Professional Documents
Culture Documents
Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp PDF
Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp PDF
1 Phần 1. Mở đầu
phủ đã qui hoạch hẳn 300 ha đất ở Johor và giao cho Hiệp hội hoa lan tổ chức thành
khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”, ngành trồng hoa lan ở Đài Loan
cũng đang tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt doanh thu hằng năm hơn 9,3 tỷ đài tệ.
Ở Việt Nam, nghề trồng Lan phát triển chậm hơn các nước rất nhiều. Việc
trồng lan trên địa bàn TP.HCM lâu nay chủ yếu là do tự phát nên diện tích trồng còn
nhỏ và trình độ tay nghề nông dân chưa đồng đều, ngoài ra người trồng lan vẫn chưa
chủ động được nguồn giống, vì vậy việc trồng lan rất khó khăn, đặc biệt là trồng lan
Hồ Điệp. Loại lan này trồng rất khó và phải đầu tư lớn, từ việc cung cấp dưỡng chất và
giữ ẩm cho cây đến thiết bị nhà ươm, chăm sóc… đều phải nhập ngoại và chịu thuế
khá cao. Đặc biệt, sau 2 năm trở đi cây mới cho thu hoạch thì có thể lúc đó thị trường
đã bão hòa, lợi nhuận thu được không tương xứng với vốn và công sức bỏ ra.
Theo tình hình đó đã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro lan Hồ
Điệp nhằm tạo ra nguồn hoa mới ổn định. Từ nuôi cấy mô, nguồn gene từ các dòng lan
sưu tập sẽ được lưu giữ lại để nâng cao chất lượng giống, đồng thời tổ chức nhân
nhanh để cung cấp cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Tuy đã có một số
thành tựu đáng kể nhưng thực tế vẫn còn nhiều hạn chế như chất lượng giống không
đồng đều và không thể thực hiện trên quy mô lớn.
Dựa vào thực tế đã nêu trên, với đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi
soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. )”, chúng tôi mong
muốn góp một phần vào nền công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp. Trong đề tài này,
lan Hồ Điệp được sản xuất bằng phương pháp nhân giống in vitro tốc độ cao tạo cây
giống có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó,
có thể cho ra đời nhiều giống cây hoa lan Hồ Điệp mới có chất lượng tốt để ngày càng
đáp ứng được nhu cầu của những người yêu hoa Lan.
Hiện nay trên thế giới, các công trình nghiên cứu về phôi soma đã đạt được
những thành công nhất định trên thực vật hai lá mầm, trong khi ở những cây một lá
mầm vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Vì những ứng dụng tốt đẹp mà phôi soma có thể
mang lại, trong đề tài này chúng tôi thử nghiệm một phương pháp tạo phôi soma trên
cây hoa lan Hồ Điệp sao cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản và hiệu quả.
Từ kết quả thu nhận được trong việc tạo phôi soma cây lan Hồ Điệp, chúng tôi
đi xa hơn nữa, bằng cách sử dụng các phôi soma ấy để tạo hạt nhân tạo. Công nghệ hạt
3
nhân tạo là phương pháp tạo một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, có một phôi sinh
dưỡng hoặc "chồi ngủ" được bọc trong một lớp dung dịch alginate (một chất có tác
dụng tạo lớp vỏ cứng bên ngoài cho mầm hạt) có chứa chất dinh dưỡng, phôi này sau
đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh. Đây là một vấn đề đang được các nhà khoa học
trên thế giới quan tâm trong ứng dụng bảo quản phôi vô tính, chất mầm thực vật dài
hạn. Đồng thời mở ra một hướng mới cho việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các
hạt hữu tính có khả năng nẩy mầm thấp và không đồng loạt.
Khi thực hiện đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ mang đến những hiểu biết mới
về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan Hồ Điệp nói riêng và hoa lan nói
chung, đồng thời đem lại những ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật
tại Việt Nam.
tăng trưởng và phát triển là 15oC – 38oC và giống này thường sống ở cao độ 200m-
400m (William và Kramer, 1983).
Tên Phalaenopsis có nguồn gốc từ Phalaina (phalène) và d’Opsis (apparence),
được Blume (nhà thực vật học người Hà Lan) đặt vào năm 1852 khi ông khám phá một loài
lan đặc biệt có hoa giống cánh bướm, đó là Phalaenopsis amabilis.
Đa số các tác giả đều đồng ý xếp chi Hồ Điệp có một nhụy, kiểu phát hoa bên và
có cấu tạo đơn trục. Trong chi này có khoảng 70 loài, được phân bố trong những vùng và
khu vực khác nhau. Các loài này thường xuyên lai chéo với nhau, do đó phả hệ của những
cây nhận được cũng rất phức tạp. Thế hệ con cháu của chúng cũng không thuần nhất. Tuy
nhiên sự lai tạo đưa đến một lợi ích lớn để cung cấp những cá thể luôn đổi mới và những
đặc tính quyến rũ của hoa (Perlz, 1974).
Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô
sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng.
Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh
trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân
tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm
1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà
rốt
Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các
chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện.
Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa
kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá.
Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơnđã được phát
triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh.
Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi
cấy túi phấn cây cà độc dược.
Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc
lá.
2.2.3 Ứng dụng
Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô
đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar. Kỹ thuật này
thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng:
- Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh.
- Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.
- Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến.
- Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn.
- Lai xa.
- Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast.
- Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai.
- Cố định nitrogen.
- Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp.
- Bảo quản nguồn gen quý.
9
có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây
trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài.
Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số
loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác.
Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được
vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế
bào.
11
Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý
và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, ARN và chuyển hóa protein
không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử
lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử
lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động
của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH
do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế
bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giản nở tế bào (Roger
Prat, 1993).
Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, xenluloza,
pectin, …) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981).
(2) Cytokinin
Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần
Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein
(Vũ Văn Vụ và csv, 1993). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy
mô, những chất thường được dùng là Kinetin và BA (Benzyl Adenin).
Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm, làm tăng sự
nở hoa. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo
sinh trưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bứu ở các cây gỗ lâu
năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991).
Cytokinin kích thích sự tổng hợp mới enzym Rubisco (Ribulozo-1,5-biphotphat
cacboxylaza/oxygenaza) hoặc ở mức sao chép (làm tăng hoạt tính ARN-polymeraza)
hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) (Parthier, 1985). Ảnh hưởng của
Cytokinin thấy rõ khi phối hợp sử dụng với auxin (Meredith và csv, 1970). Skoog và
csv (1948) ghi nhận lượng benzyl amino purine cao có tác dụng kích thích sự tạo chồi,
đồng thời ức chế sự phân hóa tạo rễ.
12
sự ngủ của các đỉnh sinh trưởng ngọn, dẫn đến sự hình thành chồi bên và chồi bất định
trực tiếp từ mô cấy.
- TDZ được sử dụng trong quá trình tạo chồi (đặc biệt ở cây thân gỗ) với
nồng độ rất cao. Điển hình như báo cáo tạo phôi trên cây măng cụt bằng nồng độ TDZ
lên đến 2,25mM (Te-Chato và Lim, 1999)
- Sinh phôi: Người ta thấy rằng TDZ, có thể thay thế cho auxin hoặc tổ hợp
auxin và cytokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá
(Gill và Saxena, 1993), đậu xanh (Murthy và csv, 1995), cây phong lữ (Visser và csv,
1992), neem (Murthy và Saxena, 1998), cacao (Li và csv, 1998), … thường là với tỷ lệ
sinh phôi cao hơn so với các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác. Do tính
chất này của TDZ, nên ngoài hoạt tính của cytokinin đã được đề cập nhiều, người ta
cho rằng, TDZ có ảnh hưởng đến quá trình biến dưỡng auxin. Victor và csv (1999) đã
cũng cố cho giả thiết này bằng một khảo sát so sánh hoạt tính phát sinh hình thái của
BAP và TDZ trên cây đậu phộng, ghi nhận sự khác biệt trong hoạt tính là TDZ có khả
năng sinh phôi vô tính, trong BAP không có khả năng này.
- Nuôi cấy protoplast: TDZ kết hợp với auxin (NAA; 2,4-D; NOA) được sử
dụng trong giai đoạn hình thành vách tế bào xung quanh protoplast, khởi đầu cho sự
phân chia tế bào (Chupeau và csv, 1993; Reustle và csv, 1995) và trong giai đoạn tiếp
theo tái sinh từ mô sẹo có nguồn gốc protoplast (Lenzner và csv, 1995). Nhiều báo cáo
khác nhau cho thấy, TDZ ở nồng độ thấp có hiệu quả cao hơn hẳn so với các cytokinin
khác.
