ki nosi direkten zapis za zaporedje AK v beljakovinski molekuli.

Zaščitene so z beljakovinami ali pa vezane v ribosomih (polisomih). Nezaščitene se hitro
razgradijo. Prepisovalna stopnja je zato, da je DNA čim krajši čas izpostavljena.

tRNA

Ima 3D strukturo v obliki črke L in zato ima več zank, s katerimi tvori interakcije, ki ji
omogočajo opravljanje izredno pomembne prevajalne funkcije. V zankah so atipične baze
(dihidrouridin, pseudouridin) zato, da na teh mestih ne pride do parjenja.

AK se veže v aktivni obliki (ak-AMP) na 3' OH konec specifične tRNA. tRNA je adapterska
molekula, ki prinaša na ribosom ustrezno AK ob pravem času. Prevajanje pomeni odraz
zaporedja nukleotidov v zaporedje AK v beljakovini. Molekule tRNA z lastnim zaporednjem
treh nukleotidov (antikodon) spoznavajo zaporednje treh nukleotidov na mRNa s pomočjo
okolja v ribosomu.

Princip prepoznavanja TRIPLETA BAZ imen. GENETSKI KOD, ki je univerzalen za živi

svet.Obstaja 61 različnih tRNA molekul z različnimi tripleti za 20 različnih AK. To izvira iz št.
kombinacij, ki so možne z menjavanjem 4 različnih nukleotidov v kodonu treh zaporednih (64
možnosti za 20 AK). Za preostale 3 kodone ni tRNA molekul; to so STOP KODONI. Večjo št.
KODONOV kot AK pomeni DEGENERACIJA. Ta se kaže v pomenu posameznih nukleotidov
v tripletu, ki pada od prvega do tretjega. Poleg specifične molekule tRNA obstajajo specifični
encimi, ki katalizirajo povezavo določene AK na določeno tRNA. POLIMERIZACIJA AK
poteka na ribosomu med prosto amino skupino prihajajoče AK, s prenosom obstoječe
polipeptidne verige iz esterske vezi na 3' mestu prvega adenozina. Hkrati so vezane 3
molekule tRNA: tista, ki nosi novo AK, druga z obstoječo polipeptidno verigo in odhajajoča
brez vsega.

5
Zakaj je DNA nosilka
genetske informacije in
ne RNA?

● Je bolj stabilna,
saj jo povezujejo
vodikove vezi.
● Ima helikazno
obliko.
● Je manj
občutljiva, pride
do manj mutacij.
● Ima učinkovitejši
popravljalni
mehanizem.

GEN-regija genomskega
zaporedja in ustreza
enoti dedovanja s pridruženimi regulatornimi regijami, prepisovalnimi ter drugimi
funkcionalnimi regijami.

Kromosom vsebuje: 10'7-10'10 bp;Povprečen gen ima 10'4 bp; Povprečen protein je dolg
500 AK. ; 2%-je ORF (eksonov); več je intronov kot ekson; Mutacija v intronu lahko povzroči
spremembo.

Telomere-na njihovih koncih je malo genov. Njihovo krajšanje pomeni propad (smrt).

Evkariontski gen je kombinacija segment DNA, ki skupaj tvorijo ekspresivno unijo. Izražanje
vodi do tvorjenja ene ali več specifičnih funkcijskih produktov gena, ki so bodisi RNA
molekule ali peptidi. Vsak gen vsebuje
eno ali več DNA segment, ki regulira
transkripcijo gena (izražanje).

GENI in KROMOSOMI

Gregor Mendel (1865) uvede genetiko s

preučevanjem gojenja graha. Ugotovil je,
da se lastnosti prenašajo na potomce z
geni. Poznamo dominantne in recesivne
gene; fenotip in genotip.

6
Griffitov eksperiment o prenosu dedne informacije

Vzel je dva seva pneumonije: patogeni S-sev s kapsulo in nepatogeni R-sev brez
kapsule. Miš, okužena s S-sevom, pogine. S-sev je potrjeno patogen. Miš, okužena z
R-sevom, ne pogine. R-sev je potrjeno
nepatogen. Miš, okužena s toplotno uničenim
S-sevom, ne pogine. Termalna obdelava
uniči bakterijo, ki nima patogenega učinka.
Miš, okužena z mešanico toplotno uničenega
S-seva in R-seva, pogine. V truplu so
prisotne bakterijske celice s kapsulo.

Iz tega sklepamo, da je kljub smrti toplotno

uničenega S-seva ostal nek zapis o
kapsulah, katerega je R-sev prebral, se
prilagodil in tvoril kapsule ter tako postal
patogen.

Dokazovanje DNA kot prenašalko

dedne informacije
Avery, McCarthy in MacLeod
eksperiment

Iz mešanice proteinov, RNA in DNA iz

toplotno uničenih celic S-seva so z –azami
izločili po eno snov. Ko so dodali celice
R-seva, so se celice s kapsulami pojavile v
mešanici DNA in proteinov ter v mešanici
DNA in RNA, ne pa v mešanici RNA in
proteinov. Torej proteini ne prenašajo
informacije, temveč jo DNA.

Hershey in Chase eksperiment

Virusno DNA sta označila z radioaktivnim

fosforjem in skupaj z bakterijami kultivirala te označene viruse. Ko sta mešanico
centrifugirala sta opazila, da virusi niso radioaktivni, bakterije z virusno DNA pa so. S
centrifugiranjem sta ločila bakterije (v sedimentu) od virusov (v supernatantu) in ugotovila, da
so bakterije radioaktivne. ato proteinski plašč virusa označita z radioaktivnim žveplom. Virus
se pripne na tarčno celico in vanjo spusti svojo dednino. Opazila sta, da so virusi postali
radioaktivni, ne pa bakterije z virusno DNA. Iz tega sta zaključila, da je DNA prenašalec
dedne informacije.

»Vendar trditev, da se informacije prenašajo samo z molekulo DNA in ne proteini ni

popolnoma pravilna.«

Schrödinger

Iz fizikalnega stališča je uvidel, da ne more biti fenotipsko izražanje iz proteinov, kajti bilo bi
preveč naključno, da bi bile stalno izražene enake lastnosti v enaki meri. Torej mora nekje
obstajati nek (linearen) zapis informacij. Vzpostavil je vprašanje kaj določa živost celic.

7
Je zaslužen za opis lastnosti molekule DNA, s pomočjo katerih sta Crieck in Watson izdelala
model DNA.

Projekt The Human Genome (2001)

Ugotavljali so zaporedje človeškega genoma. Pojavljajo se različna vprašanja:

● Zakaj še ne vemo točnega števila genov? (20.000-25.000 genov) (določili so

zaporedje nukleotidov-3 milijarde v haploidnem stanju)
● Zakaj je zaporedje nukleotidov pomembnejše od zaporedja AK?
Ker če poznamo nukleotidno zaporedje, teoretično poznamo tudi zaporedje AK.
(bralni okvir) pri iskanju gena iščemo start kodon na 5'-koncu (AUG) in beremo vse do
stop kodon na 3'-koncu. Seveda je možno, da se dva gena prekrivata.

Določamo lahko vse proteine razen v primeru, da ima celica alternativni genetski kod (npr.
da start kodon AUG ni metionin ampak stop kodon.

GENSKA ONTOLOGIJA-določanje funkcije proteinov

Genetski kod je skupek pravil, po katerih žive celice informacije, zapisane v genetskem
materialu (DNA in mRNA), prevajajo v zaporedje AK, ki gradijo beljakovine. Za primer,
zaporedje GGGAAACCC se lahko bere na tri različne načine – če prevajalni sistem začne z
branjem pri prvem gvaninu, je zaporedje kodonov GGG AAA CCC, torej glicin - lizin - prolin.
Če prične pri drugem, je zaporedje GGA AAC, torej lizin - asparagin, če pri tretjem pa GAA
ACC, torej glutaminska kislina - treonin. Pravimo, da za vsako zaporedje obstajajo trije
različni bralni okvirji. 

Četudi lahko napovemo strukturo proteina, težko napovemo njegovo funkcijo. Zato moramo
eksperimentalno določati njegovo vlogo.
Npr. AKTIN
Posamezna podenota im drugačno vlogo. Lahko sodeluje pri endocitozi, lahko pa v jedrcu
določa, kateri proteini se bodo izražali. Sodeluje pri uravnavanju kromatina.
Pleiotropnost=gen izraža več funkcij.

Princip:

Na genomu imamo gene, ORF (odprte bralne okvire-kodone, dovolj dolge brez stop
kodonov). Poiščemo start konon in beremo do stop kodona. Iz zaporedja AK ne moremo
napovedati molekulo DNA, saj imamo
degeneriran genski kod (več kombinacij
nukleotidov zapiše enako AK!).

Genska ontologija se ukvarja:

● z biotskimi procesi (transkripcija,

translacija,...)
● z molekulsko funkcijo (encimi,...)
● s celično lokalizacijo (proteinov)

8
Evolucijsko ohranjeni geni:

Homologni-skupni prednik

Ortologni- homologni geni v različnih vrstah, ki so se razvili in skupnega prednika. Tekom

evolucije so ohranili isto funkcijo v različnih vrstah.

Paralogni-evolucijsko povezani geni, ki so nastali z duplikacijo gena in razvili so nove

funkcije.

SINTETIČNI MINIMALNI GENOM

Princip: vzamejo minimalni genom iz mikoplazme, celica se je sposobna deliti. Iz obstoječega

genoma izbijemo vse tiste gene, brez katerih celica še lahko živi (torej pustimo esencialne
gene). Celica lahko preživi s 473 geni. Za 149 genov ne vemo kje spadajo v gensko
ontologijo.

Celica ne potrebuje vseh genov v vsakem okolju. Esencialni geni so tisti geni, katere celica
potrebuje v vsakem primeru, ostali pa so neesencialni. Eksperimentalno so ugotovili, da ima
v najbolj neugodnih razmerah E.coli od 4000 genov 3600 esencialnih, v najbolj ugodnih
razmerah pa le 300 esencialnih.

Priprava sintetične DNA

Imamo nosilec, ki ima obstoječa zaporedja DNA. Na točno določenem mestu želimo dodati
nukleotide. Torej imamo fotolabilna mesta (vsebujejo fotolabilne skupine) na katere
posvetimo in nanje lahko dodajamo nukleotide. Postopek ponavljamo toliko časa, da dobimo
na vsa mesta želene nukleotide (oligo/poli nukleotidi).

OSREDNJA DOGMA MOLEKULARNE BIOLOGIJE

Morfološko različne celice vplivajo na to, kateri geni se bodo izražali. Embrionalne celice
imajo možnost izražanja vseh genov. Po specializaciji se nabor izražanja zniža. Določa se
funkcija celice.

Rezistenca na laktozo (laktozna intoleranca)

Ni dovolj laktaze, za razgradnjo laktoze. S tem problemom se soočajo domorodci Amerike,

Azije, Afrike.

Vitkost/prekomerna teža

Več genov QTL-lokus (del gena) kvantitativne lastnosti (več genov, ki določa isto lastnost).
Na določenem lokusu dobimo specifične variante, ki se različno pojavljajo pri vitkih oz.
debelih miši.

9
»junk DNA« (noncoding DNA)
Predeli na DNA, ki ne kodirajo za proteine. Nekaj ncDNA se prevede v funkcionalne ncRNA
molekule (tRNA, rRNA in regulatorne RNAze, microRNA). Imajo funkcijo regulacije
transkripcije in translacije, scaffold sekvence (del na kromosomu, kjer se veriga pripenja).
Lahko pa je tudi funkcijsko pomembno mesto, kjer se vežejo proteini. (8% genoma je
pomembnega za vezavo proteine, zato koncemp »junk«DNA izbrišejo).

C-value enigma (paradoks)

Ljudje so verjeli, da imajo kompleksnejši organizmi večji genom, zato so tudi predvidevali, da
imajo ljudje največjega. To se ne sklada, niti ni razmerje med količino DNA in številom genov
se ne sklada. Ljudje imamo veliko psevdo-genov, ki izgledajo kot geni, a se ne izražajo (ležijo
v nekodogeni regiji). Poleg tega imamo veliko ponavljajočih regij.

Z mutacijami lahko ugotavljamo, kako pomembno je to mesto za organizem.

Spremembe na ORF lahko privedejo do mutacij (razlike v konformaciji beljakovin, posledično

v spremembi njihove funkcije).

Hibridizacija
S hibridizacijo merimo ujemanje dveh verig ali odsekov DNA. Obe molekuli DNA
denaturiramo – eno nanesemo na filter, drugo pa imamo v raztopini. Ko filter potopimo v
raztopino se vzpostavijo vodikove vezi med ujemajočimi pari. Filter vzamemo ven, ga
posušimo in izmerimo, koliko DNA iz raztopine se je vezalo na DNA na filtru (DNA v raztopini
je označena, na primer z fluorescenčnimi elementi).

Na tak način preverjamo, ali ima neka vrsta določen gen ali ne (homolognost-skupni
prednik). Testiran DNA pripnemo in dodamo fluorescentno sondo, komplementarno genu,
katerega iščemo. Raztopino denaturiramo, zopet renaturiramo in speremo odvečne sonde.
Če ima DNA gen, se je sonda vezala nanj in opazimo fluoroscenco, če pa gena ni, se sonda
nanj ne veže in ni fluorescence.

10
Gene Chip (DNA mikromreža)
Na podobnem principu temelji DNA
mikromreža. To je ploščica s sondami, na
katero so vezani komplementarni geni,
značilni za neke skupine, ali celo za vrste
specifično. Ta tehnika je natančna, hitra in
na široko poznana zaradi primera s
SARSom.

Iz rezultatov dobimo stolpce vezave – čim

več % DNA se ujema, tem večji je stolpec.
Iz mikromreže dobimo več stolpcev, in t.i.
vzorec hibridizacije primerjamo z znanimi
vzorci.

SNP CHIP (polimorfizem nukleotidov)

Tip DNA mikromreže, ki se uporablja za detekcijo polimorfizmov v populaciji, za raziskovanje
raka. Potrebujemo oligonukleotidne probe, vezane na mikromrežo; fragmente nukleinske
kisline, označene z GFP ter sistem, ki zazna in meri signal hibridizacije. Veže se
komplementarna DNA. Več kot se jo veže, močnejši
bo signal.

TEMPERATURA vezave je prilagojena deležu G—C.

CNV (variabilnost v številu kopij)

Definiran je kot fenomen, pri katerem določeni deli
genoma so ponovljeni (duplicirani) in število ponovitev
varira glede na posameznika v človeški populaciji. Gre
za strukturno variacijo (mutacije, ki spreminjajo število
kopij), natančneje za:

● duplikacijo
● delecijo

PCR (verižne reakcije s polimerazo)

11
Določanje zaporedja DNA
SEKVENCIRANJE

Natančnost nukeotidov ni 100%. Pri daljši verigi obstaja večja možnost napak
(mutacij)-dobimo neuporabno DNA.

S sekvenciranjem po Sangerju določimo zaporedje nukleotidov v preiskovanem fragmentu

DNK. Tehnika temelji na uporabi kemijsko modificiranih fluorescenčno označenih
nukleotidov, ki se vedno vežejo na koncu. Po končani sekvenčni reakciji dobimo mešanico
različno dolgih fragmentov, ki jih ločimo z visoko-ločljivostno kapilarno elektroforezo
(kromatogram). S sekvenciranjem iščemo in določamo neznane mutacije, manjše delecije in
insercije v eksonih in obeksonskih regijah preiskovanih genov. Uporabljamo ga tudi za
potrjevanje že znanih zarodnih mutacij ter za potrditev mutacij določenih s sekvenciranjem
druge generacije..

S sekvenciranjem druge generacije (NGS) določamo nukleotidno zaporedje več miljonov

fragmentov DNK hkrati. V našem laboratoroju uporabljamo sistem Illumina MiSeq Dx.
Določanje nukleotidnega zaporedja poteka na t.i. pretočni celici oz. ploščici in temelji na
tehniki sekvenciranja po sintezi (sinteznega sekvenciranja). To pomeni, da se med potekom
sekvenciranja v vsakem koraku (ciklu) na matrico DNK veže po en komplementaren
nukleotid po principu naravne kompeticije. Vsak nukleotid ima svojo barvno kodo, ki jo aparat
zazna. Aparat pridobiva podatke z zajemanjem slike v vsakem koraku, sledi pa sestavljanje
in analiza dobljenih nukleotidnih zaporedij – odčitkov (angl. read) s pomočjo uporabe
zmogljivih računalniških algoritmov in programov. Sekvenciranje druge generacije nam torej
omogoča analizo večjega števila genov hkrati, zaradi česar je sam postopek testiranja
bolnikov hitrejši in cenejši.

Pridobimo ogromno odčitkov, ki omogočajo težavno sestavljanje. Še večja težava pa nastane

zaradi ponavljajočih se zaporedjih.

Sekvenciranje z nano porami

Je metoda, ki odpravi težave ponavljajočih se zaporedij.

Princip: dvoverižno DNA vlečemo skozi poro (podobna fosfolipidni membrani, neprepustna
za ione). Skozi poro gre le 1 veriga DNA. Naredimo gradient ionov ob membrani. Razlika v
potencialu ustvari elektronski tok skozi poro. Vsakič, ko gre nukleotid skozi poro, se pretok
ionov zmanjša. Upad toka ionov je odvisen od oblike nukleotida. Deluje zelo hitro in lahko
določimo zaporedje celotnega kromosoma.

CRISPR
Bakterije in arheje so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile poseben od RNA odvisen
sistem pridobljene imunosti, imenovan CRISPR/Cas (angl. clustered regularly interspaced
short palindromic repeats/CRISPR-associated), ki specifično prepozna in reže tujo tarčno
DNA. To se lahko s pridom izkoristi pri genomskem inženirstvu. To hitro razvijajoče področje
raziskav sega vse od bazične znanosti do biotehnoloških aplikacij. Do sedaj znana orodja
modificiranja genomske DNA so npr. nukleaze s cinkovimi prsti (ZFN) in nukleaze TAL
efektorjev (TALEN). Delovanje teh specifičnih endonukleaz sproži željene spremembe v
genomski DNA z izrabljanjem celičnih popravljalnih mehanizmov: združevanja nehomolognih
koncev (NHEJ) in popravljanje s homologno rekombinacijo.

12
V primerjavi s ZFN in TALEN se CRISPR/Cas9 sistem kaže kot bistveno enostavnejše in
zanesljivejše orodje za spreminjanje genomske DNA, saj lahko protein Cas9 veže poljubno
vodečo RNA (gRNA), katera je komplementarna tarčnemu zaporedju. Virusno kratko
zaporedje se vgradi v bakterijski kromosom. Molekula gDNA določa protein Cas9
komplementarno vezavno mesto na DNA (ki je bila prvotno nukleinska kislina virusa).
Kompleks Cas9-gRNA prepozna vezavno mesto na genomski DNA, ki je definirano z
najmanj 13 nt dolgim komplementarnim odsekom med gRNA in tarčno DNA, kar pripelje do
vezave specifične ENDONUKLEAZE, ki povzroči dvojni lom (tam celica odpravi mutacijo,
namesto tega vstavimo poljubno zaporedje).

