DNK topoizomeraze su enzimi koji su ukljueni u proces biosinteze proteina.

Neophodnost
postojanja pomenutih enzima u replikaciji se zasniva na dvostruko heliksnom obliku molekula
DNK. Ovi enzimi odmotavaju i zamotavaju, da bi DNK molekuli mogli da kontroliu sintezu
proteina. Takoer olakavaju DNK replikaciju.
Enzim DNK topoizomerazu II-a je kod ljudi kodira TOP2A gen. Topoizomeraze II djeluju
tako to formiraju privremene prekide na dvolananoj DNK. Ovaj energetski zahtjevan
proces, potrauje ATP za reakcioni ciklus u kojem prekidi nastali djelovanjem topoizomeraza
slue kao osi koji omoguuju da se dva lanca DNK kalupa slobodno rotiraju jedan oko
drugoga tako da se replikacija moe nastaviti bez uvijanja DNK ispred replikacijskih ralji
(Cooper & Hausman, 2004). Topoizomeraza II ima znaajnu ulogu u kondenzaciji i
segregaciji mitotikih hromosoma, razdvajanju hromatida u mitozi i razmotavanju
novorepliciranih petlji DNK eukariotskih hromosoma (Corts & Pastor, 2003; Corts et al.,
2003; Cooper & Hausman, 2004), pa se usljed inhibicije aktivnosti ovog enzima hromatide ne
razdvajaju.
Dok se lanci roditeljske DNK razmataju, DNK ispred replikacijskih ralji prilisljena je na
rotaciju. Nekontrolirana rotacija dovela bi do toga da se krune molekule DNK (poput SV40
DNK i hromosoma E.coli) omotaju same oko sebe to bi na kraju blokiralo proces replikacije.
Ovaj problem je rijeen djelovanjem topoizomeraza, enzima koji kataliziraju reverzibilno
kidanje i ponovno spajanje lanaca DNK. Postoje dvije vrste ovih enzima: topoizomeraze tipa I
kidaju samo jedan lanac DNK, dok topoizomeraze tipa II istovremeno kidaju oba lanca.
Prekidi nastali djelovanjem topoizomeraza slue kao osi koje omoguuju da se dva lanca
DNK kalupa slobodno rotiraju jedan oko drugoga tako da se replikacija moe nastaviti bez
uvijanja DNK ispred replikacijskih ralji. Premda su eukariotski hromosomi graeni od
linearnih, ane krunih molekula DNK, njihova replikacija takoer zahtijeva djelovanje
topoizomeraza jer bi se u suprotnom kompletni hromosomi morali kontinuirano rotirati za
vrijeme sinteze DNK.
Topoizomeraza tipa II potrebna je ne samo za razmotavanje DNK ve i za razmotavanje
novorepliciranih krunih DNK molekula koje su postale meusobno isprepletene. ini se da
je topoizomeraza tipa II u eukariotskim elijama takoer ukljuena u kondenzaciji mitotikih
hromosoma. Ispitivanja mutanata kvasca, kao i eksperimenti na vinskoj muici te elijama
sisara, pokazali su da je topoizomeraza II potrebna za razdvajanje hromatida keri u mitozi
sugerirajui njezinu ulogu u razmotavanju novorepliciranih petlji DNK eukariotskih
hromosoma. Topoizomeraze tipa II deluju tako to kreiraju privremene prekide na
dvolananoj DNK. One zahtevaju ATP da zavre reakcioni ciklus u kojem dva lanca DNK
bivaju iseena, DNK provuena kroz prekid, i a prekinuti lanci ponovo spojeni. Obe i
eukariotska i prokariotska DNK relaksiraju i pozitivno i negativno superspiralzovanu DNK,
ali samo prokariotska DNK (nazvana i DNK iraza) moe uvoditi negativne supernavoje.
Negativna superspiralizacija eukariotske elije je posledica pakovanja DNK u nukleozome.
