Professional Documents
Culture Documents
Bai Giang Phan Tich Vi Sinh
Bai Giang Phan Tich Vi Sinh
HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
1
MỤC LỤC
Chương 1: Đối tượng vi sinh vật và các chỉ tiêu trong thực phẩm………….3
Chương 2: Kỹ thuật cơ bản trong phân tích vi sinh vật……………………..17
Chương 3: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp truyền thống...39
Chương 4: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp hiện đại……...85
Chương 5:Đánh giá vệ sinh công nghiệp…………………………………….95
2
Chương I
ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT VÀ CÁC CHỈ TIÊU TRONG THỰC PHẨM
1.1GIỚI THIỆU
Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên,
trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây
ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có nguôn gốc từ vi
sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra
bởi các vi sinh vật này trong nước uống, thực phẩm. Ngày nay, an toàn, nhất là về
phương diện vi sinh vật, trở thành một trong những yêu cầu không thể thiếu đối với
chất lượng thực phẩm.
Việt Nam là một nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủy
hải sản, thực phẩm. Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho hơn 80 triệu dân, thực phẩm
và thủy sản của nước ta cũng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới (Châu Âu, Bắc
Mỹ, Nhật Bản…), mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước, giải quyết việc làm cho một
số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị. Do nhận thức ngày càng
được nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự
tăng cường về quản lý của Nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng,
yêu cầu nghiêm ngặt về chỉ tiêu vi sinh của thị trường thế giới, việc phân tích vi sinh
vật gây bệnh, thực hiện các biện pháp nhằm đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt
tiêu chuẩn an toàn và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm
đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được các đơn vị sản xuất, chế biến
thực phẩm nội địa quan tâm thực hiện. Tuy nhiên không phải vì thế mà ngộ độc thực
phẩm, số vụ ngộ độc thực phẩm, mức độ ngộ độc thực phẩm khi con người tiêu thụ
thực phẩm được thuyên giảm.
Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ độc hoặc
nhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tố vi sinh vật, độc tố hoá học hoặc
chứa các vi sinh vật gây bệnh. Có rất nhiều vụ ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi vi
sinh vật hiện diện trong nước và thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm thường được hiểu là
các triệu chứng gây ra bởi độc tố của vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm và nhiễm
bệnh bởi vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử dụng thức ăn
chứa các vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên hiện nay, khái niệm ngộ độc thực phẩm còn
bao gồm trường hợp thức ăn có chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện ở mức độ rất
thấp trong nguyên liệu hay bị nhiễm vào trong quá trình chế biến vì trong quá trình chế
biến hay bảo quản, các vi sinh vật này và độc tố của chúng có thể tăng nhanh đến mức
độ gây ngộ độc.
Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra những triệu
chứng chung sau khi tiêu thụ thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau
phụ thuộc khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của từng người. Các
triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau
nhức người, sốt, đau đầu. Triệu chứng này thay đổi ở các vụ ngộ độc khác nhau tuỳ
thuộc vào tác nhân vi sinh vật và được gây ra bởi độc tố do vi sinh vâtk tạo ra và tiết
vào thực phẩm (trường hợp này được gọi là ngoại độc tố) hay bởi độc tố nằm trong tế
bào vi sinh vật (nội độc tố).
3
Đối với nước và thực phẩm, các vi sinh vật được quan tâm cần kiểm soát là các
vi sinh vật gây ngộ độc và gây bệnh. Các vi sinh vật gây ngộ độc hay gây bệnh ở
người khi bị đào thải khỏi cơ thể bằng đường phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước bị
nhiễm phân này. Nước trở thành môi trường phân tán, lan truyền mầm bệnh cho người
khi sử dụng mà không được tinh sạch đúng quy cách. Nước là môi trường sống, môi
trường nuôi trồng của các loài thuỷ sản nên khi nước bị ô nhiễm thì vi sinh vật gây
bệnh có thể nhiễm vào các loài thuỷ hải sản, làm nhiễm nguồn nguyên liệu của các
thực phẩm thuỷ hải sản chế biến. Đó là một trong những con đường nhiễm vi sinh vật
gây bệnh vào thực phẩm. Mặt khác, trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm, vi
sinh vật gây bệnh cũng có thể nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề mặt
thiết bi, công nhân. Mặc dù có thể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh vật hiện diện
hoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn. Tuy mật
độ vi sinh vật ban đầu trong nước, trong nguyên liệu hoặc trong thực phẩm có thể rất
thấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của
vi sinh vật trong quá trình chế biên hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật được
nhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại. Do
vậy, mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong
đa số các trường hợp là bằng không.
1.2. TÌNH HÌNH CÁC VỤ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRONG CẢ NƯỚC VÀ Ở
TP. HỒ CHÍ MINH TRONG THỜI GIAN VỪA QUA
Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người
(chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan
đến thực phẩm.
Hàng năm Việt Nam có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc từ thực phẩm, gây
thiệt hại hơn 200 triệu USD. Đây là con số được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra
trong một hội thảo về an toàn thực phẩm - dantri.com.vn - 18:02 15-04-2011.
Theo số liệu thống kê tại Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, từ 1997 tới 2004 đã
có 2.237 vụ ngộ độc thực phẩm với 43.655 người mắc và 429 người tử vong. Nguyên
nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật (42,2%), sau đó là hoá chất
(24,9%) và độc tố tự nhiên trong thực phẩm (25,2%), còn lại không xác định được
nguyên nhân. 4 lý do chưa thể xác định được nguyên nhân các vụ ngộ độc là: Lấy
mẫu chậm, không lấy được mẫu, không có cách nào điều tra được hoặc còn phải xét
nghiệm.
………
Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ
độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử
vong. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử
vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ
ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người
nhập viện. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện
giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực
phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số
người đi viện giảm 174 người.
Theo TS. Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục
ATVSTP, trong năm 2010, hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác
định nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác
4
hơn. Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Mặc dù
vậy, TS. Hùng cho hay, ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ
ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc, điều đó cho thấy, các vụ
ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình chưa có xu hướng giảm. Do đó,
người dân cần phải nâng cao ý thức trong việc thực hiện ATVSTP ngay chính tại bếp
ăn của gia đình mình.
Nếu như năm 2000, ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật (chiếm 70%) thì tới năm 2010,
ngộ độc vi sinh vật thấp đi (<50%), ngộ độc chủ yếu do hóa chất, chiếm tới trên 60%.
Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do
độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc
lớn từ 30 người trở lên. Xu thế ngộ độc cho hóa chất càng ngày càng tăng lên, ngộ độc
do vi sinh vật có xu hướng kiểm soát tốt hơn nhưng không có nghĩa là nguy cơ giảm
đi.
So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm 186
người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực phẩm có
quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số người đi viện
giảm 174 người.
Năm 2010, số vụ ngộ độc do hóa chất là chủ yếu, chiếm trên 60%.
TS. Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục ATVSTP -
nhận xét: Các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và
xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác hơn. Công tác quản lý ngộ
độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Đặc biệt, thời gian vừa qua, không
có vụ ngộ độc nào xảy ra trong suốt thời gian diễn ra Đại lễ 1.000 năm Thăng Long –
Hà Nội.
Mặc dù vậy, ông Hùng cũng khuyến cáo người dân trước tình trạng ngộ độc thực
phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt
là ngộ độc cá nóc. Điều đó cho thấy: Các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ
gia đình có xu hướng tăng, ý thức người dân chưa cao trong việc thực hiện ATVSTP.
5
Trong khi đó, theo kết quả điều tra của Cục ATVSTP, nhận thức của người dân về
vấn đề ATVSTP đều được nâng cao hơn từ 2005-2008. Theo đó, nhận thức của người
sản xuất sản phẩm thực phẩm tăng từ 47,8% lên 55,7%; nhận thức của người kinh
doanh thực phẩm tăng từ 38,6% lên 49,4%; nhận thức của người sử dụng thực phẩm
tăng từ 38,3% lên 48,65%.
Nhờ đó, số vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước vẫn cao (8 triệu người/năm) nhưng
đã bắt đầu có chiều hướng giảm. Số người mắc ngộ độc thực phẩm năm 2005 đã giảm
gần một nửa (43,34%) so với năm 1994, số ca tử vong cũng giảm 28,17%.
Các cơ sở đảm bảo ATVSTP tăng mạnh. Năm 2006, cả nước chỉ có 1.106 cơ sở đạt
yêu cầu. Nhưng chỉ sau 2 năm, con số này đã lên tới 17.592 cơ sở.
Theo báo cáo của Bộ Trưởng Bộ Y tế Nguyễn Quốc Triệu, trong năm 2010, tỷ lệ
người kinh doanh thực phẩm có hiểu biết đúng đắn về VSATTP đã tăng từ 65%
(2008) lên 73% (2010); người tiêu dùng có hiểu biết đúng tăng từ 65,5% (2009) lên
84,5% (2010); người sản xuất và chế biến thực phẩm có hiểu biết đúng tăng từ 44,4%
(2009) lên 79,4% (2010). Trưởng Ban chỉ đạo, Phó Thủ tướng Nguyễn Thiện
Nhân đánh giá sự chuyển biến trong nhận thức của người dân là một trong những
điểm sáng của công tác VSATTP.
Năm 2011 : trong quý I/2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tử
vong giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010).
Trong 3 tháng đầu năm 2011, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442
người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người. So với
cùng kỳ năm ngoái, số vụ ngộ độc giảm 10 vụ (giảm 50%), số người mắc giảm 321
người, số tử vong giảm 11 trường hợp (giảm 75%). Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an
toàn thực phẩm trong 6 tháng đầu năm 2011 toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộ độc với
1.776 nạn nhân, trong đó có 9 trường hợp tử vong. Nguyên nhân gây ngộ độc do vi
sinh vật (17 vụ), do hóa chất (10 vụ), do độc tố tự nhiên (17 vụ)...
1.3. ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT–TÁC NHÂN CHÍNH GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
Các quá trình hư hỏng của thực phẩm thường do vi sinh vật gây nên. Trong đó
rất nhiều trường hợp các vi sinh vật này còn tạo ra các độc tố gây ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Chính vì vậy việc tìm hiểu về các vi sinh vật gây bệnh để từ đó tìm ra
các biện pháp khống chế chúng là việc làm cần thiết.
Có 2 dạng gây bệnh có nguồn gốc từ vi sinh vật:
- Vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của các độc tố này trong thực phẩm là
nguyên nhân gây bệnh. Ví dụ: Clostridium botulinum tiết ra độc tố gây nên bệnh
botulism (chứng ngộ độc thịt); Staphylococcus aureus gây nên bệnh tụ cầu khuẩn
- Vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người.
Sự hiện diện của chúng hoặc của các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các
chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh. Ví dụ: Salmonella spp., Vibrio
parahaemolyticus, Escherichia coli,…
Tuy nhiên có nhiều vi sinh vật mang đặc tính của cả 2 dạng gây bệnh này. Ví dụ
Clostridium perfringens và Bacillus cereus.
6
1.3.1.Tổng vi khuẩn hiếu khí:
Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật chỉ sinh trưởng trong điều kiện có oxy.Tổng
số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30 oC
trong khoảng 3 ngày.
Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau như:
7
1.3.3. Salmonella
Nếu phân loại theo mức độ gây bệnh của Salmonella ta có các loại sau:
- Loại chỉ gây bệnh cho người (vd: S. typhi gây sốt thương hàn tại người)
- Loại chỉ gây bệnh cho động vật (vd: S. typhimurium gây sốt thương hàn tại
chuột)
- Loại gây bệnh cho cả người và động vật (chiếm đa số)
Salmonella là trực khuẩn gram (-), không tạo bào tử, có tiên mao (trừ S.
gallinarum), có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3 µm. Giống như nhiều loài vi
khuẩn khác Salmonella có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ tương đối rộng từ
6 đến 45.60C, tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C. Salmonella phát triển trong
khoảng pH từ 4.1 – 9.0. Trong các món salad có độ pH khoảng 5.5 – 5.7 không nhận
dạng được sự thay đổi mùi vị khi Salmonella phát triển. Độ ẩm tối ưu cho sự phát triển
của Salmonella là 0.93 – 0.95.
Salmonella xâm nhập vào cơ thể bằng hai con đường: từ phân người hoặc động
vật; từ người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng của
chúng và nhất là phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn.
Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là những tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella
lan rộng hơn khi chúng truyền phân vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ.
Trong quá trình giết mổ cũng cần phải đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực
hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm.
Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn.
Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng
được biểu hiện là 12-36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2-7 ngày.