- Tạo chồi ngoài vườn ươm : Ngoài các tác dụng sinh chồi in vitro, TDZ còn
có tác dụng kích thích tạo chồi trên cây khi được phun hoặc xử lý vào đất trong vườn
ươm, chủ yếu là tạo chồi bất định từ rễ hoặc phần dưới thấp của cây.
Đi cùng với những ưu điểm trên, nhược điểm của TDZ cũng được ghi nhận,
bao gồm : thủy tinh hóa chồi tái sinh (Debergh và csv, 1992; Briggs và csv, 1988;
Causineu và Donnelly, 1991); biến dị hình dạng lá (van Niewkerk và csv, 1986;
Cambecedes và csv, 1991); chồi chặt và ngắn (Fasolo và csv, 1989; Meyer và van
Staden, 1988); sự khó khăn trong việc kéo dài và ra rễ chồi tái sinh.
14
anthocyanin. Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các
loại, các tế bào rây… hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo
nên chồi và rễ.
Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những mô hay cơ quan có
chứa diệp lục có khả năng quang tự dưỡng (Street, 1969). Hildebrandt và csv. (1963)
cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi
trường và cường độ ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh đến khả năng quang tự dưỡng của
những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) như : cường độ ánh sáng mạnh,
ánh sáng màu xang cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzym,
đường thấp, auxin thấp, CO2 cao, và tăng hàm lượng phosphate (Barz và Husemann,
1982), và những tế bào quang tự dưỡng này có khả năng cố định 14CO2 bằng chu trình
Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon (Yamada và csv, 1982).
Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này
xảy ra do : độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có số
lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần môi
trường nhất là hormon ( Trần Văn Minh, 2003).
Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất sinh trưởng, đôi khi
có dịch chiết (Trần Văn Minh, 2003). Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất
sinh trưởng thêm vào có khác nhau (Trần Văn Minh, 2003). Chất hormon thường tổ
hợp thành 4 nhóm :
(1) Auxin.
(2) Cytokinin.
(3) Auxin + Cytokinin.
(4) Dịch Chiết.
Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyền. Môi trường cấy chuyền
cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất sinh trưởng được giảm nồng độ.
Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô
sẹo có trọng lượng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy chuyền là 20-30 ngày phụ
thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại
tế bào :
(1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng.
18
(2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc.
Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm. Ngoài ra,
nếu sau thời gian dài không cấy chuyền thì mô sẹo sẽ hoá nâu và chết.
Sự hình thành chồi được điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944). Theo Trần
Thanh Vân và Trinh (1978) sự hình thành chồi được điều khiển bằng :
- Tỷ lệ ctytokinin /auxin từ 10-100.
- Carbohydrate như sucrose và các chất hữu cơ như casein hydrolysate.
- Điều kiện nuôi cấy.
- Dịch chiết.
Tạo rễ cần auxin, đường, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng… (Gautheret, 1959).
Adenine sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy hạt
tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi.
20
nhân giống vô tính mà còn tạo ra những thay đổi chuyên biệt và trực tiếp để đưa các
tính chất mong muốn vào các cá thể bằng việc chèn thêm những trình tự gen cố định
vào tế bào sinh dưỡng. (Saiprasad, 2001).
Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào sinh phôi có các đặc tính cơ
bản như sau: tế bào nhỏ, có cùng một đường kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh
mẽ, có cường độ tổng hợp ribonucleic acid rất cao, có tế bào chất đậm đặc, không bào
rất nhỏ, nhân to, dễ nhận thấy, hạch nhân rất to và sậm màu, đặc biệt là các tế bào này
có một lượng lớn các ribosom, ty thể, lưới nội chất nhỏ và có vách rất dày (Ammirato,
1987; Emons, 1994; Raghvan, 1983; Thorpe, 1988).
Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua
phôi hình tim và phôi hình thủy lôi.
2.5.4 Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính
Việc cảm ứng tạo phôi vô tính là một trong những công việc khá mới mẻ và rất
khó khăn. Để đạt được hiệu quả cao và thành công, việc tìm hiểu các điều kiện sinh lý,
hóa học tác động đến sự hình thành phôi là một công việc rất quan trọng.
Mẫu cấy
Mỗi loại mẫu cấy có những khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau. Sự lựa chọn
mẫu cấy rất khắc khe, ví dụ, nhiều loài một lá mầm đòi hỏi mẫu cấy phải ở một giai
đoạn cụ thể nào đó của hợp tử phôi non thì mới hình thành mô sẹo từ đó tạo phôi vô
tính. Những bộ phận thích hợp được sử dụng để nuôi cấy tạo phôi Asparagus
officinalis, Lilium như chồi đỉnh, cuống lá, lóng thân, mầm, phôi chưa trưởng thành,
còn những bộ phận khác thì hiệu quả tạo phôi rất thấp (Hisato Kunitake, 1998).
Nguồn cacbohydrate
Sucrose là một nguồn cacbon chính trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên trong
một vài trường hợp, galactose (Cabasson và cộng sự, 1997), lactose (Jumin và Nato,
1995), maltose (Dhir và Yavada, 1995), glucose và fructose (Canhoto và Cruz, 1994)
24
và manitol (Kunitake và cộng sự, 1991) khi kết hợp với sucrose đã đẩy mạnh sự cảm
ứng tạo phôi cũng như sự phát sinh hình thái bình thường của phôi.
dụng TDZ, chất điều hòa tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng
tạo phôi vô tính ở một số thực vật hai lá mầm (Murthy và cộng sự, 1998). Vì vậy trong
những năm gần đây việc sử dụng TDZ đã trở nên phổ biến.
Môi trường không có hormone thường được sử dụng cho sự phát triển của phôi
vô tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con. Đôi khi, những nồng độ
thấp của hormone trong môi trường cần cho sự biểu hiện hoặc trong môi trường cần
cho sự phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo loài, để kích
thích sự phát triển bình thường của phôi.
Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lưỡng cực cần phải có tín hiệu của một
loại hormone. Ngược lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có hai tín hiệu hormone
khác nhau: đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trường khác nhau. Để
những tế bào phôi phát triển bình thường thành những cây con thì cần một môi trường
khác, có hoặc không có hormone.
Thời gian xử lý
Khoảng thời gian mẫu cấy được xử lý với chất điều hòa tăng trưởng là một
nhân tố quan trọng trong việc cảm ứng cũng như hình thành phôi vô tính một cách
bình thường. Khi mẫu cấy được chuyển sang môi trường không có nhân tố tăng
trưởng, một khoảng thời gian tối thiểu là 8 ngày rất cần thiết cho việc cảm ứng hình
thành phôi với một hiệu quả rất cao mà không cần quan tâm đến dạng chất điều hòa
tăng trưởng đã sử dụng.
nồng độ sucrose cao (4-6%) được bổ sung ở giai đoạn cảm ứng và phát triển của phôi
thì rất có lợi cho việc tạo phôi ở một số loài thực vật.
Kiểu gen
Một vấn đề thường gặp trong cảm ứng tạo phôi nữa là sự phụ thuộc rất lớn vào
loại cây trồng và kiểu gen. Kiểu gen có một ảnh hưởng to lớn trong việc cảm ứng tạo
phôi của hầu hết các loài thực vật. Không phải tất cả các thực vật đều có khả năng cảm
ứng tạo phôi. Đối với những cây tự thụ phấn, những giống cây khác nhau thì khả năng
phát sinh phôi vô tính cũng có thể khác nhau.
Đã có các thí nghiệm khác nhau tiến hành trên các loài có kiểu gen khác nhau để
khảo sát khả năng hình thành phôi vô tính. Chẳng hạn như ở cây Asparagus, người ta
đã quan sát khả năng tạo phôi vô tính trên các giống có kiểu gen khác nhau (Hisato và
Masahiro, 1998). Delbreil và Julien (1994) đã mô tả những khác biệt quan sát được từ
tần suất tạo phôi từ chồi dỉnh của 12 giống Asparagus có các kiểu gen khác nhau.
Những khác biệt về tần suất hình thành phôi ở các loài đa bội ( lưỡng bội, tứ bội) cũng
đã được phát hiện ( Kunitake và cộng sự, 1992). Haensch và cộng sự (1996) đã quan
27
sát khả năng hình thành phôi vô tính và tái sinh cây ở những giống Lilium có kiểu gen
khác nhau.
