การเตรียมตัวอย่างเพื่อการวิเคราะห์

1 .ตัวอย่างหญ้าสด

ควรสุ่มเก็บตัวอย่างทุกส่วน เก็บประมาณ 500 กรัม ท้าการชั่งน้้าหนักของหญ้า และบันทึกไว้

ท้าการสับให้หญ้ามีขนาดประมาณ 1 นิ้ว (ตัวอย่างจะแห้งเร็ว และสะดวกต่อการบดตัวอย่าง ) น้า
ตัวอย่างใส่ถุงผ้า หรือถุงกระดาษ น้าไปผึ่งแดดทันที หรือน้าไปอบในตู้อบที่อุณหภูมิ 60 -65 องศา
เซลเซียส จนน้าหนักคงที่ แล้วชั่งน้้าหนักแห้ง

2. ตัวอย่างหญ้าแห้ง
การสุ่มตัวอย่างมีหลายวิธี วิธีที่เหมาะสมคือการใช้แท่งสุ่มตัวอย่างที่มีความยาว ประมาณ 18 นิว้
เส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 1 นิ้ว ปลายหยักด้านโคนจะมีที่ต่อกับเครื่องสว่านหมุน เพื่อเจาะในก้อนหญ้า
ได้สะดวก จะสุ่มเจาะโดยแทงตามขวางชองฟ่อนๆละ 1-2 จุด ในกรณีไม่มีหลาวสุ่มตัวอย่างสามารถสุ่ม
ตัวอย่างได้โดย แกะฟ่อนตัวอย่างออกและสุ่มโดยใช้มือสุ่มจากฟ่อนโดยตรงระวังการร่วงของใบ

3. ตัวอย่างวัตถุดิบอาหารสัตว์
น้าตัวอย่างมาผสมคลุกเคล้าให้เข้ากัน แล้วท้าการสุ่มตัวอย่างโดยวิธีแบ่ง 4 โดยน้าตัวอย่างมา
ผสมให้เข้ากันแล้วแบงออกเป็น 4 ส่วนเท่าๆกัน น้าตัวอย่างที่อยู่ตรงข้ามกันมารวมกัน 2 ส่วน ท้าการแยก
ออกไป ส่วนที่เหลือ 2 ส่วนน้ามารวมกัน และเก็บใส่ภาชนะ ปิดผนึกเพื่อกันความชื้น เขียนรายละเอียด
ตัวอย่าง และส่งเพื่อการวิเคราะห์ ประมาณ 500 กรัม
 2

การวิเคราะห์อาหารสัตว์แบบประมาณ
( Proximate Analysis of Feeds)

การวิเคราะห์ทางเคมีในอาหารสัตว์โดยทั่วไปวิธีที่ได้รับความนิยมคือวิธีแบบประมาณ (Proximate
analysis) วิธีการนี้ได้รับการพัฒนาโดย Henneberg and Stohmann ในปีค.ศ. 1865 ณ สถานีวิจัย
Weende ประเทศเยอรมันนี (Lloyd et al.,1978) หรือเรียกอีกอย่างว่า Weende System เพื่อเป็นเกียรติแก่
สถานที่ที่ท้าการวิจัย
วิธีการวิเคราะห์แบบประมาณ จะแยกองค์ประกอบของอาหารสัตว์เป็น 6 กลุ่มใหญ่ๆ คือ (1)น้้า
หรือ ความชื้น (moistur) (2) เถ้า (ash) (3)ไขมันหยาบ (crude fat) (4)โปรตีนหยาบ(crude protein)
(5) เยื่อใยหยาบ (crude fiber) (6) แป้งและน้้าตาล(nitrogen free extract)
1. การวิเคราะห์ความชื้น (Moisture)
การวิเคราะห์หาความชื้น เป็นวิธีการวิเคราะห์ที่ต้องท้าในห้องปฏิบัติการอาหารสัตว์ เนื่องจาก
องค์ประกอบทางเคมีอื่นๆค่าที่รายงานบนพื้นฐานร้อยละวัตถุแห้ง (% dry matter basis,DM) ปริมาณ
ความชื้นที่มีอยู่ในอาหารสัตว์หรือวัตถุดิบอาหารสัตว์มีความส้าคัญมากเพราะตัวอย่างที่มีความชื้นสูงก็มี
โอกาสที่จะเสียหรือเป็นเชื้อราจะเกิดได้ง่าย นอกจากนั้นยังใช้ค่าความชื้นไปค้านวณปริมาณการให้
อาหารสัตว์ในการประกอบสูตรอาหารสัตว์
วิธีการวิเคราะห์หาความชื้น ที่นิยมกันมากคือ การน้าตัวอย่างไปอบที่อุณหภูมิ 105 องศาเซล
เชียส 16-18 ชั่วโมง หรือ 135 องศาเซลเชียส 2 ชั่วโมง น้้าจะระเหยกลายเป็นไอออกจากอาหารสัตว์ ส่วนที่
เหลือ เรียกว่าวัตถุแห้ง (dry matter)
อุปกรณ์
1. เครื่องชั่งชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง
2. ถ้วยอบตัวอย่างพร้อมฝาปิด (weighing bottle) ที่ท้าด้วยโลหะไม่เป็นสนิมหรือ แก้วพร้อมมีฝา
ปิดสนิท ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง ≥ 50 มิลลิเมตร ลึก≤ 40 มิลลิเมตร
3. ตู้อบ ชนิด Forced-air drying oven
4. โถดูดความชื้น หรือ ตู้ดูดความชื้น (desiccator)
วิธีการ
1. น้าถ้วยอบตัวอย่างพร้อมฝา ที่ล้างสะอาดและแห้งอบในตู้อบที่อุณหภูมิ 135 0C นาน 2ชั่วโมง
น้าออกใส่ในโถดูดความชื้นและทิ้งให้เย็น ไม่เกิน 2 ชั่วโมง แล้วน้ามาชั่งบันทึกน้้าหนัก
2. ชั่งตัวอย่างอาหารที่บดละเอียดขนาด 1 มิลลิเมตร ประมาณ 2 กรัม ใส่ลงในถ้วยอบ บันทึก
น้้าหนัก ปิดฝาถัวย แล้วเขย่าเล็กน้อยให้ตัวอย่างกระจายเต็มพื้นที่สม่้าเสมอ น้าไปอบที่
อุณหภูมิ 135 0C นาน 2 ชั่วโมงหรือจนน้้าหนักคงที่ โดยให้มีระยะห่าง 1 ถ้วย ต่อความจุ
ของตู้ 1 ลิตร ขณะที่อบต้องเปิดฝาถ้วย
 3

3. เมื่อครบก้าหนดเวลา น้าถ้วยอบออกใส่ในโถดูดความชื้นและปิดฝาถ้วย แล้วปล่อยให้เย็น ไม่

เกิน 2 ชั่วโมง ชั่งน้้าหนัก
การคานวณ
% ความชื้น = (W1 – W2) x (100)
น้้าหนักตัวอย่าง
% วัตถุแห้ง (Dry matter, DM) = 100 - (% ความชื้น)
W1 คือ น้้าหนักถ้วยอบ + น้้าหนักตัวอย่างก่อนอบ
W2 คือ น้้าหนักถ้วยอบ + น้้าหนักตัวอย่างหลังอบ
ขอบเขต วิธกี ารนี้ใช้สา้ หรับวิเคราะห์หาความชื้น ในพืชอาหารสัตว์ อาหารสัตว์ และวัตถุดบิ อาหาร
สัตว์ ยกเว้น ตัวอย่างที่มีสารประกอบกรดไขมันระเหยได้ (Volatile Fatty acid) ตัวอย่างที่มีน้าตาล ,
Urea สูง
เอกสารอ้างอิง วิธีการนี้ดัดแปลงมาจาก
Moisture in Animal Feed. (7.007) Official Methods of Analysis. 1990. Association of Official
Analytical Chemists. 15 th Edition.
Animal feeding stuffs – Determination of moisture and other volatile matter content ISO 6496.
 4

2. การวิเคราะห์หาปริมาณเถ้า (Ash)
เถ้า (Ash) คือ ส่วนของสารอนินทรีย์ (inorganic) ในอาหารสัตว์ ซึ่งได้แก่แร่ธาตุต่าง ๆ เมื่อน้า
ตัวอย่างไปเผาที่อุณหภูมิ 550-600 องศาเชลเซียส นาน 2 ชั่วโมง ส่วนที่เป็นสารอินทรีย์จะถูกเผาไหม้หมด
ไป เหลืออยู่ แต่ส่วนของสารอนินทรีย์ ค่าของเถ้าที่หาได้สามารถบอกถึงคุณภาพของอาหารสัตว์ ถ้าค่า
ของเถ้าสูงมากกว่าปกติอาจมีการปลอมปนของทราย เป็นต้น
อุปกรณ์
1. เครื่องชั่งชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง
2. เตาไฟฟ้า
3. เตาเผา (muffle furnace)
4. ถ้วยส้าหรับเผาเถ้า (porcelain dish)
5. โถดูดความชื้น (dessicator)
วิธีการ
1. น้าถ้วยเปล่าอบที่อุณหภูมิ 100 0C นาน 1 ชั่วโมง เอาออกใส่ในโถดูดความชื้นปล่อยให้เย็น
แล้วชั่งน้้าหนัก
2. ชั่งตัวอย่างใส่ลงในถ้วยที่ทราบน้้าหนักแล้วประมาณ 2 กรัม น้าไปท้าการเผาบนเตาไฟฟ้า จน
หมดควัน
3. น้าตัวอย่างที่เผาไล่ควัน แล้วไปเผาต่อในเตาเผา (Muffer furnace) อุณหภูมิ 600 0C นาน
2 ชั่วโมง แล้วปิดสวิทช์เตาเผา เปิดฝาเตาออกรอจนอุณหภูมิภายในเตาลดเหลือประมาณ
100 0C เพื่อป้องกันมิให้ถ้วยสัมผัสอากาศเย็นกะทันหัน ซึ่งอาจท้าให้ถ้วยแตกได้
4. น้าถ้วยออกมาใส่ในโถดูดความชื้น ปล่อยให้เย็นแล้วชั่งน้้าหนัก
การคานวณ