1.3.4. Coliforms
Đây là những vi sinh vật hình que, G -, không tạo bào tử, có khả năng lên men
latose và sinh khí trong quá trình lên men này. Phát triển trong khoảng nhiệt độ (từ – 2
8
đến 50oC), pH từ 4,0 đến 8.5, có thể sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Sau 12 – 16 giờ
trên môi trường thạch tạo ra những khuẩn lạc có thể nhìn thấy được. Coliform đi vào
thực phẩm từ nước hoặc nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân. Các loài tiêu biểu cho
Coliform: Escherichia coli và Enterobacter aerogenes. Tuy nhiên, ngoài ra còn có
khoảng 20 loài mang những tính chất đặc trưng cho Coliform, trong đó bao gồm cả các
Enterobacteriaceae khác và các loài thuộc Aeromonas.
Nhóm Coliform phân là những Coliform có khả năng phát triển trong môi trường
có nhiệt độ từ 44.5 – 450C (các Coliform khác có t0opt=370C). Đây cũng là đặc điểm
nhận biết và phân biệt Colifom phân. Tuy nhiên việc xác định này chỉ là giá trị dùng để
tham khảo cho việc xác định điều kiện sống của Coliform.
Dưới đây là một vài tính chất đặc trưng cho việc làm hư hỏng thực phẩm của
Coliform:
- Chúng có khả năng phân giải nhiều loại cơ chất khác nhau: carbohydrate, các
chất hữu cơ sinh năng lượng, các hợp chất chứa nitơ đơn giản,..
- Có khả năng tổng hợp hầu hết các vitamin cần thiết.
- Có khả năng phát triển tốt trong môi trường có nhiệt độ từ 10 – 460C.
- Có khả năng tạo ra acid và sinh gas từ đường
- Sinh ra mùi vị hư hỏng, khó chịu
Escherichia coli:
Được phát hiện là vi sinh vật gây bệnh từ năm 1700. E. coli thuộc họ
Enterobacteriaceae. Các loài E. coli hiện diện diện rộng rãi trong môi trường bị ô
nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Các.
Thường sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài, nhiễm vào
thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất chế biến.
Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit. Gây nhầy
nhớt, hư hỏng thực phẩm.
Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu; với cơ
thể yếu gây nhiễm khuẩn máu; gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh; gây tiêu chảy.
9
1.3.5. Staphylococcus
Hiện nay tìm thấy 31 loài. Staphylococcus là cầu khuẩn, G+, các tế bào thường
liên kết thành hình chùm nho. Không di động, không tạo bào tử. Nhiệt độ tối ưu là
37oC. Chịu được khô hạn, hơi nóng (ở 50oC vẫn sống được trong 30 phút). Có khả năng
sống được trong nồng độ NaCl là 9-10%. pHopt= 6-7 ; aw opt = 0,83- 0,90.
Staphylococus có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường khác nhau nhất là trên
các môi trường chứa chất hữu cơ. Tuy nhiên phải có nitơ trong môi trường. Nguồn
nitơ sử dụng là acid amin. Trong tự nhiên Staphylococcus được tìm thấy trên da, mũi,
tóc hay lông của các động vật máu nóng. Staphylococcus sinh một số độc tố đường
ruột enterotoxin bền nhiệt và không bị phân huỷ ở 100 0C trong 30 phút. Khi ăn phải
thực phẩm có chứa độc tó này, sau 4-6 giờ người ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy,
nôn mửa kéo dài 6-8 giờ. Ngoài ra Staphylococcus còn tạo mụn nhọt, làm đông huyết
tương, từ đó gây nên các bệnh như viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận,
viêm tủy xương ở người. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem
tổng hợp, nước súp và các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm vi
sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình
chế biến
Staphylococcus aureus
Đặc trưng nhất của loài nay là gây viêm ruột dẫn đến bệnh chảy máu ruột.
Mang tính chất đặc trưng của loài Staphylococcus, kết lại với nhau thành dạng
chùm nho hoặc thành từng chuỗi ngắn. Có một vài loài Staphylococcus aureus có khả
năng chịu mặc rất tốt (10 – 20% NaCl) và cũng chịu được tác động của nitrit. Chính vì
vậy phải rất kiểm tra sự hiện diện của Staphylococcus aureus đối với các sản phẩm thịt
như: xúc xích, dăm bông, lạp xưởng. Staphylococcus aureus cũng phát triển tốt trong
môi trường có nồng độ đường cao (50 – 60% đường). Chúng lên men và phân giải
đường nhưng lại không tạo mùi vị khó chịu cho sản phẩm.
Nguồn gây nhiễm Staphylococci vào cơ thể người thường từ những người bị
viêm mũi gây nên viêm xoang, từ các ung nhọt, hoặc các vết thương bị nhiễm trùng, từ
da người tiếp xúc với người bệnh. Staphylococci còn gây nên chứng viêm vú bò dẫn
đến làm nhiễm sữa và các sản phẩm từ sữa. Riêng không khí không phải là nguồn gây
nhiễm đặc trưng trừ phi trong môi trường có quá nhiều Staphylococci.
Các sản phẩm thực phẩm thường có Staphylococci : thịt và các sản phẩm từ thịt,
cá và các sản phẩm từ cá, sữa và các sản phẩm từ sữa, salad, pudding, cream. Nếu
không được trữ lạnh đúng mức thì Staphylococci sẽ phát triển mãnh liệt và gây bệnh.
10
1.3.6. Vibrio
Có khoảng 28 loài. Trong đó có 4 loài thường gặp nhiều trong hải sản:
- Vibrio vulnificus
- V. cholerae
- V. parahaemolyticus
- V. alginolyticus
Vibrio là phẩy khuẩn. Phần lớn thuộc gram (-). Di động nhanh nhờ đơn mao ở
đầu. Không sinh nha bào, phản ứng oxydase dương tính. Thuộc loài hiếu khí tùy tiện.
Vibrio là loài vi khuẩn ưa mặn, trong môi trường sống yêu cầu có khoảng 1 – 3%
NaCl. Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ muối đến 7.0%. Nhiệt độ phát
triển tối ưu là 35 – 370C, tuy nhiên vẫn phát triển được ở khoảng nhiệt độ từ 10 – 44 0C.
Khoảng pH mà Vibrio có thể phát triển từ 5.0 – 11.0. Vibrio cholerae tạo ra độc tố tả
cholerae-toxin có độc tính mạnh, chỉ cần 5µg gây nhiễm qua đường miệng có thể gây
tiêu chảy cho người trưởng thành. Ngoài độc tố này, loài này còn tiết độc tố hemolysin
có độc tính tương tự tetrodotoxin của các nóc.
Thường có mặt ở hải sản, các sản phẩm hải sản, nước biển. Nguồn thực phẩm có
nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây và các sản phẩm sữa,
các loại thuỷ hải sản tươi sống. Tuy nhiên bị tiêu diệt dưới tác động của nhiệt độ. Nói
một cách khác, khi nấu chín thực phẩm thì không phải lo sợ sự tác động của Vibrio.
1.3.7. Shigella
Shigella thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn gây bệnh lỵ trực trùng. Chỉ
gây bệnh cho người và linh trưởng. Sinh độc tố enterotoxin. Là trực khuẩn gram(-),
không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy tiện. Phát triển trong khoảng nhiệt độ từ
10 – 40oC, t0opt = 370C, pH = 6 – 8, nồng độ muối 5 – 6%. Nhạy cảm với nhiệt.
11
Bao gồm 4 loài
– S. dysenteriae
– S. boydii
– S. plexnery
– S. sonnei
Shigella tạo độc tố gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực trùng), kích thích
lên thành ruột, lên hệ thần kinh trung ương, gây tiêu chảy, ức chế hấp thu
đường và acid amin ở ruột non. Nếu tác động lên hệ thần kinh thì có thể gây tử
vong. Khi bị nhiễm Shigella, chúng sẽ tấn công lớp biểu mô niêm mạc ruột
già, gây hoại tử, làm loét, xuất huyết. Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng
dữ dội, tiêu chảy nhiều lần, phân nhầy nhớt, có máu. Liều lượng gây ngộ độc
thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể ở mức 10 tế bào/g sản phẩm. Không
được phép hiện diện trong 25g thực phẩm
Thường nhiễm vào cá, quả, rau, thịt, các loại salad từ nước hoặc phân người.
Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quá
trình sản xuất, chế biến thực phẩm.
1.3.8. Yersinia
Hiện nay tìm thấy 11 loài. Là trực khuẩn gram(-). Trong một số trường hợp có
khả năng chuyển động. Thuộc loại kỵ khí tùy tiện, không tạo bào tử, không sinh nha
bào. Khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu từ 25 – 32 oC. Bị tiêu diệt ở 60oC trong vòng 1 – 3
phút. Đại diện tiêu biểu là Yersinia enterocolitica. Yersinia enterocolitica phát triển
trên nhiều loại thực phẩm khác nhau: bò, heo, dịch trứng, pho mát mềm, sữa, cá, tôm,
cua, gà, đậu phụ,… Y. enterocolitica thường gây bệnh đường ruột, gây viêm dạ dày tại
người. Sau 24 – 36 giờ sau khi sử dụng thực phẩm có mầm bệnh thì triệu chứng của
bệnh bắt đầu xuất hiện như đau bụng, sốt, tiêu chảy, các vết loét dạ dày hình thành.
Nếu để lâu sẽ dẫn đến chảy máu dạ dày.
12
Hình 6. Yersinia pestis (Chụp qua
kính hiển vi điện tử)
1.3.9. Clostridium
Hiện nay phát hiện ra hai chủng gây ngộ độc thực phẩm:
- Clostridium botulinum: tạo độc tố gây hại đến hệ thần kinh
- Clostridium perfringens: gây đau bụng, tiêu chảy và giải phóng nhiều khí. Khi
vi khuẩn hình thành bào tử tạo ra độc tố ruột, gây ngộ độc cho người.
Clostridium botulinum là trực khuẩn gram (+), không di động, yếm khí, tạo bào
tử. Bào tử rất chịu nhiệt. Nhiệt độ phát triển tối ưu là : 43 – 47 oC, pH từ 5 – 9, bị ức chế
bởi NaCl 5%, hoặc NaNO3 2,5%
C.botulinum là vi khuẩn sinh độc tố. Tế bào C.botulinum bị tiêu ở nhiệt độ 80 0C
đến 900C. Trong đa số trường hợp C.botulinum sinh gas và tạo mùi khó chịu. Từ đặc
điểm này ta có thể loại bỏ thực phẩm nhiễm C.botulinum một cách dễ dàng. Tuy nhiên
cần đề phòng một số trường hợp ngoại lệ, lúc này ta không nhận biết được bằng cảm
quan về sự nhiễm vi khuẩn C.botulinum của thực phẩm, do đó người sử dụng sẽ bị
nhiễm độc tố gây hội chứng botulism (ngộ độc thịt).
Sự ngộ độc thịt xảy ra không thường xuyên, nhưng nó thường gây tử vong. Theo
sự phát triển của khoa học, tỷ lệ tử vong do botulism ngày càng giảm. Ví dụ vào
những năm 1970 – 1973 chiếm khoảng 23%, vào năm 1899 – 1994 tỷ lệ này chiếm
trên 60% tại Mỹ. Theo như thống kê của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh tại Mỹ, thì
các sản phẩm được làm tại nhà dễ bị nhiễm C.botulinum hơn là các sản phẩm sản xuất
trong công nghiệp.
Hình 7. Clostridium botulinum và bào tử hình viên đạn (Chụp qua KHV điện tử)
13
Tùy theo từng loại C. botulinum mà triệu chứng bệnh xuất hiện sau khi sử dụng
thực phẩm chứa độc tố xuất hiện sau các khoảng thời gian khác nhau (từ 12 – 36 giờ).
Khi bị ngộ độc các triệu chứng đầu tiên xuất hiện là: nôn mửa, tiêu chảy, mệt mỏi,
chóng mặt và đau đầu. Sau đó là các triệu chứng táo bón, nhìn một thành hai. Rồi các
hiện tượng khó nuốt, khó phát âm xuất hiện. Người bệnh cảm nhận được sự khô
miệng, khó thở, lưỡi bị sưng và xuất hiện màng. Có thể lên cơn sốt hoặc không. Tiếp
theo là cơ bị tê cứng, rồi đến hệ thống hô hấp bị tê cứng và cuối cùng là tim ngừng
đập. Kết quả là người bị bị tử vong do tê liệt hệ thống hô hấp. Sự tử vong này thường
diễn ra sau 3 – 6 ngày sử dụng thực phẩm nhiễm độc tố.
Phương thức duy nhất để chữa trị là sử dụng các chất kháng độc tố. Tuy nhiên nó
chỉ hiệu nghiệm nếu sử dụng khi phát hiện ra các triệu chứng đầu tiên của bệnh. Còn
để khi các triệu chứng đặc trưng xuất hiện thì đã muộn rồi. Chính vì vậy việc xác định
bệnh là rất khó khăn. Kèm theo việc sử dụng chất kháng độc tố là phải giữ cho người
bệnh ở trạng thái yên tĩnh, sử dụng phương pháp thở nhân tạo, tạo sự cân bằng các
chất lỏng trong cơ thể,..