Cường độ chiếu sáng
Các nhân tố khác trong môi trường nuôi cấy như là cường độ ánh sáng cũng có
ảnh hưởng đến việc cảm ừng tạo thành phôi vô tính. Các nghiên cứu cũng đã baó cáo
về những ảnh hưởng khác nhau của chế độ sáng và tối. Nhìn chung, chế độ tối đã cho
thấy có những ảnh hưởng tốt hơn trong giai đoạn cảm ứng. Ở một số loài thực vật, sự
cảm ứng cần có những điều kiện ủ trong tối. Những điều kiện trong tối có thể được tạo
bằng cách bao môi trường nuôi cấy bằng những tấm nhôm mỏng hoặc đặt chúng trong
hộp carton. Những nghiện cứu tạo phôi vô tính ở loài Gossypium kltzschianum và
L.longiflorum đạt được kết quả tốt khi nuôi cấy trong tối (Yuqiang Sun và cộng sự,
2003; Tribulato, 1997).
2.5.5 Những vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính
Một vài vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở vài loại thực
vật là sự xuất hiện những phôi dị thường. Các lá mầm có thể bị xoắn lại, mô phân sinh
chồi có thể có hình dạng không bình thường hoặc có thể thiếu. Những trường hợp này
cần phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất hiện bình thường và sự phát triển
của phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến vừa phải các chất điều hòa tăng
trưởng trong môi trường, sử dụng acid abscisic hoặc những cách xử lý thẩm lọc cao,
hay bằng những phương pháp vật lý khác như sự sấy khô (Ammirato, 1983; Parrott,
1988).
Những thực vật được tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào có thể bị
biến dị về hình thái hoặc biến dị ở phần sinh dưỡng. Tuy nhiên, những trường hợp đó
ít xuất hiện ở những cây được tái sinh bởi sự phát sinh phôi vô tính hơn là những cây
được tái sinh từ sự phát sinh cơ quan (Ammirato, 1987; Reisch, 1983). Nếu những cây
được sử dụng với mục đích nhân lên, thì việc kiểm tra lại kiểu di truyền là rất quan
trọng bằng cách tiến hành kiểm tra độ hữu thụ và chỉ số di truyền cho nhửng đặc điểm
tiêu biểu. Nếu những cây được sử dụng với mục đích sản xuất thì những kiểu biến dị
nên được bỏ đi.
28
Một điều đáng chú ý nữa là sự phát sinh phôi vô tính và sự phát sinh cơ quan
thì không loại trừ nhau. Ví dụ, cỏ ba lá có thể được tái sinh từ phôi vô tính (Phillips và
Collins, 1984). Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự phát triển chồi
thì cũng tạo ra phôi vô tính, sau đó nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự nhân lên
của chồi thì đã tạo ra nhiều cây tái sinh hơn so với khi nuôi cấy bình thường.
Vì vậy những phương pháp làm cho phát sinh phôi và làm tái sinh cơ quan
được kết hợp để làm tối ưu hóa khả năng tái sinh cây. Thật thú vị khi trên cùng môi
trường thuận lợi cho sự phát triển sinh cực chồi của những phôi vô tính cũng là môi
trường thích hợp để tái sinh những hợp tử phôi lai khác loài. Từ đó cho thấy đã có một
vài đặc điểm tương tự giữa phôi hợp tử và phôi vô tính
nền công nghệ sinh học thực vật, tuy nhiên đây là một công việc khó khăn và khá mới
mẻ.
Tạo phôi thông qua nuôi cấy protocorm lan Hồ Điệp (Jen Tsung Chen và
Wei Chin Chang, Đài Loan):
Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang là 2 nhà nghiên cứu lan nổi tiếng ở châu
Á. Hai ông tiến hành nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trường ½ MS không
bổ sung chất điều hoà sinh trưởng. Sau 45 ngày nuôi cấy, 28.1% mẫu cấy hình thành
phôi, trung bình 1 mẫu hình thành 1 phôi.
Khi nuôi cấy thử nghiệm Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trường MS bổ sung
TDZ (0.45M, 4.54M, 13.62M), hai ông thấy rằng TDZ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự
hình thành phôi vô tính. Trong đó, môi trường bổ sung TDZ nồng độ 13.62M cho hiệu
quả tạo phôi cao nhất: gần 100% mẫu protocorm hình thành phôi (45NSC). Trung bình
30
13.5 phôi/mẫu cấy… Ngược lại, khi bổ sung thêm NAA (nồng độ 0.54M và 57.37M)
sẽ ức chế sự tạo phôi.
Phƣơng pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ cuống hoa (Ken Tokuhara và
Masahiro, Nhật Bản)
Theo báo cáo của hai nhà khoa học người Nhật này, khi nuôi cấy mẫu cuống
hoa trên môi trường New Dogashima (NDM) có chứa (NAA 0,5µM + BA 4,4µM +
sucrose 29,2 mM) thì mô sẹo phát sinh phôi (embryo callus) sẽ được tạo thành sau 7
tháng nuôi cấy, với tỉ lệ 73% mẫu cấy hình thành embryo callus.
Tác động của điều kiện nuôi cấy và cơ quan nuôi cấy lên sự hình thành
phôi soma lan Oncidium (Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang):
Theo báo cáo của tác giả, sự hình thành phôi có liên quan đến vị trí mẫu cấy:
những mảnh có vị trí ở phía đầu lá có khả năng tạo phôi cao hơn là ở những vị trí khác
và môi trường tốt nhất cho việc tạo phôi lan Oncidium là: môi trường 1/2MS (chứa
85mg/l KH2PO4) bổ sung 10-20 g/l sucrose, 170mg/l NaH2PO4 và 0,5 mg/l peptone.
Phƣơng pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ mô sẹo (Nguyễn Bá Hùng ,
Hồng Ngọc Trâm, 2005).
Phôi vô tính sẽ hình thành khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS bổ sung
NAA 0,5 mg/l + BA 2 mg/l + đường 30g/l sau 11 tuần nuôi cấy.
31
Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để nói đến các phôi
vô tính hoặc các thể nhân giống khác được bao lấy bởi một lớp gel mang chất dinh
dưỡng, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài, vận chuyển trở nên dễ dàng hơn.
Khái niệm được đưa ra lần đầu tiên bởi Murashige vào năm 1978.
Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phôi vô tính có vai trò rất quan trọng trong
việc trồng trọt ở những loài thực vật :
(1) Không tạo được hạt
(2) Hạt được tạo thành với một số lượng thấp
(3) Khả năng hạt sống sót thấp
(4) Việc nhân giống thực vật khó khăn và chất mầm không thể bảo quản
được.
2.6.2 Mục đích của sự ra đời công nghệ hạt nhân tạo
Sự biểu hiện thành công của việc tái sinh cây thông qua sự hình thành phôi vô
tính ở một vài loài thực vật đã mở ra một phạm vi ứng dụng mới đó là tạo hạt nhân tạo
nhằm tạo một hệ thống vận chuyển dễ dàng cho việc gieo trực tiếp phôi lên đất trồng.
Khả năng tái sinh cây của một số loài thực vật từ phôi vô tính và sự thích hợp khí hậu
sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất nhằm đạt đến thành công
trong việc tạo hạt này. Phôi vô tính được tạo thành in vitro thiếu một vỏ bao ngoài và
có khuynh hướng nẩy mầm ngay tức khắc (nếu phôi đã trưởng thành) dưới những điều
kiện tối ưu hoặc có thể chuyển vào trạng thái thụ động nếu bị thiếu nước (Litz và
Gray, 1992). Ngược lại phôi hợp tử với vỏ bao bên ngoài có một khả năng chịu hạn rất
cao (Senaratna và csv, 1990, 1995; Teng và Hor, 1997). Do đó, cần có một hệ thống
để cảm ứng phôi vô tính sao cho nó hoạt động giống phôi hợp tử, và từ đó có thể chịu
đựng được những tổn hại ở mức tối thiểu.
33
Dùng dao cắt những chồi (shootbud) có kích thước 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro.
Với nguyên liệu là phôi vô tính
Bước 2. Dùng pince cấy gắp các phôi/chồi cho vào môi trường tạo vỏ alginate.
Bước 3 Dùng pipette 10ml hút môi trường alginate có chứa chồi/phôi nhỏ vào
dung dịch CaCl2.2H2O 100mM trong 15 phút.
Somatic embryos formed from cultured plant parts are ideal for artificial seed production.
Bước 4. Dùng pince gắp hạt vào đĩa petri có chứa nước cất vô trùng để làm
sạch lượng CaCl2.H2O còn sót lại.
Bước 5. Cấy hạt nhân tạo vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng).
35
2.6.4 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo
Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực
hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém. Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một
yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính chất lượng cao, có sức
sống tốt, và các phôi này phải phát triển đồng bộ. Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn
diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ
phôi đến cây con cao. Quá trình làm vỏ bọc cho phôi chỉ quan trọng trong sự vận
chuyển phôi, nó không phải là một nhân tố làm giới hạn sự phát triển của hạt nhân tạo.
Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là
agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan,
gelrite (Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum
… những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có chất điện
phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào
những liên kết ion. Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó
là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv,
1993). Alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính
dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp sinh
học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải để có
thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn
thương bên ngoài.
2.6.5 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium
Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một
polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G)
(Aoyagi và csv, 1998).
36
Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate
chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp
NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na+ có trong hỗn hợp sodium alginate
với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số
lượng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+. Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium
alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể
tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất.
Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng
bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng,
chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa
cho tăng trưởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh
và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nước, hay các tổn thương cơ
học, tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng
sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật.
Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate
cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn
đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ
bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã
có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng
sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cường
khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ
bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi.
37
Nồng độ (mg/l)
Nghiệm thức Môi trƣờng
2,4-D BAP
1.1(đối chứng) VW 0 0
1.2 VW 0,01 0
1.3 VW 0,1 0
1.4 VW 1 0
1.5 VW 0 0,01
1.6 VW 0 0,1
1.7 VW 0 1
1.8 VW 0,1 0,01
1.9 VW 0.1 0.1
1.10 VW 0.1 1
1.11 VW 1 0.01
1.12 VW 1 0.1
1.13 VW 1 1
Các chất khác agar (8,6g/l) + sucrose (40g/l) + nước dừa (200ml/l) + than (1g/l)
40
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành
mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro
Nồng độ
Nghiệm thức Môi trƣờng
Đƣờng (mg/l) Nƣớc dừa (ml/l)
2.1(đối chứng) VW 0 0
2.2 VW 20 100
2.3 VW 20 150
2.4 VW 20 200
2.5 VW 40 100
2.6 VW 40 150
2.7 VW 40 200
2.8 VW 60 200
2.9 VW 80 200
Các chất khác 2,4-D (0,1 mg/l) + BAP (0.01 mg/l) + agar (8,6 g/l) + than(1 g/l)
41
Dùng dao phẩu thuật tách rời các phôi hình tim.
Dùng pince cấy gắp các phôi cho vào môi trường tạo vỏ alginate. Dùng
pipette hút môi trường alginate có chứa phôi nhỏ vào dung dịch CaCl2.2H2O 100mM.
Sau 15 phút dùng pince cấy gắp hạt vào đĩa petri có nước cất vô trùng.
Rửa hạt bằng nước cất vô trùng làm sạch lượng CaCl2.2H2O còn sót lại bên
ngoài vỏ hạt.
Sau khi thực hiện xong giai đoạn tạo vỏ hạt nhân tạo, hạt được cấy vào môi
trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng).
Quan sát khả năng tái sinh thành cây con của hạt.
44
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến thời gian hình
thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro
Thời gian
2,4D BA Màu sắc của Độ cứng
Nghiệm hình thành
thức (mg/l) (mg/l) mô sẹo của mô sẹo
mô sẹo (NSC)
1 (ĐC) 0 0 19.88 Trắng xanh Xốp
2 0,01 0 20.88 Trắng xanh Xốp
3 0,1 0 20.55 Trắng xanh Xốp
4 1 0 20.55 Trắng xanh Xốp
5 0 0.01 19.66 Vàng xanh Chắc
6 0 0.1 19.77 Vàng xanh Chắc
7 0 1 20.00 Vàng xanh Chắc
8 0,1 0.01 20.22 Vàng xanh Chắc
9 0.1 0.1 19.44 Vàng xanh Chắc
10 0.1 1 20.44 Vàng xanh Chắc
11 1 0.01 20.44 Trắng xanh Xốp
12 1 0.1 21.00 Trắng xanh Xốp
13 1 1 20.44 Vàng xanh Chắc
46
Nhận xét:
Kết quả cho thấy thời gian hình thành mô sẹo ở nghiệm thức 9 (môi trường VW
bổ sung thêm 0.1 mg/l 2,4-D và 0.1 mg/l BA) là sớm nhất: 19.44 NSC. Tuy nhiên
không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức.
Về mặt hình thái của mô sẹo, chúng tôi nhận thấy:
Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì mô sẹo có màu trắng xốp, dễ
vỡ.
Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì mô sẹo thường có màu vàng
xanh và khá chắc.
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình
thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC)
Ghi chú:
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự
khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
Nhận xét:
Sau khoảng thời gian từ 30 – 45 ngày sau khi cấy, sự đáp ứng của mẫu cấy với
các loại môi trường đã có sự khác biệt rõ ràng.
Nghiệm thức 1 (đối chứng) có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo thấp, vì ở môi trường
không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, PLB có khuynh hướng tăng sinh tạo thêm
nhiều PLB mới.
48
Riêng nghiệm thức 13 có tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cũng rất thấp, mẫu cấy phát triển
yếu nên tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng khá cao (64.45%).
Ở nghiệm thức 8 (2,4-D=0.1mg/l kết hợp BA=0.01mg/l) là môi trường có tỉ lệ
mẫu cấy tạo mô sẹo lớn nhất: 80% và đây cũng là môi trường có tỉ lệ mẫu chết và
không phản ứng ít nhất (4.44%).
Kết luận sơ bộ
Ở nghiệm thức đối chứng, PLB cũng có khả năng tạo mô sẹo nhưng còn thấp,
chủ yếu là tăng sinh PLB hoặc mẫu không phản ứng.
Nghiệm thức 8 đạt tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất và tỉ lệ mẫu chết thấp nhất nên
thích hợp để tạo mô sẹo lan Hồ Điệp từ PLB.
Nghiệm thức 5 chứng tỏ việc sử dụng kết hợp 2,4-D và BA ở nồng độ cao cùng
lúc đã gây ức chế quá trình phát triển của mẫu cấy PLB lan Hồ Điệp.
Qua kết quả thu nhận được ở thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy:
Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì từ protocorm sẽ phát triển thành
mô sẹo nhiều hơn và mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ.
Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì khả năng hình thành mô sẹo sẽ
thấp, còn khả năng tăng sinh protocorm và tái sinh chồi tăng lên. Do đó mô sẹo thường
có màu vàng xanh và khá chắc.
Ở môi trường mà tỉ lệ 2,4-D và BA quá cao thì mẫu rất dễ chết, khả năng tạo
mô sẹo thấp.
49
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình
thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC)
Đường đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy mô, đây là nguồn cung cấp
carbohydrate chủ yếu, giúp cho cây có khả năng sinh trưởng trong điều kiện in vitro.
Bên cạnh đó, nước dừa cũng được sử dụng khá phổ biến do nước dừa có chứa Myo-
Inositol, Riboflavin, Axit folic…có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu cấy
trong quá trình tạo mô sẹo cũng như tái sinh cây.
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến thời gian hình thành
mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro
Nƣớc Thời gian hình
Nghiệm Đƣờng
dừa thành mô sẹo
thức (g/l)
(ml/l) (NSC)
1 (ĐC) 0 0 0.00B
2 20 100 21.11A
3 20 150 20.89A
4 20 200 19.89A
5 40 100 21.11A
6 40 150 20.22A
7 40 200 20.22A
8 60 200 20.56A
9 80 200 20.22A
CV(%) 13.8
Ghi chú:
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự
khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
Nhận xét:
Nghiệm thức 4 có thời gian hình thành mô sẹo sớm nhất, có sự khác biệt rất có ý
nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng do ở nghiệm thức này không có
sự xuất hiện mô sẹo. Bên cạnh đó, nghiệm thức 4 lại không có sự sai khác về mặt
thống kê so với các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức đối chứng).
50
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo
từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC)
Ghi chú:
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự
khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
Nhận xét:
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình
thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro, 40 ngày sau cấy chúng tôi nhận
thấy, trừ nghiệm thức đối chứng, các nghiệm thức còn lại đều xuất hiện mô sẹo. Mô
sẹo ban đầu có màu trắng vàng xốp, sau đó chuyển sang màu vàng xanh và chắc.
Trong đó, nghiệm thức 7 (VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa) có tỉ
lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất: 80% mẫu, có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với
nghiệm thức đối chứng: không có mẫu nào hình thành mô sẹo.
Ngoài ra, nghiệm thức đối chứng còn có tỉ lệ mẫu không phản ứng và mẫu chết
cao nhất (28.89%). Ngược lại, nghiệm thức 7 có tỉ lệ mẫu chết thấp nhất (4.44%).
51
Kết luận sơ bộ
Về khả năng tạo mô sẹo, khi ta thay đổi nồng độ đường (0-80g/l) và nước dừa
(0-200 ml/l) thì tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cũng thay đổi. Chứng tỏ nồng độ
đường và nước dừa có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo mô sẹo của protocorm lan Hồ
Điệp, có tác dụng kích thích khả năng tạo mô sẹo khi tăng nồng độ. Trong đó môi
trường VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa cho tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô
sẹo cao nhất (80% mẫu) nên được khuyến khích sử dụng.
