Oligonukleotydy Immunostymulujące - Patent

RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2376107
POLSKA
(13) T3
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int.Cl.
01.12.2009 09774978.2 A61K 39/00 (2006.01)
A61K 39/29 (2006.01)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:

21.05.2014 Europejski Biuletyn Patentowy 2014/21
Urząd Patentowy
EP 2376107 B1
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54) Tytuł wynalazku:

Oligonukleotydy immunostymulujące
(30)
Pierwszeństwo:
09.12.2008 US 121022 P
28.05.2009 US 181799 P
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
19.10.2011 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/42
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.09.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/09
(73) Uprawniony z patentu:
Coley Pharmaceutical Group, Inc., New York, US
(72) Twórca(y) wynalazku:
HEATHER LYNN DAVIS, Ottawa, CA

RISINI DHAMMIKA WEERATNA, Ottawa, CA
PL/EP 2376107 T3
(74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Marta Kawczyńska
POLSERVICE
KANCELARIA RZECZNIKÓW
PATENTOWYCH SP. Z O.O.
ul. Bluszczańska 73
00-712 Warszawa
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
1
17/P34537PL00 EP 2 376 107

Opis
DZIEDZINA WYNALAZKU
5
[0001] Wynalazek dotyczy oligonukleotydów
immunostymulujących oraz sposobów stosowania
oligonukleotydów immunostymulujących do indukowania
odpowiedzi immunologicznej swoistej względem antygenu.
10
TŁO WYNALAZKU
[0002] DNA bakteryjny ma działanie immunostymulujące

aktywując komórki B i komórki naturalnych zabójców, ale
15 DNA kręgowców nie (Tokunaga, T., i wsp., 1988. Jpn. J.
Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T., i wsp., 1984,
JNCI 72:955-962; Messina, J. P., i wsp., 1991, J.
Immunol. 147:1759-1764; i jest to opisane w pracy
przeglądowej Krieg, 1998, W: Applied Oligonucleotide
20 Technology, C. A. Stein and A. M. Krieg, (red.), John
Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y., str. 431-448).
Jest obecnie zrozumiałe, że te efekty immunostymulujące
bakteryjnego DNA są wynikiem obecności niemetylowanych
dinukleotydów CpG w danym kontekście zasad (motywy
25 CpG), które są powszechne w DNA bakteryjnym, ale
metylowane i słabo reprezentowane w DNA kręgowców
(Krieg i wsp, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999
Biochim. Biophys. Acta 1489:107-116). Efekty
immunostymulujące DNA bakteryjnego mogą być naśladowane
30 poprzez zastosowanie syntetycznych
oligodeoksynukleotydów (ODN) zawierających te motywy
2
CpG. Takie ODN CpG mają wysoce immunostymulujące efekty

wobec leukocytów ludzkich i leukocytów myszowatych,
indukując proliferację komórek B; wydzielanie cytokin i
immunoglobulin; aktywność lityczną komórek naturalnych
5 zabójców (NK, ang. natural killer) i wydzielanie IFN-
gamma oraz aktywację komórek dendrytycznych (DC,
dendritic cell) i innych komórek prezentujących antygen
do ekspresji cząsteczek kostymulacyjnych i wydzielania
cytokin, zwłaszcza cytokin Th1-podobnych, które są
10 ważne w promowaniu rozwoju odpowiedzi Th1-podobnych
komórek T. Te efekty immunostymulujące natywnego
szkieletu fosfodiestrowego ODN CpG są wysoce swoiste
dla CpG, pod tym względem, że efekty są dramatycznie
zmniejszone, jeśli motyw CpG jest zmetylowany,
15 zmieniony na GpC lub w inny sposób wyeliminowany lub
zmieniony (Krieg i wsp., 1995 Nature 374:546-549;
Hartmann i wsp., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96:9305-10).
[0003] Luganini i wsp. (Antimicrob Agents Chemother.
20 2008, 52(3):1111-20) opisali wpływ hamujący ODN CpG na
replikację hCMV poprzez mechanizm, który jest
niezależny od TLR9.
[0004] Doniesiono wcześniej, że aktywność
immunostymulująca oligonukleotydów CpG jest zależna od
25 liczby motywów CpG, sekwencji flankujących dinukleotyd
CG, położenia motywu(motywów) CpG i odstępów pomiędzy
motywami CpG (Ballas i wsp., 1996, J. Immunol. 157(5):
1840-5; Hartmann i wsp., 2000, J. Immunol., 164(3):
1617-24; Klinman i wsp., 2003, Clin. Exp. Immunol.,
30 133(2): 227-32). Ujawniony jest tutaj oligonukleotyd
immunostymulujący mający usunięty motyw 3'CpG, który,
3
ku zaskoczeniu, zachowuje swoją aktywność

immunostymulującą. Ponadto, ujawniona jest szczepionka
zawierająca oligonukleotyd immunostymulujący i antygen
oraz sposoby stosowania takiej szczepionki.
5
KRÓTKIE STRESZCZENIE WYNALAZKU
[0005] W aspektach wynalazku, dostarczony jest

oligonukleotyd immunostymulujący zawierający sekwencję
10 nukleotydową 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (NR ID. SEKW.:
1). W niektórych wykonaniach oligonukleotyd
immunostymulujący zawiera jeden lub więcej
zmodyfikowanych wiązań. W niektórych wykonaniach,
oligonukleotyd immunostymulujący zawiera jeden lub
15 więcej wiązań fosforotionianowych. W niektórych
wykonaniach, wszystkie wiązania międzynukleotydowe
oligonukleotydu są wiązaniami fosforotionianowymi. W
niektórych wykonaniach oligonukleotyd immunostymulujący
zawiera co najmniej jeden lipofilowy podstawiony analog
20 nukleotydu i dinukleotyd pirymidyna-puryna.
[0006] W aspektach wynalazku, dostarczona jest
szczepionka zawierająca antygen i oligonukleotyd
immunostymulujący zawierający sekwencję nukleotydową NR
ID. SEKW.: 1, zawierająca ponadto farmaceutycznie
25 dopuszczalny nośnik. W niektórych wykonaniach
oligonukleotyd immunostymulujący jest w ilości
skutecznej do zaindukowania odpowiedzi immunologicznej
swoistej dla antygenu. W innych wykonaniach,
zaindukowaną odpowiedzią immunologiczną swoistą dla
30 antygenu jest odpowiedź immunologiczna Th1. W
niektórych wykonaniach, antygenem jest antygen
4
drobnoustrojowy, autoantygen lub substancja

uzależniająca. W innych wykonaniach, antygen bakteryjny
jest związany ze Staphylococcus aureus albo antygen
bakteryjny jest związany z bakterią, która powoduje
5 próchnicę zębów. W kolejnych wykonaniach, bakterią jest
Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus,
Streptococcus sanguis, Lactobacillus acidophilis lub
Actinomyces viscosus. W innych wykonaniach, antygen
10 chorobę przyzębia. W dalszych wykonaniach, bakterią
jest Porphyromonas gingivalis lub Actinobacillus
actinomycetemcomitans. W niektórych wykonaniach,
antygen wirusowy jest związany z syncytialnym wirusem
oddechowym (RSV, ang. Respiratory Syncytial virus),
15 wirusem opryszczki pospolitej 1, wirusem opryszczki
pospolitej 2, ludzkim wirusem niedoboru odporności 1
(HIV-1, ang. Human Immunodeficiency Virus-1) lub HIV-2.
W innych wykonaniach antygen pasożytniczy jest związany
z pasożytem, który powoduje malarię. W niektórych
20 wykonaniach, autoantygenem jest antygen nowotworowy,
antygen związany z chorobą Alzheimera, antygen wobec
ludzkiego przeciwciała lub antygen, który ulega
ekspresji z ludzkich endogennych elementów
retrowirusowych. W dalszych wykonaniach, antygenem
25 nowotworowym jest HER2, MAGE, NY-ESO, PSA, CEA lub
wariantowa forma EGFR. W innych wykonaniach, gdzie
antygen jest związany z chorobą Alzheimera, antygenem
jest tau lub β-amyloid. W niektórych wykonaniach
antygenem jest IgE. W niektórych wykonaniach antygenem
30 jest hapten nikotynowy sprzężony z nośnikiem. W
dalszych wykonaniach, nośnikiem, z którym sprzężony
5
jest hapten nikotynowy, jest toksyna błonicy (DT, ang.

diphtheria toxin). W innych wykonaniach, antygenem jest
peptyd, rekombinowane białko, oczyszczone białko, cały
zabity patogen, żywy, atenuowany wirus lub wektor
5 wirusowy, żywe atenuowane bakterie lub wektor
bakteryjny, polisacharyd, hapten lub antygen jest
kodowany przez plazmidowy DNA.
[0007] W niektórych wykonaniach, antygen jest
sprzężony z nośnikiem. W innych wykonaniach, nośnikiem
10 jest toksyna błonicy (DT). W innych wykonaniach,
nośnikiem jest cząstka wirusopodobna. W dalszych
wykonaniach, cząstką wirusopodobną jest fag RNA Q-β,
antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B
(HBsAg, ang. hepatitis B surface antigen) lub antygen
15 rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBcAg, ang.
hepatitis B core antigen). W niektórych wykonaniach,
szczepionka zawiera ponadto jeden lub kilka adiuwantów.
W dalszych wykonaniach, adiuwantem jest agonista
receptora Toll-podobnego (TLR Toll-like receptor),
20 którym nie jest TLR 9. W innych wykonaniach, agonista
jest dla TLR 3. W dalszych wykonaniach, agonistą TLR 3
jest stabilizowany poli I:C. W niektórych wykonaniach,
agonista jest dla TLR 4. W dalszych wykonaniach,
agonistą TLR 4 jest pochodna lipopolisacharydu (LPS). W
25 jeszcze dalszych wykonaniach, pochodną LPS jest MPL lub
GLA. W innych wykonaniach, agonista jest dla TLR 5. W
dalszych wykonaniach, agonistą TLR 5 jest flagelina. W
niektórych wykonaniach, agonista jest dla TLR 7 albo 8.
W dalszych wykonaniach, agonistą TLR 7 albo 8 jest mała
30 cząsteczka z rodziny imidazochinoliny. W innych
wykonaniach, adiuwantem jest sól glinu. W dalszych
6
wykonaniach, solą glinu jest wodorotlenek glinu. W

niektórych wykonaniach, adiuwantem jest kompleks
immunostymulujący (ISCOM, ang. immune stymulatory
complex). W innych wykonaniach, adiuwantem jest emulsja
5 olej-w-wodzie lub woda-w-oleju. W niektórych
wykonaniach, adiuwantem jest liposom. W innych
wykonaniach, adiuwantem jest system dostarczania. W
dalszych wykonaniach, układem dostarczania jest
nanocząstka lub mikrocząstka.
10 [0008] W niektórych wykonaniach oligonukleotyd
immunostymulujący zawiera jedno lub więcej
zmodyfikowanych wiązań. W dalszych wykonaniach,
oligonukleotyd immunostymulujący zawiera jedno lub
więcej wiązań fosforotionianowych. W niektórych
15 wykonaniach, wszystkimi międzynukleotydowymi wiązaniami
oligonukleotydu są wiązania fosforotionianowe. W innych
wykonaniach, immunostymulujący oligonukleotyd zawiera
co najmniej jeden lipofilowy podstawiony analog
nukleotydu i dinukleotyd pirymidyna-puryna. W
20 niektórych wykonaniach, szczepionka jest sporządzana do
podawania. W dalszych wykonaniach, szczepionka jest
sporządzana do podawania drogą pozajelitową, gdzie
droga pozajelitowa jest domięśniowa, podskórna,
śródskórna, dożylna lub dootrzewnowa. W jeszcze innych
25 wykonaniach, szczepionka jest sporządzana do podawania
drogą miejscową, gdzie drogą miejscową jest skóra,
droga przezskórna lub powierzchnia śluzówki. W dalszych
wykonaniach, droga śluzówkowa jest doustna, donosowa,
dopochwowa, doodbytnicza, dopoliczkowa lub dooczna.
30 [0009] W niektórych aspektach wynalazku, sposób
indukowania odpowiedzi immunologicznej swoistej dla
7
antygenu u osobnika potrzebującego takiego leczenia

obejmuje podawanie osobnikowi antygenu i
oligonukleotydu immunostymulującego zawierającego
sekwencję nukleotydową NR ID. SEKW.: 1 w ilości
5 skutecznej do indukowania swoistej dla antygenu
odpowiedzi immunologicznej u tego osobnika. W pewnych
wykonaniach antygenem jest antygen drobnoustrojowy,
autoantygen lub substancja uzależniająca. W dalszych
wykonaniach antygenem drobnoustrojowym jest antygen
10 bakteryjny, antygen wirusowy lub antygen pasożytniczy.
W dalszych wykonaniach, antygen bakteryjny jest
związany ze Staphylococcus aureus albo antygen
próchnicę zębów. W kolejnych wykonaniach, bakterią jest
15 Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus,
Actinomyces viscosus. W innych wykonaniach, antygen
chorobę przyzębia. W dalszych wykonaniach, bakterią
20 jest Porphyromonas gingivalis lub Actinobacillus
actinomycetemcomitans. W niektórych wykonaniach,
antygen wirusowy jest związany z syncytialnym wirusem
oddechowym (RSV), wirusem opryszczki pospolitej 1,
wirusem opryszczki pospolitej 2, ludzkim wirusem
25 niedoboru odporności 1 (HIV-1) lub HIV-2. W innych
wykonaniach antygen pasożytniczy jest związany z
pasożytem, który powoduje malarię. W niektórych
wykonaniach, autoantygenem jest antygen nowotworowy,
antygen związany z chorobą Alzheimera, antygen wobec
30 ludzkiego przeciwciała lub antygen, który ulega
ekspresji z ludzkich endogennych elementów
8
retrowirusowych. W dalszych wykonaniach, antygenem

nowotworowym jest HER2, MAGE, NY-ESO, PSA, CEA lub
wariantowa forma EGFR. W innych wykonaniach, gdzie
antygen jest związany z chorobą Alzheimera, antygenem
5 jest tau lub β-amyloid. W niektórych wykonaniach
antygenem jest IgE. W niektórych wykonaniach antygenem
jest hapten nikotynowy sprzężony z nośnikiem. W
dalszych wykonaniach, nośnikiem, z którym sprzężony
jest hapten nikotynowy, jest toksyna błonicy (DT). W
10 innych wykonaniach, antygenem jest peptyd,
rekombinowane białko, oczyszczone białko, cały zabity
patogen, żywy, atenuowany wirus lub wektor wirusowy,
żywe atenuowane bakterie lub wektor bakteryjny,
polisacharyd, hapten, lub antygen jest kodowany przez
15 plazmidowy DNA.
[0010] W niektórych wykonaniach, antygen jest
sprzężony z nośnikiem. W innych wykonaniach, nośnikiem
jest toksyna błonicy (DT). W innych wykonaniach,
nośnikiem jest cząstka wirusopodobna. W dalszych
20 wykonaniach, cząstką wirusopodobną jest fag RNA Q-β,
antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B
(HBsAg) lub antygen rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby
typu B (HBcAg). W niektórych wykonaniach, szczepionka
zawiera ponadto jeden lub kilka adiuwantów. W dalszych
25 wykonaniach, adiuwantem jest agonista receptora Toll-
podobnego (TLR), którym nie jest TLR 9. W innych
wykonaniach, agonista jest dla TLR 3. W dalszych
wykonaniach, agonistą TLR 3 jest stabilizowany poli
I:C. W niektórych wykonaniach, agonista jest dla TLR 4.
30 W dalszych wykonaniach, agonistą TLR 4 jest pochodna
lipopolisacharydu (LPS). W jeszcze dalszych
9
wykonaniach, pochodną LPS jest MPL lub GLA. W innych