PAM- nujno potrebno za vezavo kompleksa (ima obliko NGG). Učinkovitost sistema
CRISPR/Cas9, da preko NHEJ sproži insercije oz. delecije na tem lokusu, so spremljali s
sekvenatorjem nove generacije 

KARAKTERISTIKE GENOMA

C-vrednost=večina genoma nekega

organizma se definira kot količina DNA v
haploidnem stanju

Virusi imajo okoli 5000 bp; človek ima 1,1

m dolg genom s 3,2*10 (na 9) bp. Človek
ima manj DND kot npr. koruza, žaba,
lilija, kar imenujemo PARADOKS
VREDNOSTI C (gre za odstopanje med
količino genoma in dejansko razvitostjo
organizma. Večina organizmov ima več
DNA in večji del tega genoma je
nekodirajočega-brez funkcije).

Število eksonov ne napove, koliko proteinov bo nastalo (vemo pa: več kot je eksonov, imamo
večji nabor proteinov-tudi če imamo manj genov : npr. pri človeku). Smiselno je, da je več
tistih elementov, ki zapisujejo za fenotip.

13
Ponavljajoča/ neponavljajoča se zaporedja

Ponovitve so lahko od dveh nukleotidov pa tudi do 10 oz. 100 bp. Ti so običajno

TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI (tuja DNA):

● dolge ponovitve večinoma predstavljajo insercijska zaporedja (IS; ang: “Insertion

Sequences”), ki so dolga med 0,8 in 2 kbp in vsebujejo terminalne obrnjene ponovitve
(TIR; ang: “Terminal Inverted Repeats”) ter zapisujejo za endonukleaze, ki interagirajo
s TIR in omogočajo premike IS;
● kratke ponovitve (posledica zdrsa DNAP) so dolge med 20 in 300 bp ter imajo
različno strukturo, zato jih lahko ločimo v več skupin:

- tandemsko urejene ponovitve (24-48 bp) (kratke palindromske ponovitve, združene v

klastre; CRISPR). Omogočajo prepoznavanje in utišanje eksogenih elementov v genomu.

-ponavljajoči izvengenski palindromi (20-40 bp) (REP; vplivajo na dodatno zvitje DNA,
na terminacijo transkripcije in stabilizacijo DNA; večinoma se zaključijo z GTAG).

-miniaturne obrnjene ponovitve transpozicijskih elemntov (15-30 bp) (MITEs; so blizu

kodirajočih delih in vplivajo na izražanje spsednjih genov; zvijajo se v sek. strukture in
stabilizirajo oz. pospešijo razgradnjo mRNA).

Pri evkariontih ločimo:

● retroelementi (elemneti, ki se prestavljajo po genomu z vmezno pretvorbo v RNA

intermediat)
● DNA transpozoni (transpozicijski elementi, pride do izreza zaporedja iz donorske
molekule DNA, zato vstavitev na drugo mesto v genomu ne privede do povečanja
števila ponovitev v genomu).
● tandemske ponovitve DNA (niso sposobne premestitve po DNA. Sestavljajo
satelitna mesta, poembna za organizacijo centromer, minisatelit, mikrosatelit-genski
markerji za iskanje prstnih odtisov DNA).

PANGENOM-nabor vseh genov, ki jih najdemo pri populaciji celotne vrste.

Človeški genom ima 6 milijonov SNP (snip, polimorfizem). Torej lahko sestavimo 26 000 000
različnih kombinacij. Reakcijska norma so vsi možni fenotipi, ki jih genotip omogoča. Ampak
fenotipi so lahko drugačni že z istim genotipom, npr. debelost, mišična masa, lepotne pike itd.
Večina lastnosti je tudi kvantitativnih, se pravi da niso monogenetske, ampak na njih vpliva
več genov.

Pleiotropni geni – protein dela v interaktomu, se pravi v kompleksu proteinov z vplivom drug
na drugega. Nekateri proteini imajo tudi več različnih funkcij:

- Aktin tvori filamente, eno od vrst citoskeleta, pri katerih se več monomernih enot
poveže skupaj. Monomerna oblika aktina ima posamezno funkcijo v jedru s
kromatinom (kompleks DNA in proteinov) in ima vlogo tudi pri transkripciji.
- Heksokinaza (encim, ki fosforilira glukozo), deluje tudi kot transkripcijski faktor
(veže se na DNA in pritegne RNA polimerazo).

14
KARTE GENOMA

● Fizične karte (zaporedje nukleotidov-sekvenciranje ; 4 milijoni bp-prikazan je ORIGIN,

začetek replikacije)
● Genetske karte (zaporedje genomov od ORI mesta)

Uporaba genetskih kart:

● Pri določanju ene verige (haplotip)

S pomočjo REKOMBINACIJE na bakteriofagih so ugotavljali genetske mape.

IZMENJAVANJE DEDNINE PRI BAKTERIJAH:

● Konjugacija

F+ celice oz. celice ki imajo sposobnost tvorbe pilusa so donorske celice, F- celice pa
prejemnice. Pride do prenosa DNA na način kotalečega se kroga. Pride do integracije DNA v
genom (kromosom). Prejemnica postane F+ (sposobna konjugacije).

Konjugacija je prepočasen proces,

prenese se le linearna DNA.

Za ugotavljanje vrstnega reda genov

uporabljamo tehniko, pri kateri fizično
prekinemo piluse in glede na fregvenco v
celicah ugotavljamo vrstne rede genov.
Hitrost potovanja, rekombinacije je 1 min/
10 kbp.

● Transformacija

Prenos gole DNA. Tuja DNA se vgradi v

bakterijski kromosom. Transformacijo
pospešimo tako, da naredimo celice
KOMPETENTNE (sposobnost sprejetja
tuje DNA).

● Transdukcija

S pomočjo fagov prenesemo DNA. V fagno

kapsido vnesemo želeno tarčno DNA. Celice
sprejemnice okužimo s fagi, ti vanje
prenesejo DNA.

PUNNETTOV KVADRAT

Je grafični prikaz, s katerim lahko napovemo,

katere genotipe in fenotipe pričakujemo v
generaciji potomcev ter v katerem deleži
bodo zastopani.

15
Bakterije imajo krožno DNA. Ta se podvaja v dve smeri. Ko se na enem delu DNA odvija, na
drugem delu protein suče v drugo stran.

SPORULACIJA

Sestava gena

Gen ni sestavljen le iz regij, ki se prepisujejo. Med eksoni – deli, ki se prepisujejo – so tudi

introni, ki se ne prepisujejo. Prokarionti nimajo intronov. Po prepisovanju pri evkariontih v
jedru encimi izrežejo introne na pre-RNA in pošljejo v citoplazmo le mRNA iz eksonov.

Če poznamo zaporedje aminokislin torej še ne vemo, kako bo izgledal odsek DNA, ki kodira
protein. Ne vemo, kje pridejo kakšni introni, sploh pa posamezno aminokislino kodira po več
različnih kodonov. Torej ne moremo napisati niti komplementarne DNA (cDNA) – zaporedje
eksonov.

Obstaja tudi policistonska DNA - tu se RNA ne napiše le od start do stop kodona, temveč
je skupaj veriga kodov za več proteinov. Ko ribosom prevaja to RNA in pride do stop kodona

16
ter spusti polipeptid se ne odlepi, temveč začne sintetizirati drug protein. Količina teh
proteinov v celici je torej vedno enaka , saj se s sintezo enega sintetizirajo še ostali.

Branje večjih okvirov

Imamo naslednje zaporedje DNA, ki se lahko prepiše pri vsakem poudarjenem ATG
zaporedju:

CTATGCTCAGTACGAATACATGCGAGGCT

Branje večih okvirov lahko poteka v obe smeri, geni pa se lahko prekrivajo eden z drugim.

Horizontalni prenos genov

S podvajanjem enocelični organizmi posredujejo svoj genetski material potomskim

celicam, lahko pa prenašajo DNA tudi horizontalno.

Funkcijska genomika

Genom Transkriptom Proteom Metabolom

Interaktom

Genom - zaporedje celotne DNA v celici. Poznamo tudi jedrni genom, mitohondrijski genom,
kloroplastni genom itd.

Transkriptom – nabor vseh transkriptov – RNA, ki se prepisujejo. Pogosto določen za vse

transkripte v nekem trenutku/stanju.

Proteom – Nabor vseh proteinov v celici v določenem trenutku

– vsi možni proteini, ki jih lahko celica naredi

Metabolom – Nabor vseh metabolitov v celici

Interaktom – Nabor proteinskih interakcij v celici

Divji tip – Wild type

Divji tip je organizem , iz katerega izvirajo vse mutacije. V laboratoriju je lahko določiti wild
type, saj delamo mutacije na osnovi enega genetskega zapisa, v opazovanju neke že
obstoječe populacije pa je to skorajda nemogoče. Divjemu tipu pravimo tudi referenčni sev.

Haplotip
Haplotip je skupina alelov, ki se nahajajo na istem kromosomu in so glede na položaj v
genskem zapisu zelo blizu drug drugemi. Zaradi tega se dedujejo skupaj. Sekvence so dolge
100 nukleotidov; pri večjih sekvencah sestavljajo več zaporedij-CONTIG(niz prekrivajočih
segment DNA, ki skupaj predstavljajo konsezno regijo DNA). Kadar pri mejozi pride do
crossing over, se haplotip ne ohranja. To je zato, ker so na DNA zelo skupaj in se pri crossing
over ne ločita pogosto. Če sta bolj daleč narazen, je bolj verjetno, da se bosta ločila.

Polimorfizem-prisotnost dveh ali več različnih alelov enega gena v populaciji. Posledica tega
je prisotnost več različnih fenotipov. Vendar pa mora biti različen alel prisoten v več kot 1%
populacije, drugače je smatran kot mutacija.

17
Kako pogosto se zgodi rekombinacija?
Eksperiment: delež rekombinant

● Sekvenciramo Dna
● Ugotavljamo fenotipsko (TESTNO KRIŽANJE)-heterozigota (AaBb) križamo s
homozigotom (abab)-enaka alela na kromosomih

Frekvenca rekombinacij

Zgodi se ena rekombinacija na 100 mejoz. Bolj kot sta gena narazen, je verjetnost da je
prišlo do rekombinacije 50% (torej skoraj vedno pride do rekombinacije). Bližje kot sta gena,
manjša je ta možnost. Razmerje v cM(centimorgen) je linearna z dolžino nukleotidov med
A-C-G.

Ali je verjetnost vezave proteina enaka po celotni DNA?

NE! HOT SPOTs je magnet za protein.

18
MOLEKULSKI MARKERJI
Če pride do mutacije v regulatornem delu gena, pride do razlike v količini izražanega gena,
kar vpliva na fenotip. Za ugotavljanje teh mutacij uporabljamo markerje, ki ne vplivajo na
fenotip.

Satelitna DNA je sestavljena iz tandemsko ponavljajočih se zaporedij DNA, ki so v številnih

kopijah prisotna v genomu višjih organizmov. Na osnovi dolžine ponovitve so ta zaporedja
razdeljena v tri razrede in sicer na:

● satelite (enota ponovitve dolga nekaj tisoč baznih parov),

● minisatelite (enota ponovitve daljša od 10 bp) in
● mikrosatelite (enota ponovitve dolga od 2-8 bp; nastopajo v različnih ponovitvah).

PENETRANCA

Kakšen delež osebkov bo razvilo nek fenotip (pojav bolezni). Več kot je ponovitev, bolj zgodaj
se bo bolezen pojavila.

SNP (Single Nucleotid Polymorphism) – je marker na točno določenem mestu DNK, ki

nastane zaradi zamenjave enega nukleotida z drugim (npr. A → C) in predstavlja variacijo v
genetskem zapisu, ki se razlikuje med ljudmi. Te variacije so lahko številne, saj v človeškem
genomu obstaja približno 30 milijonov SNP-ov. Omenjene zamenjave pa se odražajo v
fenotipskih razlikah (boleznih, lastnostih) med posameznimi ljudmi.

SNV-variacija na enem nukleotidu (do 1% mutacije).

Simulacija evolucije: preverjamo fitness pri genetsko identični populaciji

1. vegetativno razmnoževanje (mutacija)

2. vegetativno in spolno razmnoževanje (mutacija + rekombinacija)

fiksirane mutacije: mutacija se izgubi, ostane polimorfizem.

Pri spolnem razmnoževanju imamo manj mutacij, posledično boljši fitness.

Mitohondrijsko DNA dobimo po materini strain (haploidna). Kromosom Y ne rekombinira

(haploiden).

RFLP
»Restriction fragment lenght polymorphom«

Tehnika za ugotavljanje variacij v homolognih DNA sekvencah. Gre za razliko v vzorcu

homolognih DNA molekul in različnih restrikcijskih mest.
Včasih so uporabljali t.i. restriktaze – specifične endonukleaze, ki prepoznajo točno določeno
zaporedje DNA in jo tam cepijo. Pogosto je palindromsko. Restrikcija pomeni, da se nekaj ne
more izraziti.

19
Zunaj-jedrna DNA
Mitohondrijska, kloroplastna.

Ima druge encime za njeno prevajanje,

prepisovanje, podvajanje (večja frekvenca
mutacij), dedovanje (dedovanje je odvisno od
dedovanja mitohondrija/kloroplasta). DNA ni v
stiku z jedrno DNA in od nje tudi ni odvisna. V
celici je lahko več organelov in ima vsak tak po
več kopij kromosoma. Dedovanje je naključno,
lahko da hčerinska celica dobi le en tip
mitohondrijev. Potem ni zmožna delovati tako kot
materinska celica

Staranje
Replikativno staranje

Kolikokrat lahko ena celica brsti. Celica zmore

deset ali manj brstenj. Celica, ki se je delila že osemkrat je stara, a bo njena potomka vedno
isto mlada in zmožna delitve, kot tista pri prvem brstenju. Ko se celica dovolj postara sledi
apoptoza – nadzorovan proces celične smrti.

Replikativno staranje obstaja tudi pri celicah, ki ne brstijo, ampak se delijo. Materinska celica
ohranja svoje stare lipide in proteine, medtem ko za hčerinsko celico vse zgradi na novo.

Nekateri organizmi (npr. vretenčarji) ne dedujejo celotne celice. Mitohondriji in celotna celica
s polovico genetskega materiala je materino, oče pa prispeva le polovico genetskega
materiala. Mitohondriji spermalne celice se ne vključijo v potomko.

Kronološko staranje

Mitohondrijska DNA je premajhna, da bi preživljala celoten organel sama. To je zaradi

kronološkega staranja. Veliko DNA se je izgubilo, saj po vključitvi v simbiozo znotraj
evkariontske celice marsikaterih genov niso rabili. Del genov se je tudi prenesel v jedro. Ti
geni se prepisujejo v jedru in proteini nastajajo v citoplazmi, potem pa potujejo v mitohondrij.
Med geni, ki so ostali v mitohondriju, so rRNA in tRNA geni, NADH dehidrogenaza geni, geni
za encimske komplekse notranje mitohondrijske membrane ipd.

Organizacija genoma: kromosomi, kromatin

1.1 Virusi

Ko se DNA zvije in zapakira v jedro, je v taki koncentraciji, da ne moremo reči, da je

raztopina, temveč gelsko stanje. Največjo gostoto DNA imajo virusi (50% DNA), ki so
sestavljeni iz DNA in proteinskega plašča. Pakirajo se na dva načina:

- Sočasno pakiranje – Ob zvijanju DNA se hkrati tvori okoli proteinski plašč

- Zaporedno pakiranje – Prvo se tvori kapsida, nato pa se noter zvije DNA

20
1.2 Prokarionti

Nukleoid – struktura prokariontov, ki vsebuje

genom (ni omejeno z membrano).

Pri vseh organizmih obstaja pakiranje DNA. Pri

bakterijah je najmanj gosto – nimajo ne jedra in ne
histonov, arheje imajo histonom podobne proteine
in nimajo jedra. Bakterije imajo DNA s proteini
zavito v zanke. In vitro ne znamo simulirati pogojev
v celici, saj imamo razredčeno raztopino DNA (v
celici je gel).

1.3 Evkarionti

Evkarionti imajo v jedru kromosome. Citogenetika je veda, ki temelji na morfoloških

značilnostih kromosomov (lise) – na ta
način označimo mesto na kromosomu
(po vzorcu) Kromosomi so vidni
posamično le med mitozo. V interfazi je
DNA zapakirana v dve strukturi:

- Heterokromatin – DNA,
zapakirana na maksimalno
gostoto, ki se ne prepisuje
o Fakultativen
heterokromatin
o Konstitutiven
heterokromatin – se
nikoli ne razvije
- Evkromatin – manj pakirana
DNA, ki se izraža

1.3.1 Sestava kromosoma

Kromosomi so sestavljeni iz dveh kromatid, na vsaki je ena kopija

gena. Kromatidi sta povezani s centromerom (ki je določen z obliko
histonov). Centromeri so pomembni za pravilno ločevanje kromatid.
Če jih ne bi bilo, bi se kromosomi dedovali naključno. Na koncu
kromosoma je telomer. Pri poškodbah telomerov jih popravljalni
mehanizmi ne popravijo, zato se krajšajo. Telomeri so cirkularno
zaključeni v kapo in ščitijo konec kromosoma. Z vsako podvojitvijo
se telomeri krajšajo, zato ima vsaka celica omejeno število delitev.
Obstaja tudi encim telomeraza, ki podaljšuje telomerne regije, a ta
ni prisotna v vseh celicah. (glej 4.7)

21
1.3.2 Zvijanje DNA v kromosome

DNA se zvija s proteini, imenovanimi histoni. Pri evkariontih je kromatin več kot 50%
proteinov. Kompleks DNA, navite okoli histona, se imenuje nukleosom. Nukleosomi se
nalagajo v zankah v 10-nm vlakna. Ta se zvijajo v 30-nm vlakna s H1 histoni. 30-nm vlakna
se zvijejo naprej vse do 300-nm vlaken, 700-nm vlaken itd. do kromosoma.

ChIP metoda
Kromatinska imunopercipitacija.

Zanima nas, na katero zaporedje DNA se veže protein (npr. histon). Dodamo nukleazo, ki
razreže DNA, ostane nam protein, ki je povezan na
košček DNA in obilo preostale DNA. Naredimo kolono,
na katero so vezana protitelesa za naš protein. Zmes
spustimo čez kolono, nevezana DNA pade skozi, naš
protein in vezana DNA pa ostaneta. S kolone očistimo
proteine in jih denaturiramo, da se sprostijo z DNA. Te
koščke posekvencioniramo in dobimo zaporedje, na
katerega se veže protein.

»izdelamo specifična protitelesa, ki specifično

prepoznajo antigen (kromatin + protein) in se nanje
vežejo. Nukleaza nam razreže tisto DNA, ki ni vezana
na protein. Nato z uporabo proteaze odstranimo proteine, DNA pa ohranimo.