Để ngăn chặn sự nhiễm C.botulinum vào cơ thể cần chú ý thực thi các việc sau:
- Nên xử lý nhiệt các đồ hộp trước khi sử dụng.
- Loại bỏ các đồ hộp có triệu chứng phồng, méo mó.
- Không nếm các thực phẩm có mùi khó chịu.
- Không sử dụng các thực phẩm đã được nấu chín nhưng không được bảo quản
tốt và không được hâm nóng.
- Cần đun nóng lại thực phẩm nghi ngờ trong khoảng 15 phút.
- Đối với cảc sản phẩm xông khói thì cần chú ý một số điểm sau:
- Sản phẩm được giữ sạch, tay trước khi cầm sản phẩm được rửa sạch.
- Trrong quá trình xông khói cần giữ ít nhất ở 820C trong 30 phút.
- Làm lạnh nhanh sau khi đóng gói và bảo quản lạnh.
- Tất cả các bao bì sử dụng phải là loại được bộ Y tế cho phép và chịu lạnh tốt.
14
1.3.11. Feacal streptococcus (Streptococcus phân)
Streptococcus phân được sử dụng như là chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực
phẩm. Streptococcus phân là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, hình cầu hay
hình oval kéo dài, Gram dương, thường tụ tập thành hình đôi hay hình chuỗi, không di
động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu hết các loài này sống hiếu
khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí, tiết bacteriocin trong quá trình
tăng trưởng.
Các loài này có thể phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muối NaCl, pH
ở 9,6 ở 450C.
1.4. CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ TRONG THỰC PHẨM
1.4.1. Chỉ tiêu vi sinh vật trong nước
* Nước dùng cho mục đích sinh họat và sản xuất
Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩn
quốc gia Việt Nam (TCVN 5942 – 1995) quy định hai mức như sau:
- Loại A dùng là m nguồn cấp nước sinh họat nhưng phải qua quá trình xử lý,
giới hạn tối đa số coliform cho phép là 5.000 MPN/100ml
- Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số coliform cho phép là
10.000 MPN/100ml
* Nước uống
Nước uống bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có cồn). Tiêu
chuẩn (TCVN 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994) quy định về vi sinh vật của các dạng
nước này như sau:
1. Coliform (MPN/100ml) 0
2. Coliform phân (MPN/100ml) 0
3. E. coli (CFU/100ml) 0
4. Clostridium khử sulphat (CFU/100ml) 0
5. Streptococci phân (CFU/100ml) 0
15
- Nước giải khát không cồn
16
- Clostridium perfringens
- Tổng số nấm men, nấm mốc
Chương II
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
2.1.LẤY MẪU
2.1.1.ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU THỰC PHẨM
Trong mẫu thực phẩm vi sinh vật hiện diện cở mật độ thấp và không có sự phân bố
đồng đều trong mẫu
Trong quá trình chế biến thực phẩm vi sinh vật trong nguyên liệu và bán thành phẩm
thường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống do các biện pháp vật lý (nhiệt độ, ánh
sáng…), hóa học (chất ức chế, chất diệt khuẩn, nồng độ cao của muối, dung môi, …)
được sử dụng nhằm hạn chế thấp nhất sự hiện diện và tăng trưởng của vi sinh vật trong
quá trình chế biến. Sự tổn thương và sức sống yếu của các vi sinh vật cần phát hiện có
thể làm sai lệch kết quả các phản ứng sinh hóa dùng để định danh vi sinh vật.
Do vậy, hầu hết các quy trình kiểm nghiệm vi sinh trong nước và trong thực phẩm đều
có thêm các bước nuôi tăng sinh để phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổn
thương và bước nuôi tăng sinh chọn lọc nhằm làm gia tăng mật độ tương đối của vi
sinh vật cần phát hiện, ức chế sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mong
muốn khác.
2.1.2. PHƯƠNG PHÁP LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU
Lấy mẫu nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm để xác định chất lượng bằng cảm quan
và phân tích trong phòng thí nghiệm (PTN) là khâu đầu tiên rất quan trọng trong công
tác phân tích, góp phần vào tính chính xác của kết quả kiểm nghiệm và xử lý thực
phẩm sau này. Trong kiểm nghiệm vi sinh, công đoạn lấy, vận chuyển và bảo quản
mẫu mặc dù được thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm nhưng lại là công đoạn rất
quan trọng trong quá trình thử nghiệm. Mọi sai sót trong công đoạn này đều có thể dẫn
tới những sai lệch nghiêm trọng kết quả thử nghiệm.
- Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng hay nơi lấy mẫu và được nhận dạng rõ ràng.
- Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ
khi lấy mẫu đến khi phân tích.
Khi lấy mẫu cần lưu ý các nguyên tắc sau:
17
- Người lấy mẫu đọc kỹ tài liệu làm căn cứ lấy mẫu tương ứng (tài liệu luôn có
thể sẵn dùng).
Lô hàng đồng nhất: là lô hàng bao gồm những sản phẩm có cùng một tên gọi, cùng
một loại phẩm chất và cùng một khối lượng, đựng trong bao bì cùng 1 kiểu, cùng một
kích thước, sản xuất trong cùng một thời điểm nhất định theo cùng một quy trình công
nghệ.
- Trước khi lấy mẫu trung bình, phải xem xét lô hàng có đồng nhất không và
kiểm tra tình trạng bao bì của lô hàng đó.
- Mẫu thực phẩm phải có tính chất đại diện cho cả một lô hàng thực phẩm đồng
nhất.
- Tỉ lệ lấy mẫu từ 0,5 ÷1,0% tùy theo số lượng, nhưng mỗi lần không ít hơn
lượng cần thiết để phân tích.
- Mẫu hàng lấy để đưa đi kiểm phải là mẫu trung bình. Nghĩa là sau khi chia
thành lô hàng đồng nhất, mẫu sẽ lấy đều ở các góc, ở các phía trên dưới, giữa lô
hàng và trộn đều..
- Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lô thực phẩm. Mẫu kiểm của một lô
hàng lớn hơn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gói tối thiểu phải đạt 200g, mẫu
bao gói rồi tối thiểu cần 100 g. Với sản phẩm bao gói, chỉ những sản phẩm còn
nguyên mới được dùng để phân tích. Đối với dạng lỏng (nước dùng trong chế
biến, nước mắm..): 500ml…
- Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu phù hợp.
Dụng cụ lấy mẫu, bảo quản mẫu phải được tiệt trùng
- Những mẫu chưa sử dụng ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ -20 oC cho đến khi
phân tích. Trường hợp mẫu không cần bảo quản đông thì có thể bảo quản ở
nhiệt độ 0-4oC để tránh sự biến động về thành phần đặc tính của mẫu cũng như
vi sinh vật. Nhìn chung, mẫu phải được xét nghiệm trong vòng 24h.Để lâu hơn
có thể bị tăng hoặc giảm vi sinh vật.
Bảng 2.1. Lượng mẫu tối thiểu cần thiết để phân tích
STT Tên thực phẩm Lượng mẫu Đơn vị
18
1 Thịt và các sản phẩm của thịt 200 ÷ 500 gram
2 Cá, tôm, cua (nguyên con) 200 ÷ 500 gram
3 Trứng 5 ÷ 10 Quả
4 Nước mắm, nước chấm 500 ÷ 750 ml
5 Dấm 500 ÷ 750 ml
6 Sữa tươi 500 ÷ 750 ml
7 Dầu, mỡ 500 ÷ 750 ml
8 Rượu các loại 750 ÷ 1000 ml
9 Bột ngũ cốc, sản phẩm của bột 250 ÷ 500 gram
10 Bánh, mứt, kẹo 250 ÷ 500 gram
11 Gia vị, muối 50 ÷ 100 gram
12 Phẩm màu 20 ÷ 50 gram
13 Đồ hộp, nước giải khát 5 ÷ 10 hộp, chai
Tùy theo lô hàng và yêu cầu kiểm nghiệm, thực phẩm có thể lấy nhiều hơn mức trên.
Mẫu Test N C m M
Thịt tươi - Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình 5 3 106 107
gia súc - Samonella 5 0 0
Thịt gia - Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình 5 3 106 107
cầm
- Salmonella 5 0 0
- Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: bánh, kẹo, mứt… Cân 10 g (hoặc 25 g)
mẫu cho vào cối sứ nghiền nát, sau đó bỏ vào erlen 150 ml hoặc 200 ml đã có
sẵn bi thủy tinh vô khuẩn hay nước cất đã tiệt trùng. Lắc đều, để lắng cặn. Hút
phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1.
- Đối với các sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: đồ hộp thịt… cân 10-100 g mẫu (cả
cái lẫn nước) cho vào cối nhỏ vô trùng nghiền. Cân 10 g đã nghiền nát cho vào
erlen 250 ml có 90 ml dung dịch nước muối sinh lý có bi thủy tinh, lắc đều, để
lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1.
- Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: nước chấm, nước giải khát… Có thể hút
trực tiếp mẫu hoặc pha loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn. Lắc kỹ. Hút 10 ml
mẫu cho vào erlen 250 ml đã có sẵn 90 ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệt
khuẩn. Ta có độ pha loãng 10-1.
20
- Đối với các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE
(Polyetylen), đặt vào khay tráng men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rã
đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, hoặc giải đông ở 2-5 oC trong 18 h; hoặc 45oC
trong 15 phút nếu cần (liên tục lắc bình chứa mẫu nếu có thể để tăng tốc độ giải
đông)
- Dung dịch pha loãng: tốt hơn nên dùng nước peptone 0.1%, nước đệm phot
phat, nước muối sinh lý (0.85%), trong buffer nếu cần.
2.2. KỸ THUẬT PHA LOÃNG
Mẫu thực phẩm ở dạng rắn đã được đồng nhất hoặc dạng lỏng sẽ được pha loãng theo
bậc 10 trong dung dịch pha loãng SPW hoặc BPW. Sau khi pha loãng dịch pha loãng
sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng hoặc phân lập vi
sinh vật thành những khuẩn lạc riêng biệt. Từ đó chúng ta có thể gián tiếp xác định
được mật độ tế bào hay bào tử gọi chung là CFU (Coloning Form Unit) có trong thực
phẩm cũng như phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật.
- Môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng
cần thiết khác nhau. Thành phần dinh dưỡng này tuỳ thuộc vào nhu cầu của
từng loại vi sinh vật.
- Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh,
phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật… Môi trường
cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng đa lượng và vi
lượng… cần cho sự biến dưỡng về vật chất, năng lượng của đối tượng vi sinh
vật quan tâm. Ngoài ra, môi trường cần có một hàm lượng nước thích hợp, có
độ pH xác định và kết cấu thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật mục
tiêu.
- Mọi cơ thể sống đều được cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ. Các hợp chất hữu
cơ có cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O và N gọi là các nguyên tố thiết yếu của
sự sống. Nhìn chung các nguyên tố thiết yếu không thể thiếu trong quá trình
sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài các nguyên tố thiết yếu, trong
các cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa lượng như: S và P, các nguyên tố
vi lượng như: Fe, Cu, Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I…Vì thế trong thành phần
dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhóm
nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, VSV sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơ
thể thực vật, động vật hoặc VSV.
- Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0,05 –
0,20%, nấm mốc và nấm men khoảng 3 – 15%.
- Các chất tăng trưởng chủ yếu là các vitamin và các gốc kiềm purin, pirimidin,
các acid béo, các thành phần của màng tế bào... Nồng độ thích hợp của các gốc
21
kiềm purin, pirimidin cho vi sinh vật vào khoảng 5 – 20 µg /ml. Nồng độ thích
hợp của các vitamin vào khoảng 0,1 – 0,5 µg/ml (1 µg = 10-6 g )
Chất hữu cơ
C 50
CO2
O Chất hữu cơ 20
N NH4+,NO3 - ,NO2- 14
H Chất hữu cơ 8
S SO42- 1
- - Môi trường tự nhiên: có thành phần được sản xuất từ các sản phẩm có nguồn
gốc động thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là không xác
định.
- - Môi trường tổng hợp: được điều chế từ các hoá chất tổng hợp tinh khiết với
hàm lượng xác định
- - Môi trường bán tổng hợp: là môi trường tổng hợp mà trong thành phần của
môi trường có bổ sung một số thành phần có nguồn gốc tự nhiên.
22
- - Lỏng (Broth): không chứa agar trong thành phần môi trường. Môi trường lỏng
dùng để nuôi cấy tăng sinh, thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hoá.
- - Rắn: trong thành phần môi trường có từ 20-25% agar. Môi trường rắn dùng để
phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, định lượng
mật độ vi sinh vật.
- - Bán lỏng (bán rắn): được dùng để lên men vi sinh vật trong công nghiệp
- - Môi trường tiền tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không chọn
lọc vi sinh vật. Ví dụ: nước pepton.
