Heterologická expresia a purifikácia neuropeptidu ITPL

z Bombyx mori v Escherichia coli

Andrea Hubináková1, Zdenko Levarski2, Stanislava Bírová1, Eva Struhárňanská1,
Stanislav Stuchlík1, Ján Turňa1,2
1Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra molekulárnej biológie, Mlynská dolina, Ilkovičova 6, 842 15 Bratislava, Slovenská republika
2 Univerzita Komenského v Bratislave, Vedecký park, Ilkovičova 8, 842 16 Bratislava, Slovenská republika

Úvod a formulácia cieľa Výsledky a diskusia

Iónový transportný peptid (ITP) a jeho alternatívna zostrihová varianta, proteín podobný
iónovému transportnému peptidu (ITPL) sú hmyzie neuropeptidy. Tieto peptidy boli
identifikované ako modulátory homeostatických mechanizmov u hmyzu v prednej časti zadného
čreva (ileum). ITP a ITPL zdieľajú vysokú sekvenčnú similaritu. Biologicky aktívny ITPL
obsahuje 76 aminokyselín, z toho 6 cysteínov, ktoré vytvárajú tri vysoko konzervované
intramolekulové disulfidové väzby, podobne ako u ITP [1-2]. Štúdie zamerané na funkciu ITPL
u hmyzu nie sú až také rozsiahle a práve z tohto dôvodu sme sa zamerali na produkciu tohto
proteínu.
Po úspešnej izolácii plazmidov pUC57-ITPL a pJK100EK-hGH sme skonštruovali
cieľový plazmid pJK100EK-ITPL s veľkosťou 3175 bp a takto skonštruovaný plazmid sme
transformovali do buniek DH5α. Po vyizolovaní plazmidu sme overili úspešnosť ligácie
kontrolným štiepením pJK100EK-ITPL, ktorým sme potvrdili, že náš konštrukt obsahuje
požadovaný gén s veľkosťou 267 bp.

Počet disulfidových väzieb a veľkosť ITPL proteínu (9 kDa) vytvára limitácie pri produkcii
správne poskladaného proteínu v cytoplazme E.coli. Aj napriek všetkým výhodám produkcie
proteínov v E.coli, cytoplazma divokého kmeňa neposkytuje vhodné prostredie na tvorbu
disulfidových väzieb. To môže viesť k vytváraniu nerozpustných agregátov- inklúznych telesiok.
Na zníženie alebo zamedzenie tvorby inklúznych teliesok sa používajú viaceré stratégie napr.
použitie jedného alebo kombináciu viacerých fúznych partnerov, optimalizácia kultivačných
podmienok, zloženie média a teplota pri heterologickej expresii a iné [3-4].

Cieľom tejto práce je nadprodukcia fúzneho proteínu ITPL (23kDa) v solubilnej forme a jeho Obr. 1: Schéma konštrukcie plazmidu pJK100EK-ITPL Obr. 2.: Kontrolné štiepenie plazmidu pJK100EK-ITPL
purifikácia na následné využitie pri funkčných štúdiách v hmyzom modelovom organizme, 1) Štandard molekulových hmotností SM1331
2) neštieený plazmid pJK100EK-ITPL
priadke morušovej. 3) štiepený plazmid pJK100EK-ITPL
4) neštiepený plazmid pJK100EK-ITPL
5) štiepený plazmid pJK100EK-ITPL
6) neštiepený kontrolný plazmid pJK100EK-hGH
7) štiepený kontrolný plazmid pJK100EK-hGH