% เถ้า = (W2 – W1) x 100

น้้าหนักตัวอย่าง
W1 คือ น้้าหนักถ้วย
W2 คือ น้้าหนักถ้วย + น้้าหนักตัวอย่างหลังการเผา
ส่วนปริมาณอินทรีย์วัตถุ (Organic matter, OM) ค้านวณได้จากผลต่างระหว่างน้้าหนักตัวอย่าง
กับ น้้าหนักเถ้า ดังนี้
%OM = 100 - (%ความชื้น) - (%เถ้า)
 5

3. การวิเคราะห์หาโปรตีน (Crude protein, CP)

โปรตีนประกอบด้วย กรดอะมิโนหลายชนิด และกรดอะมิโนนี้มีธาตุไนโตรเจนเป็นองค์ประกอบอยู่
ดังนั้น การวิเคราะห์หาปริมาณโปรตีนจึงวิเคราะห์ในรูปของปริมาณไนโตรเจน โดยวิธี Kjeldahl แล้ว
ค้านวณกลับเป็นปริมาณโปรตีน โดยตัวอย่างอาหารจะถูกย่อยด้วยกรดซัลฟุริกเข้มข้น (H2SO4conc.) ใน
สภาพที่มีความร้อน และตัวเร่งปฏิกิริยา (Catalyst) จนสารละลายใสสารอินทรียวัตถุจะสลายไป
สารประกอบไนโตรเจนทั้งส่วนที่เป็นโปรตีนแท้ ( True protein ) และไม่ใช่โปรตีน (Non-protein nitrogen)
ยกเว้นที่อยู่ในรูปไนเตรท (Nitrate,NO3 ) ไนไตร (Nitrite,NO2 ) จะถูกเปลี่ยนเป็นแอมโมเนียมซัลเฟต เมื่อ
เติมโซเดียมไฮดรอกไซด์ที่มีความเข้มข้น 40% (w/v) ลงไป แล้วไนโตรเจนจะอยู่ในรูปของแอมโมเนีย
มไฮดรอกไซด์แก๊สแอมโมเนียที่กลั่นได้โดยใช้กรดบอริกที่มีความเข้มข้น 4% (w/v) เป็นตัวดักจับ น้าไปไต
เตรทหาไนโตรเจนด้วยกรดไฮโดรคลอริก หรือกรดซัลฟุริกที่มี ความเข้มข้น 0.1 (w/v) เพื่อหาปริมาณ
กรดที่ใช้ท้าปฏิกิริยาก็จะสามารถค้านวณหาปริมาณไนโตรเจนได้
โดยทั่วไปแล้วโปรตีนมีไนโตรเจนเป็นองค์ประกอบเฉลี่ย 16% (100/16 = 6.25)
ดังนั้นจึงค้านวณหาโปรตีนหยาบ (Crude protein) โดยใช้สูตร
% CP =%N X 6.25
ในวัตถุดิบบางชนิดอาจมีค่าไนโตรเจนแตกต่างกันไป ดังนั้น ค่าแฟคเตอร์ก็จะเปลี่ยนแปลงตามชนิด
ตัวอย่างดังแสดงในตาราง

ชนิดตัวอย่าง % ไนโตรเจน ค่าแฟคเตอร์

พืชอาหารสัตว์ เนื้อสัตว์ ผลิตภัณฑ์สัตว์ 16 6.25

ถั่วเหลือง 17.51 5.71
ถั่วลิสง 18.32 5.46
เมล็ดข้าว 16.81 5.95
นม และผลิตภัณฑ์นม 15.68 6.38
ข้าวบาร์เลย์ ข้าวโอ๊ต ข้าวสาลี ข้าวฟ่าง 17.15 5.83
ร้าข้าวสาลี 15.85 6.31
เมล็ดพืชน้้ามัน (ทานตะวัน ฝ้าย) 18.87 5.30
จมูกข้าวสาลี, corn gluten 17.24 5.80
 6

อุปกรณ์
1. เครื่องชั่งชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง
2. เครื่องย่อย (Block digestor)
3. หลอดย่อย (Digestion tube)
4. Exhaust manifold และ Aspirator
5. Tube stand
6. ชุดเครื่องกลั่น (Distilling unit)
7. ชุดไตเตรท
8. ตู้ดูดควัน (Fume hood)
สารเคมี
1. กรดซัลฟุริกเข้มข้น 95 – 98% ( H2SO4 conc., AR grade)
2. สารเร่งปฏิกิริยา [สารผสมระหว่าง copper sulfate (CuSO4.5H2O) กับ potassium sulfate
(K2SO4) ในอัตราส่วน 1 : 9]
3. สารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.1 นอร์มอล
4. สารละลายมาตรฐานกรดซัลฟุริก 0.1 นอร์มอล
5. Potassium hydrogen phthalate (C8H5KO4, AR grade)
6. ฟีนอล์ฟธาลีน (Phenolphthalein)
7. สกรีนเมทธิล เรด อินดิเคเตอร์ (Screened methyl red indicator)
8. กรดบอริกความเข้มข้น 4% (w/v)
9. สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ความเข้มข้น 40% (w/v)
การเตรียมสารละลาย
1.ฟีนอล์ฟธาลีน (Phenolphthalein)
ละลายฟีนอล์ฟธาลีน (AR grade) 5 กรัม ใน 96% ethyl alcohol 400 มิลลิลิตร ปรับปริมาตรด้วย
น้้ากลั่นให้ได้ 500 มิลลิลิตร
2.สารอินดิเคเตอร์ เลือกใช้สกรีนเมทธิลเรดอินดิเคเตอร์ (Screened methyl red indicator,MR)
โดยชั่งเมทธิลเรด (AR grade) 0.2 กรัม และโบรโมครีซอลกรีน (BCG) (AR grade) 0.1 กรัม
ละลายใน 96% ethyl alcohol 100 มิลลิลิตร เก็บในที่เย็นไม่ถูกแสง
3.กรดบอริกความเข้มข้น 4% (w/v)
ละลายกรดบอริก (AR grade) 40 กรัม ด้วยน้้ากลั่นร้อน รอจนสารละลายเย็น ปรับปริมาตรให้ได้
1 ลิตร
4. สารละลายผสมอินดิเคเตอร์ ผสมสารละลายในข้อ 2. ในอัตรา 1 : 3 (MR:BCG)โดยตวง 20
มิลลิลิตร ผสมในสารละลาย 4 %กรดบอริค 1 ลิตร (ข้อ 3)
 7

5.สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ที่มีความเข้มข้น 40% (w/v)

ละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH, commercial grade) 400 กรัม ด้วยน้้ากลั่น ปรับให้ได้
ปริมาตร 1 ลิตร
6.สารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.1 นอร์มอล
6.1 ต้มน้้ากลั่นให้เดือดประมาณ 20 นาที เพื่อไล่แก๊สคาร์บอนไดออกไซด์ ทิ้งให้เย็นโดย
เก็บในภาชนะที่มีฝาปิด
6.2 ชั่งโซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH, AR grade) ที่มีโซเดียมคาร์บอเนตน้อยกว่า 5%
ละลายด้วยน้้ากลั่นในข้อ 1. ในอัตราส่วน 1 : 1 โดยน้้าหนัก ลงในขวดเออร์เลนเมเยอร์
เขย่าให้ละลาย ปิดปากขวดไมให้สัมผัสอากาศ ตั้งทิ้งให้โซเดียมคาร์บอเนตตกตะกอนจน
ได้สารละลายใส (ประมาณ 10 วัน)
6.3 เตรียมสารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด์ โดยใช้สารละลายในข้อ 2. 5.4
มิลลิลิตร ปรับปริมาตรด้วยน้้ากลั่นในข้อ 1. จนได้ 1 ลิตร
6.4 ชั่ง Potassium hydrogen phthalate ที่อบแห้งแล้ว ณ อุณหภูมิ 103 0C
ประมาณ 4 ชั่วโมง ปริมาณ 0.2042 กรัม ใส่ในขวดเออร์เลนเมเยอร์ ละลายด้วยน้้า
กลั่น 20 มิลลิลิตร หยดฟีนอล์ฟธาลีน 2 – 3 หยด ไตเตรตกับสารละลายมาตรฐาน
โซเดียมไฮดรอก-ไซด์ในข้อ 3. จนกระทั่งได้สารละลายสีชมพู่อ่อน เช่นเดียวกับ blank ซึ่งใช้
น้้าในข้อ 1. หยดฟีนอล์ฟธาลีน 2 - 3 หยด ไตเตรตกับสารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดร
อกไซด์ใน ข้อ 3. จนกระทั่งได้สารละลายสีชมพู่อ่อน
6.5 ค้านวณหาความเข้มข้นที่แน่นอนของสารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด์ ในรู
ปนอร์มอล (Normallity)
ความเข้มข้นของสารละลาย NaOH = น้้าหนักของPotassium hydrogen phthalate (กรัม) x 1000
ปริมาตรสารละลายมาตรฐานNaOH ที่ใช้ไตเตรต(มล.) x 204.229
7 สารละลายมาตรฐานกรดซัลฟุริก 0.1 นอร์มอล
7.1 ตวงกรดซัลฟุริกเข้มข้น 95-98% (AR grade) 5.5 มิลลิลิตร ละลายในน้้ากลั่น ปรับ
ปริมาตรให้ได้ 2 ลิตร
7.2 ท้าการไตเตรทหาความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานกรดซัลฟุริก โดยใช้ ปิเปตดูด
สารละลายมาตรฐานกรดซัลฟุริก 10 มิลลิลิตร ใส่ในขวดเออร์เลนเมเยอร์ หยดฟี-
นอล์ฟธาลีน 2-3 หยด น้าไปไตเตรทกับสารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซดที่ทราบ
ค่าความเข้มข้นแล้ว จนได้สารละลายสีชมพูอ่อน บันทึกปริมาตรสารละลายมาตรฐาน
โซเดียมไฮดรอกไซด์ที่ใช้
7.3 ค้านวณความเข้มข้น ของสารละลายมาตรฐานกรดซัลฟุริก 0.1 นอร์มอล โดยใช้สูตร
 8

N1V1 = N2V2

N1 = ความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด์ (นอร์มอล)
N2 = ความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานกรดซัลฟุริกที่ต้องการทราบ (นอร์มอล)
V1 = ปริมาตรของสารละลายมาตรฐาน โซเดียมไฮดรอกไซด์ที่ใช้ไตเตรต (มิลลิลิตร)
V2 = ปริมาตรของสารละลายมาตรฐาน กรดซัลฟุริกที่ใช้ (10 มิลลิลิตร)

วิธีการทา
การย่อยตัวอย่าง
1. ชั่งตัวอย่าง
1.1 ตัวอย่างอาหารประมาณ 0.5 - 1 กรัม ใส่ลงในหลอดส้าหรับย่อย (digestion tube) หรือ
ในกรณีที่เป็นตัวอย่างมีความชื้นสูงจะชั่งลงบนกระดาษกรองที่ปราศจากไนโตรเจน พับ
กระดาษใส่ลงในหลอดย่อยเพื่อท้าเป็น blank
2. เติมสารเร่งปฏิกิริยาประมาณ 5 กรัม หรือ Kjeldahl catalyst tablets 2 เม็ด และเติม
กรดซัลฟุริกเข้มข้นลงไป 13 – 15 มิลลิลิตร ขึ้นกับปริมาณตัวอย่างที่ใช้ปล่อยให้ท้าปฏิกิริยา
จนไม่รุนแรง และเติม H2O2 36 % (v/v) 1 มิลลิลิตร กันตัวอย่างปั๊มติดข้างหลอด
3. ตั้งหลอดย่อยใน stand ปิด heat shield สวม exhaust manifold ลงบนส่วนบนของหลอด
ย่อย
4. ตั้ง stand หลอดย่อยและ exhaust ลงบนเครื่องย่อย ยี่ห้อ Tecator รุ่น 2020 ที่ตั้งอุณหภูมิไว้
ที่ 420 0C แล้ว เพื่อความปลอดภัยควรท้าการย่อยภายในตู้ดูดควัน เปิดเครื่องดูดไอกรด
(scruber ) ช่วงเริ่มต้นจะเปิดแรงประมาณ และย่อยเป็นเวลา 5 นาที และลดวาวล์เพื่อลด
อัตราการไหลไอกรดลงประมาณ 3 ท้าการย่อยจนตัวอย่างใส ใช้เวลาประมาณ 30 – 45 นาที
5. ยก stand พร้อมหลอดย่อยตัวอย่างออกปล่อยให้เย็นเพื่อรอน้าไปกลั่น
การกลั่น
1.เปิดเครื่องท้าน้้าเย็น จนได้อุณหภูมิที่ตั้งไว้ 15 องศาเซลเชียส
2. เปิดเครื่องส้าควบแรงดันไฟฟ้า (stabilizer) แล้วเปิดสวิทช์ของเครื่องกลั่น warm เครื่องกลั่น
(Kjeltec รุน่ 1026) ใช้ flask และหลอดย่อยเปล่าใช้โปรแกรม Manual กดน้้าลง 50 มล. และกด
steam กลั่นให้ได้ปริมาตร 100 – 150 มล. เป็นเวลา 5 -7 นาที กด steam เพื่อปิด เช็คไนโตรเจนที่
ติดค้างอยู่ในระบบโดยหยดฟีนอล์ฟธาลีนจะไม่เปลี่ยนสี
3.น้าหลอดและ flask ออกจากเครื่องกลั่น
 9

4.ตั้งโปรแกรมเป็น Autor โดยกดปุ่ม ปรับปริมาณน้้า (50 มล.), ด่าง(25 มล.) stroke (2), ช่วงห่าง
ของเวลา delay time (0.2 นาที) และเวลาที่ใช้ในการกลั่น (3.6 -3.7 นาที) หรือกลั่นให้ได้ปริมาตร
150 มล.
5.น้า flask ซึ่งบรรจุกรดบอริกความเข้มข้น 4% ปริมาณ 25 -30 มิลลิลิตร ตั้งไว้บน platform
ของเครื่องกลั่นและยก platform ขึน้ ให้ปลายแท่งแก้วจุ่มอยู่ใต้กรดบอริก
6. ใส่หลอดตัวอย่างที่ผ่านการย่อยแล้ว (ข้อ 4.) เข้ากับเครื่องกลั่น
ปิด safety door เครื่องกลั่นจะเริ่มท้างาน
7. เมื่อกลั่นครบตามเวลาที่ก้าหนด เครื่องจะหยุดท้างาน น้า flask และหลอดย่อยออกจาก
เครื่องกลั่น
8. น้า flask กรดบอริก ที่ดักจับแก๊สแอมโมเนียที่ถูกกลั่นออก ไปไตเตรตหาไนโตรเจนด้วย
สารละลายมาตรฐานกรดซัลฟุริก
การคานวณ
% ไนโตรเจน = 14.01 x (V1 - V2) x N
น้าหนักตัวอย่างเป็นกรัม x 10
14.01= น้้าหนักมวลโมเลกุลของไนโตรเจน
V1 = ปริมาตรของกรดที่ใช้ไตเตรทตัวอย่าง (ml)
V2 = ปริมาตรของกรดที่ใช้ไตเตรท blank (ml)
N = ความเข้มข้นของกรดที่ใช้ไตเตรท (N)
10 = ค่าคงที่ที่แปลงจากหน่วยกรัมเป็น %
%Crude Protein = % ไนโตรเจน x F
F = ค่าคงที่ในการเปลี่ยนค่าไนโตรเจนเป็นโปรตีน
F = 6.25 ส้าหรับตัวอย่างอาหาร อาหารสัตว์ หรือตัวอย่างอื่นๆที่ไม่ระบุเฉพาะ
F= 5.71 ส้าหรับกากถั่วเหลือง
 10

4. การวิเคราะห์หาไขมัน (Crude fat หรือ Ether extract, EE)

ไขมัน เป็นสารประกอบอินทรีย์ที่ไม่ละลายน้้า แต่ละลายในสารอินทรีย์ ดังนั้น ในการวิเคราะห์หา
ปริมาณไขมันจึงสกัดด้วยสารละลายอินทรีย์ ระเหยง่าย ตัวท้าละลายที่นิยมใช้กันมากคือ diethyl ether,
petroleum ether, dichloromethane, acetone เป็นต้น สารที่ถูกสกัดได้นอกจากไขมัน แล้วยังมีสารบาง
ชนิดที่ถูกสกัดออกมาพร้อมกับไขมันด้วย เช่น carotenoid, wax, sterine, phosphatedein lecithine
และ alkaloid เป็นต้น จากการที่สารที่ถูกสกัดมีทั้งพวกที่เป็นไขมัน และไม่ใช่ไขมัน จึงเรียกสารทั้งสองว่า
crude fat หรือ ether extract
เอกสารอ้างอิง : ดัดแปลงวิธีการจาก AOAC 2000
สาหรับตัวอย่าง : พืชอาหารสัตว์ วัตถุดิบอาหารสัตว์ และอาหารสัตว์