wykonaniach, agonista jest dla TLR 5. W dalszych
wykonaniach, agonistą TLR 5 jest flagelina. W
niektórych wykonaniach, agonista jest dla TLR 7 albo 8.
5 W dalszych wykonaniach, agonistą TLR 7 albo 8 jest mała
cząsteczka z rodziny imidazochinoliny. W innych
wykonaniach, adiuwantem jest sól glinu. W dalszych
wykonaniach, solą glinu jest wodorotlenek glinu. W
niektórych wykonaniach, adiuwantem jest kompleks
10 immunostymulujący (ISCOM). W innych wykonaniach,
adiuwantem jest emulsja olej-w-wodzie lub woda-w-oleju.
W niektórych wykonaniach, adiuwantem jest liposom. W
innych wykonaniach, adiuwantem jest system
dostarczania. W dalszych wykonaniach, układem
15 dostarczania jest nanocząstka lub mikrocząstka.
[0011] W niektórych wykonaniach oligonukleotyd
immunostymulujący zawiera jedno lub więcej
zmodyfikowanych wiązań. W dalszych wykonaniach,
oligonukleotyd immunostymulujący zawiera jedno lub
20 więcej wiązań fosforotionianowych. W niektórych
wykonaniach, wszystkimi międzynukleotydowymi wiązaniami
oligonukleotydu są wiązania fosforotionianowe. W innych
wykonaniach, oligonukleotyd immunostymulujący zawiera
co najmniej jeden lipofilowy podstawiony analog
25 nukleotydu i dinukleotyd pirymidyna-puryna. W
niektórych wykonaniach, antygen i/lub oligonukleotyd
immunostymulujący jest sporządzany do podawania. W
dalszych wykonaniach, antygen i/lub oligonukleotyd
immunostymulujący jest sporządzany do podawania drogą
30 pozajelitową, gdzie droga pozajelitowa jest
domięśniowa, podskórna, śródskórna, dożylna lub
10
dootrzewnowa. W jeszcze innych wykonaniach, szczepionka

jest sporządzana do podawania drogą miejscową, gdzie
drogą miejscową jest skóra, droga przezskórna lub
powierzchnia śluzówki. W dalszych wykonaniach, droga
5 śluzówkowa jest doustna, donosowa, dopochwowa,
doodbytnicza, dopoliczkowa lub dooczna. W niektórych
wykonaniach, antygen i oligonukleotyd immunostymulujący
są podawane tymi samymi, podobnymi albo różnymi
drogami. W innych wykonaniach antygen i oligonukleotyd
10 immunostymulujący są podawane łącznie, równocześnie lub
oddzielnie. W dalszych wykonaniach, oligonukleotyd
immunostymulujący i antygen podaje się w ciągu 24
godzin po sobie. W niektórych wykonaniach, osobnikiem
jest gatunek leczony przez medycynę weterynaryjną. W
15 innych wykonaniach, osobnikiem jest osobnik nie będący
gryzoniem. W niektórych wykonaniach, osobnikiem jest
człowiek.
OPIS FIGUR
20
[0012]
Fig. 1: Zwiększenie humoralnej odpowiedzi

immunologicznej u myszy. Dorosłe (w wieku 6-8 tyg.
25 n=10/gp) myszy immunizowano 1 g HBsAg (panel po lewej
stronie) lub 20 g OVA (panel po prawej stronie) bez
adiuwanta lub łącznie z CPG 24555, 10103 lub 7909 (10
g) albo kontrolnym ODN bez CpG 2137 (10 g; tylko z
OVA). Osocze po 2 tygodniach (dla HBsAg) lub 1 tygodniu
30 (dla OVA) po ostatnim szczepieniu przypominającym
badano pod kątem poziomów swoistej dla antygenu
11
całkowitej IgG, IgG1 i IgG2a/c (anty-HBs i anty-OVA).

Każdy słupek reprezentuje średnią geometryczną (± SEM)
mian dla całkowitej IgG. Miana zostały określone jako
najwyższe rozcieńczenie skutkujące wartością
5 absorbancji dwa razy w stosunku do osocza bez
immunizacji, z wartością odcięcia 0,05. Liczby powyżej
każdego słupka reprezentują stosunek IgG2a (lub 2c)
swoistej dla antygenu/IgG1.
10 Fig. 2: Natura humoralnej odpowiedzi

immunologicznej indukowanej u myszy. Dorosłe (w wieku
6-8 tyg. n=10/gp) myszy immunizowano 1 g HBsAg (panel
po lewej stronie) lub 20 g OVA (panel po prawej
stronie) bez adiuwanta lub łącznie z CPG 24555, 10103
15 lub 7909 (10 g) albo kontrolnym ODN bez CpG 2137 (10
g; tylko z OVA). Osocze po 2 tygodniach (dla HBsAg)
lub 1 tygodniu (dla OVA) po ostatnim szczepieniu
przypominającym badano pod kątem poziomów IgG1 (jasne
słupki) i IgG2a lub IgG2c (czarne słupki) przeciw HBsAg
20 (anty-HBs) lub OVA (anty-OVA). Każdy słupek
reprezentuje średnią geometryczną (± SEM) miana
rozcieńczenia w punkcie końcowym w teście ELISA dla
całej grupy (n=10). Miana zostały określone jako
najwyższe rozcieńczenie skutkujące wartością
25 absorbancji dwa razy w stosunku do osocza bez
immunizacji, z wartością odcięcia 0,05.
Fig. 3: Odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T

indukowane u myszy. Dorosłe (w wieku 6-8 tyg. n=5/gp)
30 myszy immunizowano 1 g HBsAg (panel po lewej stronie)
lub 20 g OVA (panel po prawej stronie) bez adiuwanta
12
lub łącznie z CPG 24555, 10103 lub 7909 (10 g) albo
kontrolnym ODN bez CpG 2137 (10 g; tylko z OVA).
Splenocyty po 2 tygodniach (dla HBsAg) lub 1 tygodniu
(dla OVA) po ostatniej dawce przypominającej badano pod
5 kątem swoistych dla antygenu odpowiedzi CTL przy użyciu
51
standardowego testu uwalniania Cr.
Fig. 4: Brak wzmocnienia odpowiedzi CTL, w której

pośredniczy CpG, u myszy z brakiem TLR9. Dorosłe (w
10 wieku 6-8 tyg.; n=5/gp) myszy z brakiem TLR9
immunizowano 20 g OVA bez adiuwanta lub łącznie z CPG
24555, 10103 lub 7909 (10 g) albo kontrolnym ODN bez
CpG 2137 (10 g). Splenocyty po 1 tygodniu po
mostatniej dawce przypominającej badano pod kątem
15 swoistych wobec OVA odpowiedzi CTL przy użyciu
51
standardowego testu uwalniania Cr.
Fig. 5: Swoiste wobec OVA komórki T CD8 u myszy

typu dzikiego vs z brakiem TLR9. Dorosłe (w wieku 6-8
20 tyg.; n=5/gp) myszy typu dzikiego i z brakiem TLR9
CpG 2137 (10 g). Splenocyty po 1 tygodniu po ostatniej
dawce przypominającej badano pod kątem swoistych wobec
25 OVA komórek T CD8 przy zastosowaniu tetramerów MHC
klasy I H-2Kb-SIINFEKL.
Fig. 6: Swoiste dla antygenu wydzielanie IFN- u

myszy. Dorosłe (w wieku 6-8 tyg. n=5/gp) myszy
30 immunizowano 1 g HBsAg (panel po lewej stronie) lub 20
13
g OVA (panel po prawej stronie) bez adiuwanta lub

łącznie z CPG 24555, 10103 lub 7909 (10 g) albo
kontrolnym ODN bez CpG 2137 (10 g; tylko z OVA).
Splenocyty po 2 tygodniach (dla HBsAg) lub 1 tygodniu
5 (dla OVA) po ostatniej dawce przypominającej
stymulowano odpowiednim antygenem jak pokazano na
figurach przez 72 h i nadsącza hodowlane badano pod
kątem IFN- przy zastosowaniu testu ELISA.
10 Fig. 7: Brak wzmocnienia w swoistym dla antygenu

wydzielaniu IFN- u myszy z brakiem TLR9. Dorosłe (w
wieku 6-8 tyg.; n=5/gp) myszy z brakiem TLR9
15 CpG 2137 (10 g). Splenocyty po 1 tygodniu po ostatniej
dawce przypominającej stymulowano OVA w stężeniach 0;
0,5 i 1 mg/ml w ciągu 72 godzin i nadsącza hodowlane
badano pod kątem IFN- przy zastosowaniu testu ELISA.
20 Fig. 8: Swoiste dla antygenu populacje komórek T

wydzielające wiele cytokin u myszy. Dorosłe (w wieku 6-
8 tyg.; n=5/gp) myszy immunizowano 1 g HBsAg, samym
lub łącznie z CPG 24555, 10103 lub 7909 (10 g).
Splenocyty po 2 tygodniach po dawce przypominającej
25 stymulowano ponownie antygenem HBsAg (dla CD4) albo
peptydem HBs klasy I (dla CD8) i populacje komórek T
CD4 (panel A) i CD8 (panel B) wydzielające IFN-, TNF-α
i/lub IL-2 określano ilościowo przy zastosowaniu
cytometrii przepływowej.
30
14
Fig. 9: Wrodzona odporność w ludzkich PBMC.

Ludzkie PBMC (5x106/ml) inkubowano przy zastosowaniu
różnych stężeń CPG 10103, CPG 24555 lub kontrolnego ODN
bez CpG 22881 przez 24 lub 48 h. Nadsącza komórkowe
5 zbierano i testowano pod kątem wydzielania
cytokin/chemokin przy zastosowaniu dostępnego handlowo
zestawu ELISA. Fig. 9A przedstawia wydzielanie IFN-α,
MCP-1 i IP-10. Fig. 9B przedstawia wydzielanie IL-6,
IL-10 i IL-2R.
10
Fig. 10: Wrodzona odporność in vivo u myszy
BALB/c. Myszom BALB/c (n=5/grupę) wstrzyknięto
podskórnie PBS (kontrola-placebo), CPG 24555, CPG 10103
lub kontrolnego ODN bez CpG 2137 w dawce 100 g. Od
15 zwierząt pobierano krew 3 godziny po wstrzyknięciu i
osocze badano pod kątem IP-10 (Fig. 10A) i IL-12 (Fig.
10B) i IL-6 (Fig. 10C), przy zastosowaniu komercyjnie
dostępnego testu ELISA.
20 Fig. 11: Odporność humoralna in vivo u myszy

BALB/c. Myszy BALB/c immunizowano domięśniowo HBsAg (1
g) ± CPG 24555 lub 10103 (10 g), OVA (20 g) ± CPG
24555 lub 10103 (10 g) albo HA grypy A z Teksas 1/77,
H3N2 (1 g) + ałun (25 g Al3+) ± CPG 24555 lub 10103
25 (10 g). Myszy immunizowano w dniach 0. i 14. (HBsAg),
w dniach 0., 7. i 21. (OVA) lub tylko w dniu 0. (HA).
Fig. 11A pokazuje miana całkowitej IgG swoistej wobec
HBsAg po 2 tygodniach po szczepieniu przypominającym
mierzone przy zastosowaniu testu ELISA w punkcie
30 końcowym. Fig. 11B pokazuje miana całkowitej IgG
swoistej wobec OVA po 1 tygodniu po dawce
15
przypominającej. Fig. 11C pokazuje kinetykę całkowitej

IgG swoistej wobec HA w różnych czasach po immunizacji
mierzoną przy zastosowaniu testu ELISA w punkcie
końcowym.
5
Fig. 12: Odpowiedzi komórek T u myszy BALB/c.
Myszom BALB/c wstrzykiwano domięśniowo HBsAg (1 g) z
lub bez CPG ODN 2455, CPG 10103 lub kontrolnego ODN bez
CpG 2137 w ilości 10 g. Myszy dostawały zastrzyk w
10 dniach 0. i 14. Fig. 12A pokazuje CTL swoiste dla HBsAg
51
mierzone poprzez uwalnianie Cr po 2 tygodniach po
dawce przypominajacej. Myszom C57BL/6 wstrzyknięto
domięśniowo OVA (20 g) z lub bez CPG ODN 2455, CPG
10103 lub kontrolnego ODN bez CpG 2137, w ilości 10 g.
15 Myszy dostawały zastrzyk w dniach 0.; 7. i 21. Fig. 12B
pokazuje CTL swoistą dla OVA mierzoną poprzez
51
uwalnianie Cr po 1 tygodniu po ostatniej dawce
przypominajacej.
20 Fig. 13: Odpowiedzi komórek T u myszy BALB/c.