- - Môi trường tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối
tượng vi sinh vật cần kiểm nghiệm. Ví dụ: môi trường tetrathionate dùng tăng
sinh chọn lọc Salmonella
- - Môi trường chọn lọc: là môi trường rắn dùng để phân lập chọn lọc các khuẩn
lạc của vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân chọn lọc trong môi trường chọn lọc:
- + Chất chỉ thị màu như brilliant green, sodium selenite, bile salts, potassium
tellurite, sodium lauryl sulfate;
- + anaerobiosis bằng cách tạo điều kiện kỵ khí hoặc bổ sung những hóa chất ức
chế quá trình hô hấp như sodium azide, potassium cyanide (ức chế vsv sinh
catalase); phủ một lớp thạch lên trên mặt thạch (vd trong phân tích VK lactic);
- - Môi trường phân biệt :là môi trường rắn chọn lọc chứa các thành phần chỉ thị
giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối lượng vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân phân
biệt trong môi trường phân biệt:
- + Chỉ thị pH: Lên men đường tạo acid và làm giảm pH, decarboxyl amino acids
và thủy phân urea tạo ra ammonia amine khiến tăng pH. Chỉ thị pH thường
dùng là phenol red, methyl red và brom cresol purple.
- + Chỉ thị H2S: Một số vsv phân giải amino acid tạo H 2S. H2S được phát hiện
bằng cách sử dụng muối sắt như sắt citrate, ferric ammonium citrate… tạo ra
FeS có màu đen.
- + Phản ứng lòng trắng trứng: Một số vsv tạo lypolytic enzymes khiến môi
trường có chứa lòng trắng trứng xung quanh khuẩn lạc trở nên trong hơn.
- + Phản ứng phân huỷ hồng cầu máu: Để phân biệt một số VK độc hại như
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes.
23
- - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định một hoặc vài
đặc điểm sinh hoá của chủng vi sinh vật đã phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để
định danh chủng.
- Trong rất nhiều các phản ứng sinh hoá dùng trong quá trình phân tích vi
sinh vật, thành phần môi trường của các thử nghiệm này thường có chứa những
chất chỉ thị màu. Các chất chỉ thị màu hoạt động theo nhiều nguyên tắc khác
nhau như làm cho tế bào vi sinh vật, khuẩn lạc của chúng có màu, làm cho môi
trường có màu hoặc thay đổi màu.... Trong các nguyên tắc đó, thì sự thay đổi
màu theo sự thay đổi của pH môi trường là phổ biến nhất ở các phản ứng sinh
hoá. Mỗi một chất chỉ thị màu thay đổi màu theo những giá trị pH khác nhau.
Do đó, ở mỗi phản ứng, cần căn cứ vào đặc tính của vi sinh vật khi phân tích,
môi trường nuôi cấy, đặc điểm cần nhận diện mà bổ sung những chất chỉ thị
màu cho phù hợp.
Bảng. Một số chất chỉ thị màu và ngưỡng pH thay đổi màu của chúng
24
-
26
- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và nhúng
vào canh trường lấy một ít canh trường chứa vi sinh vật mà không để đầu que cấy
chạm vào thành và miệng ống nghiệm.
- Đầu que cấy có dính VSV được giữ ở không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn cồn.
- Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi
đưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và khuấy nhẹ que
cấy.
- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.
- Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá để
que cấy.
- Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy: ghi tên vi sinh vật và ngày gieo
cấy.
Chú ý : Khi cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm kia có thể cầm hai ống
nghiệm cùng một lúc trên cùng bàn tay trái.
Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống nghiệm
thạch nghiêng
Thường sử dụng que cấy vòng. Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ môi
trường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4. Sau khi lấy được sinh
khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào trong ống
nghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên.
Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng
Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng. Các
bước tiến hành cũng tương tự như mục 1.1 và 1.2, nhưng có điểm khác như sau:
- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việc
nhiễm khuẩn lúc gieo cấy.
- Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần đáy
ống nghiệm.
Lưu ý: Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút que cấy ra, chú ý phải giữ que cấy
thẳng, nhẹ nhàng và không làm cho môi trường bị nứt nẻ.
2.5.2.Phân lập vi sinh vật
VSV tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài VSV. Việc
phân lập 1 loài nhất định trong quần xã VSV dựa vào khả năng phân tách các tế bào ra
thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc.
Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật
pha loãng để phân tách tế bào VSV kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để tạo ưu thế
tăng trưởng cho chủng quan tâm. Hiện nay, có các kỹ thuật phổ biến sau:
2.5.2.1.Kỹ thuật hộp ria (streak plate)
Là kỹ thuật phân tách hỗn hợp VSV bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch sao cho các tế
bào riêng rẽ nhau ra. Sau khi được ủ trong một thời gian, mỗi tế bào sẽ tăng trưởng
thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành do sự sinh sản, phân chia từ
một tế bào ban đầu.
27
Trong kỹ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và không có kỹ thuật nào hoàn hảo
tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy. Sau đây là môt số
kỹ thuật ria thường dùng:
Kỹ thuật ria chữ T (T streak) Kỹ thuật ria liên tục (continuous streak)
Kỹ thuật ria 4 góc (quadrant streak) Kỹ thuật ria tia (radiant streak)
Hình 3.1 Các kiểu ria trên môi trường thạch
Chú ý: Sau mỗi vùng ria, người ta phải tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
2.5.2.2.Kỹ thuật hộp trải : Môi trường được chuẩn bị trước trong các đĩa Pettri. Yêu
cầu bề mặt môi trường phẳng, không ướt. Nhỏ 0,1 hoặc 0,2 ml dịch mẫu đã được pha
loãng vào chính giữa đĩa môi trường. Dùng que trang vô trùng trải đều mẫu khắp bề
mặt đĩa. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.
2.5.2.3.Kỹ thuật hộp đổ : Hút 1 ml dịch mẫu đã được pha loãng vào chính giữa đĩa.
Đổ 15-20 ml môi trường đã tiệt trùng, đã để nguội khoảng 45-50 oC vào giữa đĩa. Dùng
tay xoay nhẹ sang trái và xoay nhẹ sang phải vài lần để dịch mẫu hòa để vào môi
trường. Để yên đĩa trên bề mặt phẳng cho đông. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ
phát triển thành một khuẩn lạc.
28
lượng vi sinh vật có trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp.
Phương pháp tiến hành theo hai bước:
1. Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm sao cho các dung dịch
thu được khi đo trên máy so màu ở bước sóng 610nm được các trị số OD gần 0,1; 0,2;
0,3; 0,4; 0,5.
Dùng phương pháp đếm trực tiếp xác định lượng tế bào vi sinh vật có trong 1ml
ký hiệu N/ml.
Tính giá trị log (N/ml) cho từng mức nồng độ pha loãng. Vẽ đồ thị biểu diễn log
(N/ml) (trục tung) theo các giá trị OD đặt trên trục hoành. Xác định khoảng tuyến tính
giữa log (N/ml) với OD.
2. Xác định lượng tế bào theo độ đục:
- Đo độ đục của huyền phù của tế bào vi sinh vật cần xác định.
- Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và
OD để xác định lượng tế bào có trong mẫu nghiên cứu. Lưu ý N/ml = 10 a với a=log
(N/ml).
Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh
mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng. Trong
trường hợp không cần thiết giá trị tuyệt đối của tế bào vi sinh vật thì không cần phải
xây dựng biểu đồ tuyến tính giữa mật độ vi sinh vật và giá trị OD.
Phương pháp này cho kết quả nhanh, thường được dùng để theo dõi hoặc nghiên
cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hoặc
trong sản xuất, tuy nhiên không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật
2.6.2.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
KHUẨN LẠC
Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống trong mẫu.
Những tế bào sống mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường thích
hợp.
29
Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tuỳ thuộc vào môi
trường nuôi cấy.
Phương pháp này thực hiện như sau:pha loãng mẫu sao cho số lượng khuẩn lạc
xuất hiện trên một dĩa petri khoảng 25 – 250. Dưới mức 25 sẽ khó chính xác trên mức
250 rất khó phân biệt các khuẩn lạc khi đếm. Mẫu có thể được cấy bằng kỹ thuật cấy
ria hay cấy trải.
Với mỗi loại vi khuẩn đòi hỏi phải có thời gian nuôi cấy tối ưu. Sao cho các tế
bào sống đủ thời gian phát triển thành khuẩn lạc. Kết quả thu được là số trung bình của
2 – 3 đĩa petri với cùng điều kiện nuôi cấy. Kết quả cũng thường được trình bày dưới
dạng CFU (Colony Forming Unit) thay vì số tế bào/ml, vì rằng có nhiều tế bào hình
thành chung một khuẩn lạc.
Cứ tiếp tục, sẽ có các dung dịch với độ pha loãng tăng thêm 10 lần cho đến khi
tìm được độ pha loãng thích hợp, cho phương pháp đếm khuẩn lạc.
30
Nguyên tắc chung là 1 phần mẫu + 9 phần dung dịch pha loãng cho nên nếu là
0,1ml cần bổ sung 0,9ml dung dịch pha loãng.
Chuẩn bị môi trường thích hợp trên đĩa petri
Cách tính kết quả :
Ví dụ: kết quả số khuẩn lạc trung bình từ 2 đĩa petri thu được là 35, độ pha loãng
10-4, số lượng mẫu đưa vào đĩa petri là 0,1ml ta có: 35.10.10000 = 3500000 CFU/ml
Cách biểu diễn kết quả:
- Biểu diễn kết quả phù hợp phương pháp đang áp dụng
- Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10 n (n là số
mũ thích hợp của 10).
Ví dụ:
31
Số ống dương tính Số ống dương tính
Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng
MPN/100 ml MPN/100 ml
(ml) (ml)
10 1 0,1 10 1 0,1
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6 2 1 1 20
0 1 2 9 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6 2 2 0 21
0 2 1 9 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 4 3 0 0 23
1 0 1 7 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 -
2.6.4. ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT MÀNG LỌC
Phương pháp này được dùng để định lượng vi sinh vật trong các mẫu nước với
mật độ vi khuẩn thấp. Vì vậy phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật
có trong mẫu nước trên màng lọc. Việc xác định số lượng tế bào vi sinh vật dựa vào số
khuẩn lạc đếm được. Sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thật có thành phần dinh
dưỡng thích hợp. Theo nguyên lý một khuẩn lạc là một tế bào vi sinh vật.
Màng lọc có kích thước 0,2 – 0,45 µm được chế tạo từ các sợi thủy tinh hay sợi
polypropylene.
Ngoài màng lọc thông thường, ngày nay còn dùng màng lọc kỵ nước
(Hydrophobic Grid Membrane). Các vạch chia ô làm bằng vật liệu ngăn cản sự mọc
lan của các khuẩn lạc. Số vi sinh vật được tính theo số khuẩn lạc mọc trong các ô.
- Từ số các ô vuông có khuẩn lạc suy ra mật độ vsv trong mẫu theo dạng số có
xác xuất lớn nhất (MPN): MPN = N. ln(N/(N-x)); trong đó N là tổng số các ô vuông, x
là số ô có khuẩn lạc mọc.
32
Hình 12. Bộ lọc vô trùng và màng lọc
400 ô nhỏ sẽ bằng hoặc 25 ô vuông lớn, tương ứng thể tích của ô vuông lớn là
1/250mm3.
Trước khi quan sát cho thêm vài giọt formalin vào trong mẫu. Pha loãng mẫu
sao cho trong mỗi ô vuông nhỏ có khoảng 5 – 10 vi sinh vật. Muốn đạt được yêu cầu
33
trên cần phải ước lượng số vi sinh vật trong mẫu, hay phải làm thử một vài lần để xác
định được công thức pha loãng tối ưu.
34
3. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
Khi nhuộm vi sinh vật bằng một số thuốc nhuộm phát huỳnh quang như:
- Acridin Cam (AODC)
- 4, 6 – dianidino – 2 – phenyl – indol (DAPT)
- Fluoresecin isothio cyanate (FITC)
Mật độ vi sinh vật có thể xác định trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Số đếm nhận được bằng phương pháp này có thể cao gấp 2 lần phương pháp
đếm khuẩn lạc. Sự sai khác này do các tế bào chết hoặc tổn thương không có khả năng
phát triển thành khuẩn lạc.
Kết quả số đếm vi sinh vật bằng kính huỳnh quang phản ánh số vi sinh vật có
thật trong mẫu.
2.7. THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, sau khi phân lập, việc định danh vi sinh
vật là một vấn đề rất quan trọng. Việc định danh này được thực hiện dựa và các đặc
điểm về kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng sinh hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh
vật. Thông thường để thực hiện các phản ứng sinh hoá có thể tiến hành theo một trong
ba cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bị tự động.
Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá biểu thị quy
ước bằng các ký hiệu như: (+): dương tính; (-): âm tính; (+/-): khoảng trên 70% là
dương tính và (-/+): khoảng trên 70% là âm tính.