อุปกรณ์และสารเคมี
1. เครื่องชั่งชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง
2. เครื่องสกัดไขมัน (Extraction unit)
3. Service unit ส้าหรับจ่ายความร้อน
4. เครื่องท้าน้้าเย็น (Cooling)
5. Cellulose thimble, Thimble adapter, Thimble support
6. ถ้วยรองรับ (Extraction cup), Cup holders
7. ตู้อบ (oven)
8. โถดูดความชื้น
9. Petroleum ether จุดเดือด 35-60 0C

วิธีการ
1. ชั่งตัวอย่างที่บดละเอียดขนาด 1 มิลลิเมตร ประมาณ 1-2 กรัม ห่อด้วยกระดาษกรองใส่ลงใน
cellulose thimble
2. น้า thimble ที่มีตัวอย่าง น้าไปอบไล่ความชื้นที่อุณหภูมิ 105 0C 3 ชั่วโมง
3. น้าถ้วยเปล่าอบที่อุณหภูมิ 105 0C นาน 1 ชั่วโมงน้าออกมาปล่อยให้เย็นในโถดูดความชื้น ชั่ง
บันทึกน้้าหนัก
4. ท้าการ warm เครื่องสกัด โดยเปิดสวิทช์เครื่องจ่ายความร้อนซึ่งตั้งอุณหภูมิประมาณ 85-90 0C
นานประมาณ 20 นาที หรือรอจนอุณหภูมิสูงไว้ตามที่ก้าหนด ในขณะเดียวกันท้าการ warm
เครื่องท้าความเย็น ซึ่งตั้งอุณหภูมิไว้ที่ 10 0C น้า thimbleที่มีตัวอย่างติดกับ thimble
adapter
วางลงใน thimble support จากนั้นน้าเข้าในเครื่องสกัดไขมัน พร้อมทั้งเปิดสวิทช์ปั๊มน้้าที่
เครื่องท้าน้้าเย็น
 11

5. ตวง petroleum ether ประมาณ 50 มิลลิลิตร ใส่ลงในถ้วยที่ทราบน้้าหนักแล้ว วางลงใน

cup holders น้าเข้าในเครื่องสกัด
6. กดล๊อคคานของเครื่องสกัดให้แน่น เปิดวาวล์ให้สารสกัดไหลเวียน ท้าการต้มตัวอย่างกับ
สารสกัด โดยเลื่อนคันโยกตัวอย่างไปไว้ที่ต้าแหน่ง boiling นาน 30 นาที จากนั้น ท้าการ
สกัดโดยเลื่อนคันโยกตัวอย่างไปไว้ที่ต้าแหน่ง rinsing นาน 60 นาที ระยะเวลาการต้มและ
การสกัดขึ้นอยู่กับประเภทตัวอย่าง หากเป็นตัวอย่างที่มีไขมันสูงให้ใช้เวลานานขึ้น โดยปกติ
แนะน้าให้ใช้เวลาต้มกับเวลาสกัดในอัตราส่วน 1 : 2
7. เมื่อครบเวลาให้ท้าการปิดวาวล์เก็บสารสกัด นานประมาณ 10 นาที หรืออาจช่วยให้สารสกัด
ระเหยเร็วขึ้น โดยเปิดวาวล์ลดความดันที่เครื่องสกัดก่อน แล้วจึงเปิดสวิทช์ aspirator ที่
เครื่องจ่ายความร้อน
8. หลังจากท้าการระเหยสารสกัดออกจากถ้วยแล้ว ท้าการปลดล๊อคคานที่เครื่องสกัด น้า cup
holders ออกจากเครื่อง น้าถ้วยที่มีสารสกัดไปอบต่อในตู้อบที่อุณหภูมิ 105 0C นาน 30
นาที น้าออกมาทิ้งให้เย็นในโถดูดความชื้น แล้วจึงชั่งบันทึกน้้าหนัก
9. ถ้าสกัดไขมันหลายรอบต่อวัน รอบที่ 2 ควรใส่ petroleum ether ในถ้วยประมาณ 15-20
มิลลิลิตร
การคานวณ
% ไขมัน = (W3 – W2) x 100
W1
W1 = น้้าหนักตัวอย่าง
W2 = น้้าหนักถ้วย
W3 = น้้าหนักถ้วย + น้้าหนักไขมัน
 12

5. การวิเคราะห์หาปริมาณเยื่อใยหยาบ (Crude fiber, CF)

เยื่อใยเป็นสารประกอบพวกคาร์โบไฮเดรทชนิดหนึ่ง ที่พบมากในพืชประกอบด้วย
เซลลูโลส เฮมิเซลลูโลส และลิกนิน เป็นส่วนใหญ่

คาร์โบไฮเดรทในอาหาร แบ่งออกเป็น 2 ส่วนใหญ่ คือ ส่วนของเยื่อใย (crude fiber) และ

ส่วนของคาร์โบไฮเดรตที่ไม่มี N เป็นองค์ประกอบหรือเรียกว่า nitrogen-free extract ส่วนของเยื่อใย คือ
ส่วนของอินทรีย์วัตถุที่ปราศจากไขมัน ซึ่งทนต่อการย่อยของกรดและเบสในความเข้มข้น สูง ในการ
วิเคราะห์หาเยื่อใย เมื่อน้าตัวอย่างที่ผ่านการวิเคราะห์หาความชื้นและไขมันแล้ว มาย่อยด้วยกรดซัลฟุริก
โปรตีน แป้ง และน้้าตาลจะถูกย่อยสลายและเมื่อย่อยตัวอย่างด้วยโซเดียม-ไฮดรอกไซด์ แป้งที่ยังเหลืออยู่
จากการย่อยด้วยกรดซัลฟุริกจะถูกย่อยสลายสิ่งที่เหลืออยู่ คือ เยื่อใย
เอกสารอ้างอิง : ดัดแปลงจาก AOAC2000 และ ISO6865 Semi-automatic method
สาหรับตัวอย่าง : พืชอาหารสัตว์ วัตถุดิบอาหารสัตว์ และอาหารสัตว์
อุปกรณ์และสารละลาย
1. เครื่องชั่งชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง
2. เครื่องวิเคราะห์หาเยื่อใย
3. ครูซิเบิ้ล (Fritted glass crucible)
4. ตู้อบ (Oven)
5. เตาเผา (Muffle furnace)
6. โถดูดความชื้น
7. สารละลายกรดซัลฟุริก (H2SO4) ความเข้มข้น 1.25%
8. สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) ความเข้มข้น 1.25%
วิธีเตรียมสารละลาย
1. สารละลายกรดซัลฟุริก ความเข้มข้น 1.25% (0.255 ± 0.005N)
-ตวงน้้าประมาณ 500 มิลลิลิตร ใส่ในบีกเกอร์ ขนาด 2 ลิตร
-ชั่งกรดซัลฟุริก 12.5 กรัม แล้วค่อย ๆ เทใส่ในบีกเกอร์ ใช้แท่งแก้วคนสารละลายให้
เข้ากัน แล้วเติมน้้ากลั่นจนครบ 1 ลิตร ปล่อยให้เย็นแล้วจึงเทใส่ขวดเก็บสารละลาย
2. สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ ความเข้มข้น 1.25% (0.313 ± 0.005N)
- ต้มน้้ากลั่นให้เดือดนานประมาณ 20 นาที แล้วปล่อยให้เย็นในภาชนะที่มีฝาปิ
- ชั่งโซเดียมไฮดรอกไซด์ 12.5 กรัม ใส่ในบีกเกอร์ ขนาด 2 ลิตร ตวงน้้ากลั่นที่ ต้มเดือดแล้ว
(ในข้อ1.) ประมาณ 500 มิลลิลิตร ใส่ในบีกเกอร์ ใช้แท่งแก้วคนเป็นระยะ ๆ ให้โซเดียมไฮดรอก
 13

ไซด์ละลายจนหมด แล้วเติมน้้ากลั่นอีก 500 มิลลิลิตรหรือเติมจนครบ 1 ลิตร คนให้เข้ากัน

ปล่อยให้เย็นแล้วจึงเทใส่ขวดเก็บสารละลาย
* การตรวจสอบค่าความเข้มข้นของสารละลาย ทาได้โดยวิธีการไตเตรท