Myszom BALB/c wstrzykiwano domięśniowo HBsAg (1 g) z
lub bez CPG ODN 2455, CPG 10103 lub kontrolnego ODN bez
CpG 2137, w ilości 10 g. Myszy dostawały zastrzyk w
dniach 0. i 14. Splenocyty z 2 tygodnia po dawce
25 przypominajacej inkubowano z odpowiednim antygenem
przez 72 godzin i nadsącza hodowlane badano pod kątem
IFN- przy zastosowaniu testu ELISA (Fig. 13A). Myszom
C57BL/6 wstrzykiwano domięśniowo OVA (20 g) z lub bez
CPG ODN 2455, CPG 10103 lub kontrolnego ODN bez CpG
30 2137, w ilości 10 g. Myszy dostawały zastrzyk w dniach
16
0.; 7. i 21. Splenocyty z 1 tygodnia po ostatniej dawce

przypominajacej inkubowano z odpowiednim antygenem
przez 72 godzin i nadsącza hodowlane badano pod kątem
IFN- przy zastosowaniu testu ELISA (Fig. 13B).
5
Fig. 14: Przeciwciała anty-HA w 6 tygodniu po
immunizacji. Samice myszy BALB/c immunizowano HA (1 g)
± ODN CpG lub kontrolny ODN (10 g) ± ałun (25 g Al3+)
w całkowitej objętości 50 l. Ilość przeciwciał anty-HA
10 mierzono w 6 tygodniu po szczepieniu.
Fig. 15: Miana hamowania hemaglutynacji (HIA) w 4

tygodniu po immunizacji. Funkcjonalność przeciwciał
badano stosując test hamowania hemaglutynacji (HIA ang.
15 hemagglutination inhibition assay). Mierzono zdolność
do zwiększania mian HIA, samodzielnie lub w łącznie z
ałunem.
Fig. 16: Swoiste dla HA wydzielanie IFN. Samice

20 myszy BALB/c immunizowano HA (1 g) ± ODN CpG lub
kontrolny ODN (10 g) ± ałun (25 g Al3 +) w całkowitej
objętości 50 l. Splenocyty pobrane 6 tygodni po
immunizacji użyto do oznaczenia swoistego dla antygenu
wydzielania IFN-.
25
Fig. 17: Odpowiedzi humoralne u naczelnych innych
niż człowiek. Makaki jawajskie (3-5 lat; n=5 na grupę)
immunizowano Engerix-B (10 g HBsAg, 250 g Al3+),
samym lub łącznie z 0,5 mg CPG 7909 lub CPG 24555
30 poprzez wstrzyknięcie domięśniowe w tygodniach 0., 4. i
17
8. Zwierzętom pobierano krew w regularnych odstępach

czasu i miana przeciwciał swoistych wobec HBsAg
mierzono przy zastosowaniu dostępnych w handlu zestawów
(MONOLISA™ anty-HBS).
5
8. Osocze z 4 tygodnia po 2. immunizacji i 2 tygodnie
po 3. immunizacji badano pod kątem zachłanności
przeciwciała przy zastosowaniu metody wymywania
tiocyjanianem sodowym.
15
8. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC, ang.
Peripheral blood mononuclear cells) przed szczepieniem
i w kilku punktach czasowych po szczepieniu badano pod
kątem swoistego dla HBsAg wewnątrzkomórkowego
25 wydzielania cytokin z udziałem komórek T CD4 przy
zastosowaniu cytometrii przepływowej. Fig. 19A
przedstawia wydzielanie IFN-. Fig. 19B przedstawia
wydzielanie IL-2. Fig. 19C przedstawia wydzielanie TNF-
α.
30
18
Fig. 20: Odpowiedzi komórek T: wielofunkcyjne

komórki T CD4; Analiza ilościowa. Makaki jawajskie (3-5
lat; n=5 na grupę) immunizowano Engerix-B (10 g HBsAg,
250 g Al3+), samym lub łącznie z 0,5 mg CPG 7909 lub
5 CPG 24555 poprzez wstrzyknięcie domięśniowe w
tygodniach 0., 4. i 8. Komórki jednojądrzaste krwi
obwodowej (PBMC) z 2 tygodnia po 3. immunizacji badano
pod kątem swoistych dla HBsAg komórek T CD4
wydzielających jedną, dwie lub trzy cytokiny, przy
10 zastosowaniu cytometrii przepływowej. Fig. 20A pokazuje
liczbę swoistych dla HBsAg komórek T CD4 wydzielających
jedną, dwie lub trzy cytokiny na milion analizowanych
komórek T CD4. Fig. 20B przedstawia proporcję komórek T
wydzielających jedną, dwie lub trzy cytokiny, w obrębie
15 całej populacji komórek T CD4 swoistych dla HBsAg.
Fig. 21: Odpowiedzi komórek T: wielofunkcyjne

komórki T CD4; Analiza jakościowa. Mierzono liczbę
komórek wydzielających IL-2, IFN- i TNF lub
20 kombinacje tych cytokin. Makaki jawajskie (3-5 lat; n=5
na grupę) immunizowano Engerix-B (10 g HBsAg, 250 g
Al3+), samym lub w łącznie z 0,5 mg CPG 7909 lub CPG
24555, poprzez wstrzyknięcie domięśniowe w tygodniach
0., 4. i 8. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej
25 (PBMC) z 2 tygodnia po 3. immunizacji badano pod kątem
liczby swoistych dla HBsAg komórek T CD4 wydzielających
IL-2, IFN- i TNF- lub kombinacje tych cytokin, przy
zastosowaniu cytometrii przepływowej.
30
19
OPIS SEKWENCJI
[0013]
5 NR ID. SEKW.: 1 - sekwencja nukleotydowa

oligonukleotydu immunostymulującego ODN CPG 24555.
NR ID. SEKW.: 2 - sekwencja nukleotydowa
oligonukleotydu immunostymulującego CPG 10103.
10 oligonukleotydu immunostymulującego CPG 7909.
oligonukleotydu bez CpG 22881.
oligonukleotydu bez CpG 2137.
15
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
[0014] Aspekty wynalazku są oparte, w części, na

zaskakującym odkryciu, że usunięcie motywu CpG z
20 oligonukleotydu immunostymulującego nie ma negatywnego
wpływu na zdolność oligonukleotydu immunostymulującego
do zwiększania swoistych dla antygenu odpowiedzi
immunologicznych. Stwierdzono również, ku zaskoczeniu,
że usunięcie tego motywu CpG umożliwia wytwarzanie
25 populacji komórek T swoistych dla antygenu, która jest
inna. Konkretnie, stwierdzono, że ta populacja komórek
T swoistych dla antygenu zawiera więcej komórek T
wydzielających IFN-gamma i więcej wielofunkcyjnych
komórek T.
30 [0015] W aspektach wynalazku, oligonukleotyd
immunostymulujący ma sekwencję kwasu nukleinowego 5'
20
TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (ODN CPG 24555; NR ID. SEKW.:

1). Sekwencja kwasu nukleinowego oligonukleotydu
immunostymulującego o NR ID. SEKW.: 1 różni się od
wcześniej opisanego oligonukleotydu immunostymulującego
5 (ODN 10103) 5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (NR ID. SEKW.:
2) odwróceniem dinukleotydu CG najbardziej skrajnego po
stronie 3’. Podobieństwo w aktywności pomiędzy dwoma
oligonukleotydami immunostymulującymi jest zaskakujące,
ponieważ donoszono wcześniej, że aktywność
10 immunostymulująca oligonukleotydów CpG jest zależna od
liczby motywów CpG, sekwencji flankujących dinukleotyd
CG, położenia motyw(ów) CpG i odstępu między motywami
CpG (Ballas i wsp., 1996, J. Immunol. 157(5): 1840-5;
Hartmann i wsp., 2000, J. Immunol., 164(3): 1617-24;
15 Klinman i wsp., 2003, Clin. Exp. Immunol., 133(2): 227-
32). Usunięcie dinukleotydu CG najbardziej skrajnego po
stronie 3’ w oligonukleotydzie immunostymulującym CPG
ODN 24555 (NR ID. SEKW.: 1) nie miało negatywnego
wpływu na zdolność tego oligonukleotydu
20 immunostymulującego do zwiększania swoistej antygenowo
odpowiedzi immunologicznej, jak można by się spodziewać
z poprzednich ujawnień. CPG ODN 24555 wykazywał
podobną, a w niektórych przypadkach zwiększoną
aktywność immunostymulującą w porównaniu z CPG ODN
25 10103.
[0016] Ponadto stwierdzono, że CPG ODN 24555 indukuje
inną populację komórek T swoistych dla antygenu w
porównaniu z CPG ODN 10103 (patrz Fig. 8, Tabela 1 i
Tabela 2). Konkretnie, stwierdzono, ku zaskoczeniu, że
30 populacja komórek T swoista dla antygenu (zwłaszcza
populacja komórek T CD4+ swoistych dla antygenu)
21
wytworzona z użyciem CPG ODN 24555 jako adiuwanta

zawierała więcej komórek T wydzielających IFN-gamma i
więcej wielofunkcyjnych komórek T w porównaniu do
populacji komórek T swoistych dla antygenu wytworzonej
5 przy zastosowaniu CPG ODN 10103 lub CPG ODN 7909.
[0017] Na przykład uzyskiwano większą proporcję
komórek T CD4+ swoistych dla antygenu wytwarzających
IFN- w porównaniu do populacji komórek T CD4+
swoistych dla antygenu uzyskaną przy zastosowaniu CPG
10 ODN 10103. Uzyskiwano również większą proporcję
wielofunkcyjnych komórek T CD4+ swoistych dla antygenu
wytwarzających zarówno IFN- jak i TNF-α, zarówno IFN-
jak i IL-2 albo zarówno TNF-α jak i IL-2, a nawet
potrójnych producentów wydzielających IFN-, TNF-α i
15 IL-2 w porównaniu do populacji komórek T CD4+ swoistych
dla antygenu uzyskaną przy zastosowaniu CPG ODN 10103
lub CPG ODN 7909. Uzyskiwano większą proporcję komórek
T CD8+ swoistych dla antygenu wytwarzających TNF-α w
porównaniu do populacji swoistych dla antygenu komórek
20 T CD8+ uzyskaną przy zastosowaniu CPG ODN 10103.
Uzyskiwano również większą proporcję wielofunkcyjnych
komórek T CD8+ swoistych dla antygenu wytwarzających
zarówno IFN- jak i TNF-α, zarówno IFN- jak i IL-2
albo zarówno TNF-α jak i IL-2, a nawet potrójnych
25 producentów wydzielających IFN-, TNF-α i IL-2 w
porównaniu do populacji komórek T CD8+ swoistych dla
antygenu uzyskaną przy zastosowaniu CPG ODN 10103 lub
CPG ODN 7909.
[0018] Znaczenie wielofunkcyjności komórek T w
30 immunogenności zostało ostatnio podkreślone.
Konkretnie, wielofunkcyjność komórek T swoistych dla
22
antygenu pod względem wytwarzania chemokin (takich jak

IFN-, TNF-α i IL-2) skorelowano w niektórych
przypadkach z ich potencjałem ochronnym (patrz np.
Harari A, i wsp., Immunol Rev. 2006;211:236-54,
5 Makedonas G and Betts MR. Springer Semin Immunopathol.
2006;28(3):209-19, Precopio ML i wsp., J Exp Med. 2007
204(6):1405-16, Xu R i wsp. Vaccine. 2008; 26(37):4819-
29), uważanym za będący wynikiem ich lepszej funkcji
efektorowej w porównaniu do komórek T, które wydzielają
10 tylko jedną cytokinę.
[0019] CPG ODN 24555 korzystnie umożliwia wytwarzanie
populacji wielofunkcyjnych komórek T swoistych dla
antygenu, kiedy jest stosowany jako adiuwant, co może
mieć istotne znaczenie przy projektowaniu szczepionki.
15 [0020] Immunostymulujące kwasy nukleinowe mogą być
dwuniciowe lub jednoniciowe. Generalnie, cząsteczki
dwuniciowe są bardziej stabilne in vivo, natomiast
cząsteczki jednoniciowe mają zwiększoną aktywność
immunologiczną. W pewnych aspektach wynalazku,
20 korzystne jest, aby kwas nukleinowy był jednoniciowy, a
w innych aspektach korzystne jest, aby kwas nukleinowy
był dwuniciowy.
[0021] Terminy „kwas nukleinowy” i „oligonukleotyd” są
tu stosowane się zamiennie w znaczeniu wielu
25 nukleotydów (tj. cząsteczek zawierających cukier (np.
rybozę lub dezoksyrybozę) połączoną z grupą fosforanową
i wymienną zasadą organiczną, którą jest albo
podstawiona pirymidyna (np. cytozyna (C), tymidyna (T)
lub uracyl (U)) albo podstawiona puryna (na przykład
30 adenina (A) lub guanina (G)). Tak jak są tu stosowane,
terminy te odnoszą się do oligodeoksyrybonukleotydów,
23
oligorybonukleotydów (tj. polinukleotyd minus fosforan)

oraz dowolnego innego polimeru zawierającego zasadę
organiczną. Cząsteczki kwasu nukleinowego można
otrzymać z dostępnych źródeł kwasów nukleinowych (na
5 przykład genomowego lub cDNA), lecz są korzystnie
syntetyczne (na przykład, wytwarzane na drodze syntezy
kwasu nukleinowego).
[0022] W aspektach wynalazku, oligonukleotydy
immunostymulujące mogą zawierać różne modyfikacje i
10 podstawienia chemiczne w porównaniu do naturalnego RNA
i DNA, obejmujące międzynukleozydowy mostek
fosfodiestrowy, jednostkę β-D-rybozy i/lub naturalną
zasadę nukleozydową (adenina, guanina, cytozyna,
tymina, uracyl). Przykłady modyfikacji chemicznych są
15 znane specjalistom w tej dziedzinie i są opisane, na
przykład w Uhlmann E. i wsp. (1990), Chem. Rev. 90:543;
„Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis
and Properties & Synthesis and Analytical Techniques,
S. Agrawal, Red., Humana Press, Totowa, USA 1993;
20 Crooke, S.T. i wsp. (1996) Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 36:107-129; oraz Hunziker J. i wsp., (1995),
Mod. Synth. Methods 7:331-417. Oligonukleotyd według
wynalazku może mieć jedną lub więcej modyfikacji, gdzie
każda modyfikacja znajduje się w konkretnym
25 fosfodiestrowym mostku międzynukleozydowym i/lub w
konkretnej jednostce β-D-rybozy i/lub w konkretnej
pozycji zasady naturalnego nukleozydu, w porównaniu do
oligonukleotydu o tej samej sekwencji, który składa się
z naturalnego DNA lub RNA.
30 [0023] W aspektach wynalazku, oligonukleotydy mogą
zawierać jedną lub więcej modyfikacji. Takie
24
modyfikacje mogą być wybrane spośród: a) zastąpienia

fosfodiestrowego mostka międzynukleozydowego
znajdującego się na końcu 3' i/lub 5' nukleozydu przez
zmodyfikowany mostek międzynukleozydowy, b) zastąpienia
5 fosfodiestrowego mostka znajdującego się na końcu 3'
i/lub 5' nukleozydu przez mostek defosfo, c)
zastąpienia jednostki ze szkieletu cukrowo-
fosforanowego przez inną jednostkę, d) zastąpienia
jednostki β-D-rybozy przez zmodyfikowaną jednostkę
10 cukrową oraz e) zastąpienia naturalnej zasady
nukleozydowej.
[0024] Kwasy nukleinowe obejmują również podstawione
puryny i pirymidyny, takie jak C-5 propinopirymidyna i
zmodyfikowane zasady: puryny podstawione 7-deaza-7-
15 (Wagner i wsp., 1996, Nat. Biotechnol. 14:840-4).
Puryny i pirymidyny obejmują, ale nie ograniczają się
do tego, adeninę, guaninę, cytozynę, tymidynę, 5-
metylocytozynę, 2-aminopurynę, 2-amino-6-chloropurynę,
2,6-diaminopurynę, hipoksantynę i inne występujące
20 naturalnie i niewystępujące naturalnie zasady
nukleinowe, podstawione i niepodstawione ugrupowania
aromatyczne. Inne takie modyfikacje są dobrze znane
specjalistom w tej dziedzinie.
[0025] Zmodyfikowaną zasadą jest dowolna zasada, która
25 jest chemicznie różna od występujących naturalnie
zasad, znajdujących się typowo w DNA i RNA, takich jak
T, C, G, A i U, ale które mają wspólne podstawowe
struktury chemiczne z tymi w zasadach występujących
naturalnie. Zmodyfikowana zasada nukleozydowa może być,
30 na przykład, wybrana z hipoksantyny, dihydrouracylu,
pseudouracylu, 2-tiouracylu, 4-tiouracylu, 5-
25
aminouracylu, 5-(C1-C6)-alkilouracylu, 5-(C2-C6)-