DNA je zvita v 3D strukturi, vendar je iz zaporedja ne znamo napovedati. S ChIP metodo

lahko ugotovimo, kako se veže. Dela, ki sta daleč na zaporedju, sta lahko blizu v 3D strukturi.

22
Ko se na DNA izvaja funkcija proteinov (npr. RNA polimeraze) se histoni umaknejo.

1.3.3 Posttranslacijske spremembe histonov

Zaporedje aminokislin na histonih je zelo pomembno. Pri vseh evkariontih je zaporedje zelo
podobno, saj je skoraj vsaka mutacija histonov kritična napaka. Histoni imajo repke, ki štrlijo
izven nukleosoma. Na njih se dogajajo kovalentne modifikacije z dodajanjem funkcionalnih
skupin (acetilacija, metilacija, fosforilacija…). Če neaktiven gen acetiliramo (na lizinu), ta
postane aktiven, saj ima manjši privlak do histona – lažje je izpodrinjen. Acetilacija je
pomembna tudi za pakiranje in vezavo DNA.

23
1.3.4 Histonski kod

Na osnovi mesta in načina modifikacije histona lahko napovemo, kaj se bo zgodilo s

tem delom DNA. Pri podvajanju se histoni odpnejo iz DNA. Del se jih reciklira. Za odstranitev
ni dovolj le acetilacija. Obstajajo preoblikovalci kromatina, ki imajo proteinske domene
(bromodomene prepoznajo acetilirane lizine in kromodomene prepoznajo metilirane lizine).

Histoni se modificirajo na repkih, ki štlijo ven:

- Zapisovalci (writers) - uvajajo posttranslacijske spremembe

- Bralci (readers) – prepoznajo specifične modofikacije
- Brisalci (erasers) – izbrišejo zapis na repku

1.3.5 Mehanizem začetka transkripcije

Mesto, kamer se veže enhancer in TATA box nista vezana v nukleosome. Na enhancer
proteine se specifično veže histonski zapisovalec in acetilira histonske repke. Potem se na
enhancerske proteine veže kinaza in fosforilira histonske repke. Proteina gresta stran, na
histon pride bralec – preoblikovalc kromatina. Histon se odstrani ali prestavi po verigi
navzdol. RNA polimeraza se veže na TATA box in začne transkripcijo.

1.3.6 Warburg efekt (npr. pri rakavih celicah)

Aerobna fermentacija – metabolizem, kjer se tudi v prisotnosti kisika dogaja

fermentacija, ne pa aerobna respiracija. Piruvat ne vstopi v Krebsov cikel ampak se
fermentira. Podoben proces kot pri kvasovkah. Kvasovaka izloča stranski produkt etanol in z
njim tudi inhibira rast ostalih celicah. Ne preraste jih zaradi uspešnosti, ampak jih »zastrupi«.

Varianta metabolizma vpliva na to, kako se bo butirat prestavljal. Pri Warburgovem

efektu se pretvarja glukoza v laktat. Nastaja tudi butirat, ki ima običajno zaščitno vlogo
(posredno prehaja v Krebsov cikel). Hkrati je inhibitor histonskih deacetilaz. Če je preveč
butirata, ta teče ven iz Krebsovega cikla in inaktivira histonske deacetilaze. Butirat se preko
Krebsovega cikla pretvori v acetil koencim A, acetilacija histonov je večja. Če je celica rakava
se glukoza ne prenaša v Krebsov cikel, ampak v laktat. Butirat ne vstopa v krebsov cikel in
ne gre v acetil CoA in deluje kot inhibitor histonskih deacetilaz. Deacetilaze so specifične. Ne
aktivirajo se geni za delitev (kot normalno), celica gre v apoptozo. (Rakaste celice gredo v
apoptozo, če dodaš butirat – učinek butirata te zaščiti – vlaknine, vredu mikroflora te reši).

1.3.7 Izolator

Se nahaja med enhancerjem in promotorjem in onemogoči enhancer ter loči

evkromatin in heterokromatin (če ni prisotnega izolatorja se heterokromatin podaljša, kar vodi
v epigenetske spremembe).

1.3.8 Utišani kromatin

Protein Rap1 (repressing activating protein 1) se veže na regijo DNA, nato se veže
bralec in brisalec Sir2. Reservatol aktivira Sir2, ki deacitilira histone in s tem ugasne
izražanje »slabih« genov, jih utiša. Če prestavimo aktiven gen v utišano regijo se ta ne bo
izražal.

24
2 Epigenetika
Osebka imata isti genotip, a različen fenotip. Razlogi za epigenetiko:

- Metilacija DNA
- Spremembe kromatina
- Prioni (proteinsko posredovano)
- Regulatorna RNA

2.1 Crispr Cas9

S Cas9 lahko vplivamo na izražanje. Če zablokiramo mesto transkripcije RNA polimeraza ne

more več dostopati do gena. Gen smo utišali. Cas9 lahko uporabimo tudi kot signal za prepis
gena. Cas9 lahko povežemo tudi z epigenetskimi modulatorji, pride do acetilacije/metilacije.

2.2 Metilacija DNA

Metilirata se lahko citozin in adenin.

2.2.1 Bakterije

Metilirana DNA deluje kot prstni odtis pri bakteriji – vsaka ima drugačen način. S tem
bakterija prepozna svojo lastno DNA. Restriktaze prepoznajo to nelastno mesto in
onemogočijo delovanje DNA. Metilacija je del imunskega sistema bakterij.

Hemimetilirano stanje nastane takoj po podvajanju DNA. Metilirano verigo popravljalni

mehanizmi prepoznajo kot staro verigo in glede na njo popravijo mutacije.

2.2.2 Evkarionti

Metilacija pomeni utišanje genov ali zmanjšano ekspresijo le-teh. Specifično se metilirajo CG
(palindromsko zaporedje). Če je teh regij več zaporedij, je metilnih skupin več.

Vzdrževalna metiltransferaza vzdržuje metilacijo pri dedovanju. Prepozna CG zaporedja in

metilira citozin na tisti verigi, ki ni metilirana.

Tudi evkarionti na principu hemiacetilacije prepoznajo staro verigo DNA in popravijo

mautacije glede na to verigo.

Metilacija na histonih bolj zapakira DNA, zaradi česar je oteženo prepisovanje. Na podoben
način, kot se deduje metilacija, se lahko deduje heterokromatin. Kromatin se precej dobro
ohranja skozi generacije. Stanje acetiliranih histonov se deduje. Pri replikaciji se histoni
odcepijo od DNA, nato pa se povežejo nazaj v nukleosome. Histonski kod se prenese na
vsaki vergi v polovični meri. (Nepodvojena DNA ima histonov dovolj le za eno verigo.
Starševski histoni se naključno delijo med podvojenima vlaknoma DNA, ostalo se sintetizira
na novo.)

Pri večceličarjih se metilacija izbriše v gametah. To je ključno za možnost diferenciacije celic.

Pri ženskah (XX) se en kromosom X utiša. (utiša se po podvojitvi, enkrat se utiša eden,
enkrat drugi).

25
2.3 Spremembe kromatina

Kadar se DNA preveč trdno zapakira proteini do nje ne

morejo dostopati (fizično). Gen se zato manj izraža.
Včasih je izražanje odvisno od tega, kdaj/kako dobro RNA
polimeraza začne.

2.4 Regulatorna RNA

Dosage effect:

Utišanje spolnega kromosoma X pri ženskah (XX): Najprej

se izražata oba – izražata lokus Xist, ki tvori regulatorno
RNA. Kateri se bolj izrazi se inaktivira – tvori se antisense
RNA (komplementarna RNA). Na kromosom se potem
vežejo še histoni in inaktivirajo kromosom. Nastane
ireverzibilen heterokromatin. Ne inaktivira se vedno en
kromosom, enkrat se utiša eden, enkrat drugi.

2.5 Prioni

Nekateri proteini se lahko stabilno zvijejo v več oblik – ena je prava oblika, ki povzroči
pravilno delovanje proteina. Lahko pa se zvijejo v prionsko obliko. Prion ima identično
zaporedje kot pravilno zvit protein. Ti proteini imajo možnost, da preoblikujejo pravilno obliko
proteina v prionsko obliko – delujejo kot šaperoni (proteini, ki zvijajo proteine po translaciji). S
tem se vsi proteini v celici spremenijo v prionsko obliko. Prionska oblika se lahko tvori zaradi
nepravilnega zvijanja, lahko pa celico infecira prion tujega izvora (bolj pogosto). Prionsko
stanje ni nujno bolezensko.

Podvajanje DNA
2.6 DNA polimeraza

Poleg polimerazne aktivnosti ima tudi eksonukleazno aktivnost. Zaradi tavtomerije dušikovih
baz se v DNA vgrajujejo napačni nukleotidi v verjetnosti 10-3. Pri podvojevanju DNA pa je
možnost mutacije le 10-10 verjetna. To je zato, ker ima DNA polimeraza 'proofreading'
aktivnost – ko vgradi nukleotide še enkrat preveri pravilnost in napačne nukleotide zamenja
s pravimi.

2.7 Začetek podvajanja

DNA polimeraza lahko nukleotid doda v že obstoječo verigo, ne more je pa na novo začeti.
Začetek verige je RNA, ki jo dela encim primaza. DNA polimeraza na RNA začetno verigo
dodaja nukleotide in podvaja DNA. DNA polimeraza pa tudi zazna RNA, jo odstrani in
zamenja z DNA. Potem ligaza poveže fragmenta.

26
2.8 Klenow fragment in PCR

Klenow fragment je večji del DNA polimeraze, ki ima polimerazno in 3' 🡪 5' eksonukleazno
aktivnost (proofreading), nima pa 5' 🡪 3' eksonukleazne aktivnosti (primer removal). Torej
lahko podaljšuje verigo, ne more pa odstraniti primerja in ga zamenjati z DNA. Na tem
principu deluje PCR (s toploto denaturiramo DNA na posamezni verigi, dodamo primerje, ki
pa so DNA in se ne odstranijo, DNA polimeraza podvoji DNA naprej od odseka, cikel se
ponovi), vendar ne uporablja Klenowega fragmenta, saj ta denaturira. Uporablja se
polimeraza, ki še ne denaturira pri tej temperaturi.

2.9 Podvajanje DNA in vivo

2.9.1 Replisom – kompleks proteinov pri podvajanju DNA

1. Denaturacija DNA ne poteče s toploto, temveč DNA razpira encim helikaza, ki razpira
vodikove vezi med dušikovimi bazami. SSB proteini (single strand binding proeini) se
vežejo na enovijačnico DNA, da se H vezi ne vzpostavijo nazaj.
2. Primaza doda začetni oligonukleotid RNA, ki je komplementaren DNA verigi. Primaza
je distributivna – doda nekaj nukleotidov in se sprosti – in ni povezana dolgo in
stabilno ter se hitro sprosti z DNA. Primerji so zato kratki.
3. Na primer DNA polimeraza III dodaja nukleotide DNA. Hkrati odstranjuje SSB
proteine. DNA pol. III je procesivna, saj ostane vezana do konca replikacije. To ji
omogoča β sponka, ki jo drži na enojni verigi.
4. Čez gre DNA polimeraza I, ki odstrani primerje RNA in jih zamenja z DNA.
5. Ligaza nato zapre prosta mesta med temi fragmenti.

Leading strand se tako podvoji. Ko DNA pol. začne podvajanje, DNA podvoji do konca. Na
lagging strand se dogaja podobno – primaza doda RNA primer, DNA pol. nadaljuje verigo,
DNA pol. zamenja primer z DNA, ligaza zlepi DNA – vendar ker lahko podvaja DNA le v
smeri 5' proti 3' to dela pogosto in dela krajše odseke imenovane Okazakijeve fragmente. Ti
se zlepijo skupaj z ligazo.

Takšno podvajanje DNA je tipično za bakterije.

Poznamo več DNA polimeraz:

● α – podobna funkcija kot primaza

● δ – podvajanje lagging strand
● ε – podvajanje lagging strand
● β – popravljanje DNA
● γ – replikacija mitohondrijske DNA

27
2.10 Mesto ORI

ORI – origin of replication – je mesto začetka podvajanja DNA. Bakterije – ki imajo krožno
DNA – ima eno mesto ORI. Evkarionti jih imajo bistveno več (kvasovka 400, človek več
1000).

2.10.1 Prokarionti

Z A in T bogato zaporedje, kjer se veže DNA A protein in s tem toliko spremeni

konformacijo, da se začne denaturacija. Nato se veže helikaza in začne odvijati DNA in
odpre mesta za vezavo celotnega replisoma. A bakterije imajo krožno DNA in bi se ob
odpiranju drug del navijal. To rešijo proteini topoizomeraze. Ti prekinejo verigo, da se
supernavitje odvije in jo zlepijo nazaj. Pri
podvajanju DNA deluje topoizomeraza
imenovana DNA giraza.

2.10.2 Evkarionti

Pri evkariontih je bolj zapleteno. Tega AT

bogatega zaporeja ne znamo prepoznati
in določiti, kje se podvaja. Na to bogato
zaporedje se veže ORC (origin of
replication recognition complex)
kompleks proteinov. Pri evkariontih ima
podobno funkcijo kot β sponka PCNA
(proliferating cell nuclear antigene).

28
Čas podvajanja DNA

Podvojevanje DNA se začne takrat, ko celica doseže neko določeno velikost.Cikel

podvojevanja

M faza – mitoza

G1 faza – celična rast – podvojevanje

vsega razen DNA

S faza – podvojevanje DNA

G2 faza – vmesna faza med

podvojevanjem DNA in delitvijo celice

DNA se ne prepisuje neprenehoma.

Prepisovanje se uravnava z metilacijo
DNA. Remetilira se z zamikom (10
min), zato je zaznana kot
drugačna/nova. Tako se tudi pravilno
popravi pravi čas.

Replikacije ne moremo ustaviti – ko

se enkrat začne se podvoji do konca.
Če DNA pol. predolgo miruje, se zazna napaka in celica lizira.

Dedovanje na pol podvojene DNA

E. coli 40 minut podvojuje celotno DNA, v 20 minutah pa se

kromosoma uredita vsak v svojo celico. Skupaj to traja 60 minut,
pa vendar ima E. coli podvojevalni čas 20 minut. Kromosom se
deduje že deloma podvojen, zato je čas delitve celice manjši.

Prokarionti

ORI mesto je pripeto na membrano in s

podvajanjem vleče kromosom za sabo. Na koncu
ostaneta celici pritrjeni le s terminal mestom.

29
2.10.3 Evkarionti

Check point – predem gre celica iz G2 faze v M fazo, celica preveri, ali je vse vredu. Prisotni
morajo biti tako rastni faktorji in nepoškodovana DNA. Če ni vse OK, potem celica miruje, se
deferenciira ali gre v apoptozo.

Iz rastnih faktorjev pride do aktivacije genov. Če so nutrienti prisotni v zadostnih količinah, jih
rastni faktorji zaznajo in zaženejo delitev DNA. Če jih ni, se podvajanje DNA zavre.

Licenčni dejavnik/faktor
Faktor v jedru, ki je potreben za podvajanje DNA. Po eni podvojitvi je inaktiviran ali
uničen. Za ponovno iniciacijo podvajanja so potebni novi licenčni dejavniki. S tem se
zagotovi, da enkrat sintetiziran licenčni faktor ne povzroči ponovne podvojitve. To bi bila
katastrofa, saj celica nima vedno zadosti hranil za delitev!

Podvajanje štrlečih koncev

Pri leading strand ni problema, saj DNA pol.

dodaja nukleotide do konca. Pri lagging strand
pa na koncu včasih ni dovolj nukleotidov, da bi
polimeraza dodala odsek. Telomeraza je
encim, ki ima v svoji strukturi RNA, ki prepozna
konec telomera. V organizmih z večimi
kromosomi imajo vsi enake telomere, zato ne
potrebujemo več različnih telomeraz, temveč
samo eno. Zaporedje v telomerazi je
komplementarno zaporedju na 3' koncu. RNA
telomeraze se komplementarno veže in dodaja
DNA nukleotide na kodirajočo verigo – DNA se
podaljša. Telomeraza se premakne in znova
podaljša verigo. Ko je konec dovolj dolg, se
veže primaza, nato DNA pol. in se veriga
podvoji.

30
Telomeri se z delitvijo DNA
krajšajo (zaradi npr. mutacij na
koncih in njihovega odpadanja),
zato imamo le določeno število
podvojitev. Pri večceličnih
organizmih so telomeraze le v
gametah in nedeferenciiranih
celicah, saj se le te delijo. Pri
prokariontih so vedno prisotne.

2.10.4 Wernerjev sindrom

Pri sindromu pride do mutacije na

genu, ki skrbi za pakiranje telomer.
Ljudje s tem sindromom se hitreje
starajo, saj telomeri hitreje propadajo (erozija telomer)

2.10.5 Adenovirusi

Terminalni protein se veže na DNA polimerazo. Podvaja se le ena veriga, druga ostane
linearna in se izpodrine. Tvori se krožna DNA, ki se tako tudi podvaja.

31
2.11 Podvajanje na način kotalečega se kroga (rolling circle)

Določeni plazmidi in fagi lahko delujejo kot episomi – plazmidi, ki so lahko tako samostojni,
kot tudi integrirani v kromosom. V obliki plazmida se lahko podvajajo na način kotalečega se
kroga. Na začetku je dvoverižna krožna DNA, v kateri pa nastane zareza. Na 3' koncu se
začne DNA veriga podvajati, drugi konec pa se izpodrine. Tako se DNA podvaja, dokler se
ne podvoji celoten krog. Tu se lahko preščipne in se podvajanje neha, lahko pa se plazmid
podvoji večkrat (teoretično lahko poteka v nedogled).

Če je plazmid podvojen enkrat, se poveže v krožno DNA in se DNA podvoji, da

nastane dsDNA. Če pa je podvojen večkrat
(multimetric), se najprej zgradi komplementarna
veriga, potem pa se konca povežeta v krožni
dupleks, kateri vsebuje več ponovitev istega
plazmida.

Konjugacija (preko pilov se prenese krožna DNA)

tudi poteka po principu kotalečega se kroga.

32
2.12 Evkariontski plazmidi

Odkrili so jih pri nekaterih glivah. Obstajajo v jedru, podvajajo pa se v fazi podvajanja
citoplazme, in ne podvajanja DNA. Nekateri se delijo naključno med celici, večina pa
sintetizira nekaj podobnega delitvenemu vretenu (podobno aktinu).

2.13 Umetni plazmidi

Vektorji, s katerimi vstavimo našo DNA v celico.

Shuttle vektorji – posebni prenosni plazmidi, ki se lahko podvajajo tako v bakteriji, kot v
kvasovki.

Izguba plazmida

Če se plazmid izgubi, celica

izgubi gene plazmida in izgubi
nekatere funkcije. Če pa sta plazmida
nekompetentna (se ne moreta množiti
v prisotnosti drug drugega) in se
ločita, se lahko podvajata.