DNK heliks koji e biti prekinut prvo se vezuje za enzim i smeta u aktivni centar. Zatim se u
prisustvu ATP-a vezana DNK iseca a drugi dupleks DNK se provlai kroz otvor na
centralnoj upljini enzima. Pretodno iseena DNK se spaja a provueni deo naputa
kompleks na suprotnoj strani od one na kojoj je uao. Hidrolizom ATP-a enzim se priprema
za novi katalitiki ciklus.Rendgeno strukturnom analizom utvrena struktura enzima ukazuje
da je njegov aktivni centar u obliku srca sa upljinom visine 60 i visine 50. (STANICA)

Potreba za postojanjem ovih enzima je bila prepoznata dugo prije njihovog otkria. Kad su
Watson i Crick utvrdili dvostruko helikoidnu strukturu DNK molekule, oni su napomenuli da
mora postojati mehanizam kojim se rjeava pitanje preplitanja lanaca. Enzim, koji je
originalno bio nazvan giraza, je prvi otkrio harvardski profesor tajvanskog porijekla James C.
Wang.

Konfiguracija dvostrukog heliksa u kojoj DNK lanci prirodno poivaju nije lako
razdvojiva. Lanci moraju da se razdvoje proteinima helikazama da bi drugi enzimi mogli da
transkribuju DNK sekvencu koja kodira proteine, ili da bi dolo do replikacije hromosoma.
Kod takozvane cirkularne DNK dvostruki heliks je spojen u krug, dva lanca su topoloki
vezana, ili vezana u vor. Inae, identine DNK petlje koje imaju razliit broj zavoja su
topoizomeri. Topoizomeraze katalizuju i upravljaju rasplitanjem DNK vorova putem
stvaranja privremenih prekida lanaca koristei konzervirani tirozin kao katalitiki ostatak
(aminokiselinu) (Champoux, 2011). Mogue je da topoizomeraze takoer imaju ulogu u
procesu umetanja virusne DNK u hromosome, i u drugim oblicima rekombinacije.
Postoje tri glavna tipa topologije: supernamotavanje, uvoravanje i vezivanje u lanac. Izvan
esencijalnih procesa replikacije ili transkripcije, DNK mora biti odravana u kompaktnom
obliku, i ova tri topoloka stanja pomau u tome. U toku transkripcije ili replikacije DNK
mora biti slobodna. Dodatno, tokom replikacije, novoformirani i originalni DNK dupleksi se
isprepleu i moraju biti kompletno razdvojeni da bi se odrao genomski integritet elija.
Topoizomeraze mogu rijeiti ove topoloke probleme. One se dijele u dva tipa po osnovi broja
presjeenih lanaca u jednom krugu djelovanja (Wang, 1991). Obje klase enzima koriste
konzervirani tirozin, meutim ovi enzimi su strukturno i mehaniki razliiti.
Tip I topoizomeraza presijeca jedan lanac DNK dvostrukog heliksa, dolazi do relaksacije, i
nakon toga presjeeni lanac se ponovo povezuje. Tip I topoizomeraze se dalje dijele u dvije
podklase: tip IA topoizomeraze, koje dijele mnoge strukturne i mehanike osobine sa tip II
topoizomerazama, i tip IB topoizomeraze, koje koriste kontrolisani rotacioni mehanizam.
Primjeri tip IA topoizomeraze su topo I i topo III. Historijski, tip IB topoizomeraze su
nazivane eukariotske topo I, mada su -[IB}- topoizomeraze prisutne u svim ivotnim
domenima. Tip IA topoizomeraze formiraju kovalentni intermedijar sa 5' DNK krajom, dok
IB topoizomeraze formiraju kovalentni intermedijar sa 3' DNA krajom. Nedavno je
identifikovan tip IC topoizomeraza (topo V). Dok je ona strukturno jedinstvena u odnosu na
tip IA i IB topoizomeraze, ona ima slian mehanizam sa tip IB topoizomerazom.
Tip II topoizomeraza presijeca oba lanca DNK dvostrukog heliksa. Takoer postoje dvije
podklase: tip IIA i tip IIB topoizomeraze, koje imaju sline strukture i mehanizam. Primjeri
tip IIA topoizomeraze su eukariotski topo II, E.coli giraza, i E.coli topo IV. Primjer tipa IIB
topoizomeraze je topo VI.