วิธีการ
1. น้าตัวอย่างอาหารที่สกัดไขมันออกถ่ายลงใน beaker ขนาด 600 มิลลิลิตร crucible
2. ตวงสารละลายกรดซัลฟุริก 1.25% ประมาณ 200 มิลลิลิตร น้าเข้าเครื่องย่อยเมื่อสารเดือด
ปรับความร้อนลง ให้อุณหภูมิ (reflux) จับเวลา 30 นาที
3. เมือครบถ่ายตัวอย่างลงใส่ผ้ากรอง ล้างด้วยน้้าร้อน ประมาณ 1 ลิตร แล้วถ่ายตัวอย่างลงใน
บีกเกอร์ตามเดิม
4. ตวงสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 1.25% ที่อุ่นไว้ประมาณ 200 มิลลิลิตร น้าเข้าเครื่องย่อย
เมื่อสารเดือดปรับความร้อนลง ให้อุณหภูมิ (reflux) จับเวลา 30 นาที
5. เมื่อครบเวลาถ่ายตัวอย่างลงใส่ครูซิเบิ้ล และล้างตัวอย่างด้วยน้้าร้อนจนหมดด่างจะใช้น้าร้อน
ประมาณ 1,500 มิลลิลิตร น้าครูซิเบิ้ลที่มีเยื่อใยไปอบจนแห้งที่อุณหภูมิ 105 องศาเชลเซียส
นาน 16-18 ชั่วโมง จากนั้นน้าครูซิเบิ้ลออกมาใส่โถดูดความชื้น ปล่อยให้เย็นจากนั้นชั่ง
น้้าหนัก จดบันทึก
6. น้าครูซิเบิ้ลที่ชั่งน้้าหนักแล้วเข้าในเตาเผาที่อุณหภูมิ 5500C นาน 2 ชั่วโมง จากนั้นเปิดฝา
เตาเผา รอให้ถ้วยมีอุณหภูมิลดลงประมาณ 150-200 0C แล้วน้าใส่โถดูดความชื้นปล่อยให้
เย็น แล้วชั่งน้้าหนักครูซิเบิ้ล จดบันทึก (โดยส่วนของเยื่อใยคือส่วนที่ถูกเผาหายไป)

การคานวณ
% เยื่อใย = (W2 – W3) x 100
W1
W1 = น้้าหนักตัวอย่าง
W2 = น้้าหนัก crucible + น้้าหนักตัวอย่างหลังการอบ
W3 = น้้าหนัก crucible + น้้าหนักตัวอย่างหลังการเผา
 14

7. การวิเคราะห์หาคาร์โบไฮเดรทที่ย่อยได้ง่าย ( Nitrogen free extract,NFE )

การวิเคราะห์หาคาร์โบไฮเดรทที่ย่อยได้ง่าย โดยการค้านวณจาก
% NFE = 100-[%Moisture+%Ash+%CP+%EE+%CF]
เมื่อ %Moisture= เปอร์เซ็นต์ความชื้น
%Ash = เปอร์เซ็นต์เถ้า
%CP = เปอร์เซ็นต์โปรตีนหยาบ
%EE = เปอร์เซ็นต์ไขมันหยาบ
%CF = เปอร์เซ็นต์เยื่อใยหยาบ

การตรวจสอบข้อผิดพลาด จากการวิเคราะห์แบบประมาณ

การวิเคราะห์จะทาตัวอย่างละ 2 ซ้า
คานวณข้อผิดพลาดระหว่าง 2 ซ้า ดังนี้ (% Error) = ผลต่างระหว่าง 2 ซ้า x 100
ผลวิเคราะห์ที่ได้ค่าน้อย
ผลการวิเคราะห์อยู่ระหว่าง 0-2 % ไม่ควรผิดพลาดเกิน 10 %
ผลการวิเคราะห์อยู่ระหว่าง 2-4% ไม่ควรผิดพลาดเกิน 6 %
ผลการวิเคราะห์อยู่ระหว่าง 4-6 % ไม่ควรผิดพลาดเกิน 5 %
ผลการวิเคราะห์อยู่ระหว่าง 6 % ขึ้นไป ไม่ควรผิดพลาดเกิน 3 %
 15

การวิเคราะห์เยื่อใยในอาหารสัตว์
( Detergent analysis )

เยื่อใย เป็นสารประกอบทางเคมีที่เป็นองค์ประกอบที่ส้าคัญโดยเฉพาะพืชอาหารสัตว์ สารที่

จัดเป็นเยื่อใยในพืชมีอยู่ด้วยกันหลายชนิด ที่ส้าคัญได้แก่ เซลลูโลส (cellulose) เฮมิเซลลูโลส
(hemicellulose) และลิกนิน (lignin) ซึ่งประมาณ 98 % ของปริมาณเยื่อใยทั้งหมดที่พบในพืชจะ
ประกอบด้วยสาร 3 ชนิดนี้
วิธีการที่ใช้วิเคราะห์เยื่อใยที่ใช้ทดแทนวิธีแบบดั้งเดิม Weende method ที่ยังมีข้อบกพร่องคือ
ในการวิเคราะห์เยื่อใยหยาบ จะมีเยื่อใยบางส่วนที่สามารถละลายได้ในกรด และด่าง จะละลายออกไปคือ
เฮมิเซลลูโลส และลิกนิน ท้าให้ผลการวิเคราะห์ผิดพลาด และในปี ค.ศ.1960 , Dr.P.J.Van Soest แห่ง
สถาบันวิจัยและส่งเสริมการเกษตร เมืองเบลท์สวิลล์ มลรัฐแมรี่แลนด์ ประเทศสหรัฐอเมริกา ได้พัฒนา
เทคนิคใหม่ในการวิเคราะห์หาส่วนประกอบของเยื่อใยต่างๆ โดยใช้สารฟอกและเรียกว่า Detergent fiber
Analysis ซึ่งการวิเคราะห์โดยใช้สารฟอกนี้สามารถแยกส่วนประกอบของเซลออกเป็น 2 ส่วน คือ
1.องค์ประกอบภายในเซลล์ (Cell content) หมายถึงสารต่างๆที่อยู่ภายในเซลล์ของพืชเป็นส่วนที่
สามารถย่อยสลายได้ง่ายประกอบด้วย แป้ง น้้าตาล โปรตีนที่ละลายได้ง่าย ไขมัน เป็นต้น
2. องค์ประกอบที่เป็นส่วนประกอบผนังเซล (Cell wall ) หมายถึงสารต่างๆที่เป็นส่วนประกอบของ
ผนังเซลล์พืช ได้แก่สารที่เป็นเยื่อใยต่างๆที่ท้าหน้าที่เป็นโครงสร้างของพืช ที่ส้าคัญได้แก่ เซลลูโลส เฮมิ
เซลลูโลส ลิกนิน โปรตีนที่ไม่ละลายได้ง่าย
การวิเคราะห์หา Cell wall constituents (CWC)หรือ NDF ท้าได้โดยน้าตัวอย่างอาหารไปต้มกับ
สารละลาย neutral detergent ส่วนที่เหลือซึ่งไม่ละลายในสารละลายที่เป็นกลางคือส่วนของ CWC ซึ่งเป็น
สารต่างๆที่เป็นส่วนของผนังเซลล์พืชได้แก่ เซลลูโลส (cellulose) เฮมิเซลลูโลส (hemicellulose) ลิกนิน
(lignin) รวมทั้ง cutin ,siliga และ tannin
การวิเคราะห์หา Acid Detergent Fiber (ADF) ในพืชอาหารสัตว์และวัตถุดิบอาหารสัตว์ ท้าโดย
น้าเอาตัวอย่างอาหารไปต้มในสารละลาย acid detergent ส่วนที่เหลือที่ไม่ละลายคือส่วนของ ADF ซึ่ง
ประกอบด้วย cellulose lignin ประมาณ 90 % ส่วนที่เหลือ 10 % จะเป็นพวก cutin และเถ้าที่ไม่ละลาย
ในกรด ดังนั้น ส่วนที่ หายไป คือ hemicellulose ซึ่งละลายในสารละลายที่เป็นกรดได้ ในที่นี้จะใช้
sulfuric acid ที่มีความเข้มข้น 1 นอร์มอล (N) และมี detergent คือ cetyl trimethyl ammonium bromide
จะช่วยย่อยพวกโปรตีนออกไป
การหาปริมาณ Cellulose โดยวิธี Detergent analysis หาได้ 2 วิธีขึ้นอยู่กับวิธีการวิเคราะห์หา
lignin ถ้าวิเคราะห์หาแบบ ADL ผลต่างระหว่าง ADF และ ADL (ADF-ADL) คือค่า cellulose ที่มีส่วน
ของ AIA รวมอยู่ ถ้าวิเคราะห์โดยวิธี PML ปริมาณ cellulose คือ (ADF-PML-AIA)
 16

การวิเคราะห์ lignin ท้าได้โดยใช้ตัวอย่างที่ได้จากการหา ADF มาท้าการวิเคราะห์หาlignin โดยใช้

กรดก้ามะถันความเข้มข้น 72 % ซึ่งlignin ที่หาได้โดยวิธีนี้เรียกว่า acid detergent lignin ลิกนิน ไม่จัดเป็น
สารพวกคาร์โบไฮเดรทแม้จะมีคาร์บอน ไฮโดรเจน และอ๊อกซิเจน แต่ก็จัดเป็นส่วนประกอบที่ส้าคัญของ
ผนังเซลพืชท้าให้เซลล์พืชมีความแข็งแรง

วิธีวิเคราะห์หา Neutral Detergent Fiber (NDF)