33
2.13.1 Regulacija

Nekateri plazmidi vsebujejo gene za protistrup proti ubijalski

molekuli, katero tudi sintetizira isti plazmid. Te molekule
obdajo ubijalsko molekulo. Če se plazmid izgubi, se
propadajoče molekule protistrupa ne sintetizirajo na novo,
ubijalska molekula se sprosti in ubije celico.

2.14 Podvajanje mitohondrijske DNA

Mitohondriji imajo večje število nukleoidov, ki ni vezano

na podvajanje celice. Mitohondrijska DNA hitro mutira, zato se
pojavljajo v mitohondrijih drugačne molekule DNA, glive pa
lahko dobijo mitohondrijsko DNA od obeh staršev. Te
molekule DNA se ne podvajajo v enakomernem razmerju. Če
se v mitohondrij zapakira le en nukleoid, drug pa ne, bo izgubil
vse funkcije drugega nukleoida, ki so drugačne od prvega.

2.15 Povzetek podvajanja

2.15.1 Prokarionti

Npr. bakterija.

Ima en kromosom in en replikon, saj ima le eno mesto

začetka podvajanja (ORI). Pogoj za podvajanje je velikost celice.
Na ORI se veže protein DNA A. Nastanejo replikacijske vilice v
obe smeri. Obenem se ob podvojevanju DNA prepisuje tudi RNA
(seveda ne na mestu replikacijskih vilic). DNA se prepisuje tudi
vnaprej, torej celica deduje že delno podvojeno DNA. Podvojevati
se konča v mestu terminacije (Ter). Po podvojevanju pride do
hemimetilacije, kjer je metilirana le ena veriga. Metilirana veriga
je prepoznana kot stara veriga in mutacije se popravljajo glede na
to verigo. Ko se po cca. 10 minutah DNA metilira stare in nove
verige ne moremo več ločiti.

2.15.2 Evkarionti

Ima en set kromosomov (razen v G2 fazi, ko je genetski material podvojen).

Podvajanje se začne na večih mestih ORI. Podvajanje je regulirano z rastnimi faktorji. V G1
fazi je checkpoint poškodb DNA. Licenčni faktorji preprečujejo takojšnje ponovno podvajanje
DNA. Na koncih je telomerazna aktivnost.

34
Mutacije in popravljalni mehanizmi
2.16 Točkovne mutacije

Tranzicija ali transverzija:

- Sinonimna/tiha – genski kod se spremeni, a kodon kodira isto aminokislino

- Drugačno smiselna:
● Konzervativna – spremeni se genski kod in zaporedje aminokislin, vendar
so si AK podobne in se na ravni proteina ne spremeni veliko (nepolarna
AK🡪nepolarna AK)
● Nekonzervativna – spremeni se genski kod in zaporedje aminokislin, ki so si
po lastnostih drugačne (nepolarna AK 🡪 polarna AK)
● Nesmiselna – pomen proteina se drastično spremeni, saj STOP kodon
narekuje konec zaporedja

Indeli:

- Insercija – doda se en nukleotid (ali dva), bralni okvir se zamakne in vse AK so

različne
- Delecija – izgubi se en nukleotid (ali dva), bralni okvir se zamakne in vse AK so
različne

35
2.17 Hibridizacija odtisa Northern

mRNA ločimo po velikosti (elektroforeza) in ugotavljamo, ali je določena mRNA

prisotna v vzorcu. Ločeno mRNA prenesemo na membrano. Naredimo komplementarno
DNA, katero označimo. Naša sonda se komplementarno veže na iskano mRNA. Nevezano
sondo speremo in poiščemo sondo.

2.18 Hibridizacija odtisa Southernu

Poteka po istem principu, vendar iščemo protein. Proteine ločimo po velikosti,

odtisnemo, namesto DNA sond pa uporabimo specifična protitelesa za naš protein.

2.19 Fluktuacijski test – Luria-Delbrück test

Dokazuje, da brez selekcije v bakterijski populaciji vzniknejo mutacije, medtem ko se s

selekcijo ne pojavljajo – dokazuje, da princip naravne selekcije velja tudi za bakterije, ne
samo za višje organizme. Mutacije
se dogajajo spontano in ves čas.
Mutacije se ne dogajajo na ukaz,
ker bi bila večja potreba po
raznolikosti. Spremembe spontanih
mutacij se prenašajo naprej le, če je
mutacija koristna in daje prednost –
naravna selekcija

36
2.20 Replica plating

Odtis master plate gojišča preko sterilnega odtisovalca

prenesemo na selektivno gojišče

2.21 Uvajanje mutacij

2.21.1 Tavtomerija dušikovih baz

Ena tisočinka nukleotidov je v obliki izomera.

Torej se na vsake 1000 vgradi en napačen
nukleotid. Če se zaporedje ne popravi, potem
mutacija ostane in spremeni genski kod.

2.21.2 Replikacijski zdrs

Replikacijski zdrsi se pojavljajo na območjih

številnih ponovitev.

Backward slippage: Pri podvajanju verige se

verigi razcepita in ena ponovitev na novo
sintetizirane DNA tvori zanko. Ko se DNA še
enkrat podvoji je ena veriga za eno ponovitev
daljša.

Forward slippage: Pri podvajanju verige se

verigi razcepita in ena ponovitev matrične DNA
tvori zanko. Ko se DNA še enkrat ponovi je
ena veriga za eno ponovitev krajša.

2.21.3 Depurinacija

V verigi pride do cepitve vezi med dušikovo bazo

in sladkorjem. En člen verige nima dušikove baze.

2.21.4 Deaminacija

Izgubi se amino skupina dušikove baze.

Ko iz citozina nastane uracil se le-ta zamenja s

timinom, saj uracil ne spada v DNA, temveč v
RNA.

37
2.21.5 Bolezni trinukleotidnih ponovitev

Sindrom krhkega
kromosoma X – na
kromosomu X so
predolge ponovitve in
so osebki prizadeti.

Huntingtonova bolezen

Kennedyjeva bolezen

2.21.6 Interkalirajoči agensi

Vgradijo se v DNA in spremenijo

strukturo tako, da se vgradi napačna
baza ali celo ustavijo replikacijo.

2.21.7 Dimeri pirimidinov

Kovalentna sprememba, kjer se

znotraj ene verige parita dva timina
ali dva citozina (bolj redko).
Replikacija se tam ustavi.

2.21.8 Poškodbe DNA

Popravljalni mehanizmi ne delujejo v

100% primerih. Pri lomu dvojnih vijačnic (DSB) se del DNA zbriše, preden se DNA poveže
skupaj. (glej 5.8.5)

Kot poškodbe DNA se štejejo tudi ostale (zgoraj naštete) poškodbe – spremembe na
kemijski ravni itd. Tudi zamenjava baze je poškodba. Najbolj drastična pa je še vedno dvojni
lom (DSB).

38
2.22 Amnesov test

Za poljubne kemične substance določimo vpliv na DNA: ali so mutagene, kje so mutagene in
kako.

- Podgana je donor jeter in jeternih encimov

- Likvidacija jeter 🡪 sprostimo jetrne encime
- Dodamo seve, ki imajo že vpeljane mutacije za selektivnost (selekcijsko gojišče), ki
pa so različnih vrst
- Dodamo kemično substanco in iščemo revertante (mutacija celice ali organizma
nazaj do divjega tipa)
- Prototrof (lahko sintetizira vse, kar potrebuje) mutira v auksotrofa (ne zna
sintetizirati vsega sam)
- Iščemo substanco, ki povrne mutirani sev v divji tip
- Z Amnesovim testom gledamo število kolonij, ki rastejo na minimalni meji (rastejo le
tiste s povratno mutacijo)

Marsikatere substance (tudi hranila) so v visokih koncentracijah mutagene, čeprav tudi ne

kancerogene. Zagovarja, da je kancerogenost najpogosteje zaradi spodbujene hitrosti delitve
– mutacije se kopičijo z delitvijo.

39
2.23 Popravljalni mehanizmi

Mutacije lahko izzovejo drugačne odzive popravljalnih mehanizmov. Ne popravi se vse na isti
način.

Poseben primer encima: alkiltransferaze – prevzemajo alkilne skupine na svoje cisteine.

ENCIM SE SPREMENI (proti definiciji encima). Če je mutacij tega tipa preveč, alkiltransferaz
zmanjka in se ne popravlja več.

Popravljanje z izrezom baze

Napačna baza se vgradi v DNA. DNA glikozilaza

odcepi napačno bazo iz verige tako, da cepi vez
med sladkorjem in fosfatom. AP endonukleaza
prepozna manjkajočo bazo in cepi fosfodiestersko
vez. Deoksiribofosfodiesteraza okrog manjkajočega
dela odstrani nukleotide. Nastane mesto, kamor se
lahko veže DNA polimeraza. Ta doda nukleotide,
potem pa ligaza poveže dele skupaj.

40
 Popravljanje z izrezom nukleotida

Obstajata dva modela: Global genomic nucleotide excision repair (GG-NER) in Transcription
coupled nucletide excision tepair (TC-NER). GG-NER se izvaja kjerkoli na genomu
(prepoznava mesta napačnega nukleotida), TC-NER pa takrat, ko RNA polimeraza ne more
napredovati (prepoznava zaustavljen transkripcijski komoleks).

Na mesto se veže transkripcijski faktor II (TF II). Njegovi proteini razvijejo DNA in odstranijo
nukleotide. Veže se DNA polimeraza in doda nukleotide. Ligaza zlepi DNA.

Popravljanje neujemanja

Sistem deluje tudi

post-replikacijsko.

Bazi DNA se ne ujemata.

Protein MutH prepozna bližnji
(tudi do nekaj 100 baznih parov
stran) metilirani adenin
materinske verige (hčerinska je še
nemetilirana). Helikaza odvije
DNA, endonukleaza odstrani
nukleotide (MutH je
endonukleaza), DNA polimeraza
doda nukleotide, ligaza zlepi
verigo.

41
 Popravljanje podvrženo napakam

DNA se v določenem času lahko popravi – začasna

zaustavitev replikacijskih vilic. Če se ustavi predolgo, gre v
apoptozo (celično smrt). Replikacijske vilice se zaustavijo
pri poškodbi v DNA.

Helikaza kljub poškodbi na eni verigi naprej odvija DNA. Rec A

proteini se vežejo na ssDNA in sprostijo SOS signal, ki izzove
druge mehanizme (pri evkariontih so že prisotni, pri prokariontih
se na novo sintetizirajo), ki izpodrinejo DNA polimerazo, popravijo
DNA in spustijo DNA pol. nazaj gor. Translacijska DNA pol. V gre
le čez ssDNA z Rec A proteini. DNA pol. V nima proofreading
aktivnosti. Vse napake, ki jih naredi, morajo popraviti drugi
mehanizmi.

Popravljanje s povezovanjem nehomolognih koncev

Zgodi se nenadzorovan prelom dvojne vijačnice (double strand

break – DSB). Na DSB se vežeta proteina KU80 in KU70 in
zaščitita proste konce. Pritegneta tudi druge proteine, ki izrežejo
okolico loma (zato je DSB pogosto mutagenega značaja). Ligaza
IV zlepi dsDNA skupaj (ligaze tipično popravljajo le zareze – le

42
ena veriga precepljena – obstaja pa tudi ligaza, ki lahko zapre DSB, na katerega so vezani
zgornji proteinski kompleksi).

DSB je težka poškodba, saj izbriše del DNA. Če je na mestu DSB esencialen gen, potem
celica žal umre, ampak je tak mehanizem, ki izreže del DNA še vedno boljši kot nič.

Problem tega mehanizma je tudi, če nastane DSB na večih kromosomih (npr. dvojni DSB).
Ena možnost je, da se kromosoma zlepita nazaj tako, kot sta bila prej (le da sta nekoliko
krajša), lahko pa nastaneta hibridna kromosoma, ki imata del enega in del drugega
kromosoma. To je še večja katastrofa.

Popravljanje z rekombinacijo

Leva slika: Zgodi se, da se izpusti del podvojitve in ostane luknja v ssDNA. Na ssDNA
se veže Rec A protein. Zgodi se strand invasion – DNA se veže s homologno verigo na drugi
strani – na sestrski kromatidi. Potem ukrade del verige. Podvajanje ni več
semikonzervativno! DNA polimeraza se veže na sestrsko kromatido, kateri zdaj manjka del
DNA 8je ssDNA) in podvoji manjkajoči (ugrabljeni) del. Ligaza zlepi DNA.

To ni rekombinacija, ker ne nastane novo zaporedje (DNA je identična). Po drugi strani

pa je rekombinacija, saj dobimo verigo, ki je zamenjava DNA.

Desna slika: SDSA – synthesis-dependent strand annealing

DNA je že podvojena. Na eni kromatidi nastanejo štrleči konci. Zgodi se invazija verige
in po matrici se sintetizira nova DNA (zeleno). Zanka, ki nastane med kromatidama ob
invaziji verige se imenuje zanka D. Ko je DNA podvojena se razvije in se verigi ponovno
parita. Ligaza zlepi verige skupaj.

43
2.23.1

44
3 Rekombinacija DNA

Crossing over ponavadi poteka v mejozi, občasno v mitozi (S

faza), vendar mu zaradi enakosti zaporedja ne moremo slediti in
ne vpliva na variabilnost DNA.

Pri intermolekularni rekombinaciji je pogostejša double crossover

varianta. Mesto prekrižanja imenujemo χ mesto (grška črka hi).
Da se prekrižata, si morata biti mesti podobni ali enaki.

Hot spots imenujemo mesta, kjer se rekombinacija dogaja z

visoko frekvenco. Mesta z nizko frekvenco rekombinacije
imenujemo cold spots.

Sistem Rec BCD

Zgodi se dvojni lom vijačnice (DSB). Na mesto loma se veže

protein Rec BCD. Veže se vse do χ mesta. Nato pride do invazije
DNA in tvori se D zanka. Rec BCD se sprosti. Pride do cepljenja
verige sestrske kromatide, verigi se zamenjata, popravijo se
zareze. Nastane prekrižanje Holiday junction, ki se premika po
verigi naprej. Lahko se zgodi sledeče:

45
Če se reže na notranjih verigah na mestih 1 in 2 dobimo rekombinacijo le na osrednjem delu
ene verige (noncrossover). Če se reže na zunanjih verigah na mestih 3 in 4, dobimo 'pravi'
crossing over, kjer se vsi aleli zamenjajo.

3.1 Evkariontska rekombinacija

V mejozi se homologna kromosoma orientirata tako, da sta eden nad drugim. Zgodi se
crossing over.

46
47
Pri rekombinaciji sta kromatidi homologni, nista pa identični.
Zgodi se dvojni lom (DSB), nastanejo štrleči konci. Pride do
invazije verige, tvori se zanka D. Manjkajoča DNA se
sintetizira, ligaza jo zlepi skupaj v verigo. Nastanejo
heterodupleks regije (regije z DNA z izvorom iz dveh
različnih dupleksov DNA) s Holliday juncion. Če se cepita
notranji verigi dobimo noncrossover rekombinacijo, kjer je
zamenjan le en delček in sta kromatidi bolj podobni
starševskim, če pa se cepita zunanji verigi, dobimo pravi
crossing over.

3.1.1 Nastanek DSB in štrlečih koncev

Encim Spo11 se z obeh straneh približa dvojni vijačnici.

DSB naredi tako, da cepi vez med fosfatom in sladkorjem
ter se veže na fosfat. Nekoliko dlje od mesta cepitve naredi
še eno zarezo, ter 'odnese' DNA stran.

3.2 Pretvorba gena (zamenjava alela)

Ko križamo haploida A in a dobimo diploid Aa, ki se

cepi na štiri haploide: A, A, a, a. Alela se dedujeta v
razmerju 2:2. V praktičnih poskusi pa so ugotovili, da se deduje v razmerju 3:1. To se zgodi
zaradi pretvorbe gena.

48
Po rekombinaciji sta v heterodupleksu dve neidentični zaporedji. Neujemanje prepozna
mismatch repair popravljalni mehanizem in ga popravi. En alel se pretvori v drugega. Po
replikaciji je razmerje med aleloma 3:1. Čeprav je neujemanje na dveh mestih se ne deduje v
razmerju 4:0. To bi bil t.i. genski poriv in bi se en alel izpodrinil, kar pa evolucijsko ni ugodno.
Inducira se lahko le umetno in vitro, in vivo pa se ne dogaja.

3.3 Uporaba homologne rekombinacije

Rekombinacijo uporabljamo pri Crisp Cas9. S to metodo lahko v genom vstavljamo različne
gene (npr. označevalni gen, gen za rezistenco ipd.).

Cas9 naredi DSB, tam se nekaj DNA zbriše, obstajajo pa tudi sistemi, kjer se naključni
nukleotidi vgradijo. Cas9 dodamo repair template (naše zaporedje DNA s χ mestom na vsaki
strani). χ mesto se ujema z DNA, kamor želimo vstaviti naš gen – obnaša se kot sestrska
kromatida. S tem pretentamo popravljalne mehanizme, da mislijo, da je bila na mestu DSB
naša DNA. Naše zaporedje se vgradi/popravi v genom.

49
4 Kromosomske aberacije
Mutacije genoma, pri katerih je kromosomalne DNA preveč, premalo, ali je v nepravilnih
proporcijah (npr. en kromosom podvojen, en kromosom manjka itd.). Večina
nepravilnosti/aberacij od normale je negativnih.

4.1 Evploidija

Celoten naraven nabor kromosomov (običajno 2n ali n). Pri

človeku je 2x 22 avtosomov + X kromosom + X/Y kromosom
(ženska/moški).

4.2 Monoploidija

Le en set kromosomov – n (če je organizem diploid – 2n)

Na primer razmnoževanje čebel – Jajčece ima n število
kromosomov. Če se jajčece ne oplodi, iz njega nastane trot, ki
je monoploid. Če pa se jajčece oplodi, postane 2n in iz njega
se izleže diploidna delavka ali matica.

4.3 Poliploidija

Več kromosomov, kot je naravno. Poliploidne rastline

imajo običajno večje plodove, zato so tudi zanimivi za nas.

4.3.1 Aloploidija

Več kromosomov, ki so iz več vrst (npr. 4 kromosomi iz

pšenice, 2 iz rža)

4.3.2 Avtoploidija

Več kopij genoma (3n, 4n, 6n, 8n)

50
Triploidija – Diploidna gameta (produkt 4n cveta), se združi s haploidnim pelodnim zrnom.
Zigota ima 3n genom. Triploidi se pojavljajo pri rastlinah. Te so ponavadi sterilne, njihovi
plodovi pa so včasih brez semen.

4.3.3 Anevploidija

Nimamo opravka s številom nabora kromosomov, ampak s številom posameznih

kromosomov (eden preveč, premalo…). Do tega pride zaradi nedisjunkcije – napačne delitve
kromosomov.