Trong các thử nghiệm sinh hoá, để đảm bảo chính xác trong việc đọc kết quả,
người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng. Một số chủng đối
chứng cho các thử nghiệm sinh hoá thường dùng được trình bày trong bảng sau:
35
Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC
Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng thường sử dụng trong phân tích vi sinh vật
bao gồm như sau:
1. Thử nghiệm khả năng lên men
Thử nghiệm khả năng lên men là thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử
dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên
men. Tùy theo vi sinh vật và nguồn cơ chất muốn kiểm tra có thể bổ sung vào môi
trường nuôi cấy những nguồn cơ chất khác nhau. Sản phẩm tạo thành từ quá trình sống
này sẽ làm giảm pH của môi trường nuôi cấy và từ đó làm thay đổi màu của chất chỉ
thị màu được bổ sung vào môi trường.
Chất chỉ thị màu thường sử dụng trong thử nghiệm là phenol red.
2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men
Thử nghiệmkhả năng oxy hoá – lên men nhằm mục đích xác định vi sinh vật
biến dưỡng nguồn carbon hydrat theo con đường lên men hay hô hấp. Phản ứng được
xác định dựa trên sản phẩm tạo thành từ quá trình sống của vi sinh vật và có thể làm
chuyển màu của chất chỉ thị màu bổ sung vào môi trường theo những cách khác nhau.
36
Thử nghiệm tiến hành trên môi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thị pH là
bromothymol blue
3. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat
duy nhất của vi sinh vật. Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối
amoniu. Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường Simmon citrate có nguồn carbon
duy nhất là citrae với sự hiện diện của chất chỉ thị màu bromothymol blue.
4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duy
nhất. Ở những chủng có đặc tính này, sẽ có khả năng dùng muối amonium. Thử
nghiệm được tiến hành trên môi trường malonate broth với chất chỉ thị màu
bromothymol blue.
37
12. Thử nghiệm KIA, TSI
Thử nghiệm KIA hay TSI là thử nghiệm được thực hiện đồng thời trên môi
trường KIA, TSI dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau
(glucose, lactose, sucrose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật.
13. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat
thành nitrite và các sản phẩm khác. Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng
với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức
chất màu hồng.
14. Thử nghiệm oxidase
Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxydase ở vi sinh vật.
Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiện
của enzym, thuốc thử bị oxy hoá một hợp chất indolphenol có màu xanh dương.
15. Thử nghiệm ONPG
Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym β-galactosidase tham gia vào
quá trình lên men lactose ở vi sinh vật. Môi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa o-
nitrophenyl-D-galactopyranoside. Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol có màu vàng.
16. Thử nghiệm MR (Methyl Red)
Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo
và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men
glucose tạo và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử methy red trong môi
trường. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính, không làm
đổi màu thuốc thử.
17. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)
Phản ứng dùng phân biệt các loài trong họ vi khuẩn đường ruột
Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxi hoá acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thành
diacetyl. Diacetyl được xác định dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine của
pepton tạo phức đỏ.
18. Thử nghiệm CAMP
Phản ứng nhằm phân biệt các nhóm Streptococcus. Phản ứng CAMP là thực
hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhóm B tiết ra và β-hemolysin được tiết ra
bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của β-hemolysin gây phá vỡ hồng cầu
(tan huyết)
19. Thử nghiệm tính di động
Là thử nghiệm dùng để xác định đặc tính di động nhờ tiêm mao của vi sinh vật.
Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường bán lỏng. Kết quả được xác định dựa vào
kích thước của vệt cấy vi sinh vật.
38
Ngày nay, các thử nghiệm sinh hoá truyền thống để định danh vi sinh vật đã có
thể thực hiện ở các thuốc thử ở dạng đĩa giấy, que giấy. Ngoài ra, còn có các bộ KIT
cho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hoá theo một quy trình hai lựa chọn để
định danh vi sinh vật. Các bộ KIT này được sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưu
điểm là tiết kiệm thời gian, công sức; tuy nhiên cũng có nhược điểm ví dụ như mỗi bộ
KIT chỉ cho phép định danh một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn
Hình 24. Các dạng KIT sinh hoá định danh vi sinh vật
CHƯƠNG III
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG
40
1.3.Thực hành
1.3.1.Quy trình phân tích
Định lượng mẫu
10 g hoặc 10 ml
Ủ mẫu
30 ± 1 oC trong 72 giờ
41
1ml 1ml 1ml
42
V là thể tích dịch cấy vào petri
fi là độ pha loãng tương ứng
Ví dụ: Phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1 gram thịt heo sống đã qua bảo
quản 3 ngày ở 10 oC. Kết quả:
Độ pha loãng (fi) 10-3 10-4
Đĩa số 1 (n1) 224 20
Đĩa số 2 (n2) 235 26
Áp dụng công thức, ta có kết quả:
224 + 235 + 26
A= −3 −4
= 2,3× 105 (CFU/g)
2 × 1× 10 + 1× 1× 10
Các kết quả của tổng số vi khuẩn hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số
mũ của cơ số thập phân.
Trường hợp khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mỗi vết loang được tính là một
khuẩn lạc.
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250, ví dụ ở
nồng độ 10-4 số đếm > 250 thì kết quả ghi: > 2,5 x 10-6 CFU/g.
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở
nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25 thì kết quả ghi: < 2,5 x 10-2 CFU/g.
Petri có > 250 khuẩn lạc Petri có 25 – 250 khuẩn lạc Petri < 25 khuẩn lạc Petri có khuẩn lạc mọc loang
Hình 1.2. Số khuẩn lạc đếm trên đĩa Petri
43
2. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN-NẤM MỐC
2.3.1.Quy trình phân tích Trải 0,1 ml dung dịch mẫu lên môi trường DRBC
Ủ mẫu
30 ± 1 oC trong 3 – 7 ngày
44
Đếm khuẩn lạc
Chọn đĩa có 25 - 250 khuẩn lạc
Sơ đồ quy trình định lượng tổng số nấm men - nấm mốc
45
3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ SÁC
XUẤT LỚN NHẤT (MPN)
3.1.Nguyên tắc
Phương pháp phân tích trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử dụng canh
Lauryl Sulphate Broth (LSB) vào test đoán chừng (presumptive test), sau đó dùng
canh Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB) và ủ ấm ở 37oC/24-48 giờ.
Phương pháp MPN là phương pháp dựa trên nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1
dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); mỗi nồng độ pha
loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại có ống Duharm. Theo dõi sự đục môi trường và
sinh hơi để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương
tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và
dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g
(hoặc 1ml) mẫu ban đầu.
3.2.Dụng cụ, môi trường, hóa chất và thiết bị
3.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 3.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 3
Dụng cụ Thiết bị
Túi dập mẫu Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Que trang Máy dập mẫu (Stomacher)
Ống Durham Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân kỹ thuật
Ống nghiệm
Pipette 1 ml, 10 ml
46
3.3.Thực hành
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng
47
3.4.Câu hỏi thảo luận
1.Trong Coliforms tổng có các giống vi sinh vật nào?
2. Nêu nguyên tắc của phương pháp MPN? Viết tắt của MPN?
3. Nêu vai trò của các thành phần trong môi trường LSB và BGB
Töø Coliforms ñöôïc Blachstein söû duïng ñaàu tieân vaøo naêm 1893
ñeå noùi veà nhöõng vi khuaån Bacilli coù ñaëc ñieåm hình thaùi gioáng E.
coli.
Coliforms toång coäng laø nhöõng tröïc khuaån ñöôøng ruoät, gram (-),
khoâng sinh baøo töû, hieáu khí hoaëc kò khí tuøy tieän, coù khaû naêng leân
o o
men lactose sinh acid vaø sinh hôi ôû35 C - 37 C trong 24-48 giôø. Nhoùm
Coliforms hieän dieän roäng raõi trong töï nhieân, trong ruoät ngöôøi, ñoäng
vaät. Soá löôïng Coliforms trong maãu ñöôïc duøng ñeå chæ thò khaû naêng
hieän dieän cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc, maëc duø ñieàu naøy
coøn nhieàu tranh caõi. Nhoùm Coliforms goàm boán gioáng laø: Escherichia
vôùi moät loaøi duy nhaát laø E. coli; Citrobacter; Klebsiella vaø Enterobacter.
Coliforms chòu nhieät laø nhöõng Coliforms coù khaû naêng leân men
o
lactose sinh hôi khi uû ôû 44 C/24h trong moâi tröôøng EC.
Coliforms phaân (Faecal Coliforms hay E. coli giaû ñònh) laø Coliforms
o
chòu nhieät coù khaû naêng sinh indole khi uû ôû 44.5 C/24h trong tryptone.
Escherichia coli laàn ñaàu tieân ñöôïc Escherich phaân laäp töø phaân
ngöôøi vaøo naêm 1855. Ñaây laø vi khuaån ñöôïc chuù yù nhieàu vaø
nghieân cöùu kyõ löôõng nhaát. Chuùng cö truù ôû ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi
vaø ñoäng vaät maùu noùng. Chuùng coù theå laø vi khuaån gaây beänh cô
hoäi. E. coli laø vi sinh vaät chæ thò tieâu bieåu nhaát. Söï coù maët cuõng
nhö soá löôïng cuûa chuùng chæ ra möùc ñoä veä sinh trong quaù trình cheá
bieán, baûo quaûn, vaän chuyeån thöïc phaåm, nöôùc uoáng cuõng nhö söï
oâ nhieãm phaân trong moâi tröôøng. Töø naêm 1982 ñaõ phaùt hieän thaáy
48
4 loaøi E. coli coù khaû naêng gaây beänh coù nguoàn goác thöïc phaåm
(Enteropathogenic-EPEC; Enteroinvasive-EIEC; Enteroinvasive- EIEC;
Enterotoxigenic – ETEC, trong ñoù coù chuûng O157:H7). Baøi thöïc haønh
naøy chæ giôùi haïn ôû vieäc xaùc ñònh E. coli nhö moät vi sinh vaät chæ thò
thöïc phaåm.
Phöông phaùp phaân tích trong baøi naøy ñöôïc döïa treân quy trình
MPN baèng söû duïng canh thang Lauryl sulphate tryptose (LST) vaøo test
ñoaùn chöøng (presumptive test), sau ñoù duøng canh thang BGLB (Brilliant
o
Green Lactose Bile Broth) vaø uû aám ôû 37 C/24-48 h (ñeå kieåm tra
Coliforms). Tieáp theo chuyeån sang moâi tröôøng canh EC (E. coli medium)
o
uû ôû 44.5 C ñeå kieåm tra Coliforms chòu nhieät. Sau ñoù xaùc ñònh
Coliforms phaân (E. coli giaû ñònh) baèng caùch caáy sang moâi tröôøng EMB
(Eosine Methylene Blue Agar), choïn khuaån laïc ñieån hình vaø thöû khaû
naêng sinh Indol (I). Ñeå xaùc ñònh E. coli caàn thöû ba phaûn öùng sinh hoùa
tieáp theo laø Methyl Red (MR), Voges-Proskeur (VP) vaø Citrate (iC). E. coli
laø Coliforms phaân vaø cho keát quaû thöû nghieäm IMViC laø + + - -.
49
Water(SPW)
Lauryl Sulfate Tryptone Broth. HCl 20%
Môi trường BGBL (Brilliant NaOH 20%
Green Lactose Bile Salt)
Thuốc thử Kovac’s
Moâi tröôøng Tryptic Soya
Agar (TSA)
NaOH 10%
4.3.Thực hành
4.3.1.Quy trình phân tích
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có các độ pha loãng
10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1 ml dung dịch pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp vào ống nghiệm có 10
ml canh LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3 ống, ủ ở 37 ± 1 oC, 48 giờ
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng
50
Chuyển 1 ml từ LSB (+) sang canh EC, ủ 44,5 ± 0,2 oC, 24giờ
Choïn khuaån laïc deït, hình dĩa, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính ≥ 1mm
ñeå caáy sang TSA/BHI, ủ 37 ± 1 oC, 24 giờ
E.coli
51
Hình 4.1 : Các ống EC (+) Hình 4.2 : E.coli trên môi trường EMB
Bước 6.Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang
môi trường thạch đĩa EMB/ Endo . Ủ các đĩa 37oC, 24giờ.
- Treân moâi tröôøng EMB: khuaån laïc maøu tím, aùnh kim, troøn, bôø
ñeàu, ñöôøng kính khoaûng 1mm
- Treân moâi tröôøng Endo: Khuaån laïc maøu ñoû, aùnh kim, troøn, bôø
ñeàu, ñöôøng kính khoaûng 1mm
Bước 7. Chọn khuẩn lạc E.coli giả định trên EMB/Endo cấy vào TSA/BHI, ủ qua đêm
Bước 8.Cấy chuyển từ môi trường TSA/BHI vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa
Trypton broth, MR- VP, SC. Ủ 44,5 ± 0,2 oC, 24giờ.