52
Hình 4.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường đặc TDZ 2mg/l.
53
Thí nghiệm 3b : Nuôi cấy trên môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút)
Khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường lỏng lắc chúng tôi quan sát thấy lượng
sinh khối tạo ra ít hơn so với nuôi cấy trên môi trường đặc, phần lớn có màu tối và khá
chắc. Trong đó nghiệm thức 4 với nồng độ TDZ 2mg/l có lượng sinh khối cao nhất và
màu sáng hơn các môi trường còn lại, đặc biệt xuất hiện một số mô sẹo có màu xanh.
Hình 4.3 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường TDZ lỏng lắc.
Mô sẹo thu được từ thí nghiệm 3 được tách thành những cụm nhỏ và cấy
chuyền sang môi trường ½ VW.
Sau 45 ngày nuôi cấy chúng tôi nhận thấy xuất hiện nhiều các cấu trúc giống
phôi trên bề mặt embryo callus (sinh khối thu được ở bước 1). Quan sát dưới kính hiển
vi soi nổi thì chúng ta có thể thấy rằng các dạng này có hình thái tương tự như hình
thái phôi vô tính, cũng trãi qua tất cả các giai đoạn phát triển: hình cầu, hình tim, hình
thuỷ lôi, hình lá mầm. Kết luận rằng đây chính là phôi vô tính của lan Hồ Điệp
(phalaenopsis.sp)
54
Hình 4.4 Các giai đoạn phát sinh phôi ở lan Hồ Điệp
Sự phát sinh phôi vô tính này có sự khác nhau đáng kể giữa các mẫu cấy
chuyền từ những bình nuôi cấy ở thí nghiệm 3.
Mô sẹo từ các bình nuôi cấy đặc ở thí nghiệm 3a ban đầu tiếp tục gia tăng
sinh khối, chỉ có 1 số ít phôi vô tính xuất hiện.
Mô sẹo từ các bình nuôi cấy lỏng lắc ở thí nghiệm 3b có kết cấu khá chắc và
tạo ra lượng phôi vô tính khá nhiều.
55
Bảng 4.5 Số phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3a và 3b sang
môi trường đặc 1/2VW
Nghiệm Nồng độ của Số phôi/mẫu cấy từ Số phôi /mẫu cấy từ môi
thức TDZ (mg/l) môi trƣờng đặc (3a) trƣờng lỏng lắc (3b)
3.1 0 0.00D 0.00E
3.2 0,1 2.67C 4.33D
3.3 1,0 4.33BC 12.67C
3.4 2,0 10.67A 39.67A
3.5 3,0 5.67B 20.00B
CV(%) 23 18,3
Ghi chú:
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự
khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
Nhận xét:
Kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu quả tạo phôi ở những mẫu cấy được cảm ứng
trên môi trường TDZ lỏng lắc ở thí nghiệm 3b cao hơn hẳn so với những mẫu cấy
được cảm ứng trên môi trường TDZ đặc ở thí nghiệm 3a.
Trong đó, số phôi hình thành nhiều nhất (39,67 phôi) là ở những mẫu cấy được
cảm ứng trên môi trường lỏng lắc với nồng độ TDZ 2mg/l. Trong khi nghiệm thức đối
chứng không có phôi nào được tạo ra.
Bảng 4.6 Sự phát sinh hình thái của phôi soma ở các loại môi trường (75NSC)
Xuất hiện Xuất hiện Xuất Xuất hiện
Nghiệm thức
mô sẹo protocorm hiện chồi rễ chồi
MS X X
MS+30g Khoai tây X X X
MS+30g Khoai tây+1g Than X X X
½ MS+30g Khoai tây+1g Than X X X
VW X X X
VW+30g Khoai tây X X X
VW+30g Khoai tây+1g Than X X X
½ VW+30g Khoai tây+1g Than X X
Ở môi trường MS không tạo chồi mà lại xuất hiện một ít protocorm + mô sẹo.
Ở môi trường MS+30g khoai tây có xuất hiện chồi và cả protocorm + mô sẹo.
Ở môi trường MS+30g khoai tây+1g Than có xuất hiện chồi nhiều hơn nhưng
chủ yếu là protocorm và 1 ít mô sẹo.
Ở môi trường ½ MS+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi nhiều hơn và 1 ít
protocorm.
59
Ở môi trường VW có xuất hiện 1 ít chồi nhưng chủ yếu là mô sẹo + protocorm.
Ở môi trường VW+30g khoai tây xuất hiện chồi nhiều hơn, đặt biệt một số chồi
đã mọc rễ.
Ở môi trường VW+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi nhiều nhất và có rất
nhiều chồi đã mọc rễ.
Ở môi trường ½ VW+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi cũng khá nhiều.
4.1 Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng đến tỉ lệ mẫu chết và hệ số nhân chồi của
phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây.
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy đến tỉ lệ mẫu chết và hệ
số nhân chồi cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma 75 NSC.
Số Số Số chồi Tỉ lệ Hệ số
Nghiệm thức mẫu mẫu hình mẫu chết nhân
cấy chết thành (%) chồi
45 11 0
MS 26.67A 0,00E
45 12 35
MS+30g khoai tây 24.45A 0,78E
45 0 65
MS+30g khoai tây+1g than 4.45BC 1,44E
45 0 405
½ MS+30g khoai tây+1g than 2.22BC 9,00B
45 0 20
VW 6.67B 0,44E
45 0 135
VW+30g khoai tây 2.22BC 3,00D
45 0 510
VW+30g khoai tây+1g than 0C 11,34A
45 0 240
½ VW+30g khoai tây+1g than 0C 5,33C
CV(%) 32 21,2
Ghi chú:
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác
biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
60
Nhận xét:
4.1.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến tỉ lệ mẫu chết của phôi soma lan Hồ
Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây.
Kết quả cho thấy tỉ lệ mẫu chết ở 2 môi trường là MS và MS+30g khoai tây là
cao nhất với tỉ lệ khoảng 26.7%. Mẫu chết có thể là do 1 số phôi yếu không thích ứng
được với môi trường cơ bản MS không bổ sung nhiều các chất dinh dưỡng. Ở các môi
trường còn lại mẫu vẫn phát triển bình thường thành chồi hoặc tạo protocorm hay mô
sẹo, chỉ có một số ít tỉ lệ mẫu bị chết (2.22 – 6,67%).
4.1.2 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ
Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, hệ số nhân là điều được quan tâm nhất bởi
vì hệ số nhân càng cao thì số lượng cây sẽ càng nhiều.
Môi trường MS không bổ sung khoai tây và than có hệ số nhân thấp nhất:
không có chồi lan nào được tái sinh mà chỉ xuất hiện protocorm và mô sẹo, môi trường
VW cũng có hệ số nhân rất thấp (0,44). Ngược lại, ở môi trường VW + 30g khoai tây
+ 1g than cho hệ số nhân cao nhất (11,34. Điều này cho thấy việc kết hợp sử dụng
khoai tây và than trong nuôi cấy tái sinh lan Hồ Điệp sẽ cho kết quả cao hơn là khi
không sử dụng.
Biểu đồ 4.2 Hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây.
61
4.2 Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng đến các chỉ tiêu hình thái của lan Hồ Điệp
trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma
Bang 4.8 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến các chỉ tiêu hình thái của lan Hồ
Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma.
Ghi chú:
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác
biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
Nhận xét:
4.2.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến số lá và chiều dài lá của lan Hồ Điệp
trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma
Trong tất cả các môi trường, môi trường VW bổ sung thêm khoai tây và than
hoạt tính có số lá trung bình ở mỗi chồi lan nhiều nhất (1,38). Bên cạnh đó, ở môi
trường này thì chiều dài lá trung bình của chồi tái sinh cũng là dài nhất (8mm).
62
Nhận xét tổng quát kết quả thí nghiệm ta thấy rằng khi nuôi cấy trên môi trường
VW thì sẽ đạt được số lượng lá cao hơn và lá có độ dài hơn hẳn khi nuôi cấy trên môi
trường MS.
Biểu đồ 4.3 Số lá và chiều dài lá của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi
soma
4.2.2 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp
trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma.
Sau 75 ngày nuôi cấy, ở các môi trường phần lớn xuất hiện chồi nhưng rễ chỉ
xuất hiện khi nuôi cấy trên môi trường VW có bổ sung khoai tây và môi trường VW
bổ sung khoai tây và than. Trong đó, ở môi trường VW bổ sung khoai tây thì số rễ
xuất hiện nhiều hơn: 0,24 so với 0,22 (biểu đồ 3.4).