Oba tipa (I i II) topoizomeraze mijenjaju DNK koeficijent vezivanja (Chernavskii, 2001). Tip
IA topoizomeraze mijenjaju koeficijent vezivanja za jedan, tip IB i tip IC topoizomeraze
mijenjaju taj parametar za bilo koji cio broj, dok tip IIA i tip IIB topoizomeraze mijenjaju
koeficijent vezivanja za dva.

Neki organizmi imaju dvije izoforme topoizomeraze II: alfa i beta. U elijama raka,
topoizomeraza II-alfa se intenzivno eksprimira u jako proliferirajuim elijama. Kod
odreenih vrsta raka, kao to je tumor ovojnica perifernih nerava, visoka ekspresija njegovog
kodiranog proteina je takoer povezana sa visokom stopom smrtnosti pacijenata...
Dvije klase topoizomeraza posjeduju slian mehanizam prolaza kroz DNK lanac i strukturu
domene, no oni takoer imaju i nekoliko bitnih razlika. Tip IIA topoizomeraze formiraju
prekide na oba lanca sa prevjesom od etiri para baza, dok tip IIB topoizomeraza formiraju
dupli prekid sa prevjesom od dvije baze (Buhler et al., 2001). Osim toga, tip IIA
topoizomeraze su u mogunosti da pojednostave topologiju DNK molekule (Rybenkoc,
1997), dok IIB to ne mogu (Corbett, 2006).
Struktura topoizomeraza tipa IIA
Topoizomeraza tipa IIA se sastoji od nekoliko kljunih motiva: N terminalna GHKL domena
(sa girazu, HSP kinazu i MutL); Toprim domene (poznata i kao Rossmann preklop) - koja je
prisutna kod oba tipa II topoizomeraza, topo IA; i bakterijske primaze (DnaG), centralna
jezgra za vezanje DNK (koja tvori srcoliku strukturu); te varijablinu C-terminalnu domenu.
Eukariotske topoizomeraze tipa II su homodimeri (A2), dok prokariotske topo II su
heterodimeri (A2B2). U prokariota, ATPaza domena i Toprim domena se savijaju na jednom
polipeptidu, dok jezgra za umetanje DNK segmenta i CTD lee na drugom polipeptidu. Za
giraze, prvi polipeptid se naziva GyrB a drugi GyrA. Za topo IV, prvi peptid se naziva ParE a
drugi polipeptid ParC.
Struktura N-terminalne ATPaza domene giraze (Wigley et al., 1991) i topo II kvasca (Classen
i Berger, 2003) je razjanjena u kompleksu sa AMPPNP (ATP analog), gdje je pokazano da
dvije domene ATPaze vre dimerizaciju u obliku zatvorene konformacije. Za girazu, struktura
ima znaajnu upljinu u centralnom dijelu, za koju se pretpostavlja da slui za smijetanje T-
segmenta.
Povezivanjem ATPaza-domene sa Toprim preklopom obrazuje se helikoidni element poznat
kao tranduktorna domena. Ovo podruje ima ulogu da obezbjedi komunikaciju nukleotidnog
stanja ATPaza-domene sa ostatkom proteina. Modifikacije na ovoj domeni mogu utjecati na
aktivnost topoizomeraze i istraivanja pokazuju da stanje ATPaze utjee na orijentaciju
transduktorne domene (Verdine group, journal of biological chemistry, 2006).
Sredinji dio proteina sadri Toprim preklop i jezgru za vezanje DNK koja posjeduje krilatu
helikoidnu domenu (WHD winged helix domain), koja se jo esto naziva CAP domena,
budui da je prvi put identificirana zato to nalikuje na WHD katabolitikog aktivatora
proteina. Katalitiki tirozin lei upravo na ovoj WHD. Toprim domena je Rossmann preklop
koji sadri tri invarijantna kiselinska ostatka koji koordiniraju magnezijeve jone ukljuenih u
cijepanje i ponovno povezivanje DNK lanaca. (Avarind et al, 1998). Strukturu Toprim
preklopa i DNK-vezujue jezgre topo II kvasca su prvi odgonetnuli Berger i Wang (1996),
dok su strukturu DNK-vezujue jezgre giraze prvi put razjasnili Cabral sa saradnicima (1997).