Phaûn öùng Indol: Caáy khuaån laïc nghi ngôø vaøo oáng
0
nghieäm chöùa 5ml Trypton broth, uû 37 C trong 24giôø. Cho theâm
0,5ml thuoác thöû Kovac baèng caùch cho chaûy doïc theo thaønh
oáng nghieäm
Phaûn öùng MR (metyl red): Caáy khuaån laïc nghi ngôø vaøo 2
oáng nghieäm, moãi oáng chöùa 5ml moâi tröôøng MRVP ñeå ôû
0
37 C töø 48 – 96 giôø. Moät oáng thöû phaûn öùng Methyl red,
moät oáng thöû phaûn öùng VP.
Cho vaøo moät oáng nghieäm vaøi gioït metyl red ôû pH trung tính
hoaëc kieàm yeáu
52
+ Moâi tröôøng chuyeån maøu ñoû: MR (+)
+ Moâi tröôøng ñoåi sang maøu ñoû eosin hoaëc coù veät ñoû eosin
phaùt trieån trong voøng 15 phuùt : VP (+)
+ Moâi tröôøng khoâng ñoåi maøu, khoâng moïc khuaån laïc: citrat (-)
4.3.3.Kết quả
Ống nghiệm cho kết quả EC (+), và khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường
EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC (++-- ) là ống nghiệm có E.coli (+). Từ số
lượng các ống có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu tra bảng MPN để tính
ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay
MPN/ml
5.1.Nguyên tắc
53
Nhö vaäy vieäc xaùc ñònh thoâng thöôøng chæ döøng ôû möùc ñoä ñònh
tính, teân chuûng chæ ñöôïc xaùc ñònh trong nhöõng tröôøng hôïp quan
troïng. Caàn löu yù Salmonella laø nhoùm chöùa caùc doøng gaây beänh nguy
hieåm, do vaäy caàn tuaân thuû trieät ñeå caùc bieän phaùp an toaøn khi
laøm vieäc vôùi caùc chuûng ñoái chöùng (+) cuõng nhö khi thao taùc treân
caùc chuûng phaân laäp ñöôïc. Caùc moâi tröôøng hay maãu vaät sau khi
nuoâi caáy caàn phaûi haáp khöû truøng caån thaän tröôùc khi röûa. Do trong
thöïc phaåm Salmonella thöôøng toàn taïi ôû soá löôïng ít, teá baøo coù theå
bò toån thöông do ñoù quy trình xeùt nghieäm thoâng thöôøng goàm 4 böôùc:
taêng sinh, taêng sinh choïn loïc, phaân laäp vaø khaúng ñònh.
5.2.Dụng cụ, thiêt bị, môi trường và hóa chất
5.2.1..Dụng cụ và thiết bị
54
Môi trường Hóa chất
Cồn 90 và 70o
o
Dung dòch Buffered Peptone Water (BPW)
Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV) Dd creatine 0,5 %
Selenit xystin / Tetrathionat (TT)
Dung dòch α- naphtol 5%
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)
KOH 40%
Môi trường Hektoen Entric Agar (HE)
Thuoác thöû Kovac
HCl 10%
Moâi tröôøng Trypticase Soy Agar (TSA)
NaOH 10%
Moâi tröôøng Lysine Decacboxylase broth
(LDC)
Moâi tröôøng KIA hoaëc TSI
5.3.Thực hành
5.3.1.Quy trình phân tích
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHI
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3o vào ống
hoặc thạch TSA, ủ qua đêm, 37 C
10ml canh LBS, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ ở
5
37cho
Thử nghiệm sinh hóa
0
C, kết
48 giờ
quả:
- KIA/TSI: đỏ/vàng, có /không H2S, sinh hơi/không
55
5.3.2.Các bước tiến hành
Bước 1. Tăng sinh
- Caân 25g maãu ñaõ nghieàn, hoặc hút 25 ml mẫu cho vaøo bình ñaõ
0
chöùa saün 225ml moâi tröôøng BPW, laéc ñeàu ñeå ôû 37 C trong 24 giờ.
Bước 2. Tăng sinh chọn lọc
- Huùt 1ml canh khuaån BPW sang moâi tröôøng RV, nuoâi trong 24
o
giờ ôû 42 C.
- Huùt 1ml canh khuaån BPW sang moâi tröôøng Selenit-cystin/TT,
o
nuoâi trong 24 giờ ôû 37 C.
\
Hình 5.2. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD (trái), HE (phải)
57
Thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU chứa chỉ thị
đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu
là pH 6,8 - 8,4). Có thể sử dụng môi trường urea thạch cơ
bản có bổ sung urea.
Lấy đầy một que cấy vòng từ khuẩn lạc trên môi trường
TSA vào ống chứa 3ml-5ml môi trường RSU vô trùng,
lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37 oC trong 48
giờ.
Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi
pH môi trường; nếu phản ứng dương tính, việc phân giải Urea (-) Urea
ure sẽ giải phóng NH3 làm đổi màu phenol red sang màu (+)
hoa hồng và sau đó chuyển sang màu đỏ tím. Hình5.4. Thử nghiệm
Thử nghiệm VP
Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào
các ống môi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02
giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đó thêm
02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi
trong vòng 15 phút là phản ứng dương tính
Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, không đổi
màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ VP (-) VP
trên bề mặt môi trường.
(+)
58
Cho một giọt dung dịch nước muối sinh lý lên một phiến kính đã rửa sạch. Dàn đều
khuẩn lạc cần thử nghiệm trong giọt dung dịch sao cho thu được một thể huyền phù
đục đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính trong 30-60 giây.
Quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất nên dùng kính lúp.
Nếu các vi khuẩn vón lại thành các đơn vị ít nhiều có kết dính thì chủng này được
coi là tự kết dính và không cần phải thử tiếp vì việc phát hiện kháng nguyên không
thể thực hiện được.
+ Kiểm tra kháng nguyên O:
Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết không tự ngưng kết, tiến hành như phương
pháp kiểm tra sự tự kết dính ở trên, bằng cách thay một giọt kháng huyết thanh O
thay cho dung dịch nước muối.
Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng được coi là dương tính. Sử dụng tuần tự một
kháng huyết thanh đa giá và đơn giá.
+ Kiểm tra kháng nguyên Vi:
Tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự kết dính bằng cách thay một giọt huyết
thanh Vi thay cho dung dịch nước muối.
Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng coi là dương tính.
+ Kiểm tra kháng nguyên H:
Cấy từ 1 khuẩn lạc không tự dính kết thuần khiết lên thạch dinh dưỡng thể nữa đặc
(phần dính kèm), ủ ấm 18-24 giờ, 37±1oC.
Dùng giống này để kiểm tra kháng nguyên H, tiến hành như phương pháp kiểm tra
sự tự dính kết, nhưng sử dụng một giọt kháng huyết thanh H thay cho dung dịch
nước muối sinh lý.
Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng coi là dương tính.
LƯU Ý
Có thể sử dụng kháng huyết thanh đa giá OMA, OMB để phát hiện sự có mặt của
các kháng nguyên Salmonella. Trên 98% các chủng Salmonella cho phản ứng ngưng
kết với một trong hai kháng huyết thanh OMA, OMB. Do vậy khi thấy có sự dính kết
với một trong hai kháng huyết thanh đa giá trên có thể kết luận là Salmonella.
5.3.4.Kết quả
Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Salmonella được
phát hiện trong 25g mẫu
59
2. Vai trò của môi trường tăng sinh BPW ?
4. Môi trường tăng sinh chọn lọc dùng trong quy trình phân tích Salmonella là gì?
5. Vai trò của môi trường tăng sinh chọn lọc?
6. Giải thích tại sao khuẩn lạc Salmonella có thể có tâm đen?
7. Trình bày các phản ứng sinh hóa dùng trong phân tích Salmonella: tên môi trường,
hóa chất, kết quả, giải thích kết quả.
6.1.Nguyên tắc
Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, không
sinh bào tử, không di động, thường tụ thành chùm có khả
năng lên men và sinh acid từ succrose, mannitol và sinh sắc
tố vàng, chịu mặn (7,5% NaCl). và có khả năng đông tụ
huyết tương (phản ứng coagulase (+)).
Staphylococcus aueus được xác định trên cơ sở các đặc
điểm tăng trưởng trên môi trường Baird Parker Agar bằng
kỹ thuật hộp trải và phản ứng làm đông huyết tương. Dựa
vào số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng Coagulase (+) suy Hình 6.1. Sta. aureus trên BPA
ra mật độ vi khuẩn này trong thực phẩm.
6.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất
6.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 6.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 6
Dụng cụ Thiết bị
Tủ cấy vô trùng
Phieán kính, laù kinh
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Que trang Máy dập mẫu (Stomacher)
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Ống nghiệm
60
Cồn 90o và 70o
Dung dòch Saline Peptone Water
(SPW)
HCl 10%
Moâi tröôøng Baird-Parker
NaOH 10%
Moâi tröôøng Trypticase Soy Agar
(TSA)
KH2PO4
Brain heart broth (BHI)
Huyết tương thỏ
6.3.Thực hành
6.3.1.Quy trình phân tích
61
Bước 3. Chuyển 0,1 ml dung dịch mẫu thử ở các nồng độ pha loãng thu được vào
chính giữa đĩa môi trường BPA đã được chuẩn bị trước (bề mặt các đĩa môi
trường này không được ướt), dùng que trang trải đều mẫu trên mặt thạch. Cấy
vào 2 đĩa mỗi nồng độ.
Lưu ý: Nếu số lượng Staphylococcus aureus dương tính thấp, có thể nâng nồng độ
dịch mẫu lên 10 lần, nghĩa là cấy 1ml dịch mẫu sơ khởi (mẫu nguyên nếu là
chất lỏng, hoặc mẫu 10-1 nếu là chất rắn) vào 3 đĩa. Kết quả ở 3 đĩa này được
xử lý gộp như một đĩa khi đọc, khẳng định và báo cáo kết quả
Bước 4. Lật ngược các đĩa và ủ 37,0 ± 1,00C trong 24 ± 3 và 48 ± 4 giờ
Bước 5. Sau 24 ± 3 giờ, trên môi trường thạch Bair parker khuẩn lạc Staphylococcus
aureus dương tính có đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng, lồi. Mỗi khuẩn lạc
có quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình được đánh
dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa. Sau 48 ± 4 giờ, khuẩn
lạc Staphylococcus aureus dương tính có đường kính 1,5-2,0mm, màu đen,
sáng và lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là vùng sáng,
trong rộng 2-4 mm. Ngoài ra còn có các khuẩn lạc không tạo vầng sáng bao
quanh, không tạo vùng đục sát khuẩn lạc, đó là các khuẩn lạc không điển
hình. Các khuẩn lạc không điển hình này cũng được đánh dấu ở mặt sau của
đĩa.
Bước 6. Cấy chuyển 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình từ Baird
Parker Agar sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trường BHI. Ủ 37,0 ± 1,0 oC
trong 24 ± 3 giờ.
Bước 7. Chuyển 0,1ml dịch nuôi cấy trong môi trường BHI
vào 0,3 ml huyết tương thỏ (hoặc theo hướng dẫn của
nhà sản xuất) trong các ống nghiệm nhỏ đã tiệt trùng
có kích thước 10mm x 75mm, để tủ ấm 37,0 ± 1,0 oC.
Chú ý làm mẫu blank( mẫu chứng). Kiểm tra sự đông
vón của huyết tương sau 4, 6, 8, 24giờ. Phản ứng làm
đông tụ huyết tương được coi là dương tính khi thể Hình 6.2. Đông tụ huyết tương thỏ
tích đông vón chiếm 3/4 toàn bộ thể tích chọn lựa
6.3.4.Keát quaû
Maät ñoä Staphylococcus aureus trong 1g maãu (CFU/g) =
10 × ( Nt H t + Na H a )
F1 + F2
Trong đó:
- F1 và F2 : 2 độ pha loãng liên tiếp
- Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2
- Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2
- Ht: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số
khuẩn lạc đặc trưng
- Ha: tỉ số giữa khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so
với số khuẩn lạc không đặc trưng
62
1. Tại sao phải bổ sung Egg Yolk Tellurite emulsion vào môi trường BPA cơ
bản?
2. Môi trường BHI có vai trò gì trong quy trình phân tích Staphylococcua aureus?
3. Hãy nêu hình thái khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcua aureus trên BPA.
4. Giải thích tại sao Staphylococcua aureus có khả năng đông tụ huyết tương thỏ
B.cereus laø nhöõng tröïc khuaån, Gram döông, hieáu khí, kî khí tuøy yù,
di ñoäng, taïo noäi baøo töû, leân men glucose sinh hôi, phaûn öùng VP(+).
Coù khaû naêng söû duïng nitrat. B.cereus coù theå tieát ra hai loaïi ñoäc toá
chính laø diarrhoeal toxin gaây tieâu chaûy vaø emetic toxin gaây noân möûa.