Materiál a metódy Na baničkovú expresiu sme vybrali dva najvhodnejšie expresné kmene E.coli BL21
(DE3) a RV308 ai, medzi ktorými sme porovnali úroveň expresie fúzneho proteínu pri 37°C.
Pri práci sme použili plazmidy pUC57-ITPL (Genescript) a pJK100EK-hGH ([5]) transformované
Aj napriek prítomnosti fúzneho partnera tioredoxínu, ktorý zvyšuje solubilitu proteínov sa
v bunkách DH5α.
nám nepodarilo pri tejto teplote produkovať solubilný proteín. Na zvýšenie podielu
Izolácia plazmidovej DNA
solubilného proteínu sme znížili teplotné podmienky na 28°C a 20°C. Pri nižších teplotách
Použili sme kit QIAprep Spin MINIprep Kit (Qiagen) a QIAprep Spin MIDIprep Kit (Qiagen)
jemne klesal objem biomasy, ale aj napriek tomu sme získali najvyššie výťažky proteínu v
a postupovali podľa návodu výrobcu.
solubilnej forme. Najlepšou variantou bola expresia v kmeňoch BL21 (DE3) pri 20°C pred aj
Konštrukcia plazmidu pJK100EK-ITPL
po indukcii. Pomocou afinitnej kotvy 6×His sme reverzibilne naviazali fúzny proteín na
Plazmidy sme štiepili restrikčnými endonukleázami PdiI a EcoR1. Ligácia inzertu s vektorom
matricu niklovej kolóny. Na vyviazanie prečisteného fúzneho proteínu sme použili roztok s
prebiehala v prítomnosti T4 DNA ligázy. Získaný konštrukt sme transformovali do expresných
imidazolom. V elučnej frakcii môžeme vidieť koncentrovaný fúzny proteín.
kmeňov BL21 (DE3), RV308 ai.
Heterologická expresia, fermentácie a rozbitie ultrazvukom
Expresiu fúzneho proteínu sme indukovali 1mM IPTG a 0,05% arabinózou a sledovali prebeh
kultivácie v rôznych časových intervaloch pri teplotách 37°C, 28°C a 20°C. Po 24 expresii sme
bunky solubilizovali ultrazvukom a analyzovali pomocou SDS-PAGE ([6]). Najvhodnejšie
podmienky expresie sme použili na veľkoobjemú produkciu proteínu vo fermentore.
Afinitná chromatografia a dialýza
Solubilný fúzny proteín sme pomocou His-kotvy purifikovali metalovo-chelátovou afinitnou
chromatografiou (IMAC) na niklovej kolóne, Na rozrušenie väzieb medzi kolónou a fúznym
proteínom sme použili elučný roztok s 0,5 M imidazolom. Po purifikácii sme odstránili zvyšky
elučného pufra a nežiaduce soli dialýzou s 15% glycerolom.

Poďakovanie Obr. 3: SDS-PAGE porovnanie podielu expresie a solubility

v kmeňoch BL21 (DE3) a RV308 ai pri 20°C
1) štandard molekulovej hmotnosti proteínov
Obr. 4: Purifikácia fúzneho proteínu pomocou IMAC chromatografie
Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a inovácie pre 2) neindukovaná vzorka, BL21 (DE3)
3) vzorka po 24h expresii, BL21 (DE3)
projekt: Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2. Fáza, ITMS 2014+ 4) vzorka po sonikácii, nesolubilná časť, BL21 (DE3)
313021D075, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“ a tiež 5) vzorka po sonikácii, solubilná časť, BL21 (DE3)
6) neindukovaná vzorka, RV308 ai
projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ 7) vzorka po 24h expresii, RV308 ai
(BIOREKPROT - ITMS: 26240220048). 8) vzorka po sonikácii, nesolubilná časť, RV308 ai
9) vzorka po sonikácii, solubilná časť, RV308 aI
1) štandard molekulovej hmotnosti proteínov
2) neindukovaná vzorka pri 20°C
3) vzorka po 24h expresii pri 20°C
4) vzorka po sonikácii, nesolubilná časť
5) vzorka po sonikácii, solubilná časť
6) frakcia nezachytená na kolóne pri purifikácii
7) frakcia po premývacom kroku purifikácie
8) elučná frakcia

Zoznam použitej literatúry Záver

[1]
[2]
Meredith J., Ring M., Macins A., et al. (1996) J. Exp. Biol. 199, p.1053
Nagai Ch., Mabashi-Asazuma H., Nagasawa H., et al. (2014) J. Biol. Chem 289(46),
V tejto práci sme klonovaním úspešne pripravili konštrukt nesúci gén pre ITPL spolu
p. 32166 s jeho fúznymi partnermi a štiepnym miestom pre enterokinázu. Optimalizovaním
Levarski Z., Šoltýsová A., Krahulec J., et al. (2014) Protein Expres. Purif. 100, p.40
[3]
[4] Ke N., Berkmen M. (2014) Curr. Protoc. Mol. Biol. 108(16), p.1
heterologickej expresie sme našli najvhodnejšie kmene a podmienky na expresiu fúzneho
[5] Krahulec J., Hyršová M., Pepeliaev S., et al. (2010) Appl. Microbiol. Biot. 88(1), p.167 proteínu v solubilnej forme. Afinitnou chromatografiou sme čiastočne vypurifikovali fúzny
[6] Laemmli U. K. (1970) Nature. 227, p. 680
proteín, ktorý ale stále nie je v dostatočne čistej forme.