alkenylouracylu, 5-(C2-C6)-alkinyloluracylu, 5-
(hydroksymetylo)uracylu, 5-chlorouracylu, 5-
fluorouracylu, 5-bromouracylu, 5-hydroksycytozyny, 5-
5 (C1-C6)-alkilocytozyny, 5-(C2-C6)-alkenylocytozyny, 5-
(C2-C6)-alkilnylocytozyny, 5-chlorocytozyny, 5-
fluorocytozyny, 5-bromocytozyny, N2-dimetyloguaniny,
2,4-diamino-puryny, 8-azapuryny, podstawionej 7-
deazapuryny, korzystnie 7-deaza-7-podstawionej puryny
10 i/lub 7-deaza-8-podstawionej puryny, 5-
hydroksymetylocytozyny, N4-alkilocytozyny (np. N4-
etylocytozyny), 5-hydroksydeoksycytydyny, 5-
hydroksymetylodeoksycytydyny, N4-alkilodeoksycytydyny
(np. N4-etylodeoksycytydyny), 6-tiodeoksyguanozyny,
15 deoksyrybonukleozydów nitropirolu, C5-
propynylopirymizyny, diaminopuryny (np. 2,6-
diaminopuryny), inozyny, 5-metylocytozyny, 2-
aminopuryny, 2-amino-6-chloropuryny, hipoksantyny lub
innych modyfikacji naturalnej zasady nukleozydowej. Ta
20 lista ma być przykładowa i nie ma być interpretowana
jako ograniczająca.
[0026] W niektórych aspektach wynalazku, korzystne
jest, jeżeli dinukleotydy CpG opisanych tu
oligonukleotydów immunostymulujących w niniejszym
25 dokumencie są niemetylowane. Niemetylowanym motywem CpG
jest niemetylowana sekwencja dinukleotydu cytozyna-
guanina (tj. niemetylowana 5' cytozyna, po której
następuje 3' guanozyna i połączone wiązaniem
fosforanowym). W innych aspektach, motywy CpG są
30 metylowane. Metylowanym motywem CpG jest metylowana
sekwencja dinukleotydu cytozyna-guanina (tj. metylowana
26
5' cytozyna, po której następuje 3' guanozyna i

połączone wiązaniem fosforanowym).
[0027] W niektórych aspektach wynalazku,
oligonukleotyd immunostymulujący może zawierać
5 zmodyfikowaną cytozynę. Zmodyfikowana cytozyna jest
występującym naturalnie lub niewystępującym naturalnie
analogiem zasady pirymidynowej cytozyny, która może
zastąpić tę zasadę bez negatywnego wpływu na działanie
immunostymulujące oligonukleotydu. Zmodyfikowane
10 cytozyny obejmują, ale nie są do tego ograniczone, 5-
podstawione cytozyny (np. 5-metylo-cytozyna, 5-fluoro-
cytozyna, 5-chloro-cytozyna, 5-bromo-cytozyna, 5-jodo-
cytozyna, 5-hydroksy-cytozyna, 5-hydroksymetylo-
cytozyna, 5-difluorometylo-cytozyna oraz niepodstawiona
15 lub podstawiona 5-alkinylo-cytozyna), 6-podstawione
cytozyny, N4-podstawione cytozyny (np. N4-etylo-
cytozyna), 5-aza-cytozynę, 2-merkapto-cytozynę,
izocytozynę, pseudo-izocytozynę, analogi cytozyny z
układem pierścieni skondensowanych (np. N,N’-
20 propylenocytozyna lub fenoksazyna). Niektóre z
korzystnych cytozyn obejmują 5-metylo-cytozynę, 5-
fluoro-cytozynę, 5-hydroksy-cytozynę, 5-hydroksymetylo-
cytozynę oraz N4-etylo-cytozynę. W innym wykonaniu
wynalazku, zasada cytozynowa jest podstawiona przez
25 zasadę uniwersalną (np. 3-nitropirol, P-zasada),
aromatyczny układ pierścieniowy (na przykład
fluorobenzen lub difluorobenzen) lub atom wodoru
(dSpacer). W niektórych aspektach, oligonukleotyd
immunostymulujący może zawierać uracyl i/lub jego
30 pochodne (np. 5-fluoro-uracyl, 5-bromo-uracyl, 5-
27
bromowinylo-uracyl, 4-tio-uracyl, 5-hydroksy-uracyl, 5-

propynylo-uracyl).
[0028] W niektórych aspektach wynalazku,
oligonukleotyd immunostymulujący może zawierać
5 zmodyfikowaną guaninę. Zmodyfikowana guanina jest
występującym naturalnie lub niewystępującym naturalnie
analogiem zasady purynowej guaniny, która może zastąpić
tę zasadę bez negatywnego wpływu na działanie
immunostymulujące oligonukleotydu. Zmodyfikowane
10 guaniny obejmują, ale nie są do tego ograniczone, 7-
deazaguaninę, 7-deaza-7-podstawioną guaninę,
hipoksantynę, N2-podstawione guaniny (np. N2-metylo-
guaninę), 5-amino-3-metylo-3H, 6H-tiazolo [4,5-d]
pirymidyno-2,7-dion, 2,6-diaminopurynę, 2-aminopurynę,
15 purynę, indol, adeninę, podstawione adeniny (np. N6-
metylo-adeninę, 8-okso-adeninę), 8-podstawioną guaninę
(np. 8-hydroksyguaninę lub 8-bromoguaninę) i 6-
tioguaninę. W innym wykonaniu wynalazku, zasada
guaninowa jest podstawiona przez zasadę uniwersalną (na
20 przykład, 4-metylo-indol, 5-nitro-indol lub K-zasadę)
aromatyczny układ pierścieniowy (np. benzimidazol lub
dichloro-benzimidazol, 1-metylo-1H-[1,2,4]triazolo-amid
kwasu 3-karboksylowego) lub atom wodoru (dSpacer).
[0029] W niektórych aspektach, oligonukleotydy mogą
25 zawierać zmodyfikowane wiązania międzynukleotydowe. Te
zmodyfikowane wiązania mogą być częściowo odporne na
degradację (np. są stabilizowane). „Stabilizowana
cząsteczka kwasu nukleinowego” ma oznaczać cząsteczkę
kwasu nukleinowego, która jest stosunkowo odporna na
30 degradację in vivo (np. przez egzo- lub endonukleazy).
Stabilizacja może być funkcją długości lub struktury
28
drugorzędowej. Kwasy nukleinowe, które mają długość

kilkadziesiąt do kilkuset tysięcy par zasad są
stosunkowo odporne na degradację in vivo. W przypadku
krótszych kwasów nukleinowych, struktura drugorzędowa
5 może ustabilizować i zwiększyć ich efekt. Formowanie
się struktury trzonka-pętli może stabilizować
cząsteczkę kwasu nukleinowego. Na przykład, jeżeli
koniec 3' kwasu nukleinowego ma wewnętrzną
komplementarność regionu położonego powyżej tak, że
10 może sfałdować się i utworzyć strukturę trzonka i
pętli, wówczas kwas nukleinowy może stać się stabilny i
wykazuje większą aktywność.
[0030] Stabilizację kwasu nukleinowego można również
uzyskać poprzez modyfikację szkieletu fosforanowego.
15 Oligonukleotydy mające wiązania fosforotionianowe, w
niektórych wykonaniach, mogą dostarczyć maksymalnej
aktywności i chronić oligonukleotyd przed degradacją
przez wewnątrzkomórkowe egzo- i endonukleazy.
[0031] Do stosowania in vivo korzystne jest, jeżeli
20 kwasy nukleinowe są stosunkowo odporne na degradację
(np. przez endo- i egzonukleazy). Wykazano, że
modyfikacja szkieletu kwasu nukleinowego zapewnia
zwiększoną aktywność kwasów nukleinowych przy podawaniu
in vivo. Struktury drugorzędowe, takie jak trzonki i
25 pętle, mogą stabilizować kwasy nukleinowe przed
degradacją. Alternatywnie, stabilizację kwasu
nukleinowego można uzyskać poprzez modyfikację
szkieletu fosforanowego. Korzystny stabilizowany kwas
nukleinowy ma szkielet co najmniej częściowo
30 zmodyfikowany fosforotionianowo. Fosforotioniany mogą
być syntetyzowane przy zastosowaniu technik
29
automatycznych wykorzystujących reakcje chemiczne bądź

z fosforoamidem, bądź z H-fosfonianem. Arylo- i
alkilofosfoniany można wytwarzać na przykład jak
opisano w pat. USA nr 4,469,863; a alkilofosfotriestery
5 (w których reszta zawierającego ładunek tlenu jest
alkilowana, jak to opisano w pat. USA nr 5,023,243 i
europejskim opisie patentowym nr 092,574) można
wytwarzać przy zastosowaniu zautomatyzowanej syntezy w
fazie stałej, z użyciem dostępnych w handlu
10 odczynników. Sposoby dokonywania innych modyfikacji i
podstawień w szkielecie DNA są opisane (Uhlmann, E. i
Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild, J.
(1990) Bioconjugate Chem. 1:165). 2'-O-metylowe kwasy
nukleinowe z motywami CpG mogą również powodować
15 immunoaktywację, tak jak etoksy-modyfikowane kwasy
nukleinowe CpG. Rzeczywiście, nie znaleziono
modyfikacji szkieletu, które całkowicie znoszą efekt
CpG, jakkolwiek jest on wysoce zmniejszany poprzez
zastąpienie C przez 5-metylo C. Konstrukty mające
20 wiązania fosforotionianowe dostarczają maksymalnej
aktywności i chronią kwasy nukleinowe przed degradacją
przez wewnątrzkomórkowe egzo- i endonukleazy. Inne
zmodyfikowane kwasy nukleinowe obejmują kwasy
nukleinowe ze zmodyfikowanym fosfodiestrem, kombinacje
25 kwasu nukleinowego fosfodiestrowego i
fosforotionianowego, metylfosfonian,
metylofosforotionian, fosfororditionian, p-etoksy i ich
kombinacje. Każda z tych kombinacji i ich konkretne
efekty na komórki odpornościowe jest dyskutowany
30 bardziej szczegółowo w odniesieniu do kwasów
nukleinowych CpG w opublikowanych zgłoszeniach
30
patentowych PCT PCT/US95/01570 (WO 96/02555) i

PCT/US97/19791 (WO 98/18810) oraz w patencie USA nr
6,194,388 B1 wydanym 27 lutego, 2001 i patencie USA nr
6,239,116 B1 wydanym 29 maja, 2001. Uważa się, że te
5 zmodyfikowane kwasy nukleinowe mogą wykazywać większą
aktywność stymulacyjną dzięki zwiększonej odporności na
nukleazy, zwiększone pobieranie przez komórki,
zwiększone wiązanie białek i/lub zmienioną lokalizację
komórkową.
10 [0032] Do podawania in vivo, kwas nukleinowy może być
związany z cząsteczką, która daje w rezultacie wyższe
powinowactwo wiązania z powierzchniami komórki
docelowej (np. komórki B, komórki monocytu lub komórki
naturalnego zabójcy (NK)) i/lub zwiększone pobieranie
15 komórkowe przez komórki docelowe z wytworzeniem
„kompleksu dostarczania kwasu nukleinowego”. Kwasy
nukleinowe mogą być jonowo lub kowalencyjnie związane z
odpowiednimi cząsteczkami przy zastosowaniu technik,
które są dobrze znane w tej dziedzinie. Można
20 zastosować rozmaite czynniki łączące (sprzęgające) lub
sieciujące, takie jak białko A, karbodiimid lub N-
sukcynimidylo-3-(2-pirydylditio) propionian (SPDP).
Alternatywnie, kwasy nukleinowe mogą być zamykane w
liposomach lub wirosomach przy zastosowaniu dobrze
25 znanych technik.
[0033] Inne stabilizowane kwasy nukleinowe obejmują,
ale bez ograniczania się do tego, niejonowe analogi
DNA, takie jak alkilo- i arylofosforany (w których
obdarzony ładunkiem tlen w fosfonianie jest zastąpiony
30 przez grupę alkilową lub arylową, fosfodiester i
alkilofosfotriestery, w których obdarzone ładunkiem
31
ugrupowanie tlenowe jest alkilowane. Pokazano również,

że kwasy nukleinowe, które zawierają diol, taki jak
tetraetylenoglikol lub heksaetylenoglikol, na jednym z
lub obydwu końcach, są zasadniczo odporne na degradację
5 przez nukleazy. W niektórych wykonaniach oligonukleotyd
immunostymulujący może zawierać co najmniej jeden
liofilowy podstawiony analog nukleotydu i/lub
dinukleotyd pirymidyna-puryna.
[0034] Oligonukleotydy mogą mieć jeden albo dwa
10 dostępne końce 5'. Możliwe jest wytworzenie
zmodyfikowanych oligonukleotydów mających dwa takie
końce 5', na przykład poprzez połączenie dwóch
oligonukleotydów poprzez wiązanie 3'-3' z wytworzeniem
oligonukleotydu mającego dwa dostępne końce 5'.
15 Wiązanie 3'3'-może być fosfodiestrowe,
fosforotionianowe lub może być dowolnym innym
zmodyfikowanym mostkiem międzynukleotydowym. Sposoby
uzyskiwania takich wiązań są dobrze znane w tej
dziedzinie. Na przykład, takie wiązania zostały opisane
20 w Seliger, H. i wsp., Oligonucleotide analogs with
terminal 3'-3'-and 5'-5'-intemucleotidic linkages as
antisense inhibitors of viral gene expression,
Nucleosides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 oraz
Jiang i wsp., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro
25 and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal
Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.
[0035] Dodatkowo, oligonukleotydy związane 3'-3' gdzie
wiązanie między 3’-końcowymi nukleozydami nie jest
fosfodiestrowe, fosforotionianowe lub nie jest dowolnym
30 innym zmodyfikowanym mostkiem międzynukleozydowym,
można wytworzyć stosując dodatkowy łącznik, taki jak
32
ugrupowanie fosforanu tri- lub tetraetylenoglikolowego