2n+1 – Trisomija – Celoten nabor diploida in še en dodaten kromosom.

2n-1 – Monosomija – En kromosom se izgubi, manjka. Vse oblike monoploidije so

letalne, razen Turnerjev sindrom (XO, manjka drugi spolni kromosom). Večina
monosomij je letalna zato, ker imamo diploidi dve kopiji kromosoma, in se kljub
mutacijam esencialnih genov lahko še vedno izraža drugi alel, monopoidi pa imajo le
eno kopijo in se vsaka mutacija pozna.

2n-»2« - Nulisomija – Popolna izguba enega celega kromosoma (obeh kopij).

n+1 – Disomija – Haploidni organizem ima en kromosom podvojen.

4.3.4 Gene balance

Gensko ravnotežje – razmerje med produkti je takšno, da omogoča preživetje celici.

Avtoploidija – razmerje je enako. Število podvojenih kopij je pri majhnih količinah linearno s
številom izraženih genov. Torej ima celica npr. dvakrat toliko produktov in je sadež tudi
dvakrat večji.

Anevploidija – geni na podvojenem kromosomu se bolj izražajo in bo ravnovesje v celici

porušeno.

51
4.4 Izguba/nadomestitev dela kromosoma

Neuravnotežena inverzija – kromosom se podaljša/skrajša. Posledica je vpliv na fenotip,

četudi v genih ni mutacije, saj se genetska informacija ali pomnoži ali izgubi.

Uravnotežena inverzija – kromosom ostane iste dolžine. Če ni mutacije in se premesti na

mestu med geni, potem se zamenja vrstni red genov. Če se cepi na mestu gena, nastane
hibrid enega gena ter drugega dela DNA (lahko gen ali ne).

Pericentrična inverzija – v centromerih

Paracentrična inverzija – ni v centromerihTranspozicijski elementi

Po tem principu običajno delujejo virusi, ki

vstavljajo svojo DNA v genom gostitelja.

Transpoaza cepi DNA na tarčnem mestu in

naredi štrleče konce. Transpozicijski element
se nato vstavi v DNA. Popravljalni mehanizmi
gostitelja nato popravijo luknje v DNA in jo
zlepijo. Tarčno mesto je na koncu direktno
podvojeno na vsaki strani transpozicijskega
elementa. Ko se transpozicijski element
odstrani, se direktna ponovitev na vsaki
strani ohrani, torej je v genomu dvakrat
podvojena. Gen za transpoazo nosi
transpozicijski element sam. Če le-tega nima,
je odvisen od drugega transpozicijskega
elementa.

52
Prepisovanje genov
Informacija, zapisana v DNA, se izraža v RNA, nato pa najpogosteje v protein.

4.5 Hipoteze poteka izražanja

Prva hipoteza je bila, da se iz DNA najprej prepiše ribosomalna rRNA, nastane ribisom, ki
sintetizira en sam tip proteina. Takrat jim še ni uspelo izolirati mRNA, ki se pojavlja le v
majhnih količinah. rRNA in tRNA so bolj dolgoživeče, zato so jih lažje izolirali.

Dokaz: ali za nov protein nastane nova rRNA in ribosom, ali so ribosomi univerzalni.

Težki ribosom s težko kovino 🡪 dodajo radioaktiven fosfor 🡪 vsa nova RNA bi morala biti
vezana z novimi ribosomi brez težkih kovin. Ampak označen fosfor se je pojavljal tudi v
označenih ribosomih, torej morajo biti le-ti univerzalni.

4.6 Orientacija na DNA

Na DNA se orientiramo glede na začetek dela, ki se prepisuje (začne se s tripletom za prvo

aminokislino). Vse, kar je pred genom (v smer 3'), je smer navzgor oz. upstream. Vse, kar je
v smeri transkripcije (v tisto smer, kamor potuje RNA polimeraza), je smer navzdol oz.
downstream. Prvi nukleotid, ki se prepiše, nosi številko 1. V smeri downstream imajo
nukleotidi naraščajoče številke (2, 3, 4, 5,…). V smeri upstream pa imajo nukleotidi padajoče
negativne številke (-1, -2, -3, -4,…). Nukleotida 0 ni.

4.7 Transkripcijski mehurček

Nastane, ko se RNA polimeraza veže na DNA in jo razpre. Na eni strani se DNA odvija, na
drugi pa zopet zavija. Vmes RNA polimeraza nanaša nukleotide in sintetizira RNA. Veriga, na
katero se komplementarno sintetizira RNA, se imenuje matrična veriga. Veriga, ki nosi isti
zapis, kot sintetizirana RNA (le da je sladkor riboza in timin zamenja uracil), je kodirajoča
veriga.

53
4.8 Ureditev genov na DNA
Geni imajo vsak svojo kodirajočo verigo (DNA se lahko prepisuje v obeh smereh). Genomi, ki
so majhni, imajo bolj pogosto gene skupaj, ter imajo tako bolj gost open reading frame. Ena
mutacija v prekrivajočih se okvirjih vpliva na več genov, kar pa ni ugodno s strani
popravljanja, je pa v smeri kompaktnega zapisa informacij. Geni, ki se najbolj prepisujejo,
potekajo v isto smer kot podvajanje. Tako se lahko prej začnejo prepisovati. DNA polimeraza
ima namreč večjo afiniteto do DNA kot RNA polimeraza in le-to izpodrine.

PORAVNANO ZAPOREDJE

10 nukleotidov nad začetkom transkripcije imajo neko določeno zaporedje (npr.

TATAAT). Poravnano zaporedje- glede na homologijo(na čim več lokacijah na genu dobimo
enako, poravnano zaporedje). Mutacije, ki nastajajo na genu pri določenem sevu se lahko
evolucijsko prenašajo naprej. Na podlagi tega ugotavljamo lahko skupnega prednika različnih
bakterij (npr. na podlagi gena za ribosomalne proteine). Poravnava lahko poteka tudi na
osnovi sekundarnih struktur ( alfa-heliks,
beta-zanka).

Zaporedje, ki je zelo podobno pri različnih genih,

imajo na promotorju skupno zaporedje. To omogoča
vezavo RNA polimeraze. Skupna zaporedja
ugotavljajo s pomočjo:

● Pribnow box (pri prokariontih)

● TATA box (pri evkariontih)

Če naredimo primerjavo vseh upstream regij

opazimo, da imajo okoli mesta -10 zelo ohranjeno
zaporedje. Mutacije imajo torej tu večji učinek, kot
drugje. To mesto se imenuje »TATA box« (evkarionti)
ali »Pribnow box« (prokarionti). Podobno ohranjeno je mesto -35. Pomembni sta zaporedji
nukleotidov sami in razdalja med njima. Tja se veže RNA polimeraza in začne odpirati DNA.

RNA polimeraza
Ima več podenot:

Sigma podenota je del RNA polimeraze in je pomembna v začetku. Obstaja več sigma
podenot. Nekateri geni imajo »heat-shock promotor«, torej se celice s tem genom hitro
odzovejo na toplotni šok in začnejo sintetizirati ŠAPERONE, ki preprečujejo zlivanje
proteinov, tako zaščitijo celice (HSP proteini).

1. Iniciacija
V tej fazi nastopajo različni elementi: a) sporočilna oziroma informacijska RNK (mRNK);
b) mala in velika podenota ribosoma; c) iniciacijski faktorji (IF-1, IF-2 in IF-3); d)
začetna tRNK, na katero je vezan N-formil-metionin; e) gvanozin trifosfat (GTP).

V času ko na ribosomu ne poteka sinteza beljakovin, sta mala (30S) in velika (50S)
podenota v t.i. dinamičnem ravnovesju – podenoti se nenehno združujeta in ločujeta. To
onemogoča mRNK, da bi se vezala na malo podenoto. Na tem mestu nastopi iniciacijski

54
faktor 3. IF-3 se veže na malo podenoto, s tem onemogoči, da bi se podenoti ponovno
združili in istočasno omogoči, da se veže na mRNK. Pri vezavi ribosoma na mRNK je
pomembno predvsem Shine-Dalgarnovo zaporedje, ki se poveže s
komplementarnimi nukleotidi v rRNK 16S. Nato se f-Met-tRNK veže na začetni kodon (po
navadi AUG), za kar je potreben IF-2 na katerega je vezan GTP. Startna tRNK se (za razliko
od ostalih tRNK, ki se vežejo na mesto A) veže na mesto P. IF-1 nadalje ojača disociacijo
med malo in veliko podenoto ter onemogoča, da bi se na mesto A vezale aminoacil tRNK.
Nazadnje se IF-3 odcepi in omogoči veliki podenoti, da se združi z malo podenoto. GTP se
hidrolizira v GDP in IF-2 ter IF-1 zapustita ribosom. Velika podenota se veže na malo in
nastane iniciacijski kompleks 70S.

Iniciacijo lahko na kratko povzamemo v treh korakih. Sprva se na ribosom veže mRNK,
nato se startna tRNK veže na začetni kodon in nazadnje se velika podenota poveže z malo.

Vezava RNA polimeraze

RNA polimeraza je kompleksen protein, sestavljen iz več podenot (HALOENCIM).

Na levi je zaprt kompleks, kjer transkripcija ne more potekati. Ko se naredi mehurček,

preide v stanje odprtega kompleksa, ki je tudi elongacijsko stanje. Jedro se veže na DNA.
Sposoben je celo začeti transkripcijo na naključnem delu. σ podenota se veže in stabilizira
RNA polimerazo in jo veže na pravo mesto – promotor. Ko se začne transkripcija se σ
podenota sprosti, saj ni potrebna več. Vezava σ podenote povzroči spremembo konformacije
RNA polimeraze. Ta sprememba tudi odpre DNA (naredi odprt kompleks). Ko gre stran, se
zopet povrne v prvotno stanje, a je kompleks odprt in je torej v elongacijskem stanju.

Prepoznava : protein----DNA je ključna za poravnave. Sigma podenota omogoča te

prepoznave, RNA polimeraza pa jih obrne v smeri 5' proti 3'.

Med promotorjem in kodirajočim zaporedjem za gen se nahaja še ena regija, ki se prepiše v

RNA, ampak se ne prevede v protein. Zaporedje RNA je torej daljše, kot če bi ga inverzno
napisali iz proteina. (od 5' do START kodona se prepiše, vendar se ne prevaja-ne gre v
translacijo)

Jakost promotorja
Pomembno je, kako močno se RNA polimeraza veže na promotor. Tem večja je afiniteta do
promotorja, tem bolj močen bo ta in se bo veliko izražal. Z intenziteto vezave lahko
napovemo, kateri je zelo prepisovan gen.

55
Obstaja tudi več vrst σ podenote, ki se z različno afiniteto vežejo na različne promotorje. Zato
se eni geni bolj prepisujejo pod nekaterimi pogoji, drugi geni pa pod drugačnimi pogoji.
Določeni geni se morajo izražati le v majhni količini, zato imajo slabši promotor in so šibki.

Nekateri promotorji so čisto drugačni od TATA/Pribnow box in mesta-35. Ti potrebujejo

specifičen promotor, ki se veže nanje in potem privlači in veže RNA polimerazo.

2. Elongacija
V procesu elongacije nastane transkripcijski mehurček. En del DNA se mora odpreti, kasneje
nastane DNA in RNA hibridno zaporedje, ki je relativno kratko. Ko se RNA polimeraza
pomakne naprej, se DNA zapre in RNA polimeraza
se odcepi. RNA polimeraza se lahko veže na
katerokoli DNA. Sigma podenota destabilizira
nespecifično zvitje.
Z eno koordinato lahko napovemo, kje na genu se
nahajamo, glede na START.

POSTOPEK:

Sprva se tRNK z aminokislino veže na mRNK, za to

pa potrebuje pomoč EF-Tu. Na EF-Tu je vezan GTP
in skupaj s tRNK tvorijo tridelni kompleks. Ta
kompleks vstopi v ribosom na mesto A, kjer se tRNK
z antikodonom veže na ustrezen kodon mRNK. Ko
kompleks vstopi na mesto A, se GTP pretvori v GDP
in kompleks EF-Tu—GDP se disociira. EF-T
regenerira kompleks v EF-Tu—GTP. Sledi peptidilni
prenos, pri čemer med AK nastane peptidna vez; pri
tem se AK odcepi od tRNK, ki se nahaja na mestu P. Peptidilni prenos katalizira rRNK 23S, ki
je del velike podenote. Zadnji korak je translokacija. Pri tem se mRNK premakne v smeri od
5' proti 3' koncu tako, da se tRNK, ki je bila prej na mestu A, premakne na mesto P; tRNK z
mesta P pa na izhodno mesto (mesto E) in zapusti ribosom. Translokacija zahteva EF-G in
hidrolizo GTP v GDP. Mesto A tako ostane prazno, a ga kmalu zasede nova tRNK in cikel se
ponovi.

Po iniciaciji se nukleotidi dodajajo na verigo in nastaja RNA. Na verigo je komplementarno

vezanih cca. 10 nukleotidov, potem pa oddisociira in RNA polimeraza DNA znova zvije v
kompleks dvojnih verig. Pri prokariontih že pred koncem transkripcije poteka že translacija .
Včasih se ne prepiše do konca, in potem ne nastane cel protein (energija gre v nič).
Evkarionti imajo ločeno translacijo in transkripcijo.

3. Terminacija
a) INTRINZIČEN MEHANIZEM

Terminacijsko zaporedje je del UTR, ki se ne prepisuje. V tem delu ima lahko G in C pogato
zaporedje, ki omogoč nastanek ZANK (sekundarnih struktur- RNA zanka). Mehanizem
terminacije je intrinzičen – ni potrebna nobena druga komponenta/kofaktor, zgodi se sam od
sebe. Zaporedje za terminacijo je nižje od STOP kodona

56
Terminacijsko zaporedje povzroči razpadanje med RNA in DNA kompleksom. Z A bogato
zaporedje je manj močno, zato RNA polimeraza odstopa. RNA polimeraza ima tudi funkcijo,
da gre par nukleotidov nazaj, jih odstrani in na novo prepiše. Tega pa ne more narediti, saj je
terminacijsko zaporedje na delih obratno komplementarno in se poveže v zanko. RNA
polimeraza se tam ne more vezati, zato se zaustavi in ker ne more popraviti napake, celoten
kompleks RNA polimeraze oddisociira. Če se ne bi to zgodilo bi RNA polimeraza ostala
vezana, ostal bi mehurček in ne bi moglo poteči podvajanje.

b) AKTIVEN MEHANIZEM

Na nekaterih zaporedjih je nujna prisotnost Rho proteina. Ta fizično odtrga RNA polimerazo
od DNA, ko RNA polimeraza obstane.

POSTOPEK:

Prevajanje se konča, ko ribosom sreča končno zaporedje. Na končno zaporedje se ne veže

nobena tRNK, saj nima nobena komplementarnega antikodona. Namesto tega se na mesto
A vežejo t. i. sprostitveni dejavniki (»release factors« - RF). Na končni kodon se veže ali RF1
ali RF2; RF3 pa z GTP tvori kompleks in se veže na ribosom. Sprostitveni faktorji spodbudijo
odcepitev polipeptidne verige od tRNK, pri tem pa se GTP hidrolizira v GDP. Dodatni faktorji
pomagajo sprostiti tRNK in mRNK iz ribosoma ter ločiti podenoti.

Transkripcija pri evkariontih

Transkripcija in translacija sta pri evkariontih ločena procesa.

Pri evkariontih je DNA veliko bolj zakrita. Gostota genov je tudi manjša. DNA evkariontov ima
eksone in introne, pre-RNA nastane iz vseh, iz tega se izrežejo introni, eksoni pa postanejo
mRNA. Za transkripcijo so poleg eksonov pomembni promotorji, enhacerji ipd., in zaporedje,
ki signalizira introne.

Evkariontska mRNK ne vsebuje Shine-Dalgarnovega zaporedja, pač pa se ribosom z

iniciacijskimi faktorji veže na kapo 5'-konca in nato premika v smeri 5'-3' dokler ne doseže
začetnega kodona. Prepoznavo začetnega kodona ojača Kozakovo (skupno) zaporedje. Pri
evkariontih sodeluje več iniciacijskih faktorjev. Nekateri prepoznajo kapo na 5'-koncu in tako
omogočijo vezavo male podenote na mRNK, spet drugi posedujejo helikazno aktivnost in
odstranjujejo sekundarne strukture na 5'-koncu ter tako omogočijo, da se ribosom nemoteno
premika do začetnega kodona. Poli(A)-rep na 3'-koncu prav tako sodeluje pri iniciaciji.
Beljakovine vezane na ta konec stopajo v interkacijo z beljakovinami, ki se nahajajo na
5'-koncu in tako ojačajo vezavo ribosoma na mRNK. Obstaja tudi t. i. od kape neodvisna
iniciacija. Pri tem mRNK vsebuje notranje vhodno mesto za ribosom, kar omogoča, da se
ribosom neposredno veže na začetni kodon. Pri terminaciji sodelujeta zgolj dva sprostitvena
dejavnika (eRF1 in eRF2). eRF1 se veže na končni kodon, eRF2 na katerega je vezan GTP
pa spodbudi sprostitev polipeptida iz ribosoma.

RNA polimeraze:

● RNA polimeraza II (RNAPII)-prepisuje mRNA (strup zelene mušnice je inhibitor)

● RNA polimeraza I –transkripcija rRNA genov (18S, 28S rRNA)
● RNA polimeraza II – tranksripcija tRNA

57
RAZLIKE MED PROKARIONTSKO IN EVKARIONTSKO TRANSLACIJO

● Začetni kodon (AUG) pri prokariontih kodira modificirano obliko metionina

(N-formilmetionin), pri evkariontih pa nemodificiran metionin;
● Pri prokariontih potekata transkripcija in translacija istočasno v citoplazmi, medtem ko
pri evkariontih po navadi (a ne vedno) ločeno – translacija poteka v citoplazmi.
Presenetljivo je, da novejše raziskave kažejo, da v določenih primerih tudi pri
evkariontih lahko potekata oba procesa hkrati v jedru;
● Velikost in kompozicija prokariontskih
in evkariontskih ribosomov se prav
tako razlikuje.
● Ekarionti vedno potrebujejo
aktivatorje RNA polimeraze (TF), pri
prokariontih je to le izjema.
● Primarni transcript (vsebuje še
introne) je drugačen od zrele mRNA.
Zgodoti se mora procesiranje. Končni
transcript se prenese v citoplazmo.

Transkripcijski faktorji in izražanje

Transkripcijski faktorji vplivajo na izražanje in njegovo uravnavanje. Poznamo splošne
transkripcijske faktorje (GTF – general TF, ki omogočajo vezavo RNA polimeraze in
nastane prediniciacijski kompeks), katerih prisotnost je pogoj za prepisovanje vseh genov in
so prisotni povsod in bolj specifične transkripcijske faktorje (TF), ki pa pospešijo ali
zavrejo izražanje na bolj specifični ravni.