Tuy nhiên chiều dài rễ trung bình khi nuôi cấy ở môi trường VW bổ sung khoai
tây và than thì dài hơn chiều dài rễ trung bình khi nuôi cấy ở môi trường VW chỉ bổ
sung khoai tây: 4 so với 3,67(biểu đồ 3.5).
Qua đó thấy rằng khi nuôi cấy tái sinh Hồ Điệp từ phôi trên môi trường VW thì
sự cảm ứng tạo rễ dễ xảy ra hơn là khi nuôi cấy trên môi trường MS.
63
Biểu đồ 4.4 Số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi
soma
Hình 4.7 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi soma 75 NSC
65
MS 44.44D
½ MS 77.78A
1/5MS 37.78E
VW 55.56C
½ VW 71.11B
1/5VW 37.78E
CV (%) 4.89
Ghi chú:
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt
rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
Nhận xét:
Kết quả thí nghiệm thấy môi trường 1/2MS là môi trường thích hợp nhất cho
việc tạo vỏ hạt, tỉ lệ nảy mầm khi sử dụng môi trường này là 77.78%, rất có ý nghĩa về
mặt thống kê so với các môi trường còn lại.
Do đó, việc tạo hạt nhân tạo của phôi vô tính trên môi trường vỏ bao là ½ MS
sẽ tiết kiệm chi phí hơn khi sử dụng môi trường MS hoặc VW mà vẫn giữ cho phôi
khoẻ và hạt dễ nảy mầm hơn.
66
Hình 4.8 Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp trên môi trường nảy mầm
Hình 4.9 Quá trình nảy mầm của hạt nhân tạo lan Hồ Điệp.
67
5.2 Đề nghị
Cần tiếp tục hoàn thiện mô hình tạo phôi vô tính lan Hồ Điệp bằng một số
phương pháp như:
Thử nghiệm nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ mẫu lá hoặc thân lan Hồ Điệp ở các
môi trường và nồng độ auxin, cytokinin khác nhau nhằm đạt khả năng tạo mô
sẹo nhiều hơn trong thời gian ngắn hơn.
Thử nghiệm nuôi cấy mô sẹo trên các môi trường khác nhau với nồng độ TDZ
khác nhau, hoặc bổ sung thêm NAA (như đã từng được thực hiện trên cây
chuối, hoa lily…) để tìm ra môi trường cảm ứng tạo phôi hiệu quả hơn
68
Thử nghiệm tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi trên các môi trường nuôi cấy khác bổ
sung thêm các chất kích thích tố tăng trưởng như BA kết hợp với 2,4-D nhằm
tạo ra nhiều cây con lan hơn, khoẻ mạnh hơn và trong thời gian ngắn hơn.
Thử nghiệm các môi trường tạo vỏ bao hạt nhân tạo khác để tìm ra môi trường
tối ưu nhất.
Nghiên cứu, thử nghiệm các phương pháp bảo quản hạt nhân tạo như bảo quản
hạt trong Nitơ lỏng nhằm phục vụ cho việc giữ giống.
Mở rộng công nghệ phát sinh phôi và tạo hạt nhân tạo đến các giống lan có giá
trị kinh tế khác
69
10. Fujimura T. and Komamine A., 1975. Effects of various growth regulators on the
embryogenesis in carrot cell suspension culture. Plant Sci. Lett. 5:359-364.
11. Fujimura T. and Komamine A., 1979. Synchronization of somatic embryogenesis in
carrot cell suspension culture. Plant Physiol. 64:162-164.
12. Gill, R.; Saxena, P.K., 1993. Somatic embryogenesis in Nicotiana tabacum L.:
induction by TDZ of direct embryo differentiation from cultured leaf discs.
Plant Cell Rep. 12:154-159.
13. Grossmann K, 1991. Induction of leaf abscission in cotton is a common effect of
urea and adenin type cytokinins. Plant Physiol. 95:234-237.
14. Halle F, 1978. Les modèles architecturaux chez les arbres tropicaux, une
approche graphique. Colloque Elaboration et Justification des modèles en
Biologie. Paris, Ecole normale. 17pp.
15. Halle R, 1978. Recherches sur la nurtition minérale des tissus végétaux cultivés
in vitro. Ann. Sci. Nat. Biol. Vég.. 14, 1-223.
16. Hare, P.D.; Staden, J., 1994. Inhibitory effect of TDZ on the activity of cytokinin
oxidase isolated from soybean callus. Plant Cell Physiol. 35:1121-1125.
17. Hildebrandt, A.C; Wilmar, J.C.; Johns, H.; Riker, A.J., 1963. Growth of edible
chlorophyllous plant tissue in vitro. Am.J.Bot. 50:248-254.
18. Li Z; Traore, A.; Maximova, S; Guiltinan M. J., 1998. Somatic embryogenesis
and plant regeneration from floral explants of cacao (Theobroma cacao L.)
using thidiazuron. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 34:293-299.
19. Halperin W. and Wetherell, 1964. Adventive embryony in tissue cultures of the
wild carrot Daucus carota. Am. J. Bot. 51:274-283.
20. Lu, C., 1993. The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro cell. Dev. Biol.
29:92-96.
71
PHỤ LỤC
THÍ NGHIỆM 1. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng 2,4-D và BAP
đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 8.035523 12 .6696269 .512 .8878
Within groups 34.000000 26 1.3076923
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 42.035523 38
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 19.890000 .5773503 .6602253 18.930149 20.849851
2 3 20.890000 .5773503 .6602253 19.930149 21.849851
3 3 20.560000 1.0000000 .6602253 19.600149 21.519851
4 3 20.560000 .5773503 .6602253 19.600149 21.519851
5 3 19.670000 .0000000 .6602253 18.710149 20.629851
6 3 19.780000 .5773503 .6602253 18.820149 20.739851
7 3 20.000000 .0000000 .6602253 19.040149 20.959851
8 3 20.220000 1.1547005 .6602253 19.260149 21.179851
9 3 19.440000 .5773503 .6602253 18.480149 20.399851
10 3 20.440000 .0000000 .6602253 19.480149 21.399851
11 3 20.440000 1.1547005 .6602253 19.480149 21.399851
12 3 21.000000 .5773503 .6602253 20.040149 21.959851
13 3 20.440000 .0000000 .6602253 19.480149 21.399851
--------------------------------------------------------------------------------
Total 39 20.256154 .1831135 .1831135 19.989939 20.522369
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 9377.0647 12 781.42206 200.167 .0000
Within groups 101.5000 26 3.90385
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 9478.5647 38
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 24.440000 .0577350 1.1407375 22.781570 26.098430
2 3 46.670000 .3464102 1.1407375 45.011570 48.328430
3 3 53.330000 1.1547005 1.1407375 51.671570 54.988430
4 3 68.890000 1.1547005 1.1407375 67.231570 70.548430
5 3 62.220000 .1154701 1.1407375 60.561570 63.878430
6 3 48.890000 1.1547005 1.1407375 47.231570 50.548430
7 3 48.890000 .5773503 1.1407375 47.231570 50.548430
8 3 80.000000 2.3094011 1.1407375 78.341570 81.658430
9 3 53.330000 .1732051 1.1407375 51.671570 54.988430
10 3 42.220000 1.1547005 1.1407375 40.561570 43.878430
11 3 46.670000 2.3094011 1.1407375 45.011570 48.328430
12 3 35.560000 .2886751 1.1407375 33.901570 37.218430
13 3 22.220000 .5773503 1.1407375 20.561570 23.878430
--------------------------------------------------------------------------------
Total 39 48.717692 .3163837 .3163837 48.257726 49.177658
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 770.03003 12 64.169169 60.802 .0000
Within groups 27.44000 26 1.055385
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 797.47003 38
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 15.550000 .2886751 .5931230 14.687704 16.412296
2 3 13.330000 .1732051 .5931230 12.467704 14.192296
3 3 15.560000 .5773503 .5931230 14.697704 16.422296
4 3 11.110000 1.1547005 .5931230 10.247704 11.972296
5 3 15.560000 .5773503 .5931230 14.697704 16.422296
6 3 22.220000 .5773503 .5931230 21.357704 23.082296
7 3 13.330000 1.1547005 .5931230 12.467704 14.192296
8 3 8.890000 .1154701 .5931230 8.027704 9.752296
9 3 6.670000 .0000000 .5931230 5.807704 7.532296
10 3 11.110000 .5773503 .5931230 10.247704 11.972296
11 3 20.000000 .2886751 .5931230 19.137704 20.862296
12 3 13.330000 .1732051 .5931230 12.467704 14.192296
13 3 6.670000 .5773503 .5931230 5.807704 7.532296
--------------------------------------------------------------------------------
Total 39 13.333077 .1645027 .1645027 13.093919 13.572235
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 1988.7243 12 165.72703 30.454 .0000
Within groups 141.4867 26 5.44179
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 2130.2110 38
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 33.330000 1.7320508 1.3468228 31.371958 35.288042