อุปกรณ์
1. ครูซิเบิ้ล (fritted glass crucible) ขนาด 50 ml.
2. ตู้อบแห้ง (hot air oven)
3. โถดูดความชื้น (dessicator)
4. เครื่องชั่งชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง
5. บีกเกอร์ (beaker) ขนาด 600 ml.
6. เครื่องวิเคราะห์เยื่อใย แบบ manual
7. ขวดฉีดน้้า (wash bottle)
8. ขวดต้มน้้าร้อน (boiling flask)
9. เครื่องต้มน้้าร้อน
10. เครื่องดูดสุญญากาศ
สารเคมี
1. Sodium lauryl sulphate (USP หรือ purified grade)
2. Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) dihydrate, crystal, reagent grade
3. Sodium borate decahydrate (Na2B4O7.10H2O, reagent grate)
4. Disodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4), reagent grade
5. Triethylene glycol , reagent grade
6. Sodium sulphite anhydrous, reagent grade
7. Acetone (AR grade) ชนิดที่ปราศจากสี และสามารถระเหยได้หมด ไม่มีสิ่งตกค้างเหลืออยู่
8. α – Amylase EC number 3.2.1.1 ชนิด heat – stable
9. Distiled or deionized water
วิธีเตรียมสารละลาย Neutral Detergent Fiber 2 ลิตร
- Sodium lauryl sulphate (USP หรือ purified grade)
- Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) dihydrate, crystal, reagent grade
- Sodium borate decahydrate (Na2B4O7.10H2O, reagent grate)
- Disodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4), reagent grade
 17

- Triethylene glycol , reagent grade

- Distiled or deionized water
1. ชั่ง sodium lauryl sulphate 60 กรัม ใส่ใน beaker ขนาด 400 มิลลิลิตร แล้ว
น้ามาใส่ใน Volumetric flask ขนาด 2 ลิตร โดยใช้กรวยกรองและแท่งคน
สารละลายช่วย เสร็จแล้วล้าง Sodium lauryl sulphate ที่ติดค้างอยู่ใน beaker
ด้วยน้้าร้อน โดยใช้ขวดฉีดน้้าร้อน ฉีดแล้วเทรวมใส่ใน Volumetric flask เดิม
เขย่าเบา ๆ
2. เติม Triethylene glycol 20 มิลลิลิตร ใส่ลงใน Volumetric flask ในข้อ (1.1)
เขย่าให้เข้ากัน
3. ละลาย disodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4) 9.12 กรัม ,
Sodium borate decahydrate (Na2B4O7.10H2O) 13.62 กรัม และ Disodium
ethylenediaminetetraacetate (EDTA) dehydrate 37.22 กรัม ด้วยน้้ากลั่นที่
ร้อนแล้วน้ามาผสมกับสารละลาย ในข้อ (1.2) เทใส่ volumetric flask เขย่าให้
เข้ากัน แล้วเติมน้้ากลั่นจนถึงขีดปริมาตรปล่อยให้เย็นที่อุณหภูมิห้อง แล้วปรับ
ปริมาตรพอดีขีดด้วยน้้ากลั่นและปรับ pHให้ได้ 6.9 – 7.1

คาเตือนในความปลอดภัย
1.Acetone เป็นสารระเหยและติดไฟง่าย ไม่ให้ระเหยสะสมอยู่ในพื้นที่ท้างาน ใช้อุปกรณ์ก้าจัดกลิ่น
ไอและหลีกเลี่ยงการสูดดมหรือสัมผัสกับผิว ท้าการระเหย Acetone ในตัวอย่างที่บรรจุในCrucible
ก่อนเข้าตู้อบแห้ง
2. sodium lauryl sulphate เป็นสารระคายเคืองที่เยื่อบุผิว ควรสวมหน้ากากกันฝุ่นและสวมถุงมือ
ในขณะปฏิบัติการเตรียมสารละลาย
วิธีการ
1. น้า crucible ขนาด 50 ml. ไปอบในตู้อบ ที่อุณหภูมิ105 0C นาน 2 ชั่วโมง เอาออกใส่ใน
โถดูดความชื้น (dessicator) ทิ้งให้เย็น แล้วชั่งน้้าหนักบันทึกไว้
2. ชั่งตัวอย่างที่แห้งและบดละเอียด ขนาด 1 มิลลิเมตร 0.5-1.0 กรัม ใส่ใน beaker ปาก
กลมเรียบ ขนาด 600 มิลลิลิตร (ใส่ Na2SO3 0.5 กรัม ในตัวอย่างที่มี cutin) สูง ลงไป
ใน beaker ที่มีตัวอย่างใบเดิม
3. น้าสารละลาย Neutral Detergent Fiber ไปต้มให้ร้อน ประมาณ 5 นาที แล้วตวงใส่ลง
ใน beaker ที่มีตัวอย่างอยู่ 50 มิลลิลิตรโดยใช้กระบอกตวง น้าไปท้าการย่อย หลัง 5 นาที
เขย่า beaker แล้วยกลง ในตัวอย่างที่กรองยากจะเติม 0.1 ml. สารละลายมาตรฐาน α-
 18

amylase เขย่าให้สารละลายมาตรฐาน α-amylase กับสารละลาย Neutral Detergent

Fiber ผสมกัน แล้วยกขึ้นวางบนเครื่องวิเคราะห์เยื่อใย ท้าการ reflux ต่อ 60 นาที
4. ท้าการกรอง โดยเทสารละลายใน beaker ลงในcrucible ที่ชั่งน้้าหนักแล้วที่
ต่อติดกับเครื่องดูดสุญญากาศ ล้างตัวอย่างที่อยู่ใน beaker ด้วยน้้าร้อน
จนกระทั่งตัวอย่างส่วนที่เหลือทั้งหมดลงใน crucible จนหมด
5. ล้างตัวอย่างใน crucible ด้วยน้้าร้อนอีกจนหมดฟอง แล้วใช้ขวดฉีดน้้าร้อนล้างตัวอย่างที่
ติดอยู่ข้าง crucible ลงให้หมด แล้วดูดน้้าใน crucible ออก
6. จากนั้นล้างตัวอย่างด้วย acetone 3 – 5 ครั้ง หรือจนกระทั่งสารละลายล้างออกจาก
crucible ไม่มีสี
7. น้า crucible ที่มีตัวอย่าง ไปอบในตู้อบแห้ง (hot air oven) ที่อุณหภูมิ 105 0C นาน 8
ชั่วโมง หรือตลอดคืน
8. น้า crucible ที่มีตัวอย่างออกจากตู้อบแห้ง (hot air oven) เอาใส่ในโถดูดความชื้น
(dessicator) ปล่อยให้เย็น แล้วชั่งน้้าหนัก เพื่อค้านวณหาค่า NDF
9. น้า crucible เผา (ignite) ในเตาเผา ที่อุณหภูมิ 550 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง
10. เอาออกใส่ในโถดูดความชื้น ปล่อยให้เย็น ชั่งน้้าหนักหา ash

วิธีคานวณ
1. ในกรณีที่ตัวอย่างนั้นวิเคราะห์หาเฉพาะค่า NDF
%NDF = [ (W1- W2 x 100 ] - % nuetral insoluble ash
W3
เมื่อ W1= น้้าหนัก crucible + น้้าหนักตัวอย่าง
W2= น้้าหนัก crucible
W3= น้้าหนักตัวอย่าง
%NDF insoluble ash คือ % ash ที่ได้จากขั้นตอนการเผาในการวิเคราะห์หา NDF
2. ในกรณีที่ตัวอย่างนั้นวิเคราะห์หาค่า Lignin ด้วย
%NDF = [(W1- W2 x 100] - % Acid insoluble ash
W3
เมื่อ W1= น้้าหนัก crucible + น้้าหนักตัวอย่าง
W2= น้้าหนัก crucible
W3= น้้าหนักตัวอย่าง
%Acid insoluble ash คือ % ash ที่ได้จากขั้นตอนการเผาในการวิเคราะห์หา lignin
%NDS = 100 - (%Moisture) - (%NDF)
 19

เอกสารอ้างอิง
Goering, H.K. and P.J. Van Soest. 1970. Forage fiber analysis (apparatus,
reagents, procedures, and some application). Research Service. Handbook number 379
as modified by D.R. Mertens 1992, Personal Communication).
Van Soest, P.J.,J.B. Robertson, and B.A. Lewis. 1991. Methods for dietary fiber,
neutral detergent fiber and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition. J.
Dairy Science 74:3583-3597.
Mertens, D.R. 1992. Critical conditions in determining detergent fiber.
Proceedings of NFTA Forage Analysis Workshop. Denver, CO. p C1 – C8.
http://www.foragetesting.org/lab_porcedure/sectionB/4/part4.1.htm
 20

วิธีวิเคราะห์หา Acid Detergent Fiber (ADF)