(Durand, M. i wsp., Triple-helix formation by an
oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12
sequences bridged by two hexaetylene glikol chains,
5 Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, patent USA nr
5,658,738 i patent USA nr 5,668,265). Alternatywnie,
nienukleotydowy łącznik może pochodzić z etanodiolu,
propanodiolu lub jednostki bezzasadowej deoksyrybozy
(dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence i wsp., Sterical
10 Recognition by T4 polynucleotide kinase of non-
nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides;
Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) przy
zastosowaniu standardowej fosforamidytowej reakcji
chemicznej. Nienukleotydowe łączniki mogą być włączone
15 raz lub wiele razy albo łączone ze sobą nawzajem
umożliwiając uzyskanie dowolnego pożądanego odstępu
między końcami 3' dwóch oligonukleotydów, które mają
być połączone.
[0036] Fosfodiestrowy mostek międzynukleozydowy
20 znajdujący się na końcu 3' i/lub 5' nukleozydu może być
zastąpiony przez zmodyfikowany mostek
międzynukleozydowy, gdzie zmodyfikowany mostek
międzynukleozydowy jest wybrany na przykład spośród
1 2
fosforotionianu, fosforoditionianu, NR R -
25 fosforamidatu, boranofosforanu, α-
hydroksybenzylofosfonianu, estru fosforano-(C1-C21)-O-
alkilowego, fosforano-[(C6-C12)arylo-(C1-C21)-O-
alkilo]estru, mostków(C1-C8)alkilofosfonianowych i/lub
(C6-C12)arylofonianowych, (C7-C12)-α-hydroksymetylo-arylu
30 (np. jak ujawniono w WO 95/01363), gdzie (C6-C12)aryl,
(C6-C20)aryl i (C6-C14)aryl są ewentualnie podstawione
33
przez halogen, alkil, alkoksy, nitro, cyjano i gdzie R1

i R2 są to, niezależnie od siebie nawzajem, wodór, (C1-
C18)-alkil, (C6-C20)-aryl, (C6-C14)-aryl, (C1-C8)-alkil,
korzystnie, wodór, (C1-C8)-alkil, korzystnie (C1-C4)-
5 alkil i/lub metoksyetyl, albo R1 i R2 tworzą, razem z
niosącym je azotem, 5 lub 6-członowy heterocycliczny
pierścień, który może zawierać dodatkowo dalszy
heteroatom z grupy O, S i N.
[0037] Zastąpienie mostka fosfodiestrowego
10 znajdującego się na końcu 3' i/lub 5' nukleozydu może
być przez mostek defosfo (mostki defosfo są opisane, na
przykład, w Uhlmann E. i Peyman A. w „Methods in
Molecular Biology”, tom 20, „Protocols for
Oligonucleotides and Analogs”, S. Agrawal, Red., Humana
15 Press, Totowa 1993, Rozdział 16, str. 355 ff), gdzie
mostek defosfo jest na przykład wybrany spośród mostków
defosfo z grup formacetalowej, 3'-tioformacetalowej,
metylohydroksylaminowej, oksymowej, metylenodimetyl-
hydrazo, dimetylenosulfonowej i/lub sililowej.
20 [0038] Olignukleotydy immunostymulujące według
wynalazku mogą ewentualnie mieć szkielety chimerowe.
Szkielet chimerowy to taki, który zawiera więcej niż
jeden typ wiązania. W jednym wykonaniu chimerowy
szkielet może być reprezentowany przez wzór: 5'
25 Y1N1ZN2Y2 3'. Y1 i Y2 są cząsteczkami kwasów nukleinowych
mającymi od 1 do 10 nukleotydów. Y1 i Y2, każdy,
zawiera co najmniej jedno zmodyfikowane wiązanie
międzycząsteczkowe. Ponieważ co najmniej 2 nukleotydy
oligonukleotydów chimerowych zawierają modyfikacje
30 szkieletu, te kwasy nukleinowe są przykładem typu
34
stabilizowanych immunostymulujących kwasów

nukleinowych.
[0039] Co się tyczy oligonukleotydów chimerowych, Y1 i
Y2 są uważane za niezależne jeden od drugiego. To
5 oznacza, że każdy z Y1 i Y2 może mieć albo może nie
mieć różnych sekwencji i różnych wiązań szkieletowych
względem siebie w tej samej cząsteczce. W niektórych
wykonaniach, Y1 i/lub Y2 mają od 3 do 8 nukleotydów. N1
i N2 są cząsteczkami kwasów nukleinowych mającymi od 0
10 do 5 nukleotydów, o ile N1ZN2 ma ogółem co najmniej 6
nukleotydów. Nukleotydy N1ZN2 mają szkielet
fosfodiestrowy i nie zawierają kwasów nukleinowych
mających zmodyfikowany szkielet. Z jest motywem
immunostymulującego kwasu nukleinowego, korzystnie
15 wybranym spośród przytoczonego tu immunostymulującego
oligonukleotydu.
[0040] Środkowe nukleotydy (N1ZN2) ze wzoru Y1N1ZN2Y2
mają fosfodiestrowe wiązania międzynukleotydowe, a Y1 i
Y2 mają co najmniej jeden, ale mogą mieć więcej niż
20 jeden albo mogą mieć wszystkie wiązania
międzynukleotydowe zmodyfikowane. W korzystnych
wykonaniach, Y1 i/lub Y2 mają co najmniej dwa lub od
dwóch do pięciu zmodyfikowanych wiązań
międzynukleotydowych albo Y1 ma pięć zmodyfikowanych
25 wiązań międzynukleotydowych, a Y2 ma dwa zmodyfikowane
wiązania międzynukleotydowe. Zmodyfikowanym wiązaniem
międzynukleotydowym, w niektórych wykonaniach, jest
fosforotionianowe zmodyfikowane wiązanie,
fosforoditionianowe wiązanie lub zmodyfikowane wiązanie
30 p-etoksy.
35
[0041] Kwasy nukleinowe zawierają również kwasy

nukleinowe mające cukry szkieletowe, które są
przyłączone kowalencyjnie do grup organicznych o
niskiej masie cząsteczkowej innych niż grupa
5 hydroksylowa w pozycji 2' i innych niż grupa
fosforanowa w pozycji 5'. A zatem, zmodyfikowane kwasy
nukleinowe mogą zawierać 2'-O-alkilowaną grupę rybozy.
Dodatkowo, zmodyfikowane kwasy nukleinowe, mogą
zawierać cukry, takie jak arabinoza lub 2'-
10 fluoroarabinza zamiast rybozy. A zatem, kwasy
nukleinowe mogą być heterogenne w składzie szkieletu,
zawierając tam dowolną możliwą kombinację jednostek
polimerowych połączonych ze sobą, takich jak peptydowe
kwasy nukleinowe (które mają szkielet aminokwasowy z
15 zasadami kwasu nukleinowego). W niektórych wykonaniach
kwasy nukleinowe są homogenne w składzie szkieletu.
[0042] Jednostka fosforanu cukru (tj. β-D-ryboza i
fosfodiestrowe wiązanie międzynukleotydowe tworzące
razem jednostkę fosforanu cukru ze szkieletu cukrowo-
20 fosforanowego (tj. szkielet cukrowo-fosforanowy składa
się z jednostek fosforanu cukru) może być zastąpiony
przez inną jednostkę, gdzie inna jednostka jest na
przykład odpowiednia do budowania oligomeru „morfolino-
pochodnej” (jak opisano, na przykład w Stirchak E. P. i
25 wsp. (1989) Nucleic Acid Res. 17:6129-41), to jest,
np., zastąpienie przez morfolino-pochodną; albo do
budowania poliamidowego kwasu nukleinowego („PNA”; jak
opisano, na przykład, w Nielsen P. E. i wsp. (1994)
Bioconjug. Chem. 5:3-7), to jest, np., zastąpienie
30 przez jednostkę szkieletową PNA np., przez 2-
aminoetyloglicynę. Oligonukleotyd może mieć inne
36
węglowodanowe modyfikacje i zastąpienia w szkielecie,

takie jak peptydowe kwasy nukleinowe z grupami
fosforanowymi (PHONA), zamknięte kwasy nukleinowe (LNA,
ang. locked nucleic acids) i oligonukleotydy mające
5 części szkieletu z łącznikami alkilowymi lub łącznikami
aminowymi. Łącznik alkilowy może być rozgałęziony lub
nierozgałęziony, podstawiony lub niepodstawiony i
czysty chiralnie lub mieszaniną racemiczną.
[0043] Jednostka β-rybozy lub jednostka β-D-2'
10 deoksyrybozy może być zastąpiona przez zmodyfikowaną
jednostkę cukrową, gdzie zmodyfikowana jednostka
cukrowa jest na przykład wybrana spośród β-D-rybozy, α-
D-2'-deoksyrybozy, L-2'-deoksyrybozy, 2'-F-2'-
deoksyrybozy, 2'-F-arabinozy, 2'-O-(C1-C6)alkilo-
15 rybozy, korzystnie 2'-O-(C1-C6) alkilo-rybozą jest 2'-
O-metyloryboza, 2'-O-(C1-C6) alkenylo-rybozy, 2'-[O-(C1-
C6)alkilo-O-(C1-C6)alkilo]-rybozy, 2'-NH2-2'-
dezoksyrybozy, β-D-ksylo-furanozy, α-arabinofuranozy,
2,4-dideoksy-β-D-erytro-hekso-piranozy,
20 karbocyklicznych analogów cukrów (opisanych na przykład
w Froehler J. (1992) Am. Chem. Soc. 114:8320) i/lub o
otwartym łańcuchu (opisanych na przykład w
Vandendriessche i wsp. (1993) Tetrahedron 49:7223)
i/lub analogów bicyklocukrowych (opisanych na przykład
25 w Tarkoy M. i wsp. (1993) Helv. Chim. Acta. 76:481).
[0044] W niektórych wykonaniach, cukrem jest 2'-O-
metyloryboza, zwłaszcza dla jednej lub dwóch
nukleotydów połączonych przez wiązanie
międzynukleozydowe fosfodiestrowe lub fosfodiestrowe-
30 podobne.
37
[0045] Oligonukleotydy według wynalazku mogą być

syntetyzowane de novo przy zastosowaniu dowolnej z
szeregu dobrze znanych procedur w tej dziedzinie. Na
przykład, metody b-cyjanoetylofosforamidowej (Beaucage,
5 S. L. i Caruthers, M. H., (1981) Tet. Let. 22:1859);
metody z nukleozydem H-fosfonianu (Garegg i wsp.,
(1986) Tet. Let. 27:4051-4054; Froehler i wsp., (1986)
Nucl. Acid Res.14:5399-5407; Garegg i wsp., (1986)
27:4055-4058; Gaffney i wsp., (1988) Tet. Let. 29:2619-
10 2622). Te reakcje chemiczne można przeprowadzać przy
zastosowaniu rozmaitych automatycznych syntezatorów
kwasów nukleinowych dostępnych na rynku.
Oligonukleotydy te są nazywane oligonukleotydami
syntetycznymi. Alternatywnie, dinukleotydy T-bogate
15 i/lub TG mogą być wytwarzane na dużą skalę w plazmidach
(patrz, Sambrook T. i wsp., „Molecular Cloning: A
Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Nowy Jork, 1989) i rozdzielane na mniejsze
kawałki albo podawane jako całe plazmidy. Kwasy
20 nukleinowe mogą być wytwarzane z istniejących sekwencji
kwasu nukleinowego (np. genomowego lub cDNA) z
zastosowaniem znanych technik, takich jak te z
zastosowaniem enzymów restrykcyjnych, egzonukleaz lub
endonukleaz. W wykonaniu wynalazku wszystkimi
25 międzynukleotydowymi wiązaniami immunostymulującego
oligonukleotydu są wiązania fosforotionianowe.
[0046] Zmodyfikowane szkielety, takie jak
fosforotioniany, mogą być syntetyzowane przy
zastosowaniu technik automatycznych wykorzystujących
30 reakcje chemiczne fosforoamidatowe lub H-fosfonianowe.
Arylo- i alkilofosfoniany można wytworzyć, na przykład,
38
jak opisano w patencie USA nr 4,469,863, a

alkilofosfotriestry (w których reszta zawierającego
ładunek tlenu jest alkilowana, jak to opisano w pat.
USA nr 5,023,243) można wytwarzać przy zastosowaniu
5 zautomatyzowanej syntezy w fazie stałej, z użyciem
dostępnych w handlu odczynników. Sposoby dokonywania
innych modyfikacji i podstawień w szkielecie DNA są
opisane (np. Uhlmann, E. i Peyman, A. Chem. Rev 90:544,
1990; Goodchild, J. Bioconjugate Chem.1:165, 1990).
10 [0047] Kwasy nukleinowe wytworzone w ten sposób są
określane jako wyizolowany kwas nukleinowy.
„Wyizolowany kwas nukleinowy” odnosi się generalnie do
kwasu nukleinowego, który jest oddzielony od
składników, z którymi jest on wydzielony z komórki, z
15 jądra, mitochondriów lub chromatyny i innych
składników, które mogą być uważane za zanieczyszczenia.
[0048] W jednym wykonaniu, oligonukleotyd
immunostymulujący według wynalazku składa się z 5'
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3', gdzie *
20 oznacza wiązanie fosforotionianowe.
immunostymulujący według wynalazku indukuje wysoką
proporcję swoistych dla antygenu komórek T CD4+
wydzielających IFN-. W jednym wykonaniu,
25 oligonukleotyd immunostymulujący według wynalazku jest
zdolny do indukowania co najmniej 40%, korzystnie co
najmniej 45%, jeszcze korzystniej co najmniej 50%,
jeszcze korzystniej około 53% swoistych dla antygenu
komórek T CD4+ wydzielających IFN-, w populacji
30 swoistych dla antygenu limfocytów T CD4+ wydzielających
IFN-, TNF-α i/lub IL-2. W jednym z wykonań, tę
39

wydzielających IFN- ustala się przy zastosowaniu
polichromatycznej cytometrii przepływowej. Przykład
takiego określania jest ujawniony w Przykładzie 1
5 niniejszego dokumentu (patrz pkt ‘Swoiste dla antygenu
populacje komórek T wydzielające wiele cytokin’).
immunostymulujący według wynalazku jest zdolny do
indukowania przynajmniej 10%, korzystnie co najmniej
10 15%, jeszcze korzystniej co najmniej 20%, jeszcze
korzystniej około 22% swoistych dla antygenu komórek T
CD4+ wydzielających zarówno IFN- jak i TNF-α, w
populacji swoistych dla antygenu CD4+ komórek T,
wydzielających IFN-, TNF-α i/lub IL-2. W jednym z
15 wykonań taką proporcję wielofunkcyjnych, swoistych dla
antygenu komórek T CD4+ wydzielających zarówno IFN-
jak i TNF-α, ustala się przy zastosowaniu
populacje komórek T wydzielające wiele cytokin’).
immunostymulujący według wynalazku jest zdolny do
indukowania przynajmniej 30%, korzystnie co najmniej
25 40%, jeszcze korzystniej co najmniej 45%, jeszcze
korzystniej około 47% komórek T, swoistych dla danego
antygenu CD8+ wydzielających zarówno IFN- jak i TNF-α,
w populacji swoistych dla antygenu CD8+ komórek T,
wydzielających IFN-, TNF-α i/lub IL-2. W jednym z
30 wykonań taką proporcję wielofunkcyjnych, swoistych dla
antygenu komórek T CD8+ wydzielających zarówno IFN-
40
jak i TNF-α ustala się przy zastosowaniu

niniejszego dokumentu (patrz pkt ‘Swoiste dla antygenu
5 populacje komórek T wydzielające wiele cytokin’).
[0052] Kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być
stosowane jako samodzielne terapie. Samodzielną terapią
jest leczenie, w którym profilaktycznie lub
terapeutycznie korzystny efekt można uzyskać przez
10 podawanie pojedynczego środka lub kompozycji. A zatem,
ujawnione tu kwasy nukleinowe mogą być stosowane same w
zapobieganiu lub leczeniu chorób zakaźnych, ponieważ
kwasy nukleinowe są zdolne do indukowania odpowiedzi
immunologicznych, które są korzystne dla wyników
15 leczenia tych chorób. Niektóre z tych sposobów, o
których tu mowa, odnoszą się do stosowania kwasów
nukleinowych w skojarzeniu z innymi środkami
terapeutycznymi.
[0053] Kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być
20 stosowane w szczepionce. Kiedy kwas nukleinowy jest
stosowany w szczepionce, może być podawany razem z
antygenem. Korzystnie, jeżeli antygen jest swoisty dla
zaburzenia, któremu ma się zapobiegać lub leczyć. Na
przykład, jeżeli zaburzeniem jest choroba zakaźna,
25 korzystne jest, jeżeli antygen pochodzi z organizmu
zakaźnego (np. bakterii, wirusa, pasożyta, grzyba,
itd.), jeżeli zaburzenie obejmuje autoantygen (np. guz
nowotworowy, zaburzenie neurodegeneracyjne, takie jak
choroba Alzheimera, antygen wobec ludzkiego
30 przeciwciała lub antygen ulegający ekspresji z
endogennych ludzkich elementów retrowirusowych),
41
korzystne jest, jeżeli antygen pochodzi z konkretnego

zaburzenia, związanego z antygenem. Jeśli zaburzenie
obejmuje substancję uzależniającą, korzystne jest,
jeżeli antygen pochodzi z danej substancji
5 uzależniającej związanej z antygenem (np. hapten
nikotynowy).
[0054] Tak jak są tu stosowane, terminy „zaburzenie”
lub „choroba” są stosowane zamiennie.
[0055] W jednym wykonaniu, wynalazek odnosi się do
10 oligonukleotydu immunostymulującego według wynalazku do
zastosowania jako adiuwant w szczepionce do leczenia
lub profilaktyki choroby, gdzie ta szczepionka zawiera
co najmniej jeden antygen i gdzie choroba odnosi
korzyść z wytwarzania wielofunkcyjnych, swoistych dla
15 antygenu komórek T.
[0056] Stwierdzono, że CPG ODN 24555 indukuje większą
wytwarzających IFN- w porównaniu do swoistych dla
antygenu populacji komórek T CD4+ uzyskanych przy
20 zastosowaniu CPG ODN 10103. Uzyskiwano również większą
proporcję wielofunkcyjnych komórek T CD4+ swoistych dla
antygenu wytwarzających zarówno IFN- jak i TNF-α,
zarówno IFN- jak i IL-2 albo zarówno TNF-α jak i IL-
2, a nawet potrójnych producentów wydzielających IFN-,
25 TNF-α i IL-2 w porównaniu do populacji swoistych dla
antygenu komórek T CD4+ uzyskanej przy zastosowaniu CPG
ODN 10103 lub CPG ODN 7909. Uzyskiwano większą
proporcję wielofunkcyjnych komórek T CD8+ swoistych dla
antygenu wytwarzających zarówno IFN- jak i IL-2 albo
30 zarówno TNF-α jak i IL-2, a nawet potrójnych
producentów wydzielających IFN-, TNF-α i IL-2 w
42
porównaniu do populacji swoistych dla antygenu komórek