2 3 8.890000 1.7320508 1.3468228 6.931958 10.848042
3 3 6.670000 1.7320508 1.3468228 4.711958 8.628042
4 3 8.890000 .5773503 1.3468228 6.931958 10.848042
5 3 15.893333 1.4529663 1.3468228 13.935291 17.851375
6 3 11.110000 1.1547005 1.3468228 9.151958 13.068042
7 3 4.440000 .2309401 1.3468228 2.481958 6.398042
8 3 6.670000 .5773503 1.3468228 4.711958 8.628042
9 3 8.890000 1.1547005 1.3468228 6.931958 10.848042
10 3 8.890000 1.7320508 1.3468228 6.931958 10.848042
11 3 13.330000 1.7320508 1.3468228 11.371958 15.288042
12 3 15.560000 .2886751 1.3468228 13.601958 17.518042
13 3 6.670000 1.7320508 1.3468228 4.711958 8.628042
--------------------------------------------------------------------------------
Total 39 11.479487 .3735414 .3735414 10.936424 12.022550
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 8933.7662 12 744.48052 112.212 .0000
Within groups 172.5000 26 6.63462
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 9106.2662 38
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 26.680000 2.3094011 1.4871242 24.517985 28.842015
2 3 31.110000 .5773503 1.4871242 28.947985 33.272015
3 3 24.440000 .2309401 1.4871242 22.277985 26.602015
4 3 11.110000 2.3094011 1.4871242 8.947985 13.272015
5 3 6.670000 .5773503 1.4871242 4.507985 8.832015
6 3 17.780000 1.1547005 1.4871242 15.617985 19.942015
7 3 33.340000 .1732051 1.4871242 31.177985 35.502015
8 3 4.440000 .5773503 1.4871242 2.277985 6.602015
9 3 31.110000 2.8867513 1.4871242 28.947985 33.272015
10 3 37.780000 .5773503 1.4871242 35.617985 39.942015
11 3 20.000000 1.1547005 1.4871242 17.837985 22.162015
12 3 35.550000 .5773503 1.4871242 33.387985 37.712015
13 3 64.450000 2.3094011 1.4871242 62.287985 66.612015
--------------------------------------------------------------------------------
Total 39 26.496923 .4124540 .4124540 25.897288 27.096558
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình
thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 1128.1788 8 141.02235 22.251 .0000
Within groups 114.0800 18 6.33778
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 1242.2588 26
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 .0000000 1.4534760 -2.159778 2.159778
2 3 21.110000 .5773503 1.4534760 18.950222 23.269778
3 3 20.890000 1.1547005 1.4534760 18.730222 23.049778
4 3 19.890000 1.7320508 1.4534760 17.730222 22.049778
5 3 21.110000 .5773503 1.4534760 18.950222 23.269778
6 3 20.220000 .1154701 1.4534760 18.060222 22.379778
7 3 20.220000 2.8867513 1.4534760 18.060222 22.379778
8 3 20.560000 2.3094011 1.4534760 18.400222 22.719778
9 3 20.220000 .5773503 1.4534760 18.060222 22.379778
--------------------------------------------------------------------------------
Total 27 18.246667 .4844920 .4844920 17.526741 18.966593
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 12043.132 8 1505.3915 205.156 .0000
Within groups 132.080 18 7.3378
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 12175.212 26
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 .0000000 1.5639456 -2.323929 2.323929
2 3 60.000000 2.3094011 1.5639456 59.676071 64.323929
3 3 55.560000 1.7320508 1.5639456 53.236071 57.883929
4 3 48.890000 1.1547005 1.5639456 46.566071 51.213929
5 3 64.440000 1.1547005 1.5639456 62.116071 66.763929
6 3 55.560000 2.8867513 1.5639456 53.236071 57.883929
7 3 80.000000 1.1547005 1.5639456 77.676071 82.323929
8 3 62.220000 .1154701 1.5639456 59.896071 64.543929
9 3 66.670000 1.1547005 1.5639456 64.346071 68.993929
--------------------------------------------------------------------------------
Total 27 55.037778 .5213152 .5213152 54.263135 55.812421
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 704.85120 8 88.106400 65.860 .0000
Within groups 24.08000 18 1.337778
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 728.93120 26
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 .0000000 .6677769 -.992276 .992276
2 3 15.560000 1.1547005 .6677769 14.567724 16.552276
3 3 17.780000 .5773503 .6677769 16.787724 18.772276
4 3 11.110000 1.1547005 .6677769 10.117724 12.102276
5 3 8.890000 .1154701 .6677769 7.897724 9.882276
6 3 11.110000 .5773503 .6677769 10.117724 12.102276
7 3 8.890000 .0000000 .6677769 7.897724 9.882276
8 3 6.670000 .5773503 .6677769 5.677724 7.662276
9 3 4.440000 .5773503 .6677769 3.447724 5.432276
--------------------------------------------------------------------------------
Total 27 9.383333 .2225923 .2225923 9.052575 9.714092
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 9760.4610 8 1220.0576 645.533 .0000
Within groups 34.0200 18 1.8900
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 9794.4810 26
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 71.110000 1.1547005 .7937254 69.930572 72.289428
2 3 11.110000 .5773503 .7937254 9.930572 12.289428
3 3 8.890000 .0577350 .7937254 7.710572 10.069428
4 3 22.220000 .5773503 .7937254 21.040572 23.399428
5 3 8.890000 1.1547005 .7937254 7.710572 10.069428
6 3 8.890000 .5773503 .7937254 7.710572 10.069428
7 3 6.670000 .5773503 .7937254 5.490572 7.849428
8 3 22.220000 1.1547005 .7937254 21.040572 23.399428
9 3 22.220000 .5773503 .7937254 21.040572 23.399428
--------------------------------------------------------------------------------
Total 27 20.246667 .2645751 .2645751 19.853524 20.639809
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 1570.9632 8 196.37040 47.714 .0000
Within groups 74.0800 18 4.11556
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 1645.0432 26
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 28.890000 1.1547005 1.1712608 27.149577 30.630423
2 3 13.330000 1.1547005 1.1712608 11.589577 15.070423
3 3 17.780000 .1154701 1.1712608 16.039577 19.520423
4 3 17.780000 .0000000 1.1712608 16.039577 19.520423
5 3 17.780000 1.1547005 1.1712608 16.039577 19.520423
6 3 24.440000 2.3094011 1.1712608 22.699577 26.180423
7 3 4.440000 1.1547005 1.1712608 2.699577 6.180423
8 3 28.890000 .5773503 1.1712608 27.149577 30.630423
9 3 26.670000 1.1547005 1.1712608 24.929577 28.410423
--------------------------------------------------------------------------------
Total 27 20.000000 .3904203 .3904203 19.419859 20.580141
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
7 3 4.440000 X
2 3 13.330000 X
3 3 17.780000 X
4 3 17.780000 X
5 3 17.780000 X
6 3 24.440000 X
9 3 26.670000 XX
1 3 28.890000 X
8 3 28.890000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 15.5600 3.48085 *
1 - 3 11.1100 3.48085 *
1 - 4 11.1100 3.48085 *
1 - 5 11.1100 3.48085 *
* denotes a statistically significant difference.
81
Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều
kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của
cây lan Hồ Điệp in vitro
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 188.77344 4 47.193360 38.747 .0000
Within groups 12.18000 10 1.218000
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 200.95344 14
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 .0000000 .6371813 -1.0041673 1.004167
2 3 2.670000 .5773503 .6371813 1.6658327 3.674167
3 3 4.330000 .1732051 .6371813 3.3258327 5.334167
4 3 10.670000 .5773503 .6371813 9.6658327 11.674167
5 3 5.670000 1.1547005 .6371813 4.6658327 6.674167
--------------------------------------------------------------------------------
Total 15 4.668000 .2849561 .2849561 4.2189227 5.117077
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 X
2 3 2.670000 X
3 3 4.330000 XX
5 3 5.670000 X
4 3 10.670000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -2.67000 2.00833 *
1 - 3 -4.33000 2.00833 *
1 - 4 -10.6700 2.00833 *
1 - 5 -5.67000 2.00833 *
2 - 3 -1.66000 2.00833
2 - 4 -8.00000 2.00833 *
2 - 5 -3.00000 2.00833 *
3 - 4 -6.34000 2.00833 *
* denotes a statistically significant difference.