0
Loaøi naøy taêng tröôûng ñöôïc trong khoaûng nhieät ñoä töû 5-50 C,
0
toái öu ôû 35-40 C, pH dao ñoäng töø 4,5-9,3, deã taïo baøo töû vaø baøo töû
naûy maàm raát deã daøng. Treân moâi tröôøng choïn loïc loaøi naøy taïo
khuaån laïc raát to, moïc lan, rìa nhaên. Vi khuaån naøy hieän dieän trong
ñaát, buïi, caùc loaïi thöïc phaåm (söõa, thòt, rau quaû, hoãn hôïp gia vò, saûn
phaåm khoâ...).
B.cereus ñöôïc phaùt hieän vaø ñònh löôïng baèng moâi tröôøng thaïch
choïn loïc Manitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoaëc Cereus Selective Agar
(Mossel). Khuaån laïc B.cereus coù hình thaùi ñaëc tröng treân caùc moâi
tröôøng naøy. Caùc khuaån laïc naøy ñöôïc tieáp tuïc khaúng ñònh döïa treân
caùc thöû nghieäm sinh hoùa vaø caùc ñaëc ñieåm nhö leân men glucose
sinh acid trong ñieàu kieän kî khí, khöû nitrat thaønh nitrit, thöû nghieäm
VP(+), thuûy phaân L-tyrosine, taêng tröôûng ñöôïc trong 0,001% lysozym
7.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất
7.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 7.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 7
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Micropipet Máy dập mẫu (Stomacher)
Que trang, que cấy vòng Máy trộn mẫu (vortex mixer)
63
Kẹp inox Cân kỹ thuật
Đèn cồn Lò viba
Pipette 1 ml, 10 ml
7.3.Thực hành
7.3.1.Quy trình phân tích
-1
10 g mẫu + 90 ml dung dịch đệm 10
-2 -3 -4
Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10 10 10 ......
Cấy trải 0,1ml mẫu lên môi trường MYP, ủ 300C, 24-48 giờ
64
Cấy 05 khuẩn lạc nghi ngờ lên TSA, ủ 300C qua đêm
Maãu ñöa veà phoøng thí nghieäm, môû ra cho vaøo khay voâ truøng.
Duøng keùo vaø keïp voâ truøng laáy ñaïi dieän 10g maãu cho vaøo bao PE
voâ truøng trong ñieàu kieän voâ truøng. Maãu ñöôïc ñoàng nhaát vôùi 90ml
dung dòch ñeäm phosphat baèng maùy daäp maãu ñeå coù dung dòch pha
-1
loaõng 10 .
-1
Duøng pipet voâ truøng huùt 1ml dung dòch pha loaõng 10 sang oáng
nghieäm chöùa 9ml dung dòch ñeäm phosphat ñeå ñöôïc dung dòch pha
-2
loaõng 10 . Tuøy theo möùc ñoä nhieãm baån cuûa maãu maø tieán haønh
pha loaõng ôû caùc ñoä pha loaõng cao hôn.
Bước 2. Caáy maãu leân moâi tröôøng
MYP
Choïn vaø ñeám caùc ñóa coù töø 15 – 150 khuaån laïc ñaëc tröng cuûa
Bacillus aureus (deït, ñöôøng kính 2 – 3mm, bôø hình raêng cöa, maøu ñoû
hoàng, xung quanh coù voøng ñuïc). Chuyeån 5 khuaån laïc nghi ngôø naøy
o
leân moâi tröôøng phuïc hoài TSA , uû ôû 30 C qua ñeâm tröôùc khi tieán
haønh caùc thöû nghieäm sinh hoaù.
- Thöû nghieäm khaû naêng leân men glucose : caáy vi khuaån töø moâi
o
tröôøng TSA sang moâi tröôøng canh glucose, uû 35 C trong 24 giôø. Bacillus
cereus cho phaûn öùng döông tính laøm ñoåi maøu moâi tröôøng töø ñoû sang
vaøng.
- Thöû nghieäm khaû naêng chuyeån hoùa nitrat thaønh nitrit: caáy vi
o
khuaån töø moâi tröôøng TSA sang moâi tröôøng nitrat, uû ôû 35 C trong 24
giôø. Bacillus cereus coù phaûn öùng döông tính neân sau khi nhoû thuoác
thöû vaøo canh khuaån chuyeån sang maøu đoû cam trong 10 phuùt.
- Thöû nghieäm Tyrosin: caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA sang
o
oáng thaïch nghieâng Tyrosin, uû 35 C trong 48 giôø. Khuaån laïc Bacillus
phaân huûy tyrosin taïo khoaûng trong xung quanh khuaån laïc.
- Thöû nghieäm Lysozyme: caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA sang
oáng nghieäm chöùa moâi tröôøng Nutrient Broth vôùi 0,001% lysozyme, uû
o
35 C trong 24 giôø. Bacillus phaùt trieån laøm moâi tröôøng ñuïc ñeàu.
66
7.3.3. Đọc keát quaû:
N× R
Soá Bacillus cereus treân 1g maãu = n ×V × f
R: tæ leä xaùc nhaän = tæ leä giöõa soá khuaån laïc nghi ngôø cho thöû
nghieäm döông tính so vôùi soá khuaån laïc nghi ngôø.
67
8. KIEÅM TRA VI KHUAÅN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
8.1.Nguyeân taéc:
Gioáng Clostridium laø caùc vi khuaån Gram döông, hình que, kî khí,
sinh baøo töû, phaàn lôùn di ñoäng. Clostridium perfringens laø loaøi kî khí
khoâng baét buoäc, taïo caùc khuaån laïc maøu ñen trong moâi tröôøng
phaân laäp quy ñònh
Clostridium perfringens là vi khuẩn chỉ sự ô nhiễm do phân người, động vật, bùn đất,
nước cống rãnh. Vi khuẩn có bào tử và có sức đề kháng cao. Nếu thực phẩm chế biến
không đảm bảo vệ sinh, nhiệt độ khử khuẩn, đun nấu không đủ diệt bào tử, vi khuẩn
vẫn còn tồn tại và phát triển, làm hư hỏng thực phẩm và gây ngộ độc thức ăn ( nhất là
thực phẩm đồ hộp)
Do tính chất của Clostridium perfringens là phát triển trong môi trường kỵ khí và có
khả năng phân giải Sodium sulfit hoặc phân giải protein tạo H2S.
Cấy trên môi trường có Sodium sulfit và phèn sắt ( môi trường thạch Tryptose
Sulfide Cycloserin:TSC), tạo khuẩn lạc màu đen, thử tính chất sinh hóa để định danh
8.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất
8.2.1.Dụng cụ và thiết bị
68
Môi trường Hóa chất
TRIPTOSE SULPHIT CYCLOSERINE AGAR Cồn 90 và 70o
o
BASE (TSC)
MANNITOL MOBILITY NITRATE Dd creatine 0,5 %
THIOGLYCOLATE Dung dòch α- naphtol 5%
GELATINE-LACTOSE KOH 40%
IRON SULPHITE AGAR (ISA)
Thuoác thöû Kovac
HCl 10%
NaOH 10%
C.selective supplement
Anaerobic indicator
Túi kỵ khí
Griess – Ilowvay’s reagent
Bụi kẽm
8.3.Thực hành
8.3.1. Quy trình phân tích
-1
10 g mẫu + 90 ml dung dịch đệm 10
-2 -3 -4
Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10 10 10 ......
Lấy 01 ml mẫu vào đĩa, rót khoảng 20ml môi trường TSC,
xoay đều, đợi đông, phủ thêm lên bề mặt đĩa 10ml môi trường
TSC, ủ 370C ± 10C, 20 giờ trong bình kỵ khí
Chọn 10 khuẩn lạc điển hình từ các đĩa đã đếm. Cấy ria các
khuẩn lạc này lên môi trường thạch TSC cơ bản, phủ thêm 10
ml môi trường TSC cơ bản, ủ 370C ± 10C, 20 giờ trong bình kỵ
khí
69
Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình:
Thử nghiệm tính di động, thử nghiệm sự có mặt của nitrit, thử
nghiệm sự hóa lỏng geletin, lên men lactose
Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc đen ở môi trường TSC, không
di động, khử nitrat thành nitrit, sinh acide và khí từ lactose, hóa
lỏng geletin trong 48 giờ được coi là Clostridium perfringens
8.3.2. Các bước thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có các độ pha loãng 10 -1,
10-2, 10-3…
Bước 2:Dùng pipet vô trùng để lấy ở mỗi nồng độ pha loãng 1 ml dung dịch huyền
phù ban đầu hoặc 1 ml mẫu thử ( nếu mẫu là chất lỏng) cho vào giữa đĩa Petri, mỗi
nồng độ 02 đĩa.
Bước 3: Rót 15-20 ml môi trường TSC vào đĩa Petri và trộn đều bằng cách xoay nhẹ.
Bước 4: Khi môi trường đã đông chặt, rót thêm một lớp 10 ml môi trường TSC phủ
lên trên.
Bước 5: Để đông và xếp các hộp Petri nắp ở phía trên vào bình kỵ khí, Bước 6: Đếm
và ghi lại số lượng khuẩn lạc điển hình ở các đĩa. Khuẩn lạc Clostridium perfringens
có màu đen
Xác nhận
Chọn tổng số 10 khuẩn lạc điển hình từ các đĩa đã đếm. Nếu không có khả năng tách
riêng rẽ tốt các khuẩn lạc điển hình thì nuôi 10 khuẩn lạc điển hình đó trong môi
trường lỏng thioglycolate, nuôi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24
giờ.
Cấy ria các khuẩn lạc này trên môi trường thạch cơ bản TSC, phủ thêm một lớp 10 ml
môi trường TSC cơ bản. Để đông và nuôi yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ.
Tách ở mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc điển hình và dễ tách biệt. Xác nhận tính sinh hóa
Thử nghiệm tính di động : Làm môi trường thạch đứng Mannitol Mobility
Nitrate. Cấy sâu khuẩn lạc đã phân lập vào môi trường . Nuôi dưỡng trong điều kiện
yếm khí 370C ± 10C, 18-24 giờ.
Kiểm tra ống môi trường để xem dạng sinh trưởng dọc theo đường cấy sâu. Sự
sinh trưởng khuyếch tán vào môi trường từ vết cấy sâu thể hiện rõ tính di động
của vi sinh vật nuôi cấy
Thử nghiệm sự có mặt của nitrit: Thêm 0,2-0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit
vào mỗi ống môi trường nitrat di động (tiến hành trong tủ HOP). Sự hình thành
màu đỏ xác nhận phản ứng khử nitat thành nitrit. Nếu trong 15 phút mà màu đỏ
70
không hình thành thì thêm một lượng nhỏ bột kẽm. Để yên 10 phút, nếu màu đỏ
được hình thành sau khi thêm bột kẽm thì không có phản ứng nitrat thành nitrit.
Xác định sự hóa lỏng geletin:
Cấy các khuẩn lạc đã phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường gelatin-lactose.
Nuôi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ. Kiểm tra ống môi
trường xem có sự sinh khí và có chuyển màu vàng không ( tạo acide) cho biết
sự lên men của lactose. Làm lạnh 1 giờ ở 5 0C và kiểm tra sự hóa lỏng của
geletine. Nếu môi trường vẫn rắn, nuôi cấy thêm 24 giờ và kiểm tra sự hóa lỏng
của geletine.
Tham khảo quy trình phân tích Clostridium ( không dùng bình kỵ
khí)
Ñoå lôùp ISA thöù hai cao 1-2 cm sau khi phaàn
0
döôùi ñoâng ñaëc, uû 37 C, 24-48 giôø
72
9.2.2. Môi trường và hóa chất
Bảng 9.2. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 9
Môi trường Hóa chất
Ancalin Peptone Water (APW) Cồn 90 và 70o
o
Triple Sugar Iron agar –TSI/ Klingler Iron Agar NaOH 10%
-KIA
NaCl
Canh thang muối trypton ( trypton 1%) có dải Que thử Oxidase
nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký
hiệu lần lượt là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 và
T1N10).Chú thích: các ống môi trường phải được nút chặt
trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi
nồng độ muối
Cấy ria vào môi trường TCBS thạch . ủ 37,0 0C ± 1,00C trong
18 - 24 giờ
Ria cấy 03 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường TSA 2% NaCl,
ủ 37,00C ± 1,0oC trong 18 - 24 giờ
Thử nghiệm sinh hóa:
Thử nghiệm sinh hóa sơ bộ:TSA/KIA, thử nghiệm canh thang
trypton muối(+), thử nghiệm lên men, oxy hóa(+), thử nghiệm
oxidaza(+), nhuộm Gram(-)
Thử nghiệm sinh hóa khẳng định: thử phát triển ở 42,00C(+), thử
nghiệm cacbonhydrat, thử nghiệm decacboxylaza, thử nghiệm
urea(-), thử nghiệm ONPG(+), thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp
chất ức phẩy khuẩn O/129 Vibriostat(-)
Thử nghiệm kháng huyết thanh:
74
Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu.