T CD8+ uzyskanej przy zastosowaniu CPG ODN 10103 lub
CPG ODN 7909.
[0057] IFN-, TNF-α i IL-2 uczestniczą w różnorodnych
5 chorobach. Na przykład, TNF-α uczestniczy w nowotworze
złośliwym, a IFN- uczestniczy w chorobach zakaźnych,
takich jak infekcje wirusowe. Dlatego też, w jednym z
wykonań, wynalazek dotyczy oligonukleotydu
immunostymulującego według wynalazku do zastosowania
10 jako adiuwant w szczepionce do leczenia lub
profilaktyki nowotworu złośliwego. W jednym wykonaniu,
wynalazek dotyczy oligonukleotydu immunostymulującego
według wynalazku do zastosowania jako adiuwant w
szczepionce do leczenia lub profilaktyki nowotworu
15 złośliwego, gdzie ta szczepionka zawiera co najmniej
jeden antygen nowotworowy, korzystnie dowolny z
ujawnionych tu antygenów nowotworowych.
[0058] W jednym wykonaniu, wynalazek odnosi się do
oligonukleotydu immunostymulującego według wynalazku do
20 zastosowania jako adiuwant w szczepionce do leczenia
lub profilaktyki choroby zakaźnej. W jednym wykonaniu,
wynalazek odnosi się do oligonukleotydu
immunostymulującego według wynalazku do zastosowania
jako adiuwant w szczepionce do leczenia lub
25 profilaktyki choroby zakaźnej, gdzie szczepionka
zawiera co najmniej jeden antygen drobnoustrojowy,
korzystnie dowolny z ujawnionych tu antygenów
drobnoustrojowych.
[0059] Oligonukleotydy immunostymulujące są przydatne
30 w niektórych aspektach wynalazku jako szczepionka
profilaktyczna do profilaktyki infekcji (np. choroby
43
zakaźnej), zaburzenia związanego z autoantygenem lub

zaburzenia związanego z substancją uzależniającą.
Korzystnie, jeżeli szczepionkę profilaktyczną stosuje
się u pacjentów, u których nie zdiagnozowano stanu, dla
5 którego szczepionka jest przeznaczona, a korzystniej u
osobników, które mogą być narażone na ryzyko rozwoju
jednego z tych stanów. Przykładowo, osobnik może być
tym, który jest narażony na ryzyko rozwinięcia się
zakażenia organizmem zakaźnym lub podatny jest na
10 zaburzenie związane z autoantygenem lub podatny jest na
zaburzenie związane z substancją uzależniającą.
[0060] Osobnik narażony na ryzyko, tak jak się tu
stosuje, to osobnik, który jest narażony na dowolne
ryzyko ekspozycji na patogen powodujący infekcję,
15 zaburzenie związane z autoantygenem lub zaburzenie
związane z substancją uzależniającą. Osobnik narażony
na ryzyko obejmuje osobników, którzy mają predyspozycje
do rozwoju takich zaburzeń. Niektóre predyspozycje mogą
być genetyczne (a zatem, mogą być identyfikowane przy
20 zastosowaniu analizy genetycznej lub dzięki historii
rodzinnej). Niektóre predyspozycje są środowiskowe (np.
uprzednia ekspozycja na czynniki zakaźne, autoantygeny
lub substancje uzależniające). Dla osobnika narażonego
na ryzyko rozwoju infekcji, przykładem takiego osobnika
25 jest osobnik żyjący lub spodziewający się podróży do
obszaru, w którym jest lub znaleziono dany rodzaj
czynnika zakaźnego, albo może być osobnik, który
poprzez styl życia lub procedury medyczne jest
eksponowany na organizm bądź bezpośrednio, bądź
30 pośrednio poprzez kontakt z płynami ustrojowymi, które
mogą zawierać organizmy zakaźne. Pacjenci z ryzykiem
44
rozwoju infekcji obejmują również ogólne populacje, dla

których agencja medyczna rekomenduje szczepienia dla
konkretnego organizmu zakaźnego.
[0061] Osobnikiem jest osobnik leczony przez medycynę
5 weterynaryjną, osobnik będący lub nie będący gryzoniem.
Osobniki nie będące gryzoniem obejmują, ale bez
ograniczania się do tego, zwierzę – człowieka lub
kręgowca, takiego jak pies, kot, koń, krowa, świnia,
owca, koza, kura, naczelne (np. małpa) i ryba (gatunki
10 akwakultury, np. łosoś). Osobniki będące gryzoniem
obejmują, ale bez ograniczania się do tego, szczury i
myszy. W niektórych wykonaniach, osobnikiem jest
człowiek.
[0062] Immunostymulujące oligonukleotydy można także
15 podawać osobnikowi bez antygenu dla krótkotrwałej
ochrony przed zakażeniem. W tym przypadku, powtarzane
dawki pozwolą na ochronę długoterminową.
[0063] Pacjentem mającym infekcję jest osobnik, który
był eksponowany na patogen zakaźny i ma ostre lub
20 przewlekłe wykrywalne poziomy patogenu w organizmie lub
wydalinach ciała. Przy stosowaniu terapeutycznym
oligonukleotydy immunostymulujące można stosować
samodzielnie lub w skojarzeniu z innym środkiem
terapeutycznym. Na przykład, oligonukleotydy
25 immunostymulujące mogą być stosowane terapeutycznie z
antygenem dla uzyskania swoistej dla antygenu
ogólnoustrojowej lub śluzówkowej odpowiedzi
immunologicznej, która jest zdolna do zmniejszania
poziomu lub eliminowania zakaźnego patogenu.
30 [0064] Choroba zakaźna, tak jak się tu stosuje, jest
to choroba pojawiająca się w wyniku obecności obcego
45
mikroorganizmu w organizmie. Szczególnie ważne jest,

aby opracować skuteczne strategie szczepień i leczenia
w celu ochrony powierzchni błon śluzowych organizmu,
które są głównym miejscem wnikania patogenu.
5 [0065] Zaburzenie związane z autoantygenem jest to
dowolne zaburzenie, które jest powodowane przez antygen
własnych komórek osobnika lub produktów komórkowych,
które powodują odpowiedź immunologiczną u tego
osobnika. Na przykład, w niektórych wykonaniach,
10 autoantygenem jest antygen nowotworowy, antygen
związany z chorobą Alzheimera, antygen wobec
przeciwciała lub antygen ulegający ekspresji z
endogennych ludzkich elementów retrowirusowych.
Antygenem nowotworowym może być HER2, MAG, NYESO-1,
15 PSA, CEA lub forma wariantowa EGFR. Antygenem związanym
z chorobą Alzheimera może być tau lub β-amyloid.
Antygenem wobec przeciwciała może być antygen przeciw
ludzkiemu przeciwciału, na przykład, w niektórych
wykonaniach antygenem jest IgE.
20 [0066] W niektórych wykonaniach, antygenem
nowotworowym jest MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4,
MAGE A6, MAGE A10, MAGE A12, HAGE (CT13), BAGE, BORIS,
SSX-2, LAGE-1, CAMEL (alt. ramka odczytu LAGE-1), GAGE
1,2,3, TRAG-3, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, tyrozynanza,
25 tyrp1 (gp75), tyrp2, gp100/pmel17, PAP, PSA, CEA, Ep-
CAM, PSMA, MUC1, MUC2, HER-2, AFP, EphA2, FGF-5, htert,
iCE, Livin (ML-IAP), RAGE, RU2, surwiwina, surwiwina
2B, WT1, antygen Thomsena-Friedenreicha (TF), 5T4,
PSCA, STEAP, TGR, adypofilina, AIM-2, G250, OGT,
30 TGFaRII, CO-95 (KIAA1416), CO-94 (seb4D), CO-9 (HDAC
5), CO-61 (HIP1 R), CO-58 (KNSL6), CO-45, CO-42
46
(TRIP4), CO-41 (MBD2), Ren-32 (lamina C), TNKL (BC-

203), CO-26 (MNK 1), SDCCAG3, GA733-2, STn, CA125,
EGFRvIII, BCR-abl, receptor folianowy o wysokim
powinowactwie, mezotelina, hCG, FAP alfa, cyklina 1,
5 topoizomeraza, serpina B5/maspina, legumaina, CDK4,
PRAME, ADAM 17, EDDR1, CDC2, białko replikacyjne A,
CDK2, GM2, Globo H, TF(c), Ley, Tn(c), STn(c), GD2, GD3
lub GD3L.
[0067] Zaburzenie związane z substancją uzależniającą
10 obejmuje dowolne zaburzenie, w którym uczestniczą
chemiczne lub biologiczne substancje, które powodują u
osobnika rozwinięcie uzależnienia od substancji
uzależniającej. Na przykład, w niektórych wykonaniach,
substancją uzależniającą może nikotyna lub kokaina. W
15 niektórych wykonaniach, antygenem nikotynowym może być
hapten nikotynowy sprzężony z nośnikiem. W niektórych
wykonaniach, nośnikiem, z którym sprzężony jest hapten
nikotynowy jest toksyna błonicy.
[0068] Tak jak jest tu stosowany, termin „leczyć”,
20 „leczony” lub „leczenie”, kiedy jest stosowany w
odniesieniu do choroby zakaźnej, odnosi się do leczenia
profilaktycznego, które zwiększa odporność osobnika
(osobnika narażonego na ryzyko zakażenia) na zakażenie
patogenem lub, innymi słowy, zmniejsza
25 prawdopodobieństwo, że osobnik zostanie zakażony
patogenem, jak również leczenie po tym, jak osobnik
(osobnik, który został zakażony) został zakażony, w
celu zwalczania infekcji, np. zmniejszania lub
wyeliminowania infekcji lub zapobiegania jej
30 pogorszeniu.
47
[0069] Termin „leczyć”, „leczony” lub „leczenie”,

kiedy jest stosowany w odniesieniu do choroby związanej
z autoantygenem, odnosi się do leczenia
5 (osobnika narażonego na ryzyko choroby związanej z
autoantygenem) na rozwinięcie się choroby związanej z
autoantygenem lub zmniejsza prawdopodobieństwo, że u
osobnika rozwinie się choroba związana z autoantygenem,
jak również leczenie po tym, jak u osobnika (osobnika
10 narażonego na ryzyko choroby związanej z autoantygenem)
rozwinęło się takie zaburzenie lub zaczęły rozwijać się
oznaki lub objawy rozwoju takiego zaburzenia, w celu
zmniejszenia efektów zaburzenia, np., zmniejszenia lub
wyeliminowania oznak i objawów związanych z chorobą lub
15 zapobiegania jej pogorszeniu.
[0070] Termin „leczyć”, „leczony” lub „leczenie”,
kiedy jest stosowany w odniesieniu do choroby związanej
z substancją uzależniającą, odnosi się do leczenia
20 (osobnika narażonego na ryzyko choroby związanej z
substancją uzależniającą) na rozwinięcie się choroby
związanej z substancją uzależniającą lub zmniejsza
prawdopodobieństwo, że u osobnika rozwinie się choroba
związana z substancją uzależniającą, jak również
25 leczenie po tym, jak u osobnika (osobnika narażonego na
ryzyko choroby związanej z substancją uzależniającą)
rozwinęło się takie zaburzenie lub zaczęły rozwijać się
oznaki lub objawy rozwoju takiego zaburzenia, w celu
zmniejszenia efektów zaburzenia, np., zmniejszenia lub
30 wyeliminowania oznak i objawów związanych z chorobą lub
zapobiegania jej pogorszeniu.
48
[0071] Leczenie osobnika oligonukleotydem

immunostymulującym, jak tu opisano, prowadzi do
zmniejszenia zakażenia lub całkowitego zniesienia
zakażenia, zmniejszenia oznak/objawów związanych z
5 zaburzeniem związanym z autoantygenem lub całkowite
zniesienie zaburzenia albo zmniejszania oznak/objawów
związanych z zaburzeniem związanym z substancją
uzależniającą lub całkowite zniesienie zaburzenia.
Osobnik może być uważany za leczonego, jeżeli takie
10 objawy związane z chorobą zakaźną, zaburzeniem
związanym z autoantygenem lub zaburzeniem związanym z
substancją uzależniającą są zmniejszane, są pod
kontrolą albo są znoszone w wyniku takiego leczenia. W
przypadku choroby zakaźnej, takie leczenie obejmuje
15 ponadto zmniejszenie ilości czynnika zakaźnego obecnego
u osobnika (np. takie ilości można mierzyć przy
zastosowaniu standardowych testów, takich jak test
ELISA, znanych specjalistom w tej dziedzinie). W
przypadku choroby związanej z autoantygenem takie
20 leczenie obejmuje ponadto zmniejszenie ilości
autoantygenu obecnego u pacjenta lub obniżenie
odpowiedzi immunologicznej indukowanej na skutek
autoantygenu. W przypadku choroby związanej z
substancją uzależniającą, takie leczenie obejmuje
25 ponadto zmniejszenie oznak/objawów związanych z
uzależnieniem od substancji uzależniającej.
[0072] „Antygen”, tak jak się tutaj stosuje, jest to
cząsteczka, która jest zdolna do wywołania odpowiedzi
immunologicznej. Antygeny obejmują, ale nie są do tego
30 ograniczone, komórki, ekstrakty komórkowe, białka
rekombinowane, białka oczyszczone, polipeptydy,
49
polisacharydy, peptydy, koniugaty polisacharydów,