82
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 2931.9868 4 732.99669 261.039 .0000
Within groups 28.0800 10 2.80800
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 2960.0668 14
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 .0000000 .9674709 -1.524688 1.524688
2 3 4.330000 .5773503 .9674709 2.805312 5.854688
3 3 12.670000 .1154701 .9674709 11.145312 14.194688
4 3 39.670000 1.1547005 .9674709 38.145312 41.194688
5 3 20.000000 1.7320508 .9674709 18.475312 21.524688
--------------------------------------------------------------------------------
Total 15 15.334000 .4326662 .4326662 14.652139 16.015861
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 X
2 3 4.330000 X
3 3 12.670000 X
5 3 20.000000 X
4 3 39.670000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -4.33000 3.04938 *
1 - 3 -12.6700 3.04938 *
1 - 4 -39.6700 3.04938 *
1 - 5 -20.0000 3.04938 *
2 - 3 -8.34000 3.04938 *
2 - 4 -35.3400 3.04938 *
2 - 5 -15.6700 3.04938 *
3 - 4 -27.0000 3.04938 *
* denotes a statistically significant difference.
83
Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh
cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma
Tỉ lệ mẫu chết
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 2481.8963 7 354.55662 47.817 .0000
Within groups 118.6371 16 7.41482
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 2600.5334 23
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 26.670000 .0000000 1.5721341 24.312787 29.027213
2 3 24.446667 2.2233333 1.5721341 22.089454 26.803879
3 3 4.446667 2.2233333 1.5721341 2.089454 6.803879
4 3 2.223333 2.2233333 1.5721341 -.133879 4.580546
5 3 6.670000 .0000000 1.5721341 4.312787 9.027213
6 3 2.223333 2.2233333 1.5721341 -.133879 4.580546
7 3 .000000 .0000000 1.5721341 -2.357213 2.357213
8 3 .000000 .0000000 1.5721341 -2.357213 2.357213
--------------------------------------------------------------------------------
Total 24 8.335000 .5558333 .5558333 7.501599 9.168401
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
7 3 .000000 X
8 3 .000000 X
4 3 2.223333 XX
6 3 2.223333 XX
3 3 4.446667 XX
5 3 6.670000 X
2 3 24.446667 X
1 3 26.670000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 2.22333 4.71443
1 - 3 22.2233 4.71443 *
1 - 4 24.4467 4.71443 *
1 - 5 20.0000 4.71443 *
1 - 6 24.4467 4.71443 *
* denotes a statistically significant difference.
84
Hệ số nhân chồi
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 381.55196 7 54.507423 78.569 .0000
Within groups 11.10000 16 .693750
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 392.65196 23
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 .0000000 .4808846 -.721025 .721025
2 3 .780000 .0577350 .4808846 .058975 1.501025
3 3 1.440000 .2309401 .4808846 .718975 2.161025
4 3 9.000000 1.1547005 .4808846 8.278975 9.721025
5 3 .440000 .1154701 .4808846 -.281025 1.161025
6 3 3.000000 .2886751 .4808846 2.278975 3.721025
7 3 11.340000 .1732051 .4808846 10.618975 12.061025
8 3 5.330000 .5773503 .4808846 4.608975 6.051025
--------------------------------------------------------------------------------
Total 24 3.916250 .1700184 .1700184 3.661329 4.171171
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 X
5 3 .440000 X
2 3 .780000 X
3 3 1.440000 X
6 3 3.000000 X
8 3 5.330000 X
4 3 9.000000 X
7 3 11.340000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -0.78000 1.44205
1 - 3 -1.44000 1.44205
1 - 4 -9.00000 1.44205 *
1 - 5 -0.44000 1.44205
1 - 6 -3.00000 1.44205 *
* denotes a statistically significant difference.
85
Số lá/chồi
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 3.9647625 7 .5663946 462.363 .0000
Within groups .0196000 16 .0012250
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 3.9843625 23
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .0000000 .0000000 .0202073 -.0302982 .0302982
2 3 1.0000000 .0000000 .0202073 .9697018 1.0302982
3 3 1.0000000 .0000000 .0202073 .9697018 1.0302982
4 3 1.2300000 .0173205 .0202073 1.1997018 1.2602982
5 3 1.0000000 .0000000 .0202073 .9697018 1.0302982
6 3 1.2300000 .0346410 .0202073 1.1997018 1.2602982
7 3 1.3800000 .0115470 .0202073 1.3497018 1.4102982
8 3 1.2700000 .0404145 .0202073 1.2397018 1.3002982
--------------------------------------------------------------------------------
Total 24 1.0137500 .0071443 .0071443 1.0030380 1.0244620
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .0000000 X
2 3 1.0000000 X
3 3 1.0000000 X
5 3 1.0000000 X
6 3 1.2300000 X
4 3 1.2300000 X
8 3 1.2700000 X
7 3 1.3800000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -1.00000 0.06060 *
1 - 3 -1.00000 0.06060 *
1 - 4 -1.23000 0.06060 *
1 - 5 -1.00000 0.06060 *
1 - 6 -1.23000 0.06060 *
* denotes a statistically significant difference.
86
Số rễ/chồi
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups .2386500 7 .0340929 136.371 .0000
Within groups .0040000 16 .0002500
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) .2426500 23
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .0000000 .0000000 .0091287 -.0136873 .0136873
2 3 .0000000 .0000000 .0091287 -.0136873 .0136873
3 3 .0000000 .0000000 .0091287 -.0136873 .0136873
4 3 .0000000 .0000000 .0091287 -.0136873 .0136873
5 3 .0000000 .0000000 .0091287 -.0136873 .0136873
6 3 .2400000 .0230940 .0091287 .2263127 .2536873
7 3 .2200000 .0115470 .0091287 .2063127 .2336873
8 3 .0000000 .0000000 .0091287 -.0136873 .0136873
--------------------------------------------------------------------------------
Total 24 .0575000 .0032275 .0032275 .0526608 .0623392
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .0000000 X
2 3 .0000000 X
3 3 .0000000 X
4 3 .0000000 X
5 3 .0000000 X
8 3 .0000000 X
7 3 .2200000 X
6 3 .2400000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 0.00000 0.02737
1 - 3 0.00000 0.02737
1 - 4 0.00000 0.02737
1 - 5 0.00000 0.02737
1 - 6 -0.24000 0.02737 *
* denotes a statistically significant difference.
87
Chiều dài rễ
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 66.345863 7 9.4779804 60.659 .0000
Within groups 2.500000 16 .1562500
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 68.845863 23
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .0000000 .0000000 .2282177 -.3421831 .3421831
2 3 .0000000 .0000000 .2282177 -.3421831 .3421831
3 3 .0000000 .0000000 .2282177 -.3421831 .3421831
4 3 .0000000 .0000000 .2282177 -.3421831 .3421831
5 3 .0000000 .0000000 .2282177 -.3421831 .3421831
6 3 3.6700000 .5773503 .2282177 3.3278169 4.0121831
7 3 4.0000000 .2886751 .2282177 3.6578169 4.3421831
8 3 .0000000 .0000000 .2282177 -.3421831 .3421831
--------------------------------------------------------------------------------
Total 24 .9587500 .0806872 .0806872 .8377700 1.0797300
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .0000000 X
2 3 .0000000 X
3 3 .0000000 X
4 3 .0000000 X
5 3 .0000000 X
8 3 .0000000 X
6 3 3.6700000 X
7 3 4.0000000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 0.00000 0.68437
1 - 3 0.00000 0.68437
1 - 4 0.00000 0.68437
1 - 5 0.00000 0.68437
1 - 6 -3.67000 0.68437 *
* denotes a statistically significant difference.
88
Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt
nhân tạo
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 4434.6323 5 886.92645 126.704 .0000
Within groups 84.0000 12 7.00000
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 4518.6323 17
Table of means
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 44.440000 1.1547005 1.5275252 42.086005 46.793995
2 3 77.780000 1.1547005 1.5275252 75.426005 80.133995
3 3 37.780000 1.1547005 1.5275252 35.426005 40.133995
4 3 55.560000 .5773503 1.5275252 53.206005 57.913995
5 3 71.110000 2.8867513 1.5275252 68.756005 73.463995
6 3 37.780000 1.1547005 1.5275252 35.426005 40.133995
--------------------------------------------------------------------------------
Total 18 54.075000 .6236096 .6236096 53.113986 55.036014
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
3 3 37.780000 X
6 3 37.780000 X
1 3 44.440000 X
4 3 55.560000 X
5 3 71.110000 X
2 3 77.780000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference limits
1 - 2 -33.3400 4.70799 *
1 - 3 6.66000 4.70799 *
1 - 4 -11.1200 4.70799 *
1 - 5 -26.6700 4.70799 *
1 - 6 6.66000 4.70799 *
2 - 3 40.0000 4.70799 *
2 - 4 22.2200 4.70799 *
* denotes a statistically significant difference.