อุปกรณ์
1. ครูซิเบิ้ล (fritted glass crucible) ขนาด 50 ml.
2. ตู้อบแห้ง (hot air oven)
3. โถดูดความชื้น (dessicator)
4. เครื่องชั่ง (balance) ชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง
5. บีกเกอร์ (beaker) ขนาด 600 ml.
6. เครื่องวิเคราะห์เยื่อใย แบบ manual
7. ขวดฉีดน้้า (wash bottle)
8. ขวดต้มน้้าร้อน (boiling flask)
9. เครื่องต้มน้้าร้อน
10. เครื่องดูดสุญญากาศ
สารเคมี
1. Sulfuric acid (H2SO4), reagent grade
2. Cetyl triethyl ammonium bromide (CTAB), reagent grade
3. Acetone , reagent grade
4. Distilled or deionized water
วิธีเตรียมสารละลาย Acid Detergent Fiber
1. ชั่งซัลฟุริกเข้มข้น ( H2SO4 conc, AR grade) 51.08 กรัม ใส่ใน beaker ขนาด 250 มิลลิลิตร
แล้วเทใส่ volumetric flask ขนาด 1 ลิตร ที่มีน้ากลั่นอยู่ประมาณ 200 มิลลิลิตร
2. ล้างกรดที่อยู่ใน beaker ด้วยน้้ากลั่น 2 ครั้ง แล้วเทลงใน volumetric flask เดิม แล้วเขย่าให้
เข้ากัน
3. เติมน้้ากลั่นให้พอดีขีด ปิดฝา เขย่า 3 ครั้งให้เข้ากัน ปล่อยทิ้งไว้ให้เย็นที่อุณหภูมิห้อง
4. ปรับปริมาตรพอดีขีด volumetric flask ขนาด 1 ลิตร ด้วยน้้ากลั่น เขย่า 2-3 ครั้งให้เข้ากัน
5. หาความเข้มข้นที่แน่นอนของสารละลาย H2SO4 ด้วยการไทเทรตกับ NaOH
- ปิเปตสารละลายที่เตรียมได้มา 20 ml. ใส่ลงใน flask ขนาด 250 ml. หยดฟี-
นอลพทาลีน 3 หยด ไทเทรตสารละลายด้วยสารละลาย NaOH ที่ทราบความ
เข้มข้นแล้ว จนกระทั่งสารละลายเปลี่ยนเป็นสีชมพู่อ่อน
- ท้าการทดลองซ้้าอีก 1 ครั้ง บันทึกผลการทดลองและค้านวณผลที่ได้ หาความ
เข้มข้นเฉลี่ยของสารละลาย H2SO4
6. ชั่ง CTAB 20 กรัม ลงใน beaker ขนาด 250 มิลลิลิตร เทใส่ลงในขวดส้าหรับเก็บสารละลาย
Acid Detergent Fiber โดยใช้กรวยกรองและแท่งคนสารละลายช่วย ล้าง CTAB ที่ติดค้างใน
 21

beaker ด้วยสารละลาย sulfuric acid ความเข้มข้น 1 นอร์มอล แล้วใส่ลงในขวดเก็บ

สารละลาย Acid Detergent Fiber ที่มี CTAB อยู่แล้ว 3 ครั้ง เขย่าให้เข้ากัน แล้วเทกรดซัลฟุริกที่
เหลือใส่ในขวดสารละลาย Acid Detergent Fiber และเขย่าให้เข้ากัน
วิธีการ
1. น้า crucible ขนาด 50 ml.ไปอบในตู้อบ ที่อุณหภูมิ 105 °C นาน 2 ชั่วโมง เอาออกใส่ใน
โถดูดความชื้น (desiccator) ทิ้งให้เย็น แล้วชั่งน้้าหนักและบันทึกไว้
2. ชั่งตัวอย่างที่แห้งและบดละเอียด ขนาด 1 มิลลิเมตร 1 กรัม ใส่ใน beaker ปากกลมเรียบ
ขนาด 600 มิลลิลิตร
3. น้าสารละลาย Acid Detergent ไปต้มให้ร้อน ตวงใส่ลงใน beaker ที่มีตัวอย่างอยู่ 100
มิลลิลิตร โดยใช้กระบอกตวง น้าไปท้าการย่อย หรือ reflux นาน 1 ชั่วโมง โดยใช้เครื่อง
วิเคราะห์เยื่อใยชนิด manual
4. ท้าการกรอง โดยเทสารละลายใน beaker ลง crucible ที่ชั่งน้้าหนักแล้วที่ต่อติดกับเครื่อง
กรองดูดสุญญากาศ ล้างตัวอย่างที่อยู่ใน beaker ด้วยขวดฉีดน้้าร้อน จนกระทั่งตัวอย่างส่วนที่
เหลือทั้งหมดลงใน crucible จนหมด ล้างตัวอย่างที่อยู่ใน crucible 1,200 ml. หรือจนหมด
ฟอง
5. ล้างตัวอย่างที่ติดอยู่ข้าง crucible ด้วยน้้าร้อนอีก 1-2 ครั้ง โดยใช้ขวดฉีดน้้า แล้วดูดน้้าออก
ด้วย vacuum pump
6. จากนั้นล้างตัวอย่างด้วย acetone 3 ครั้ง หรือจนกระทั่งสารละลายที่ไหลออกจาก crucible
ไม่มีสี
7. น้า crucible ที่มีตัวอย่างไปอบในตู้อบ ที่อุณหภูมิ 105 0C นาน 8 ชั่วโมง หรือตลอดคืน
8. น้า crucible ที่มีตัวอย่างออกจากตู้อบ เอาใส่ในโถดูดความชื้น (dessicator) ปล่อยให้เย็น
แล้วชั่งน้้าหนัก เพื่อค้านวณหาค่า ADF
9. น้า crucible เผา (ignite) ในเตาเผา ที่อุณหภูมิ 550 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง
10. เอาออกใส่ในโถดูดความชื้น ปล่อยให้เย็น ชั่งน้้าหนักหา ash
 22

วิธีคานวณ
1. ในกรณีที่ตัวอย่างวิเคราะห์เฉพาะค่า ADF
%ADF = [(W1 – W2) x 100] - %Acid Insoluble Ash
W3
W1 = น้้าหนัก crucible + น้้าหนักตัวอย่าง
W2 = น้้าหนัก crucible
W3 = น้้าหนักตัวอย่าง
%Acid insoluble ash คือ % ash ที่ได้จากขั้นตอนการเผาในการวิเคราะห์หา ADF
2. ในกรณีที่ตัวอย่างนั้นวิเคราะห์หาค่า Lignin ด้วย
%ADF = [(W1- W2 x 100] - % Acid insoluble ash
W3
เมื่อ W1= น้้าหนัก crucible + น้้าหนักตัวอย่าง
W2= น้้าหนัก crucible
W3= น้้าหนักตัวอย่าง
%Acid insoluble ash คือ % ash ที่ได้จากขั้นตอนการเผาในการวิเคราะห์หา lignin

2. การคานวณหาปริมาณเยื่อใย Hemicellulose
 % Hemicellulose = %NDF - %ADF
เอกสารอ้างอิง
Fiber (Acid Detergent) and Lignin in Animal Feed. (973.18) Official Methods of Analysis. 1990.
Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition.
Fiber (Acid Detergent) and Lignin in Animal Feed. (973.18) Official Methods of Analysis. 2000.
Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition.
Animal feeding stuffs – Determination of acid detergent fiber content (ADF) and lignin ISO 2004.
http://www.foragetesting.org/lab_porcedure/sectionB/4/part4.1.htm
 23

วิธีวิเคราะห์หา Acid Detergent Lignin (ADL)

อุปกรณ์
1. ถาดที่ท้าด้วยโลหะสเตนเลส
2. Beaker ขนาด 250 มิลลิลิตร
3. แท่งแก้วคนสารละลาย
4. ขวดต้มน้้าร้อน
5. ขวดฉีดน้้า
6. เครื่องต้มน้้าร้อน
7. Vacuum pump
8. ตู้อบแห้ง
9. โถดูดความชื้น
10. เครื่องชั่ง (balance) ชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง

สารเคมี
1. Sulfuric acid conc, AR grade
2. Distilled or Deionized water

วิธีเตรียมสารละลาย 72% H2SO4

1. ตวง H2SO4 conc. 670 มิลลิลิตร ค่อยๆเทอย่างช้าๆ ลงใน beaker ขนาด 1,000 มิลลิลิตร ที่
มีน้ากลั่นอยู่แล้ว 100 มิลลิลิตร พร้อมกับใช้แท่งแก้วคนให้สารละลายเข้ากันเป็นระยะ ในขณะ
ที่เตรียมสารละลายนี้ต้องให้ beaker อยู่ในอ่างน้้าเย็นตลอดเวลา
2. น้ากระจกนาฬิกามาปิดไว้ รอจนสารละลายเย็นที่อุณหภูมิ 20 0C
3. เมื่อสารละลายเย็นลง เติมน้้ากลั่นลงไปให้ได้ปริมาตร 1 ลิตร คนสารละลายให้เข้ากันอีกครั้ง
เอากระจกนาฬิกามาปิด ทิ้งให้เย็นที่อุณหภูมิ 20 0C
4. เมื่อสารละลายเย็นลง เทใส่ลงในขวดส้าหรับเก็บสารละลาย 72 %H2SO4 ก่อนน้าสารละลาย
72%H2SO4 มาใช้จะต้องวัดความถ่วงจ้าเพาะของสารละลายนี้ให้ได้ 1.634 ที่อุณหภูมิ 20 0C
ในการวัดเพื่อหาความถ่วงจ้าเพาะ 1.634 ที่อุณหภูมิ 20 0C นั้น เริ่มจาก วางขวดสารละลาย
72%H2SO4 ลงในอ่างน้้าเย็น ใช้ปรอทวัดอุณหภูมิ พออุณหภูมิ 20 0C ยกขึ้นจากอ่างน้้าเย็น
เขย่าสารละลายกรดซัลฟูริกเข้มข้น72%ในขวดเก็บสารละลายให้เข้ากัน แล้วเทลงในกระบอก
ตวงขนาด 500 มิลลิลิตร ใช้เครื่องวัดความถ่วงจ้าเพาะวัดให้ได้เท่ากับ 1.634 ที่อุณหภูมิ 20 0C
ถ้าค่าที่วัดได้สูงกว่า 1.634 ให้ค่อยๆเติมน้้ากลั่นลงไป แต่ถ้าต่้ากว่า 1.634 ให้เติมกรดซัลฟูริก
 24