peptydowe i niepeptydowe mimetyki polisacharydów i inne
cząsteczki kodowane przez DNA plazmidowy, hapteny, małe
cząsteczki, lipidy, glikolipidy, węglowodany, całe
5 zabite patogeny, wirusy i ekstrakty wirusowe, żywego
atenuowanego wirusa lub wektor wirusowy, żywe
atenuowane bakterie lub wektor bakteryjny oraz
organizmy wielokomórkowe, takie jak pasożyty i
alergeny. Termin „antygen” obejmuje szeroko dowolny typ
10 cząsteczki, która jest rozpoznawana przez układ
immunologiczny gospodarza jako obcy. Antygeny obejmują,
ale nie są to tego ograniczone, antygeny bakteryjne,
autoantygeny i substancje uzależniające.
[0073] W niektórych aspektach, antygen jest sprzężony
15 z nośnikiem. W niektórych wykonaniach, nośnikiem jest
toksyna błonicy lub cząstka wirusopodobna. W niektórych
wykonanich, cząstka wirusopodobna składa się z RNA faga
Q-β, antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby
typu B (HBsAg) lub antygenu rdzeniowego wirusa
20 zapalenia wątroby typu B (HBcAg).
[0074] „Antygen drobnoustrojowy”, tak jak się tutaj
stosuje”, jest to antygen drobnoustroju i obejmuje, ale
nie ogranicza się do tego, wirusy, bakterie, pasożyty i
grzyby. W niektórych wykonaniach antygen bakteryjny
25 jest związany z bakterią Staphylococcus aureus. W
innych wykonaniach, antygen bakteryjny jest związany z
bakterią, która powoduje próchnicę zębów, na przykład,
Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus,
30 Actinomyces viscosus. W niektórych wykonaniach, antygen
50
chorobę przyzębia, na przykład, Porphyromonas

gingivalis lub Actinobacillus actinomycetemcomitans. W
niektórych wykonaniach, antygenem wirusowym jest ten
związany z syncytialnym wirusem oddechowym (RSV),
5 wirusem opryszczki pospolitej 1 (HSV1, ang. Herpes
Simplex Virus 1), wirusem opryszczki pospolitej 2
(HSV2) albo ludzkim wirusem niedoboru odporności 1
(HIV-1) lub HIV-2. W niektórych wykonaniach antygen
pasożytniczy jest tym związanym z pasożytem, który
10 powoduje malarię.
[0075] Takie antygeny obejmują nienaruszony
drobnoustrój, jak również naturalne izolaty i ich
fragmenty lub pochodne, a także związki syntetyczne,
które są identyczne albo podobne do naturalnych
15 antygenów drobnoustrojowych i indukują odpowiedź
immunologiczną swoistą dla tego drobnoustroju. Związek
jest podobny do naturalnego antygenu drobnoustrojowego,
jeżeli indukuje odpowiedź immunologiczną (humoralną
i/lub komórkową) wobec naturalnego antygenu
20 drobnoustrojowego. Takie antygeny są stosowane rutynowo
w tej dziedzinie i są dobrze znane specjalistom w tej
dziedzinie.
[0076] W niektórych aspektach wynalazku, osobnik jest
„eksponowany” na antygen. Tak jak się tutaj stosuje,
25 termin „eksponowany na” odnosi się bądź do aktywnego
etapu doprowadzenia do kontaktu osobnika z antygenem,
bądź biernej ekspozycji osobnika na antygen in vivo.
Sposoby aktywnej ekspozycji osobnika na antygen są
dobrze znane w tej dziedzinie. Generalnie, antygen
30 podaje się bezpośrednio osobnikowi sposobami takimi jak
podawanie dożylne, domięśniowe, doustne, przezskórne,
51
dośluzówkowe, donosowe, dotchawiczne lub podskórne.

Antygen można podawać miejscowo lub ogólnoustrojowo.
Sposoby podawania antygenu i oligonukleotydu
immunostymulującego są opisane bardziej szczegółowo
5 poniżej. Osobnik jest eksponowany biernie na antygen,
jeżeli antygen staje się dostępny do ekspozycji wobec
komórek odpornościowych w organizmie. Osobnik może być
eksponowany biernie na antygen, na przykład poprzez
wchodzenie obcego patogenu do organizmu.
10 [0077] Sposoby, w jakie osobnik jest eksponowany
biernie na antygen mogą być szczególnie zależne od ram
czasowych podawania oligonukleotydu
immunostymulującego. Na przykład u osobnika narażonego
na ryzyko rozwoju choroby zakaźnej, osobnikowi może być
15 podawany oligonukleotyd immunostymulujący w sposób
regularny, kiedy ryzyko jest największe. Dodatkowo,
oligonukleotyd immunostymulujący może być podawany
podróżującym przed podróżą do obcych krajów, kiedy są
oni narażeni na ryzyko ekspozycji na czynniki zakaźne.
20 Oligonukleotyd immunostymulujący może być również
podawany żołnierzom lun cywilom narażonym na ryzyko
ekspozycji, aby prowadzić wojnę biologiczną, indukując
ogólnoustrojową lub śluzówkową odpowiedź
immunologicznąna antygen, kiedy osobnik jest na niego
25 eksponowany.
[0078] Przykłady wirusów, które znaleziono u ludzi
obejmują, ale bez ograniczania się do tego:
Retroviridae (e.g. ludzkie wirusy niedoboru odporności,
takie jak HIV-1 (określany również jako HTLV-III, LAV
30 lub HTLV-III/LAV, albo HIV-III; i inne izolaty, takie
jak HIV-LP); Picornaviridae (np. wirusy polio, wirus
52
zapalenia wątroby typu A; enterowirusy, ludzkie wirusy

Coxsackie, rinowirusy, echowirusy); Calciviridae (np.
szczepy, które powodują zapalenie żołądka i jelit);
Togaviridae (np. wirusy końskiego zapalenia mózgu,
5 wirusy różyczki); Flaviridae (np. wirusy dengi, wirusy
zapalenia mózgu, wirusy żółtej febry); Coronoviridae
(np. koronawirusy); Rhabdoviradae (np. vesicular
stomatitis wirusy pęcherzykowatego zapalenia jamy
ustnej, wirusy wścieklizny); Filoviridae (np. wirusy
10 ebola); Paramyxoviridae (np. wirusy paragrypy, wirus
świnki, wirus odry, syncytialny wirus oddechowy);
Orthomyxoviridae (np. wirusy grypy); Bungaviridae (np.
wirusy Hantaan, wirusy bunga, flebowirusy i wirusy
Nairo); Arenaviridae (wirusy gorączki krwotocznej);
15 Reoviridae (np. reowirusy, orbiwirusy i rotawirusy);
Birnaviridae; Hepadnaviridae (wirus zapalenia wątroby
typu B); Parvoviridae (parwowirusy); Papovaviridae
(wirusy brodawczaka, wirusy polyoma); Adenoviridae
(większość adenowirusów); Herpesviridae (wirus
20 opryszczki pospolitej (HSV) 1 i 2, wirus ospy i
półpaśca, cytomegalowirus (CMV), wirus opryszczki);
Poxviridae (wirusy wariola, wirusy krowianki, wirusy
ospy); oraz Iridoviridae (np. wirus afrykańskiego
pomoru świń); i wirusy niesklasyfikowane (np. czynniki
25 etiologiczne gąbczastych encefalopatii, czynnik
wirusowy zapalenia wątroby typu delta (którym, jak się
sądzi, jest defektywny satelita wirusa zapalenia
wątroby typu B), czynniki wirusowe zapalenia wątroby
innego niż A, innego niż B (klasy 1=przenoszony
30 wewnętrznie; klasy 2= przenoszony pozajelitowo (tj.
zapalenia wątroby typu C); wirusy Norwalk i pokrewne
53
oraz astrowirusy). W niektórych wykonaniach, wirusami

są syncytialny wirus oddechowy (RSV), wirus opryszczki
pospolitej 1, wirus opryszczki pospolitej 2, ludzki
wirus niedoboru odporności 1 (HIV1) lub HIV2.
5 [0079] Jakkolwiek wiele opisanych tu antygenów
drobnoustrojowych dotyczy chorób ludzkich, wynalazek
jest również przydatny do leczenia innych kręgowców
poza człowiekiem. Kręgowce inne niż człowiek są również
zdolne do rozwoju infekcji, którym można zapobiegać lub
10 które można leczyć przy zastosowaniu ujawnionych tu
immunostymulujących kwasów nukleinowych. Na przykład,
poza leczeniem ludzkich chorób zakaźnych, sposoby
według wynalazku są przydatne do leczenia zakażeń
zwierząt.
15 [0080] Zarówno bakterie gram ujemne, jak i gram
dodatnie służą jako antygeny u zwierząt kręgowych.
Takie bakterie gram dodatnie obejmują, ale bez
ograniczania się do tego, gatunki Pasteurella, gatunki
Staphylococci i gatunki Streptococcus. Bakterie gram
20 ujemne obejmują, ale bez ograniczania się do tego,
Escherichia coli, gatunki Pseudomonas i gatunki
Salmonella. Konkretne przykłady bakterii zakaźnych
obejmują, ale bez ograniczania się do tego,
Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella
25 pneumophilia, Mycobacteria sps. (np. M. tuberculosis,
M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae),
Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria
meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus
pyogenes (Grupa A Streptococcus), Streptococcus
30 agalactiae (Grupa B Streptococcus), Streptococcus
(grupa viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus
54
bovis, Streptococcus (gat. beztlenowe), Streptococcus

pneumoniae, patogenny Campylobacter sp., Enterococcus
sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis,
Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp.,
5 Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens,
Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella
pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp.,
Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis,
Treponema palladium, Treponema pertenue, Leptospira,
10 Rickettsia oraz Actinomyces israelli. W innych
wykonaniach bakterią jest ta, która powoduje próchnicę
zębów, na przykład Streptococcus mutans, Streptococcus
sobrinus, Streptococcus sanguis, Lactobacillus
acidophilis lub Actinomyces viscosus. W innych
15 wykonaniach bakterią jest ta, która powoduje chorobę
przyzębia, na przykład Porphyromonas gingivalis lub
Actinobacillus actinomycetemcomitans.
[0081] Polipeptydy patogenów bakteryjnych obejmują,
ale bez ograniczania się do tego, regulowane żelazem
20 białko błony zewnętrznej (IROMP, ang. iron-regulated
outer membrane protein), białko błony zewnętrznej (OMP,
ang. outer membrane protein) oraz białko A Aeromonis
salmonicida, które powoduje furunkulozę, białko p57
Renibacterium salmoninarum, które powoduje bakteryjną
25 chorobę nerek (BKD, ang. bacterial kidney disease),
główny antygen związany z powierzchnią (msa, ang. major
surface associated antigen), cytotoksyna ulegająca
ekspresji powierzchniowej (mpr), hemolizyna ulegająca
ekspresji powierzchniowej (ish) oraz antygen flagelarny
30 yersiniozy; białko zewnatrzkomórkowe (ECP, ang.
extracellular protein), IROMP, białko strukturalne
55
pasteurlozy; OMP i białko flagelarne Vibrosis

anguillarum i V. ordalii; białko flagelarne, białko
OMP, aroA i purA z Edwardsiellosis ictaluri i E. tarda;
oraz antygen powierzchniowy ichtiofririozy; oraz białko
5 strukturalne i regulacyjne Cytophaga columnari; oraz
białko strukturalne i regulacyjne Rickettsia.
[0082] Przykłady grzybów obejmują Cryptococcus
neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides
immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia
10 trachomatis, Candida albicans. Inne organizmy zakaźne
(tj. pierwotniaki) obejmują Plasmodium spp. takie jak
Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium
ovale, Plasmodium vivax i Toxoplasma gondii. Pasożyty
pochodzące z krwi i/lub innych tkanek obejmują
15 Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens,
Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania
braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma
gambiense i Trypanosoma rhodesiense (śpiączka
afrykańska), Trypanosoma cruzi (choroba Chagasa) i
20 Toxoplasma gondii. W niektórych wykonaniach pasożyt
jest tym związanym malarią. Inne medycznie istotne
drobnoustroje zostały opisane szeroko w piśmiennictwie,
np., patrz C. G. A Thomas, Medical Microbiology,
Bailliere Tindall, Great Britain 1983.
25 [0083] Wiele szczepionek do leczenia kręgowców innych
niż człowiek jest ujawnionych w Bennett, K., Compendium
of Veterinary Products, wyd. 3. North American
Compendiums, Inc., 1995. Jak dyskutowano powyżej,
antygeny obejmują drobnoustroje zakaźne, takie jak
30 wirusy, pasożyty, bakterie i grzyby oraz ich fragmenty
pochodzące ze źródeł naturalnych lub otrzymane
56
syntetycznie. Wirusy zakaźne, zarówno ludzkie, jak i

kręgowców innych niż człowiek, obejmują retrowirusy,
wirusy RNA i wirusy DNA. Ta grupa wirusów obejmuje
zarówno retrowirusy proste, jak i retrowirusy złożone.
5 Retrowirusy proste obejmują podgrupy retrowirusów typu
B, retrowirusy typu C i retrowirusy typu D. Przykładem
retrowirusa typu B jest mysi wirus raka sutka (MMTV,
ang. mouse mammary tumor virus). Retrowirusy typu C
obejmują grupę A podgrup typu C (obejmującą wirusa
10 mięsaka Rousa (RSV, ang. Rous sarcoma virus), wirusa
białaczki ptasiej (ALV, ang. avian leukemia virus) i
wirusa mieloblastozy ptasiej (AMV avian myeloblastosis
virus)) oraz grupę B podgrupy typu C (obejmującą wirusa
białaczki kociej (FeLV, ang. feline leukemia virus),
15 wirusa białaczki gibonów (GALV, ang. gibbon ape
leukemia virus), wirusa nekrozy śledziony (SNV, ang.
spleen necrosis virus), wirusa retikuloendoteliozy (RV,
ang. reticuloendotheliosis virus) i małpiego wirusa
mięsaka (SSV, ang. simian sarcoma virus). Retrowirusy
20 typu D obejmują małpiego wirusa Mason-Pfizer (MPMV,
ang. Mason-Pfizer monkey virus) i małpiego retrowirusa
typu 1 (SRV-1, ang. simian retrovirus type 1).
Retrowirusy złożone obejmują podgrypy lentiwirusów,
wirusy białaczki z komórek T i wirusy pieniste.
25 Lentiwirusy obejmują HIV-1, ale obejmują również HIV-2,
SIV, wirusa wisny, kociego wirusa niedoboru odporności
(FIV, ang. feline immunodeficiency virus) i końskiego
wirusa anemii zakaźnej(EIAV, ang. equine infectious
anemia virus). Wirusy białaczki z komórek T obejmują
30 HTLV-1, HTLV-II, małpiego wirusa białaczki komórek T
(STLV, ang. simian T-cell leukemia virus) i wirusa
57
białaczki bydlęcej (BLV, ang. bovine leukemia virus).