Če se gen venomer izraža v vsakem tipu celice pod vsakimi pogoji, pravimo da je izražanje
konstruktivno. To so house-keeping geni (npr. geni za rRNA ali RNA polimerazo, ki morata
biti venomer prisotna). Genom, ki potrebujejo za izražanje le GTF, pravimo konstruktivni
geni.

● TFIID-mora biti prisoten v izražanju kateregakoli gena (ni specifičen).

● TF (RNA PII)- prepozna specifično zaporedje (vpliva na izražanje točno specifičnega
gena). Lahko se veže na mestu pred promotorjem, ki je specifično, zato aktivira
transkripcijo le določenega gena. Transkripcija je začne na +1 mestu, TF pa ni nujno
vezan v bližini tega mesta (pri evkariontih). Razne mutacije preprečijo vezavo TF.

Cis in trans TF

Cis regija je neposredno blizu (do 100 baznih parov) od gena. Trans regije so bolj daleč od
gena, lahko tudi na drugem kromosomu. Čeprav je lahko neka regija v zaporedju trans regija,
se včasih izkaže, da je v 3D strukturi cis regija in je čisto blizu gena.

58
Jedrni promotor

Je cis regija upstream od gena. Pomemben element je TATA box (pomemben pri iniciaciji,
ena od podenot GTF je TBP, ki prepoznava zaporedja). Vežejo se splošni TF in pripeljejo
druge proteine na pravo mesto. Tvori se preiniciacijski kompleks, šele nato se lahko veže
RNA polimeraza na TATA box.

C-terminalna domena RNA polimeraze

CTD ima veliko serina, zato se pogosto fosforilira in ima pomembno vlogo v tem, kako se bo
RNA polimeraza obnašala. Uravnava tudi procesiranje pre-mRNA (oz. proteini, ki jih CTD
pripelje). To se dogaja kotranskripcijsko. Pritegne tudi proteinske komponente, ki bodo
procesirale mRNA (poteka po transkripciji).

PROCESIRANJE:

● Dodajanje 5' kape (capping enzymes)

*pomembna za translacijo (ribosom jo prepozna

in prvi signal je START KODON-ATG...začetek
translacije)

*označena je, da je RNAza ne razgradi

● Izrezovanje intronov (splicing in spajanje)

-zrela mRNA vsebuje samo eksone, primarni

transkript vsebuje tudi introne

-kombinacija različnih domen eksonov da

različne proteine

npr. tropomiozin se različno izrazi v različnih

tkivih

-če se introni (nekodirajoči del, 10X daljši od eksonov) ne izrežejo, dobimo

nefunkcionalne proteine izreže

- G U je lahko začetek introna

-ohranjenost intronov je manjša kot ohranjenost eksonov

-mutacija se lahko zgodi kjerkoli v intronu, vendar ne povzroči znatnih sprememb, introni
se še vedno pravilno izrežejo in s tem se tudi mutacija odstrani

-če pa se zgodi da v intronu pride do mutacije adenina (A) v citozin (C), se intron ne
izreže (nefunkcionalnost proteina)

S poravnavo DNA in zrele mRNA lahko določimo, kje so eksoni. Intronov ne moremo tako
ugotoviti, saj jih v zreli mRNA ni. Lahko pa ugotavljamo njihovo prekrivanje.

Bralni okvir lahko uporabljamo za ugotavljanje zaporedja.

● Poliadenilacija
Zaključek transkripcije, mRNA se sprosti in doda se Poly (A) mesto. (je zaščita pred
razdradnnjo in oznaka za mRNA).

59
Potranskripcijsko procesiranje RNA

Spajalno telesce (spliceosome)

Prepozna mesto intronov in jih izreže. Zaradi intronov in spajalnega telesca lahko manjše
število genov (npr. 21 000) kodira večje število proteinov (npr. 70 000). To se imenuje
Alternativno izražanje.

Sestava introna:

1 – mesto, ki kodira intron

2 – mesto razdvojitve (mesto A)

3 – mesto, ki kodira konec rezanja

Mesta 1, 2 in 3 morajo ostati nemutirana,

saj po njih spajalno telesce prepozna intron
in ga pravilno izreže. Na mesto 1 in 2 se
vežeta prva proteina, ki privabita druge.
Tvori se kompleks večih proteinov, ki intron
spnejo v zanko, jo odrežejo in spnejo
konca eksonov skupaj. Intron se nato
razgradi.

60
Encimska aktivnost RNA

Ponekod za izrezovanje intronov sploh

ni potreben proteinski kompleksa,
ampak se RNA izreže sama. Zaradi
komplementarnega zaporedja se RNA
zaviha nazaj, tvori zanko, prekine vez
in spne konca eksonov skupaj. RNA z
encimsko aktivnostjo se imenuje
RIBOCIM. Je dokaz, da je mogoče
včasih svet temeljil na RNA in ne na
proteinih.

Uravnavanje izražanja genov

Je drugačno pri enoceličarjih in večceličarjih, ne le med pro- in evkarionti. Celice, ki so
specializirane, izražajo izredno manj genov. Konstituivno izražanje je le pri enoceličarjih. Pri
enoceličarjih se geni, ki se ne izražajo za izrabljanje alternativnih virov C in N iz okolja.
Prioriteta virov 🡪 prioriteta izražanja.

ŠE NEKAJ DRUGIH VRST RNA

● siRNA (»small interferring RNA-male interferenčne RNA)

Nastajajo iz prehodnih dvoverižnih RNA (virusnih, pa tudi lastnih celičnih), so dvoberižne in

dolge 19-21 baznih parov. Vežejo se na specifična zaporedja molekul mRNA in s tem
uravnavajo (zmanjšajo ali povečajo) njihovo aktivnost. Če preprečijo biosinteo proteina,
pravimo, da so utišale izražanje gena oz. njihove mRNA; ta vidik je pomemben pri obrambi
celic proti parazitskim genom (virusnim), sicer pa tudi za splošno uravnavanje izražanja
genov.

Nastajajo po delovanju DICER in RISC-a. Uporabno za tarčno utišanje genov (»GENE

KNOCK DOWN«). 100% natančno zaporedje.

● miRNA (izražanje 60% genov)

Mikro-RNA so kratka zaporedja RNA (22 nukleotidov), ki se prepisujejo in imajo same po

sebi funkcijo uravnjavanja transkripcije (post-transkripcijski regulatorji) vežejo se na
komplementarna zaporedja mRNA in spodbudijo njihovo razgradjo in s tem utišajo vlogo
tarčnih mRNA. Iz gena za miRNA se ta prepiše in procesira. Gre v cioplazmo, kjer se še
dodatno procesira in nastane single-strand RNA. Ta se veže na komplementarno regijo
mRNA in tvori kompleks dsRNA. Preko tega kompleksa ribosom ne more in translacija se
tako ustavi. miRNA ni popolnoma specifična, torej se ne veže na popolnoma
komplementarno zaporedje, ampak je zaporedje na mRNA le podobno. S tem doseže, da
lahko ena miRNA zavre izražanje večih genov, ne pa samo enega.

Izolirajo lokus in želijo ugotoviti njegovo funkcijo. Poteka transkripcija, translacija pa ne.
miRNA se izreže in tvori sekundarno strukturo (zanko), se sprocesira in se veže z DICER
proteinom v citoplazmi, ki dodatno razreže in nastane RISC (»RNA induced silecing
complex«), ki je regulator izražanja.

61
● snRNA (male jedrne RNA)

Nahajajo se v jedru evkriontskih celic. Uravnavajo izražanje intronov, akrivnost TF in encima

RNA polimeraza ter vzdrževanje telomerov. S specifičnimi malimi jedrnimi proteini so
združene v male jedrne ribonukleoproteine, »snurpe« (snRNP).

snRNA (mala jedrna RNA) + protein = SNP (prepozna specifično zaporedje GU, začetek
introna)

● snoRNA (male nukleolarne

RNA)

Imajo pomembno vlogo pri

nastajanju RNA; nadzirajo
kemične modifikacije rRNA,
tRNA in snRNA. Prisotne so v
jedru.

● Protismiselna RNA
(»antisense RNA)

Enoverižna RNA, ki je
komplementarna določeni
mRNA. Če jo vnesemo v celoco,
lahko inhibiramo translacijo
omenjene mRNA (gensko
zdravljanje), sicer pa obstajajo
tudi naravne celične asRNA
(uravnavanje izražanja genov).

Uravnavanje s transgeni
Transgen – gen, ki se izraža v istih pogojih.

Je del imunskega sistema bakterij proti virusni RNA. Deluje na principu

komplementarnega parjenja dveh verig RNA v dsRNA, ki se razgradi. Transgen je
protipomenska RNA genu iz virusa, ki se z njo komplementarno pari in zopet dobimo
utišanje.

62
 Uravnavanje s promotorji
Danes lahko izoliramo popoln humani genom. Sama DNA molekula pa ni dovolj za
sestavo organizma. Prvi vpogled, kako se informacija prenaša na podlagi prenosa DNA je
izražanje genov.

TRANSKRIPTOM je nabor vseh prepisov RNA (oz. mRNA, rRNA, tRNA in druge
nekodirajoče RNA), ki pa nam ne povedo vsega o celici.

Torej od koncentracije mRNA še ne moremo napovedati, koliko proteina bo dejansko nastalo.

Lažje je meriti transkriptom kot sam protein, saj je bližje genomu (dinamična komponenta
genoma).

»HEAT MAP«-toplotni graf

● Grafična predstavitev iz DNA

mikromreže glede na različno
gensko ekspresijo. Vrstica
predstavja gen, stolpec pa
različne dejavnike spremembe
okolja (T, kemikalije, časovni
potek,...). Če organizem zazna
neko fizikalno/kemijsko
spremembo, se bo nanjo odzval z
izražanjem genov.

Rdeča=boljša ekspresija

Zelena= manjša ekspresija

»DNA microrray (DNA mikromreža)«

Je zbirka mikroskopskih DNA točk, ki so nanešene na trdno podlago. Tvorijo mrežo molekul
DNA, s katero preverjamo izražanje (ekspresijo) tisočih genov hkrati.

Poznamo različne vrste DNA mikromrež, glede na vrsto molekul DNA, ki predstavljajo
določen gen:

● DNA čipi: Kemična sinteza kratkih, do 20 bp dolgih oligonukelotidov na matrici in situ

(npr. tehnologija Affimetrix) Vsak gen je predstavljen z ve čimi razli čnimi oligonukleotidi
● DNA mikromreže: z dolgimi oligonukleotidi: na podlago nanešeni 50 – 80 bp dolgi
oligonukleotidi Vsak gen je predstavljen z enim do tremi različnimi oligonukleotidi
● cDNA mikromreže : na podlago nanešene delne ali popolne cDNA dolžin 300 – 5000 bp
(tehnologija Patt Brown) Vsak gen je predstavljen z eno cDNA

POTEK:

Imamo kompelentarne sonde (v prebitku) vsem RNA molekulam v celici. Iz RNA naredimo
cDNA in jo označimo s fluorokromi, nato pogledamo jakost vezave. Jakost vezave nato
pretvorimo v količino transkripta.

»RNA sequencing-whole transcriptome shotgun sequencing«

63
Uporablja se za ugotavljanje prisotnosti in količine RNA v biološkem vzorcu. Tudi za
analiziranje spreminjanja celičnega transkriptoma.

»lncRNA (long non-coding RNA)«

So nekodirajoči transkripti daljši od 200 nukleotidov. So brez promotorja in niso podobne

drugim miRNA, siRNA,...

OPERONI
Aktivator=protein, ki pospeši transkripcijo (ni nujen pri prokariontih)

Represor=protein, ki zavira RNA polimerazo, s tem posledično transkripcijo

Oprerator= DNA element, zaporedje na katerega se veže represor

Efektor= majhna molekula

(običajno intermediat
metabolitov- laktoza,
arabitol,...). Veže se na
protein (aktivator/represor)
in preko alosteričnih
sprememb spremeni
konformacijo in s tem
funkcijo proteina.

Pozitivna regulacija – aktivator pospeši/omogoči transkripcijo

Brez aktivatorja se RNA polimeraza ne veže in transkripcija je onemogočena

64
 Negativna regulacija – Represor zavre transkripcijo

Brez represorja se RNA polimeraza lahko veže na DNA in transkripcija poteče

Switch on/off mehanizem

Nekonstitutivno izražani geni se enkrat izražajo, drugič pa ne. Vmesnega stanja ni.
Izražanje je odvisno od okolja (medceličnina, medij,…). Pomembna je vezava efektorja. Je
tipično del prokariontskega uravnavanja genov.

Efektor se veže na alosterično

mesto represorja in spremeni
njegovo konformacijo. Ta se zato
sprosti od DNA in transkripcija je
omogočena. Torej je efekotr
pozitiven.

Podobno je z aktivatorjem –
efektor se veže na alosterično
mesto aktivatorja in ga veže na
DNA ter tako omogoči transkripcijo.

65
 Uravnavanje izražanja pri prokariontih
Lac-operon
Uporablja se za iskanje mutant. Ima nabor genov, ki omogočajo izrabo laktoze
(glu+galaktoza).  Regulacija izražanja operona lac je bil prvi genski regulatorni mehanizem, ki
je bil povsem pojasnjen in je tako postal najpomembnejši primer prokariontske regulacije
genov.

Če laktoze ni, se gen za represor lac-operona izraža in se veže na lac-operon (operator),

torej ovira vezavo RNAP na promotor in tako poteka zgolj šibko prepisovanje strukturnih
genov (tako prepreči delovanje RNA polimeraze na genih za):

● β-galaktozidazo (Z)-cepi laktoza na glu in galaktozo,

● permeazo (Y)-beljakovina, ki se vgradi v celično membrano in mogoča prenos
laktoze v celico in
● transacetilazo (A).

Če je laktoza prisotna, se geni zopet začnejo izražati. Laktozni metabolit ALOLAKTOZA

(INDUKTOR) se veže na represor in ga alosterično inaktivira, mu spremeni konformacijo,
zaradi česar se represor ne more vezati na operator, kar omogoča RNAP interakcijo s
promotorjem in posledično prepis genov lac ter nastajanje kodiranih proteinov. Kot induktor
se uporablja tudi IPTG.

KATABOLNA REPRESIJA

Drugi kontrolni mehanizem temelji

na zaznavanju glukoze in znatno
poveča produkcijo proteinov
operona lac ob pomanjkanju
glukoze. Ciklični adenozin
monofosfat (cAMP) je signalna
molekula (sekundarni
obveščevalec, ki deluje kot
EFEKTOR), katere koncentracija
v celici je obratno sorazmerna s
koncentracijo glukoze. Veže se na
CAP in ga tako aktivira. CAP je
transkripcijski dejavnik, ki pomaga
RNAP pri vezavi na DNK. Ob
pomanjkanju glukoze je
koncentracija cAMP visoka in
vezava CAP-cAMP na DNK
znatno poveča produkcijo
β-galaktozidaze, kar omogoča
celici, da hidrolizira laktozo.

»CAP binding site«

Nastopa kot dimer, ki se veže na DNA in jo ukrivlja. Tako ima RNAP boljšo dostopnost in
delovanje.

66
Arabinozni operon

Za BAD sintezo so proteini:

Induktor (arabinoza) + ara C + cAMP + CAP

Ara C protein se veže na tri mesta: ara I, ara O1 in ara O2. C protein reprimira lastno sintezo
(je negativni regulator za lastno sintezo) in pozitivni regulator za razgradnjo arabinoze. Če ni
C proteina, ni razgradnje arabinoze, ker ni aktiven BAD operon. Če je premalo cAMP, pride
do povezave ara O2 in
ara I in nastane zanka
(ni sinteze!).

Ko arabinoze ni, AraC

protein spremeni
konformacijo DNA in s
tem prepreči
transkripcijo. Lahko
deluje kot promotor ali
aktivator.

Ko je prisotno vse kar

rabimo, se cAMP usede
na zaporedje, zanka se
razpre, ara O2 je
spredaj, arabinoza se
veže na ara I. RNAP vrši
transkripcijo.

Triptofanski operon
Deluje na osnovi negativne
povratne zveze. Gen trpR producira
represor, ki je konstantno izražen v
manjših količinah in se povezujejo v
dimere. Kadar je triptofan prisoten,
se ti triptofanski dimerni represori
vežejo na triptofan, kar privede do
spremembe konformacije represorja
in ta se veže na operator. Tako
prepreči vezavo RNAP na operon,
ni sinteze triptofana.

Kadar pa ni triptofana, represor

ostane v inaktivni konformaciji,
zaradi katere se ne more vezati na
operator, RNAP vrši transkripcijo in
pride do sinteze triptofana.

Prekurzor zanj je horizmat.

67
URAVNAVANJE SPORULACIJE PRI B. subtilis

Sporulacija je odgovor na stres in pomanjkanje hranil. Pri tem sodelujeta dva za sporulacijo
specifična faktorja: sigma E in sigma F. Faktorja sodelujeta pri diferencijaciji materinske
celice in prespore. Kasneje ju zamenjata sigma K v materinski celici ter sigma G v prespori.

ALTERNATIVNI FAKTORJI SIGMA

Pri transkripciji so del kompleksa RNA polimeraze. Potrebni so za iniciacijo

transkripcije. Za različne σ faktorje so značilne različne vezavne regije. Če pride do
mutacije, transkripcija ne poteče. Če potem pravilno mutiramo pravi σ faktor, tako da
prepozna spremenjeno zaporedje, bo transkripcija potekla. Značilna zaporedja – promotorji
obstajajo, ki so podobni, če spremenimo okolje (npr. heat shock, nitrogen starvation). Te
gene imenujemo REGULON – se sočasno izražajo pri določenih pogojih. Aktivirajo jih
alternativni faktorji σ, se sami uravnavajo.

Aktivnost proteinov
ohranjamo s konstantnim
pH, ter s T (katero
bakterije ne morejo
regulirati). Kulturo E. coli
shranjujemo pri T +4.
Pomembno je, da
preprečimo nastanek
kristalov. Vodikov peroksid
je strupen, saj okrisira
disulfidne mostičke v
proteinu.

»HEAT SHOCK RESPONSE« v bakterijah

Ko so bakterije izpostavljene visokim T, se sklop heat-shock (toplotni šok) proeinov (HSPS)

aktivira in prepreči preveliko poškodovanje proteinov. Sigma 32 je odgovoren za transkripcijo
heat-shock genov. Ob povišani T se močno namnožijo, njihovo povečanje pa je posledica
povečane sineze in stabilizacije sigma 32, ki je običajno zelo nestabilen.

5'-konec kodirajočega dela mRNA je za sigma 32. Delujejo kot krioprotektanti (glicerol).

68
 Fag λ (faktor)-uravnavanje genov s povratno zanko
Fag ima dva cikla:

Najprej mora potekati izražanje genov

za cikel, v katerega bo fag šel, glede na
stanje c celici.