Struktura koju je odgonetnuo Berger otkriva bitne uvide u funkciju enzima. DNK-vezujua
jezgra se sastoji of WHD, koja vodi do jedne domene u obliku tornja. Jedna regija smotanog
klupka (coiled-coil) vodi do C-terminalne domene koja formira jedinjenje glavnog dimera za
ovakvo kristalno stanje (esto se jo naziva C-prolaz). Dok izvorna struktura topo II pokazuje
situaciju u kojoj su krilate helikoide domene razdvojene na velike udaljenosti, struktura giraze
pokazuje zatvorenu konformaciju u kojoj su WHD smjetene dosta blie. Kasnije je
razjanjena struktura jezgre topo II u novim konformacijama (Fass et al, 1999; Dong et al.,
2007). Fass struktura pokazuje da je Toprim domena fleksibilna tako da je mogue
koordinirati sa WHD kako bi tvorili kompetentni kompleks za cijepanje. Dokazi za takvu
strukturu je kasnije potkrijepljen strukturom koju su utvrdili Dong et al. u prisutnosti DNK
molekule. Ova posljednja struktura pokazuje da Toprim domena i WHD formiraju kompleks
za cijepanje vrlo slian onome u topo IA, to ukazuje mehanizam savijanja DNK-vezujue
jezgre i cijepanja DNK. Naime, struktura pokazuje da se DNK savija na ~150 kroz
invarijantni izoleucin (u topo II to je I833 i u girazi I172).
Ovaj mehanizam savijanja podsjea na onaj od integracionog faktora domaina (IHF) i HU,
dva konstruktivna proteina u bakterija. Pored toga, dok je kod prethodne strukture DNK-
vezujue jezgre C-prolaz zatvoren, ova struktura pokazuje otvoren C-prolaz, kljuni korak u
mehanizmu dva prolaza.
Nedavno je otkriveno nekoliko struktura DNK-vezujue jezgre u pokuaju da se razumije i
hemijski mehanizam cijepanja DNK lanaca, te strukturna osnova za inhibiciju topoizomeraze
od strane antibakterijskih otrova.
C-terminalna regija prokatiotske topoizomeraze je razrijeena kod vie vrsta prvenstveno
kod giraze i topo IV (Corbett et al. 2004; 2006). Ove strukture formiraju neobini beta barrel,
koji savija DNK tako to vri omatanje nukleinske kiseline oko sebe. Savijanje DNK giraze je
predloeno kao kljuni mehanizam uvoenja negativnih superzavoja u DNK, to je u skladu
sa footprint podacima koji pokazuju da giraza ima footprint od 140 parova baza. C-terminalne
domene kod giraze i topo IV obje savijaju DNK, dok samo giraza uvodi negativne
superzavoje.
Za razliku od funkcije C-terminalne domene kod prokariota, funkcija C-terminalne regije kod
eukariotske topoizomeraze jo uvijek nije jasna. Istraivanja su pokazala da je ovo podruje
regulisano fosforilacijom, to modulira aktivnost topoizomeraze. Meutim, ostalo je da se
obave jo mnoga istraivanja za razjanjenje funkcije eukariotskog C-terminalne regije
topoizomeraze II.
Organizacija topo IIB je slina topo IIA, izuzev to IIB tip ima dva gena koji stvaraju
heterodimere. Jedan gen, nazvan TopoVI-B (jer slii gyrB), sadri kod za ATPaza-domenu, te
transdukternu domenu. Drugi gen, nazvan, TopoVI-A, sadri kod za WHD i Toprim domenu.
ATPaza-domena TopoVI-B je razjanjena u vie stanja nukleotida (Corbett i Berger, 2003).