75
Bước 3. Phân lập và đọc kết quả trên đĩa
Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng
thời gian trên , không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch
mẫu trên bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch .
ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 37,00C ± 1,00C trong
18 - 24 giờ.
Trên môi trường TCBS thạch, khuẩn lạc V.
cholerae tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng (do vi khuẩn
lên men sacaroza), ở giữa đậm và có viền mờ xung
quanh. Hình 9.1.V. cholerae trên TCBS
76
Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này.
* Nhuộm gram
V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.
b. Thử nghiệm sinh hoá khẳng định
* Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C
Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl . Ủ ở nhiệt độ
42,0 C ± 0,20C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42 0C làm môi
0
trường bị đục.
* Thử nghiệm cacbonhydrat
Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các
loại cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D-
mannoza . Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37,0 0C ± 1,00C. Phản ứng dương tính khi
môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ.
V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza,
cellobioza, arabinoza âm tính.
* Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza
Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và
ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng .
Ủ các ống ở nhiệt độ 37,00C ±1,0 0C trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi
trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh
thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng).
V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm
tính.
* Thử nghiệm urê
Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê , ủ ở nhiệt độ 37,0 0C ± 1,00C trong 18
- 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng.
* Thử nghiệm ONPG
Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ
vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm
và đọc kết quả như trên. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có
màu vàng.
* Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat
Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl . Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg
hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ
37,0 ± 1,00C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi
Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129.
* Thử nghiệm kháng huyết thanh
Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý
lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA
lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện
77
tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt
nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực
hiện.
Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 1 và Bảng 2.
78
10. ĐỊNH TÍNH SHIGELLA TRONG THỰC PHẨM
10.1.Nguyên tắc
Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kị khí tùy tiện, cho thử nghiệm
catalase (+) (trừ Shigella dysenteriae), oxidase (-), lên men glucose không sinh hơi,
hầu hết các loài không lên men và tạo acid từ latose, dulcitol, không sinh H 2S,
không có enzyme lysine decarboxylase.
Shigella có thể được phát hiện bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi
trường lỏng không chọn lọc, sau đó được chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc.
Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy phân lập trên ít nhất 2 loại môi
trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra
bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
10.2.Dụng cụ, thiêt bị, môi trường và hóa chất
10.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 10.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 10
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Que trang, que cấy vòng Máy dập mẫu (Stomacher)
79
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Pipette 1 ml, 10 ml Lò viba
10.3.Thực hành
0
Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml TSB, ủ 37 C ,
16 – 24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn
0
lọc phân biệt (T7A,MAC,XLD,HE,DC…), ủ 37 C , 24 –
48giờ 80
Chọn ít nhất 05 khuẩn lạc nghi ngờ cấy lên TSA ,
0
ủ 37 C trong20-24giờ
- Caân 25g maãu ñaõ nghieàn, hoặc hút 25 ml mẫu cho vaøo bình ñaõ
0
chöùa saün 225ml moâi tröôøng TSB, laéc ñeàu , ủ 37 C , 16 – 24 giờ
Bước 2. Tăng sinh chọn lọc
o
- Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml canh tăng sinh GN, ủû 37 C
trong 10-20 giờ.
81
Shigella ñieån hình coù maøu xanh nhạt, trong suốt. Treân moâi tröôøng T7A
khuaån laïc Shigella ñieån hình coù maøu xanh nhạt (môi trường đục như sữa, có
màu xanh hơi vàng nhạt). Treân moâi tröôøng MAC khuaån laïc Shigella ñieån
hình coù maøu đỏ nhạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục)
82
Thử nghiệm sinh hóa Kết quả Thử nghiệm sinh hóa Kết quả
Urea - Adonitol -
Malonate - Dulcitol -
MR + Inositol -
VP -
Thử nghiệm VP
Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào
các ống môi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02
giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đó thêm
02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi
trong vòng 15 phút là phản ứng dương tính
Shigella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, không đổi
màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ VP (-) VP
trên bề mặt môi trường
(+)
10.3.4.Kết quả
Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Shigella được phát
hiện trong 25g mẫu
84
Khi được nuôi cấy trong môi trường chứa acid tetrazolium chứa triphenyl
tetrazolium chloride, khuẩn lạc Streptococcus phân có màu hồng đến màu đỏ đậm do
sự khử triphenyl tetrazolium chloride. Các loài này không có catalase, không có
cytocrom c, có thể phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muối chứa NaCl, pH
9,6 ở 45oC.
11.3.Thực hành
11.3.1.Quy trình phân tích
85
Chuẩn bị dịch pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 …..
86
11.3.4.Kết quả
Tính tỷ lệ khẳng định và mật độ theo CFU/g hay CFU/g
CHƯƠNG IV
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI
Hình 15: Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA
Các kháng thể sử dụng trong phương pháp ELISA được gắn với enzyme bằng
liên kết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể liên kết
với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng nguyên
sẽ bị rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme
được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất làm thay đổi màu do hoạt tính của
enzyme. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra
lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên.
Tính nhạy của ELISA là do sự khuyếch đại bởi hoạt tính enzyme.
Mỗi một phân tử enzyme bám vào kháng thể có thể tạo ra hàng ngàn phân tử màu do
hoạt tính enzyme. Trước khi các kháng thể gắn enzyme có thể được sử dụng rộng rãi,
các kháng thể phóng xạ đã được sử dụng trong kỹ thuật miễn dịch phóng
xạ (radio immuno assays-RIA). Kỹ thuật RIA như là một đột phá có ý nghĩa và người
sáng tạo ra nó là Rosalyn Yalow đã được nhận giải thưởng Nobel Sinh lý và Y học vào
năm 1977.
88
Hình 16. Nguyên tắc của phương pháp ELISA
Hình 18. Máy rửa và máy đọc trong quy trình ELISA
4.3.PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (Hybridization)
Phương pháp lai phân tử còn được gọi là phương pháp mẫu dò, probes. Phương pháp
sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện
một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai
phân tử . Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi
nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm ) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các
đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong
hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu là DNA của tế bào vi sinh vật) được cố
định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi
đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp
nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn T m ít nhất vài độ. Sự
lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng
rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA của môi trường, nhiệt độ và thời gian phản
ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường.
90
polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này được Karl
Mullis (Mỹ) phát minh vào 1985.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA
riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có
mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của
DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các
suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở
nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm
biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt
này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100 oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng
thẳng) sẽ bị biến tính.
4.4.1. Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR
a. DNA mẫu (DNA template)
Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR tối
ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA
thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng
giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (<100ng).
Lượng DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra. PCR còn cho
phép khuyếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị
phân hủy từng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay
của người chết....
b. Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng
dây chuyền tổng hợp DNA . Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ
sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều
ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse
primer).
Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả của phản
ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định:
+ Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gần
như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ.
+ Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base) để quá
trình lai xảy ra tốt hơn.
+ Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được
khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.
+ Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh trình tự đối
xứng bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn định
do đó hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu.
+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi: sự bổ sung giữa hai mồi sẽ làm tăng sản phẩm
primer dimer (Hình 3.7).
+ Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt
độ cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C có 3 liên kết
91
hydro do đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn.
+ Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng
đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán, tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi
khi đã bám vào DNA khuôn là 150-500 base.
c. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Enzyme ssử dụng trong phản ứng PCR là enzyme DNA polymerase từ
Thermus aquaticus (Tag-polymerase) không biến tính sau mỗi chu kỳ. DNA
polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị
trường là Tag-polymerase. Hiện nay có nhiều enzyme chịu nhiệt khác được sử dụng là:
Vent- polymerase (Tli-polymerase), Pfu- polymerase, rTth...Các hoạt tính của chúng
được trình bày ở bảng:
92
Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều
lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).
a. Giai đoạn biến tính (denaturation)
Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ
o
94-95 C, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất
cả các liên kết hydro giưã hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi
đơn.
b. Giai đoạn lai (hybridization)
Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70 oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của
mồi được sử dụng khoảng từ 3-5oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi
đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến
một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ).
Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên
nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả.
Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tương đối là:
Tm=4(G+C) + 2(A+T)
c. Giai đoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp
DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và
sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách
kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc
vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các
sợi DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp.Sau mỗi chu kỳ, số
bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân.
Như vậy 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ tạo thành 2n bản sao
phân tử DNA.
93
Hình 20. Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ của
phản ứng PCR
94
Chu kỳ Số bản sao
1 21=2
2 22=4
4 2 =16
4
10 2 =1.024
10
15 2 =32.768
15
20 2 =1.048.576
20
25 2 =33.554.432
25
30 230=1.073.741.824
... ...
n 2n
Bảng . Số bản sao của phân tử DNA mẫu tạo thành qua các chu kỳ của phản ứng PCR
Hình 21. Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân
Ưu điểm của phương pháp PCR
+ Thời gian (6-48 giờ)
+ Phát hiện vsv khó nuôi cấy
+ Hóa chất dễ tìm và dễ bảo quản hơn so với huyết thanh học
95
+ Có thể tự động hóa
Hình 22. Mô hình máy PCR (Polymerase chain reaction) và máy PCR realtime của
Bio-Rad
Nhược điểm
+ Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase
+ Mật độ vsv trong mẫu thấp, đôi khi cần tăng sinh
+ Không phân biệt được tế bào sống và chết, có thể dẫn đến dương tính giả (tuy
vậy, có thể phát hiện bào tử, tế bào đã chết của vsv gây độc)
+ Ngày càng được quan tâm nhiều hơn đặc biệt phát hiện virus
Thông thường khi thực hiện phương pháp PCR, trình tự được tiến hành như sau:
- Tăng sinh: vi sinh vật được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường chọn lọc (TSB)
10-20 giờ.
- Tách chiết DNA vi sinh vật
- Thực hiện phản ứng PCR
- Điện di trên gel agarose 1,5%, đọc kết quả trên đèn UV.
96
Hình 14. Quy trình phân tích vi sinh vật dùng Petrifilm
CHƯƠNG V
ĐÁNH GIÁ VỆ SINH CÔNG NGHIỆP
QUY ĐỊNH KIỂM SOÁT VI SINH
MÔI TRƯỜNG, THIẾT BỊ, VỆ SINH TAY, BAO BÌ
97
Chæ tieâu kieåm
Ñieåm kieåm soùat Caùch laáy maãu kieåm tra
tra
1. Moâi tröôøng:
-Phoøng roùt saûn - Ñaët maãu ñóa moâi tröôøng ôû vò trí - TPC ≤ 10kl
phaåm taïi baát kyø moät trong caùc maùy - Naám men/ moác:
roùt trong 15 phuùt. ≤ 2kl
- Phoøng Vi sinh - Ñaët maãu ñóa moâi tröôøng ôû taïi - TPC ≤ 2kl
vò trí baøn thöû trong 15 phuùt - Naám men/ moác
: khoâng coù
2. Thieát bò:
- Boàn chöùa - Boàn chöùa: Duøng boâng tieät - TPC ≤ 10kl
-Ñöôøng oáng roùt truøng swab moät vuøng beân trong - Coliform: khoâng
2
saûn phaåm boàn, dieän tích 100cm ngay sau khi coù
- Ñaàu roùt saûn phẩm keát thuùc veä sinh - Naám men/ moác
- Ñöôøng oáng roùt:Duøng boâng tieät : khoâng coù
truøng swab vuøng beân trong oáng,
chieàu cao 10cm ngay sau khi keát
thuùc veä sinh
- Ñaàu roùt: Duøng boâng tieät truøng
swab vuøng beân trong oáng, chieàu
cao khoûang 5-10cm tuøy theo ñaàu
roùt saûn phaåm ngay sau khi keát
thuùc veä sinh
3.Veä sinh tay:
-Coliform: khoâng
-Nhaân vieân phoøng
- Duøng boâng tieät truøng swab baøn coù
roùt saûn phaåm
tay - E.coli: khoâng coù
-Nhaân vieân cheá
bieán /phaân chia thöùc
aên
4.Bao bì sau tieät
- Duøng nöôùc tieät truøng traùng - TPC : khoâng
truøng
beân trong bao bì chöùa saûn coù
phaåm - Coliform: khoâng
- Duøng boâng tieät truøng swab coù
vuøng beân trong bao bì - Naám men/ moác
: khoâng coù
[1]. Bài giảng: Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm
-Trần Quốc Huy, Nguyễn thúy Hương,2010
[2]. Lê Đình Hùng, Nguyễn Đức Hùng, Huỳnh Lê Tâm, Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh
thực phẩm thủy sản, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2004
[3]. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và
mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2006
[4]. TCVN 4830-1:2005(ISO 6888-1:1999) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn gia
súc - phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với
coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch. Phần 1: Kỹ
thuật sử dụng môi trường thạch Baird-Parker.
99