● Lizogen (fagna dednina se

vgradi v celični genom in deluje
kot PROFAG)

Celica ni v energetskem stanju, da bi

prevajala proteine faga. Fag se
potuhne/skrije v genom in čaka, da je
celica v ugodnem stanju. Če se celica
deli, sa fagna DNA deduje kot del
njenega genoma. Ko je energetsko
stanje ugodno se začne litični cikel.

● Litičen (povzroči lizo celic)

Če je celica dovolj bogata, da se fag

pomnoži, gre celica v litični cikl. Mora
biti možnost intenzivne translacije
fagnih proteinov.

Genom faga

Na genomu faga si geni za prepis sledijo v dveh smereh. V eno stran so geni za litični cikel, v
drugo pa geni za lizogeni cikel. λ represor preprečuje litični cikel, zgodi se lizogeni cikel,
medtem ko cro represor preprečuje lizogeni cikel, zgodi se litični cikel. Smer odločijo
razmere. Po poti lizogenega cikla se prvo prepiše gen za protein N, ki preprečuje prezgodnjo
terminacijo in omogoči aktivacijo ostalih genov.

Stikalo

V stikalu se odloča za cikel, katerega bo

fagna DNA prepisala. λ in cro represor
imata podobno vezavno mesto. Majhne
razlike povzročijo, da se λ represor z večjo
afiniteto veže na OR1, cro represor pa bolje
na OR3. OR1, OR2 in OR3 so si podobni v
zaporedju nukleotidov. RNA polimeraza se
veže na DNA tam, kjer ima dostop. Če je
prisoten λ represor, se veže na OR3 in
prepisuje v smeri lizogenega cikla, Če pa je
prisoten cro represor, se veže na OR1 in
prepiše gene za litični cikel.

69
Represorji so regulirani in prisotni v veikih količinah. Prevlada smer, ki vodi v litičen cikel.

Proizvodnja rekombinantnih proteinov

Rekombinantno DNA vnesemo v npr. E. coli, ki nato proizvedejo rekombinantne proteine

(inzulin,...).

Humani gen lahko izoliramo s pomočjo:

● restrikcijskih encimov (TEŽAVNO: pri tem izrežemo del supaj z eksoni)

● PCR (TEŽAVNO: imamo gen z vsemi introni-geni se zato v kvasovki nebi pravilno
procesirali)

(lahko sicer izoliramo zrelo mRNA in se znebimo intronov-cDNA).

Vendar če vemo kateri protein želimo, potem poznamo njegovo zaporedje in ga lahko
umetno sintetiziramo v lab. pogojih. Sintetično DNA nato vstavimo poljubno s pomočjo
metode CRISPR. (synDNA-DNA-RNA-protein)

INTERAKCIJA DNA PROTEIN

Kaj lahko mutiramo, da preprečimo normalen

lizogen cikel?

Mutiramo zapis za λ represor: (glutamin oz.

serin). Lahko tudi mutirano varianto vstavimo v
λ represor.

Uravnavanje izražanja pri evkariontih

● Vzorec izražanja je kompleksnejši.
● Evkarionti imajo KROMATIN (nukleosome-histom)
● Poleg RNAP potebujejo tudi druge proteine za transkripcijo, saj je kromatin bolj
kompakten in ga je potrebno razviti. Pri prokariontih je DNA skoraj vedno pripravljeno
za transkripcijo (ta poteka skoraj vedno, kadar je vezana RNAP). Zaradi kompleknosti
potrebujemo več stikal/proteinov.
● Pri evkariontih ni operonov.

PROTEOMIKA je veda, ki se ukvarja s proučevanje celotnih sistemov proteinov, na ravni

celice, tkiva ali organizma. Na genu ob koncu ORF povozimo STOP kodon in vrinemo GPF
(fluorescentni protein), dodamo linker in nato nov STOP kodon. S pomočjo DNA mikromreže
ugotavljamo jakost izražanja.

70
Genska ekspresija je regulirana na različnih nivojih:

● na ravni GENOMA (kondenzacija/dekondenzacija kromatina, matilacije DNA,...)

● na ravni PROCESIRANJA in jedrnega transporta RNA
● na ravni TRANSLACIJE
● na ravni POST-TRANSLACIJSKIH MODIFIKACIJ (zvijanje in vgrajevanje, cepljenje,
kemične modifikacije in import oz. secrecija organelov)

Največ uravnavanja je na ravni TRANSKRIPCIJE:

● Promotor (RNAP se veže na core promotor-jedrni promotor): TATA BOX

Jedrni promotor se nahaja v delu, kjer so splošni TF in RNAP zbrani za začetek transkripcije.

● Regulatorna regija (vsebuje proksimalne elemente) GC bogata regija (napove, kje se

promotor nahaja), CCAAT

Približno 100 nukleotidov nvzdol od promotorja leži več proksimalnih kontrolnih elementov, ki
spodbujajo transkripcijo gena, zaradi interakcije z regulatornimi TF. Število, lokacija in
identiteta teh elemntov se od gena do gena razlikuje.

ENHANCER (ojačevalec)

Znano je, kadar je promotor odstranjen z gena, transkripcija ne poteče. Sam enhancer ne
more zamenjati jedrnega promotorja, vendar pa skupaj z njem lahko prispeva k boljši
transkripciji. Enhancerji so lahko nameščeni daleč od kodirajočega dela gena. Bližje jedrnega
promotorja ga prinašajo »loop« DNA (pentlja). Njihov vpliv na promotor je posredovan s
strani regulatornih TF imen. AKTIVATORJI.

a) Aktivatorni protein se poveže z enhancerjem in tako tvori ENHANCEOSOM.

Upogibanje DNA ga prinaša bližje jedrnemu promotorju. Splošni TF (TFIID) je v bližini
promotorja. Dve od proteinskih podenot TFIID se ločita in delujeta kot
KOAKTIVARORJA. DNA vezavni aktivatorji interagirajo s specifičnimi koaktivatorji in
to omogoča pravilno pozicioniranje TFIID na promotor. Ostali splošni TF se združijo v
kompleks s RNAP in sprožijo transkripcijo.

71
Vijačnica-obrat-vijačnica
(helix-turn-helix)

● Vijačnica za prepoznavanje
(prepozna DNA zap.)
● Stabilizacijska vijačnica
(omogoči, da se DNA
pravilno usede)

TRANSKRIPCIJSKI FAKTORJI
(TF)

Cinkov prst

So posebne samostojne domene

znotraj molekul beljakovin ki,
stabilizirajo strukturo številnih beljakovin. Cinkovi prsti so tudi eden
od transkripcijskih faktorjev in tako uravnavajo izražanje različnih genov.

Aktivacija genov pri mnogoceličarjih je dandanes ena izmed najaktualnejših

tem. Vse celice nosijo enak genski zapis, a se kljub temu diferencirajo v
različna tkiva. Njihova usoda je odvisna od tega, katere kombinacije genov
so aktivirane. Preden se gen aktivira, se morajo na njegov del – promotor –
pripeti številni proteini, ki jim s skupnim imenom pravimo transkripcijski
faktorji. Ta sistem deluje kot stikalo, ki omogoča encimu prepis genske
informacije z DNA na RNA. S transkripcijo nastala RNA največkrat služi kot
predloga za sintezo proteinov (m-RNA), včasih pa je že RNA končni produkt.

Tu se pojavlja vprašanje, kako transkripcijski faktor najde ustrezno vezavno

mesto na promotorju oz. kako ga razlikuje od ostale množice DNA v celici. Izkazalo se je, da
pri tem sodelujejo številne strukture, kot so: helix-zavoj-helix, homeodomene, levcinske
zadrge. Še posebej veliko TF pa vsebujejo majhne izbokline, imenovane cinkovi prsti.

Z ligandi uravnani TF (jedrni receptorji)

Celica se odzove na spremembe v okolju tako, da se na receptor (na površini celice) veže
signalna molekula. Tako se receptor aktivira in prenese signal do TF (v jedru). TF nato
aktivira izražanje (transkripcijo) za specifičen gen. Signal je posredovan s SIGNALNO
TRANSDUKCIJO (signal se prenese in hkrati tudi prevede). Signalna transdukcija je vsak
proces, pri katerem celica pretvori eno vrsto signala ali dražljaja v drugo. Procesi, ki jih
imenujemo signalna transdukcija, pogosto obsegajo zaporedje
znotrajceličnih biokemičnih reakcij, ki jih izvedejo encimi in so med seboj povezane
s sekundarnimi obveščevalci (v prisotnosti cAMP se citoplazemska kinaza A aktivira in sproži
niz reakcij, pride v jedro, kjer fosforilira CREB protein in tako stimulira njegovo aktivacijsko
domeno-AD). Ta je lahko fosforilacija proteina.

Jedrni receptorji imajo poleg aktivacijske domene (AD) tudi ligandno vezavno domeno
(DBD). Proteini, ki so v citosolu in samostojno prehajajo fosfolipidni dvosloj imajo hidrofobne
predele.

Histoni

72
Najbolj pomemben faktor pri izražanju genov so histoni. Ti preprečujejo dostop RNA
polimerazi, represorjem, aktivatorjem itd. DNA, na katero se lahko prosto vežejo je bistveno
manj kot pri prokariontih, saj je ta navita okoli histonov. Za izražanje genov se mora odviti od
histonov.

Transkripcijski faktorji

So proteini z večimi domenami. Ena domena jim je vsem skupna – DBD (DNA binding
domena), ki specifično prepozna domeno na DNA in se nanjo veže. Imajo funkcijo interakcije
med proteini – reagirajo z RNA polimerazo ali drugimi regulatornimi proteini (koencimi,
aktivatorji, TF). Imajo lahko domeno za spremembo kromatina (kromatin se mora
spremeniti/sprostiti za dostop TF, RNA polimeraze, kofaktorjev…). Sposobni morajo biti
sprejeti signal, da jih ti aktivirajo in naprej aktivirajo druge mehanizme regulacije RNA
polimeraze s signali. Primer signala je npr. fosforilacija in sprememba konformacije, da grejo
v aktivno obliko.

AD (aktivacijska domena) aktivira generalne TF (TFIID) (tvori jih TBP-TATA binding proteini
oz. TATA BOX). TFIID nato tvori del RNAPII prediniciacijski kompleks.

● Primer TF – Gal4

S. cerevisiae ima glukozo (grozdni sladkor) za preverenčni vir ogljika, vendar pa lahko s
posebnimi mehanizmi izrablja tudi galaktozo. Pri tem najprej potrebuje transporterje
galaktoze v celico, nato različne encimo, ki omogočajo vstop sladkorja v glikolizo. Geni za
presnovo galaktoze se izražajo v primeru, kadar glukoze ni prisotne, prisotna pa je galaktoza.

Proteini Gal1, Gla1, Gla7 in Gal10 sodelujejo pri izrabi galaktoze. Vsi so regulirani s
proteinom Gal4. Gal4 se stalno izraža in tvori dimer. Ima prepoznavno zaporedje UAS
(upstream activating
sequence), ki je analogna
enhancerju (ojačevalcu).
Razlika je le v tem, kako
daleč od jedrnega
promotorja se nahaja.

Jakost promotorja izraža

količino. Močan inducibilen
promoter je pri prokariontih
Lac, pri evkariontih pa Gal4.

POSTOPEK:

UAS vstavimo pred promotorjem v določeno celico (v kvasovko) pod nadzorom nativnega
promotorja, kjer nadzoruje ekspresijo določenega (tarčnega) gena. Tako Gal4 aktivira
transkripcijo. Lahko uporabimo tudi GFP (zeleni fluorescentni protein) za sledenje genske
ekspresije. LexA služi kot aktivator izražanja/represor UAS genov.

MEDIATOR nastopa pri promotorju in je KOAKTIVATOR. Ni specifičen, saj je aktivator (Gal4)

tisti, ki določa vezavno mesto na DNA.

TF vežemo na svoje prepoznavno mesto (lahko pa speminja svojo lokalizacijo, da se

izražanje hitro inducira).

73
Gal80 inhibira aktivacijsko domeno TF. V prisotnosti Gal3 in galaktoze se vežeta na Gal80,
kar povzroči njegovo sprostitev. Tako je TF aktiven, Gal4 se veže na UAS in začne se prepis
genov za presnovo galaktoze.

Gal4 aktivira izražanje ostalih proteinov. Tvoriti mora dimer z vezavno domeno in aktivacijsko
domeno. Ker se stalno izraža ga ob nepotrebnem izražanju ostalih genov deaktivira drug
protein.

Za ekspresijo Gal genov je pomemben tudi Mig1 transkripcijski faktor (represor), ki inaktivira
gene, ki jih kvasovka ugasne ob prisotnosti glukoze. Uravnava acetilacijo histonov

74
75
Izraba pentoz je za MO nepreferirana, saj jih je manj v okolju (bakterije v vampu imajo npr.
večjo možnost izrabe, saj celuloza vsebuje tudi pentoze).

76
Acetilacija nukleosoma

TUP1- je encim, ki deacetilira histome (preko tega inhibira izražanje genov).

SLEDENJE Z DNAzo

Za izvedbo te tehnike potrebujemo monoklonska oz. poliklonska protitelesa proti

specifičnemu proteinu, ki ga želimo lokalizirati (npr. histone). Protitelesa (Pt) proti
določenemu proteinu proizvajamo z vzbrizganjem tega proteina v laboratorijsko žival. Tako
izovemo imunski odziv, ki tvori specifična Pt, ki jih nato iz krvi izoliramo.

Tehnike, za določitev položaja histonov:

Sekvenciranje (razrez primarne

strukture-AK)-v preteklosti uporabljena
tehnika.

Razrez na peptide (ti imajo točno

določeno maso):

● peptide razrežemo s pomočjo proteinaz

(proteinaza K razgradi vse proteine v
okolici-ni povsem ustreza za to metodo)

Profile lahko določamo s pomočjo masne

spektrofotometrije. Paziti moramo, da
acetilirani histoni imajo večjo maso kot
neacetilirani, zato pride do razlike v spektru.

Ne vemo lokacije histonov na DNA. S

pomočjo sledenja z DNAzo lahko določamo,
kje se veže določen protein (npr. RNAPII).

● 1. način: DNA s pomočjo restriktaz

razrežemo na fragmente, označimo in
razgradimo fragmente s pomočjo DNAze.
Ta razgradi vse fragmente DNA, razen
tiste, na katere so pripeti histoni. V takem
primeru dobimo različno dolge fragmente
(velikost določimo s pomočjo lestvice).

77
● 2. način: KROMATINSKA IMUNOPRECIPITACIJA (Chip)
DNA razrežemo na fragmente, dodamo DNAzo da jih razgradimo. Ostanejo le fragmenti,
na katerih so vezani proteini (npr. histoni). S pomočjo imunoprecipitacije očistimo
proteine, vezane na kromatin. Proteine ločimo od DNA s pomočjo spremembe ionske
jakosti (koncentracije soli). DNA nato sekvencioniramo, da jo identificiramo. (Chip-seq)

Pomembnost metode:

-ugotavljanje lokacije histonov

-ugotavljamo, kje na DNA se nalegajo TF ( na DNA prepoznavno domeno, npr. Gal4):

izdelamo Pt za TF in ugotovimo v katerem trenutku se TF veže na DNA. S spremembo
ionske jakosti ločimo protein od DNA, DNA sekvencioniramo in pridobimo točno lokacijo.

Regulacija TF

TF lahko regulirajo druge TF oz. tudi sami sebe

(npr. STET 12 regulira samega sebe).
Pomembni so mehanizmi povratne zanke. Z
označevanjem (GFP) lahko merimo npr.
izražanje genov v različnih fazah celičnega cikla
in s tem posledično sledimo regulatorjem
celičnega cikla (nanje se vežejo TF). Jakost
izražanja lahko opazujemo na DNA mikromreži.

Diferenciacija

Zaradi diferenciacije je izražanje genov pri

evkariontih zapletenejše. V Go fazi celičnega
cikla so celice diferencirane (se ne delijo). Vsi
geni se utišajo (HETEROKROMATIN), razen
tisti, ki so v zarodnih celicah. diferencirane celice
se ločijo po naboru genov, ki se bodo izražali.

Diferenciacija pri enoceličarjih (PARITVENI TIP KVASOVKE)

Kvasovke so lahko dveh paritvenih tipov: a in α. Celici dveh tipov se lahko parita in nastane
a/α hibrid (2n osebek)-kot diploid nimajo spola. Diploid se lahko deli in nastanejo diploidne
kolonije.

Celice a izločajo signalne

molekule za tip a, imajo pa
receptorje za tip α. Celice α
izločajo signal za α (feromon α)
, imajo pa receptorje za signal
a. Ko se celici zaznata
koncentracijo feromonov, tvorita
izrastke/podaljške (»the
shmoo«) in se spojita v a/α
hibrid.

78
Celice a in α so identične, razen na enem lokusu:

● a nosi zapis za gen a1: MCM 1 protein aktivira a1 specifični gen in pride do izražanja
● α nosi zapis za α2 in α1: α2 specifično aktivira (kot korepresor), pride do izražanja
genov
● diploidno stanje (α2 + MCM 1= ni izražanja).

79
Signalna transdukcija

Gledamo a celico: α feromon se veže na a receptor in povzroči prenos signala preko MAP
kinaz. Delitev celice se prekine. Signal mora tako od receptorjs, ki je na membrani,
pripotovati v citosol. Signal poteka preko večih MAP kinaz (»mitogenska-sproži mitozo
aktivacijska proteinska kinaza«) , vse skupaj pa drži scaffold protein, ki fizično spravi proteine
v nek kompleks, difuzija pa zaradi bližine poteka hitreje in odgovor je hitrejši. Iste proteine
najdemo še v drugih signalnih poteh (cross-talk). Večini je skupen tri-stopenjski prenos
informacije.

FUS 3 nato fosforilira TF in pride do transkripcije.

Takšna arhitektura signala omogoča kompleksnejše sporočanje kot le on/off. MAP kinaze
imajo tudi druge domene, s katerimi lahko sporočajo še druge signale. Ker je več stopenj
dobimo tudi ojačen signal (potrebna je le ena signalna molekula, da se sintetizira več
naslednjih).

80
PARITVENI TIP

Polovica celic v vsakem ciklu zamenja paritveni tip (50 % a-50% α). Endonukleaze
stimulirajo zamenjave paritvenih tipov.

Poskus: izolirajo so mutante, ki ne zamenjajo svojega paritvenega tipa in povzročijo mutacijo

v enem genu. MAT a oz. MAT α je
lokus, v katerem se a oz. α celice ločijo.

Divji tip kvasovke lahko zamenja svoj

paritveni tip (α/a). Imamo lokus, ki se
izraža in določa paritveni tip kvasovke.
Poleg tega ima še dva lokusa, za a in
za α, ki pa sta trajno utišana. Aktivni
lokus se izreže in se na osnovi utišanih
delov vstavi ali tip a ali tip α. Izreže se
pri vsakem podvajanju, nov lokus se
prepiše naključno (lahko tudi isti) v
razmerju 1:1. Tako je pol potomk a in
pol potomk α. Za to rezanje obstaja
posebna endonukleaza, ki pa je v
laboratorijskih sevih ni, da kvasovke
ohranijo svoj tip in se ne spreminjajo
naključno.

