ขั้นตอนการตรวจดูความมีชีวิตของเซลล์ (viability cell count

of Lymphocyte for cell proliferation assay)

Reagent 1.Trypan blue ( MW=960.8),0.2%W/V
โดยละลาย 0.2 g Trypan blue ใน 100 ml nanopore
water และเก็บไว้ในขวดทีอ
่ ุณหภูมิห้อง
2. 5X Saline: 4.25%NaCl (W/V)
โดยละลาย 4.25 g NaCl ใน 100 ml nanopore water
และเก็บไว้ในขวดทีอ
่ ุณหภูมิห้อง
6
3. Cell suspension ที ่ 2-5x 10 cells/ml
อุปกรณ์
1. Microscope
2. Haematocytometer
3. 1.5ml microcentrifuge tube
4. Autopipette 10,200,1000
5. 10-200 และ 1000 µl tips
วิธีการ
1.วันทีท
่ ำาการใช้งานทำาการ mix 4 ส่วนของ 0.2 %
Trypan blue กับ 1 ส่วนของ 5X Saline
2.ทำาการใส่ Reagent ใน microcentrifuge tube ดังนี ้
-สารละลาย Trypan blue 250 µl
-PBS 200 µl
6
- Cell suspension ที ่ 2-5x 10 cells/ml 50 µl
 จากนัน
้ Vortex
3.ใช้ Autopipette Load เซลล์ลงบน Haematocytometer 9
µl แล้วนำาไปส่องดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์นับจำานวนเซลล์ทีไ่ ม่
ติดสี(viable cells)ส่วนเซลล์ทีต
่ ิดสีเป็ นเซลล์ทีต
่ ายแล้ว

% viable cells = No.of viable cells

x 100

No.of viable cells+No.of dead cells

ข้อควรระวัง:หลังจากทำาการย้อมเซลล์ด้วย Trypan blue แล้ว
ต้องตรวจนับภายใน 3 นาทีเพราะว่าถ้าหลังจาก 3 นาทีไปแล้ว
เซลล์อาจจะ uptake สีเข้าไปได้

ขั้นตอนการทำา MTT Assay

1. ทำาการเตรียม MTT โดยชัง่ MTT 0.1 g ละลายใน PBS
20 ml
o
2. กรองโดยใช้ filter 0.22 ไมครอน แล้วเก็บไว้ที ่ 4 c
3. ใน 96 wells plate (ตามรูปที ่ 7)เติม MTT ลงไปหลุมละ
40 µl ทุกหลุมดังรูปที ่ 8
 C
T ………… ………… ……………
… … …
H ………… ………….. ……………
… …
Blank Neg. Pos. รูปที ่ 7
( Medium (cells+Con แสดง 96
+cells) A) wells plate
อย่างคร่าว ๆ

รูปที ่ 8 แสดงการเติม MTT ลงใน 96 well plate

o
4.Incubate ที ่ 5% CO2 37 c เป็ นเวลา 3 ชัว
่ โมง
5.ดูดส่วนทีเ่ ป็ นส่วนใสออก (supernatant) ดังรูปที ่ 9 แล้ว
เติม DMSO 100 µl รอให้ละลาย 15 นาที(shaker)
 รูปที ่ 9 แสดงการดูด supernatant ออกและเติม DMSO เพือ
่ ละลาย
formazan

6.นำาไปวัดค่า O.D. ทีค

่ วามยาวคลืน
่ 540nm ด้วยเครือ
่ ง
Elisa reader

Labeled Template
1.Lymphocyte Assay

C
T
H
Blank Neg. Pos.
( Medium (cells+Con
C
+cells) A)
T
H
Blank Neg. Pos.
( Medium (cells+Con
+cells) A)
2.Cytokine

Assay(template เหมือนด้านบน)ก่อนใส่ cell incubate 3hrs

3.Viability 6 well plate (2ml cells+ 2 ml สาร)Incubate 72-96 hrs

Ctrl C=30 C=40 T=30

Cell+DMSO 1 2 3
7.
 T=40 H=100 Cells+medium
4 5 6

4.Reversible incubate 24 hrs

C=30 C=40 T=30

1 2 3

T=40 H=100 Cells+medium

4 5 6

5.Cytokine Gene expression for lymp (2ml cell+2 med)

C=30 C=40 C=50

1 2 3
Ctrl
Cell+med T=30 T=40 H=100
7. 4 5 6