เข้มข้นลงไป จนกว่าจะวัดได้ค่าความถ่วงจ้าเพาะ เท่ากับ 1.634 ที่อุณหภูมิ 20 0C จึงจะ

น้าไปใช้ได้

วิธีการ
1. น้า crucible ที่มีตัวอย่างซึ่งวิเคราะห์หา ADF แล้วมาเติมสารละลาย 72% H2SO4 ที่เย็น
(200C) ลงไป ประมาณครึ่ง crucible จากนั้นน้าไปวางลงในถาดสเตนเลส ใช้แท่งแก้วคนให้
ทั่วเพื่อให้ตัวอย่างแยกจากกันไม่จับกันเป็นก้อน โดยมีน้ากลั่นที่อยู่ในถาดสเตนเลสระดับที่ต่้า
กว่าระดับของแผ่น fritted glass รักษาอุณหภูมิของcrucible ในถาดสเตนเลสที่ 20 0 - 23 0C
2. คอยเติมสารละลาย 72% H2SO4 เมื่อสารละลายใน crucible แห้ง คนเป็นระยะๆ ใช้เวลา
ย่อยนาน 3 ชั่วโมง
3. จากนั้นน้าไป suction เพื่อล้างสารละลายกรดออก แล้วล้างด้วยน้้าร้อน โดยใช้น้าร้อนปริมาณ
1,400 มิลลิลิตร หรือจนหมดกรด จากนั้นใช้ขวดฉีดน้้าร้อน ไล่ตัวอย่างที่ติดอยู่ข้าง crucible
ให้ลงไปใน crucible ให้หมด แล้วฉีดล้าง crucible อีกหนึ่งครั้ง
4. น้า crucible พร้อมตัวอย่างที่ย่อยแล้ว ไปอบในตู้อบแห้ง (hot air oven) ที่อุณหภูมิ 105 องศา
เซลเซียส นาน 8 ชั่วโมง จากนั้นน้าออกใส่โถดูดความชื้น (dessicator) ปล่อยให้เย็น แล้วชั่ง
น้้าหนักและบันทึกไว้
% Cellulose = W1 - W4 x 100
W3
เมื่อ W1 = น้้าหนัก crucible + น้้าหนัก ADF
W4 = น้้าหนัก crucible + น้้าหนักเยื่อใยหลังการอบ
W3 = น้้าหนักตัวอย่าง
 25

วิธีวิเคราะห์ Lignin
อุปกรณ์
1. เตาเผา (Muffle furnace)
2. โถดูดความชื้น (Dessicator)
3. เครื่องชั่ง (Balance) ชนิดทศนิยม 4 ต้าแหน่ง
วิธีการ
1. น้า crucible ที่มีตัวอย่างซึ่งวิเคราะห์หา cellulose แล้ว น้าไปเผา (ignite) ในเตาเผา ที่
อุณหภูมิ 500 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง
2. เอาออกใส่ในโถดูดความชื้น ปล่อยให้เย็น ชั่งน้้าหนักหา lignin

วิธีคานวณ
% Lignin = W4 - W5 x 100
W3
เมื่อ W4 = น้้าหนัก crucible + น้า้ หนักเยื่อใยหลังการอบ
W5 = น้้าหนัก crucible + น้้าหนัก เยื่อใยหลังการเผา (ignite)
W3 = น้้าหนักตัวอย่าง
% เถ้าที่ไม่ละลายในกรด = W5 - W2 x 100
W3
เมื่อ W5 = น้้าหนัก crucible + น้้าหนักเยื่อใยหลังการเผา (ignite)
W2 = น้้าหนัก crucible เปล่า ก่อนน้ามาใช้วิเคราะห์หา ADF
W3 = น้้าหนักตัวอย่าง (sample)
เอกสารอ้างอิง
Fiber (Acid Detergent) and Lignin in Animal Feed. (973.18) Official Methods of Analysis.
1990. Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition.
Fiber (Acid Detergent) and Lignin in Animal Feed. (973.18) Official Methods of Analysis.
2000. Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition.
Animal feeding stuffs – Determination of acid detergent fiber content (ADF) and lignin
ISO 2004.
http://www.foragetesting.org/lab_porcedure/sectionB/4/part4.1.htm
 26

ภาคผนวก

1. การเตรียมสารละลายกรดซัลฟุริก ความเข้มข้น 1 N
Sulfuric acid (H2SO4), reagent grade (% assay 100) = 49.04 กรัม
ผลิตภัณฑ์แต่ละบริษัทอาจจะมีค่าแตกต่างกันให้ดูจากฉลากที่ข้างขวดแล้วน้ามาค้านวณ
สมมติถ้า % assay = 95 - 97 ให้คิดค่าเฉลี่ย = 96%
แล้วน้ามาค้านวณปริมาณกรดซัลฟุริกที่ต้องใช้ ดังนี้
กรดซัลฟุริก assay 96% ใช้ปริมาณกรด = 49.04 กรัม
ถ้ากรดซัลฟุริก assay 100% ใช้ปริมาณกรด = 49.04 x100 กรัม
96
 จะต้องใช้ sulfuric acid assay 96% = 51.08 กรัม

2. การเตรียมสารละลาย H2SO4 เข้มข้น 72 %

วิธีค้านวณหาปริมาณกรดซัลฟุริกที่ต้องใช้ในการเตรียมสารละลาย H2SO4 เข้มข้น 72 %
เตรียมสารละลาย 72% H2SO4 ความถ่วงจ้าเพาะ 1.634 จาก 96% H2SO4 ความถ่วงจ้าเพาะ 1.84
(H2SO4 conc)
จากสูตร N1V1 = N2V2
เมื่อ N1 = ความเข้มข้นของ 96% H2SO4 หน่วยเป็น Normal
N2 = ความเข้มข้นของสารละลาย 72% H2SO4 หน่วยเป็น Normal
V1 = ปริมาตรของ 96% H2SO4 ที่ต้องใช้หน่วยเป็น ml
V2 = ปริมาตรของสารละลาย 72% H2SO4 ที่ต้องการเตรียมหน่วยเป็น ml
จาก 96% H2SO4 ความถ่วงจ้าเพาะ 1.84
สารละลาย H2SO4 หนัก 100 g มีเนื้อกรดอยู่ = 96 g
สารละลาย H2SO4 หนัก 1.84 g มีเนื้อกรดอยู่ = 96 x 1.84 g
100
สารละลาย H2SO4 1 ml จะมีเนื้อกรดอยู่ = 96 x 1.84 g
100
สารละลาย H2SO4 1000 ml จะมีเนื้อกรดอยู่ = 96 x 1.84 x1000 g
100 x 1
 27

 ความเข้มข้น = 96 x 1.84 x1000 N

100 x (98.08/2)
= 36.02 N
 96% H2SO4 ความถ่วงจ้าเพาะ 1.84 มีความเข้มข้น 36.02 N
จาก 72% H2SO4 ความถ่วงจ้าเพาะ 1.634
สารละลาย H2SO4 หนัก 100 g มีเนื้อกรดอยู่ = 72 g
สารละลาย H2SO4 หนัก 1.634 g มีเนื้อกรดอยู่ = 72 x 1.634 g
100
สารละลาย H2SO4 1 ml จะมีเนื้อกรดอยู่ = 72 x 1.634 g
100
สารละลาย H2SO4 1000 ml จะมีเนื้อกรดอยู่ = 72 x 1.634 x1000 g
100 x 1
 ความเข้มข้น = 72 x 1.634 x1000 N
100 x (98.08/2)
= 23.99 N
 สารละลาย 72% H2SO4 ความถ่วงจ้าเพาะ 1.634 มีความเข้มข้น 23.99 N
จาก N1V1 = N2V2
36.02 x V1 = 23.99 x 1000
V1 = 23.99 x1000
36.02
V1 = 666.02 ml

ในการเตรียมสารละลาย 72% H2SO4 ความถ่วงจ้าเพาะ 1.634 จะต้องใช้ปริมาณกรดซัลฟุริก

ความเข้มข้น 96% H2SO4 ความถ่วงจ้าเพาะ 1.84 เท่ากับ 666.02 มิลลิลิตร

………………………………......................
29
30
31
32
33
34
35