Dolgotrajno utišanje genov

Pri evkariontih so nekateri geni trajno utišani. Izgledajo kot geni, ampak se nikoli ne
prepisujejo. Imenujemo jih pseudo-geni. Pseudo-gen in navaden gen sta si lahko identična
po zaporedju, vendar se le en prepisuje. Mutacija v regulatorni regiji onemogoča
prepisovanje in izražanje. Lahko se nahaja tudi v evkromatinu, kjer se geni izražajo, a zaradi
npr. neujemanja transkripcijskih faktorjev z regulatorno regijo se nikoli ne prepiše. Obstajajo
tudi deli genoma, ki imajo vse regije intaktne (tudi regulatorno), a je gen enostavno zaprt in
se ne more prepisati.

81
 Ojačevalno telo interferona ß
TF (specifičen):

Aktivator🡪koaktivator (CBP)🡪splošni TF
(DBP)🡪haloencim (RNAPII)🡪transkripcija

Represor (ni specifičen)🡪korepresor🡪utišanje gena

Interferon-je protein, ki se sprosti ob infekciji z virusom

(pri človeku). Organizem razvije antivirusno imunost.

Ojačevalno telo (ENHANCEOSOM) se tvori med

dvema nukleosomoma:

● pritegne koaktivator (histon acetil

transferaza-HAT, ki dodaja acetilne skupine na
lizin; to povzroči razvitje kromatina; ta acetilira
histon in zniža jakost vezave med histonom in
DNA. S tem naredi kromatin dostopen za druge
proteine.
● nato vstopi splošni aktivator (SWI-SNF), KI JE
PREOBLIKOVALEC KROMATINA (DNA sprosti
iz nukleosoma, tako se sprosti tudi TATA BOX in
nanj se lahko vežejo splošni TF; vezava RNAPII
je tako mogoča in ob acetiliranih histonov je
sposobna transkripcije).

Acetilacija je izjemno pomembna za potisk histonov

(sprostitev DNA).

GCN5-je kompleks, ki acetilira vse naokrog (enhancer,

ki acetilira v celotni regiji)

Enhancer lahko dela tudi v več smeri (up- in downstream). Ne more pa delovati, kadar
se med njim in promotorjem veže enhancer-blocking insulator (izolator?), ki prepreči
nastanek ustreznih zank. DBP tako ne more ustrezno zviti DNA. Izolatorji napovedujejo na
katere gene bo enhancer deloval.

82
 NAVEZAVA NA EPIGENETIKO

Variegacija-do nje pride v primeru inverzije znotraj kromosoma (gen pride npr. v
centromerno regijo-del, ki je utišan). Vmesna regija gena varira, saj se kromatin pomika. Pri
pakiranju heterokromatina lahko pride do premika gena preko hetero/evkromatinsko mejo,
kar povzroči utišanje gena.

Dolgotrajno utišani geno so npr. HMR oz. HML.

miRNA

Majhne molekule RNA, ki utišajo mRNA – izražanje genov. Vezava ni nujno 100%
komplementarna, zato delujejo širše. Vse miRNA se ne vežejo enako močno na vse mRNA
(pogojeno s komplementarnostjo), tako da gene utišajo različno močno. Imamo tudi sisteme,
ki uravnavajo izražanje miRNA.

83
Prevajanje, sinteza proteinov in proteom
RIBOSOMI

Sestavljeni so iz rRNA (katalizira reakcije; encimska funkcija) in ribonukleoproteinov (RNP).

Namenjeni so translaciji mRNA v polipeptidno verigo. Lahko so prisotni v citoplazmi ali pa so
vezani na ER. Ribosomi so RIBOCIMI. Sestavljeni so iz dveh podenot, ki se med seboj
prilegata. Na veliki podenoti poteka sinteza polipeptida, mala podenota vsebuje vezavna
mesta za antikodone, ki jih prinaša tRNA.

Pri evkariontih so ribosomi večji: 80S; so

imobilizirani, premika se molekula mRNA

Pri prokariontih pa 70S (sedimentacijska

enota); translacija poteka vzporedno s
transkripcijo in zaradi velike molekule
mRNA se ribosom pomika.

Nekateri antibiotiki delujejo na ribosome

in tako preprečijo translacijo proteinov, s
tem zaustavi njihovo rast.

Mitohondrijski ribosomi:

Mihonodrijski genom (krožni kromatin) je

kompakten in ima zapis za 13 polipeptidov, vključenih pri oksidativni fosforilaciji,
dve rRNA (ribosomska RNA) in 22 tRNA (prenašalna RNA). Glede na kodirajoče regije v
mtDNA, najdemo eno pomembno nekodirajočo regijo, kontrolno regijo (CR). Včasih
omenjeno regijo imenujejo tudi D-zanka (D-loop). CR regija je približno dolga 1125 bp in
vsebuje promotorje za policistronsko RNA prepisovanje genov, tako lahke, kot težke verige in
mesto začetka podvojevanja »H« verige.

Majhna učinkovitost mtDNA polimeraze in pomanjkanje mtDNA popravljalnega mehanizma

vodi do višje stopnje mutacij mtDNA v primerjavi z jedrno DNA.

Genski kod
Genski kod je večinoma univerzalen in degeneriran (obstaja več kodonov za enako AK;
med seboj si niso enaki tudi v tem, kako uspešno bo translacija potekla). Translacija mRNA
poteka v tripletih nukleotidov – kodonih. En kodon se prepiše v eno aminokislino. Za
nekatere aminokisline se uporablja več različnih kodonov. Te kodone prepoznajo antikodoni
na tRNA, ki prinesejo tudi aminokislino.

»codon bias«

Gre za nesorazmerje med kodoni. Različne vrste M.O. preferirajo različne kodone za neko
AK. tRNA za različne kodone je v celici prisotna v različnih koncentracijah (odvisno od
kopij genov za tRNA), kar pomeni, da kljub enakem zaporedju aminokislin je translacija pri
enem hitrejša.

To je zelo pomembno vedeti pri produkciji rekombinantnih proteinov. Če izoliramo humani

gen in ga vstavimo npr. v E. coli obstaja možnost, da bo translacija potekala počasneje
zaradi različne količine tRNA. Zato je potrebna predhodna optimizacija kodonov.

84
tRNA

tRNA (vmesnik) je sestavljena iz zank in delov RNA, ki se

komplemntarno parijo.

Na tRNA je:

● antikodonska zanka (antikodon, ki prepozna

kodon na mRNA)
● mesto vezave AK (na 3' koncu RNA je vezana
aminokislina. To tRNA preda na ribosomu v verigo
polipeptida. Ko oddisociira gre na aminoacil tRNA
sintetazo, ki prepozna tRNA in nanjo veže
ustrezno aminokislino.
● sekundarne strukture (stebla in zanke)

Kovalentno povezavo AK in tRNA na 3'-mestu katalizira encim aminoacil tRNA sintetaza.

Gre za CCA-rep, ki je pomemben za encimsko prepoznavanje tRNA. Produkt vezave tRNK
in aminokisline je molekula aminoacil-tRNA. Le-ta potuje v notranjost ribosoma, kjer se na
kodon sporočilne RNK veže določena prenašalna RNK (kodon sporočilne RNK in antikodon
prenašalne RNK sta komplementarna). 

Editing site skrbi, da se veže prava AK na tRNA, drugače pride do nefunkcionalnosti.

Ohlapna mesta:

Kodon in antikodon beremo 5'🡪3'

Translacija
Translacija poteka v treh stopnjah: iniciacija, elongacija, terminacija.

Iniciacija

Start kodon je vedno AUG, ki kodira metionin. Ta v proteinih ni veliko uporabljen,

ampak se pojavlja. Zakaj se translacija vedno začne na pravem AUG? Pred start kodonom je
Shine-Dalgarno zaporedje (pri prokariontih), katerega prepozna 16S podenota ribosoma
(vezava tRNA na mRNA). Evkarionti imajo 5' CAP, ki ima podobno funkcijo.

V času ko na ribosomu ne poteka sinteza beljakovin, sta mala (30S) in velika (50S) podenota
v t. i. dinamičnem ravnovesju – podenoti se nenehno združujeta in ločujeta. To onemogoča
mRNK, da bi se vezala na malo podenoto. Na tem mestu nastopi iniciacijski faktor 3. IF-3 se
veže na malo podenoto, s tem onemogoči, da bi se podenoti ponovno združili in istočasno
omogoči, da se veže na mRNK. Pri vezavi ribosoma na mRNK je pomembno predvsem
Shine-Dalgarnovo zaporedje, ki se poveže s komplementarnimi nukleotidi v rRNK 16S. Nato
se f-Met-tRNK veže na začetni kodon (po navadi AUG), za kar je potreben IF-2 na katerega
je vezan GTP. Startna tRNK se (za razliko od ostalih tRNK, ki se vežejo na mesto A) veže na
mesto P. IF-1 nadalje ojača disociacijo med malo in veliko podenoto ter onemogoča, da bi se
na mesto A vezale aminoacil tRNK. Nazadnje se IF-3 odcepi in omogoči veliki podenoti, da
se združi z malo podenoto. GTP se hidrolizira v GDP in IF-2 ter IF-1 zapustita ribosom.
Velika podenota se veže na malo in nastane iniciacijski kompleks 70S.

85
Za iniciacijo translacije so potrebni dodatni faktorji (iniciacijski, elongacijski). Najprej se veže
mRNA na malo podenoto in tRNA s formilmetioninom (modificiranim metioniom), potem se
veže velika podenota. Pri evkariontih je podobno – prepozna 5' kapo in se premakne.

Elongacija

Sprva se tRNK z aminokislino veže na mRNK, za to pa potrebuje pomoč EF-Tu. Na EF-Tu je

vezan GTP in skupaj s tRNK tvorijo tridelni kompleks. Ta kompleks vstopi v ribosom na
mesto A, kjer se tRNK z antikodonom veže na ustrezen kodon mRNK. Ko kompleks vstopi
na mesto A, se GTP pretvori v GDP in kompleks EF-Tu—GDP se disociira. EF-T regenerira
kompleks v EF-Tu—GTP. Sledi peptidilni prenos, pri čemer med AK nastane peptidna vez;
pri tem se AK odcepi od tRNK, ki se nahaja na mestu P. Peptidilni prenos katalizira rRNK
23S, ki je del velike podenote. Zadnji korak je translokacija. Pri tem se mRNK premakne v
smeri od 5' proti 3' koncu tako, da se tRNK, ki je bila prej na mestu A, premakne na mesto P;
tRNK z mesta P pa na izhodno mesto (mesto E) in zapusti ribosom. Translokacija zahteva
EF-G in hidrolizo GTP v GDP. Mesto A tako ostane prazno, a ga kmalu zasede nova tRNK in
cikel se ponovi.

86
87
Terminacija

Na A mesto pride stop kodon, za katerega ne obstaja tRNA. Prepozna pa ga release faktor
(sprostitveni dejavnik), ampak ne s komplementarnim zaporedjem. Povzroči, da se ob
translokaciji sprosti polipeptid in kompleks razpade. Zadnja tRNA ima vezano celotno
peptidno verigo (s C-terminalnem koncu). Če gre za zelo dolg protein, lahko ta že začne
dobivati tercirano strukturo še preden se odcepi od tRNA.

Nonsence supresorji

Nonsense represor je mutacija na tRNA, ki se veže na stop

kodon. V primeru nonsense mutacije se veže na »fake«
stop kodon in doda vezano aminokislino v polipeptidno
verigo, na mesto da bi se vezal release faktor in bi se
translacija končala. Ta učinek se lahko zgodi tudi na pravem
stop kodonu, čemur pa pravimo missense.

Sup35 protein kvasovke pomaga pri terminaciji

translacije. V prionski obliki lahko deluje kot neke vrste
nonsense supresor. Ob spremembi razmer ga lahko
šaperoni spremenijo nazaj v neprionsko obliko.

88
Usmerjanje proteinov v celici
Proteini imajo na začetku prepoznavno sekvenco, ki deluje podobno kot poštna koda za
lokacije v celici. Zaporedje se prepozna in ribosom se vpne na ER. V ER se signalno
zaporedje odcepi, protein se prepisuje in sproti zvija. Protein se prevede do konca in ribosom
oddisociira, protein pa ostane v ER.

Tisti del proteina, ki je v lumnu, bo bil po sekreciji v zunajceličnem prostoru. Del proteina, ki
sega v citosol, ostane v citoplazmi.

Za lokalizacijo proteinov uporabljamo specifična protitelesa. Mnogi proteini so prisotni v

citosolu in jedru in imajo lastnost pleiotropnost (več lokacij proteina z več različnimi
funkcijami).

RAZGRADNJA PROTEINOV-proteasom

5'-kapa na mRNA preprečuje njeno takojšnjo razgradnjo. Razgradnja proteinov potega v

PROTEASOMU (njegove podenote lahko zamenjamo s človeškimi geni). Je kompleks
proteinov, ki prepozna proteine, označene za razgradnjo. Te proteine je potrebno do
proteasoma pripeljati.

Ubikvitinacija

Ubikvitiniran protein je signaliziran

za degradacijo. Lahko je reverzibilno
ali pa tudi ne. Ubikvitin se veže na
protein, namenjen za degradacijo.
Sestavijo se v polipeptidni repek.
Tako signaliziran protein vstopi v
proteasom, kjer se razgradi.
Oligopeptidi se s pomočjo peptidaz
razgradijo do AK, ki se lahko vključijo
v energijski metabolizem oz. v
izgradnjo novih proteinov. Ubikvitin se
ne razgradi. Oligopeptidi ubikvitina se
ponovno razgradijo na posamezne
enote. Te se vežejo na drug protein,
namenjen za degradacijo. Ubikvitin se
torej reciklira.

● Monoubikvitinacija (ni nujno, da signalizira razgradnjo proteina)

● Poliubikvitinacija (razgradnja proteina)

89
MODIFIKACIJE PROTEINA

Predvsem so to posttranslacijske spremembe:

● Acetilacija in metilacija = reverzibilna

● Glikozilacija = ireverzibilna

PROTEOMIKA
Je nabor vseh proteinov. Proteini uravnavajo funkcije v celici (trditev ne drži popolnoma).

»teorija RNA svet«

RNA ima prav tako biološko funkcijo (prenašalka informacij) in ni protein. Brez transkripcije in
translacije. RNA sposobna encimske aktivnosti.

Na osnovi mRNA ne moremo napovedati proteoma. Del proteoma se uravnava neodvisno od

transkriptoma. Pri proteomiki je težava, da ne moremo proteina amplificirati (namnožiti), kot
lahko to storimo z DNA/RNA. Prisoten protein tudi ni nujno aktiven. En gen pri evkariontih
kodira več proteinov (različno povezovanje eksonov).

● Kateri proteini so prisotni v trenutku v določeni celici?

Princip: izvedemo elektroforezo v prisotnosti detergenta

Ločjujemo po velikosti in naboju. Na osnovi pI (izoelektrične točke) proteina ugotavljamo

primarno zaporedje AK. Proteini, vključenih v signalnih poteh, so v celici prisotni v majhnih
količinah.

90
 ● Nabor vseh proteinov, ki lahko nastajajo na osnovi genoma

HUPO-»human proteome organization«

Ugotavljajo ali so vsi geni kodirajoči za proteine ter ali isti gen lahko kodira za več proteinov.

V proteomiki se uporablja masna spektrofotometrija, ki omogoča zaznavanje proteinov

tudi v manjših količinah.

Princip: izdelamo specifična primarna protitelesa, ki se vežejo na iskane proteine. Nato

izdelamo sekundarna protitelesa (nespecifična, vsa enaka); nanje vežemo lahko encim,
barvila, substrat, GFP. Tako ojačamo signal, da lahko lociramo proteine. Poznamo tudi
barvanje s srebrom, označevanje z radioakrivnim žveplom (avtoradiografsko). Na podlagi
izoelektrične točke določimo velikost proteina.

Na podlagi zrele mRNA lahko napovemo primarno strukturo proteina. Problematično je, da
so proteini modificirani, zato pride do variranja v masi.

Endoproteaze na specifičnih mestih cepijo proteine. Dobimo fragmente, katerih maso in s

tem prisotnost aminokislin določimo s spektrofotometrijo. Tako pa ne moremo določiti
vrstnega reda AK v proteinu. Ugotovimo lahko tudi posttranslacijske modifikacije.

Opis proteina

Ko opisujemo protein, moramo navesti:

1- Biološki proces – pod katerimi pogoji se izraža, zraven katerih genov, proteinska
interakcija z drugimi prisotnimi proteini
2- Molekulska funkcija – funkcija proteina
3- Lokalizacija – kje v celici se nahaja

91
FIZIČNE INTERAKCIJE MED PROTEINI

Interaktom
PPI – protein protein interakcije. Izoliramo protein in z njim vse, kar se ga drži
(afinitetna kromatografija). Ali pa izoliramo dva proteina, ju označimo in gledamo, ali
interagirata.

Dvohibridni sistem kvasovke

V kvasovko z okvarjenim genom za Gal4 vstavimo dva plazmida. Na vsakem je gen z

regulatorno regijo in našim proteinom, ki ima na koncu dodano DNA binding domeno Gal4
(izrazi se kot en povezan protein). Drug plazmid je podoben, le da ima zapis za drug protein
z aktivno domeno Gal4. Gal4 je transkripcijski faktor, ki omogoča transkripcijo drugih
proteinov. Gal4 bo intakten in bo deloval le takrat, ko bosta DNA binding domena in aktivna
domena fizično skupaj, kar pa se zgodi le takrat, ko naša proteina interagirata. Interakcijo
prepoznamo kot prisotnost proteinov, ki so uravnavani z Gal4.

Za zaznavanje interakcije transmembranskih proteionv na transmembranski protein vežemo

del ubikvitina in transkripcijski faktor. Na drug protein vežemo preostali del ubikvitina. Če
proteina interagirata prideta oba dela ubikvitina skupaj, kar pa je znak za degradacijo
proteina – encim prepozna le celoten ubikvitin in cepi vez na C' koncu, kar pa sprosti
transkripcijski faktor. Interakcijo prepoznamo kot prisotnost proteinov, ki jih uravnava ta
transkripcijski faktor.

GENETSKA INTERAKCIJA

Živost celice Dva gena Mutacija? Fitnes

živ AB divji tip 1 (100 %)
živ aB a nefunkcionalen; 0,9
mutacija
živ Ab b nefunkcionalen 0,7
mrtev ab dvojna mutanta 0,63 oz 0
Sintetična letalnost (fitnes=0)-je kombinacija mutacij dveh genov (kadar je produkt
esencialen).

92
Kvantitativni fenotip=hitrost razti-FITNES (število potomcev)

EPIGENETIKA
Imamo dva različna osebka (fenotopsko različna zaradi okolijskih dejavnikov). Za lastnost
definiramo:

DEDLJIVOST

93