Veoma je slina GHKL domeni topo II i MutL, to pokazuje kako je nukleotidno stanje (ADP
u odnosu na ATP) utjee na orijentaciju transduktorne domene.
Struktura TopoVI-A je razjanjena od strane Bergerat et al. (1997), koja pokazuje da HTH i
Toprim preklop imaju nove konformacije u usproedbi sa onim of topo IIA.
Nedavno otkrivena struktura TopoVI-B pokazuje otvorenu i zatovrenu konformaciju, dva
stanja koja su predviena u mehanizmu dva prolaza. Ove strukture, od kojih je jedna kristalna
struktura dobivena pomou kristalografije X-zraka, i druga je rekonstrukcija SAXS difrakcije
(small-angle X-ray scattering), pokazuju da ATPaza-domena moe biti otvorena ili zatvorena
(Corbett et al. 2007).
Mehanizam prolaza DNK lanca kroz topoizomerazu tipa II
Topoizomeraza tipa II djeluje kroz mehanizam dva prolaza (iako je to tek povijesna
oznaka), podran biohemijskim istaivanjem (Roca i Wang) kao i istaivanjem strukture
(Berger i Wang). Jedan DNK lanac, nazvan prolaz (the gate) ili G-segment, vezan je za
centralni DNK-vezujui prolaz. Drugi DNK lanac, nazvan transportni lanac ili T-segment, je
obuhvaen dimerizacijom N-terminalne ATPaza-domene (the ATPase gate), kada se veu
dvije molekule ATP-a. Hidroliza ATP-a i otputanje anorganskog fosfata dovodi do cijepanja
G-segmenta, kako katalitiki tirozini tvore kovalentnu fosfotirozinsku vezu na 5' kraju DNK
molekule. To stvara prevjesu (overhang) od etiri baze i dvolanane prekid u G-segmentu.
Kako je odvaja DNK-vezujui prolaz, T-segment se prenosi kroz G-segment. Zatim se G-
segment zapeati, to dovodi do otvaranje C-terminalnog prolaza, omoguujui otputanje T-
segmenta. Otputanje proizvoda ADP-a dovodi do resetiranja sistema, i tako doputajui
obuhvatanje drugog T-segmenta.
Topoizomeraze tipa IIB djeluju na slian nain, izuzev to protein tvori prevjesu od dvije baze
u G-segmentu, dok C-terminalni prolaz nedostaje u potpunosti.
Katenacija
Katenacija je proces u kojem se dva cirkularna DNK lanca povezuju kao karike lanca. To se
dogaa nakon DNK replikacije, gdje se dvije jednolanane niti povezuju i jo uvijek mogu
replicirati, ali se ne mogu razdvojiti u dvije kerke elije. Kako topoizomeraze tipa II cijepaju
oba DNK lanca, oni mogu popraviti ovo stanje (topo I mogu to uiniti samo ako je jedan
lanac ve cijepan), tako da moe ostati taan broj hromosoma u elijama keri. Linerana DNK
kod eukariota je tako duga da se mogu zamisliti gotovo kao beskrajne, stoga je i ovdje
potrebna aktivnost topoizomeraze tipa II iz istog razloga.

DNK topoizomeraze tipa II karakteristino mijenjaju topologiju DNK uvoenjem
koordiniranog privremenog prekida u oba lanca DNK dupleksa. Nakon to DNK segment
proe kroz prekid, krajevi se ponovo spajaju. Kao meuprodukt reakcije, 5' kraj prekinutog
DNK lanca je kovalentno vezan za tirozilni ostatak proteina. Za ovu katalitiku reakciju je
takoer potreba ATP hidroliza (Hsieh, 1990). Ovaj sloeni niz aktivnosti se obavlja pomou
enzima veliine 1017-1621 aminokiselina. Identificiran i sekvenciran je veliki broj gena za
topoizomeraze tipa II (topo II) kod prokariota i eukariota. Bez obzira na izvor i podjele
podjedinica, ova klasa enzima je strukturno i evolucijski konzervirana, jer lanovi dijele
opsenu homologiju aminokiselinske sekvence.