Wirusy pieniste obejmują ludzkiego wirusa pienistego
(HFV, ang. human foamy virus), małpiego wirusa
pienistego (SFV, ang. simian foamy virus) i bydlęcego
5 wirusa pienistego (BFV, ang. bovine foamy virus).
[0084] Przykłady innych wirusów RNA, które są
antygenami zwierząt kręgowych obejmują, ale nie są do
nich ograniczone, członków rodziny Reoviridae,
obejmującej rodzaj Orthoreovirus (wiele serotypów
10 zarówno ssaczych, jak i ptasich retrowirusów), rodzaj
Orbivirus (wirus niebieskiego języka, wirus Eugenangee,
Wirus Kemerovo, wirus afrykańskiej choroby koni i wirus
gorączki kleszczowej Colorado), rodzaj Rotavirus
(rotawirus ludzki, wirus biegunki cieląt z Nebraski,
15 małpi rotawirus, rotawirus bydła lub owiec, rotawirus
ptasi); rodziny Picornaviridae, obejmującej rodzaj
Enterovirus (polio, wirus Coxsackie A i B, jelitowe
ludzkie cytopatogenetyczne sieroce (ECHO, ang. enteric
cytopathic human orphan) wirusy, wirus zapalenia
20 wątroby A, małpie enterowirusy, wirusy zapalenia mózgu
i rdzenia myszowatych (ME, ang. Murine
encephalomyelitis), mysi wirus polio, enterowirusy
bydlęce, enterowirusy świńskie, rodzaj Cardiovirus
(wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMC, ang.
25 Encephalomyocarditis), mengowirus), rodzaj Rhinovirus
(rinowirusy człowieka obejmujące co najmniej 113
podtypów; inne rinowirusy), rodzaj Apthovirus
(pryszczycy (FMDV, ang. Foot and Mouth disease));
rodziny Calciviridae, w tym świński wirus wysypki
30 pęcherzykowej, wirus lwów morskich San Miguel, koci
pikornawirus i wirus Norwalk; rodziny Togaviridae,
58
obejmującej rodzaj Alphavirus (wirus wschodniego

końskiego zapalenia mózgu, wirus lasu Semliki, wirus
Sindbis, wirus Chikungunya, wirus O'Nyong-Nyong, wirus
rzeki Ross, wirus wenezuelskiego końskiego zapalenia
5 mózgu, wirus zachodniego końskiego zapalenia mózgu),
rodzaj Flavirius (przenoszony przez komary wirus żółtej
febry, wirus dengi, wirus japońskiego zapalenia mózgu,
wirus zapalenia mózgu St. Louis, wirus zapalenia mózgu
Doliny Murray, wirus zachodniego Nilu, wirus Kunjin,
10 środkowoeuropejski wirus przenoszony przez kleszcze,
dalekowschodni wirus przenoszony przez kleszcze, wirus
lasu Kyasanur, wirus Louping III, wirus Powassan, wirus
omskiej gorączki krwotocznej), rodzaj Rubivirus (wirus
różyczki), rodzaj Pestivirus (wirus choroby błony
15 śluzowej, wirus pomoru świń, wirus choroby granicznej);
rodziny Bunyaviridae, obejmującej rodzaj Bunyvirus
(wirusy Bunyamwera i pokrewne, wirusy z grupy zapalenia
mózgu California), rodzaj Phlebovirus (wirus
sycylijskiej gorączki przenoszonej przez muchę
20 piaskową, wirus gorączki doliny Rift), rodzaj
Nairovirus (wirus krymsko-kongijskiej gorączki
krwotocznej, wirus choroby owiec Nairobi) oraz rodzaj
Uukuvirus (wirusy Uukuniemi i pokrewne); rodziny
Orthomyxoviridae, obejmującej rodzaj Influenzavirus
25 (wirus grypy typu A, wiele ludzkich podtypów); wirus
świńskiej grypy, wirusy ptasiej i końskiej grypy; grypy
typu B (wiele ludzkich podtypów) i grypy typu C
(ewentualnie osobny rodzaj); rodziny Paramyxoviridae,
obejmującej rodzaj Paramyxovirus (wirus grypy rzekomej
30 typu 1, wirus Sendai, wirus hemadsorpcji, wirusy grypy
rzekomej typu 2 do 5, wirus choroby Newcastle, wirus
59
świnki), rodzaj Morbillivirus (wirus odry, wirus

podostrego stwardniającego zapalenia mózgu, wirus
nosówki, wirus pomoru bydła), rodzaj Pneumovirus
(syncytialny wirus oddechowy (RSV), bydlęcy syncytialny
5 wirus oddechowy i wirus zapalenia płuc); rodziny
Rhabdoviridae, obejmującej rodzaj Vesiculovirus (VSV),
wirus Chandipura, wirus Flanders-Hart Park), rodzaj
Lyssavirus (wirus wścieklizny), rabdowirusy ryb i
prawdopodobnie dwa rabdowirusy (wirusa Marburg i wirusa
10 Ebola); rodziny Arenaviridae, obejmującej wirusa
zapalenia limfocytarnych splotów naczyniowych (LCM,
ang. Lymphocytic choriomeningitis), kompleks wirusa
Tacaribe i wirus Lassa; rodzinę Coronaviridae, w tym
wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV, ang.
15 Infectious Bronchitis Virus), wirusa zapalenia wątroby,
ludzkiego koronawirusa jelitowego i wirusa zakaźnego
zapalenia otrzewnej kotów (koci koronawirus).
[0085] Ilustracyjne przykłady wirusów DNA, które są
antygenami u zwierząt kręgowych obejmują, ale nie są do
20 tego ograniczone, rodzinę Poxviridae, obejmującą rodzaj
Orthopoxvirus (ospy prawdziwej, ospy mniejszej, ospy
małpiej krowianki, ospy krowiej, ospy bizonów, ospy
królików, ektromelii), rodzaj Leporipoxvirus (śluzaka,
włókniaka), rodzaj Avipoxvirus (ospy kurzej, inne
25 wirusy ospy ptasiej), rodzaj Capripoxvirus (ospy
owczej, ospy koziej), rodzaj Suipoxvirus (ospy
świńskiej), rodzaj Parapoxvirus (wirus zakaźnego
krostkowego zapalenia skóry, krowiej ospy rzekomej,
bydlęcy wirus grudkowego zapalenia jamy ustnej);
30 rodzinę Iridoviridae (wirus afrykańskiego pomoru świń,
wirusy Frog 2 i 3, wirus limfocystozy ryb); rodzinę
60
Herpesviridae, obejmującą wirusy opryszczki alfa

(opryszczki typu 1 i 2, ospy wietrznej i półpaśca,
wirus ronienia klaczy, koński wirus opryszczki 2 i 3,
wirus wścieklizny rzekomej, bydlęcy wirus zakaźnego
5 zapalenia rogówki i spojówki, wirus zakaźnego zapalenia
nosa i tchawicy bydła, wirus zakaźnego zapalenia nosa i
tchawicy kotów, wirus zakaźnego zapalenia krtani i
tchawicy), wirusy opryszczki beta (ludzki
cytomegalowirus i cytomegalowirusy świń i małp), wirusy
10 opryszczki gamma (wirus Epsteina-Barra (EBV), wirus
choroby Mareka, Herpesvirus saimiri, Herpesvirus
ateles, Herpesvirus sylvilagus, wirus opryszczki świnki
morskiej, wirus nowotworu Lucke); rodzinę Adenoviridae,
obejmującą rodzaj Mastadenovirus (podgrupy ludzkie A,
15 B, C, D, E i niezgrupowane, adenowirusy małpie (co
najmniej 23 serotypów), zakaźnego zapalenia wątroby
psów i adenowirusy bydła, świń, owiec, żab i wielu
innych gatunków, rodzaj Aviadenovirus (adenowirusy
ptasie) i nie dające się hodować adenowirusy; rodzinę
20 Papoviridae, obejmującą rodzaj Papillomavirus (ludzkie
wirusy brodawczaka, wirusy brodawczakowatości bydła,
wirus brodawek królików Shope'a i różne patogenne
wirusy brodawczaka innych gatunków), rodzaj
Polyomavirus (wirus polioma, małpi czynnik
25 wakuolaryzujący (SV-40), króliczy czynnik
wakuolaryzujący (RKV), wirus K, wirus BK, wirus JC i
inne wirusy polioma naczelnych, takie jak wirus
brodawczaka limfotropowego); rodzinę Parvoviridae,
obejmującą rodzaj wirusów adenosatelitarnych, rodzaj
30 Parvovirus (koci wirus panleukopenii, parwowirus
bydlęcy, parwowirus psi, wirus aleuckiej choroby norek
61
itd.). Ponadto, wirusy DNA mogą obejmować wirusy, które

nie pasują do powyższych rodzin, takie jak wirusy Kuru
i Creutzfeldta-Jacoba oraz przewlekłych zakaźnych
neuropatii (wirus CHINA, ang. chronic infectious
5 neuropathic agents).
[0086] W jednym wykonaniu, wynalazek dotyczy sposobu
antygenu, obejmujący podawanie antygenu i
oligonukleotydu immunostymulującego według wynalazku,
10 gdzie co najmniej 40%, korzystnie co najmniej 45%,
jeszcze korzystniej co najmniej 50%, jeszcze
korzystniej około 53% swoistych dla antygenu komórek T
CD4+, w populacji swoistych dla antygenu komórek T CD4+
wydzielających IFN-, TNF-α i/lub IL-2 wydziela IFN-.
15 W jednym z wykonań, tę proporcję swoistych dla antygenu
komórek T CD4+ wydzielających IFN- ustala się przy
zastosowaniu polichromatycznej cytometrii przepływowej.
Przykład takiego określania jest ujawniony w
Przykładzie 1 niniejszego dokumentu (patrz pkt ‘Swoiste
20 dla antygenu populacje komórek T wydzielające wiele
cytokin’). W jednym z wykonań, oligonukleotyd
immunostymulujący i antygen podaje się w ilości
skutecznej do wywołania odpowiedzi immunologicznej
swoistej dla antygenu u osobnika. W jednym wykonaniu,
25 antygen jest dowolnym z ujawnionych tu antygenów.
antygenu, obejmującego podawanie antygenu i
oligonukleotydu immunostymulującego według wynalazku,
30 gdzie co najmniej 10%, korzystnie co najmniej 20%,
jeszcze korzystniej co najmniej 22% zaindukowanych
62
swoistych dla antygenu komórek T CD4+ w populacji

swoistych dla antygenu komórek T CD4+ wydzielających
IFN-, TNF-α i/lub IL-2 to producenci dwóch cytokin,
korzystnie wydzielający zarówno IFN- jak i TNF-α. W
5 jednym z wykonań, tę proporcję swoistych dla antygenu
komórek T CD4+ wydzielających zarówno IFN- jak i TNF-
α, ustala się przy zastosowaniu polichromatycznej
cytometrii przepływowej. Przykład takiego określania
jest ujawniony w Przykładzie 1 niniejszego dokumentu
10 (patrz pkt ‘Swoiste dla antygenu populacje komórek T
wydzielające wiele cytokin’). W jednym z wykonań,
oligonukleotyd immunostymulujący i antygen podaje się w
ilości skutecznej do wywołania odpowiedzi
immunologicznej swoistej dla antygenu u osobnika. W
15 jednym wykonaniu, antygen jest dowolnym z ujawnionych
tu antygenów.
antygenu, obejmującego podawanie antygenu i
20 oligonukleotydu immunostymulującego według wynalazku,
gdzie co najmniej 30%, korzystnie co najmniej 40%,
jeszcze korzystniej co najmniej 45%, jeszcze
korzystniej około 47% zaindukowanych swoistych dla
antygenu komórek T CD8+ w populacji swoistych dla
25 antygenu komórek T CD8+ wydzielających IFN-, TNF-α
i/lub IL-2 to producenci dwóch cytokin, korzystnie
wydzielający zarówno IFN- jak i TNF-α. W jednym z
wykonań, tę proporcję swoistych dla antygenu komórek T
CD8+ wydzielających zarówno IFN- jak i TNF-α, ustala
30 się przy zastosowaniu polichromatycznej cytometrii
przepływowej. Przykład takiego określania jest
63
ujawniony w Przykładzie 1 niniejszego dokumentu (patrz

pkt ‘Swoiste dla antygenu populacje komórek T
wydzielające wiele cytokin’). W jednym z wykonań,
oligonukleotyd immunostymulujący i antygen podaje się w
5 ilości skutecznej do wywołania odpowiedzi
immunologicznej swoistej dla antygenu u osobnika. W
jednym wykonaniu, antygen jest dowolnym z ujawnionych
tu antygenów.
[0089] W jednym wykonaniu, wynalazek dotyczy
zastosowania w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej
wobec antygenu, gdzie co najmniej 40%, korzystnie co
jeszcze korzystniej około 53% zaindukowanych swoistych
15 dla antygenu komórek T CD4+ w populacji swoistych dla
antygenu komórek T CD4+ wydzielających IFN-, TNF-α
i/lub IL-2 wydziela IFN-. W jednym z wykonań, tę
20 polichromatycznej cytometrii przepływowej. Przykład
populacje komórek T wydzielające wiele cytokin’). W
jednym wykonaniu, antygen jest dowolnym z ujawnionych
25 tu antygenów.
30 najmniej 15%, jeszcze korzystniej co najmniej 20%,
jeszcze korzystniej około 22% swoistych dla antygenu
64
zaindukowanych komórek T CD4+ w populacji swoistych dla

5 wykonań, tę proporcję swoistych dla antygenu komórek T
się przy zastosowaniu polichromatycznej cytometrii
10 pkt ‘Swoiste dla antygenu populacje komórek T
wydzielające wiele cytokin’. W jednym wykonaniu,
antygen jest dowolnym z ujawnionych tu antygenów.
15 zastosowania w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej
dla antygenu komórek T CD8+ w populacji swoistych dla
25 się przy zastosowaniu polichromatycznej cytometrii
wydzielające wiele cytokin’). W jednym wykonaniu,
30 antygenem jest dowolny z ujawnionych tu antygenów.
65

zastosowania jako adiuwant w szczepionce, gdzie ta
szczepionka indukuje odpowiedź immunologiczną przeciwko
5 antygenowi, gdzie co najmniej 40%, korzystnie co
10 i/lub IL-2 wydziela IFN-. W jednym z wykonań, tę
populacje komórek T wydzielające wiele cytokin’). W
jednym wykonaniu, antygenem jest dowolny z ujawnionych
tu antygenów.
szczepionka indukuje odpowiedź immunologiczną przeciwko
antygenowi, gdzie co najmniej 10%, korzystnie co
25 jeszcze korzystniej około 22% zaindukowanych swoistych
30 wykonań, tę proporcję swoistych dla antygenu komórek T
66

5 wydzielające wiele cytokin’). W jednym wykonaniu,
antygenem jest dowolny z ujawnionych tu antygenów.
10 szczepionka indukuje odpowiedź immunologiczną przeciwko
antygenowi, gdzie co najmniej 30%, korzystnie co
CD8+ wydzielających zarówno IFN-jak i TNF-α, ustala się
20 przy zastosowaniu polichromatycznej cytometrii
wydzielające wiele cytokin’. W jednym wykonaniu,
25 antygenem jest dowolny z ujawnionych tu antygenów.
szczepionki zawierającej antygen i oligonukleotyd
immunostymulujący według niniejszego wynalazku do
30 wobec tego antygenu, gdzie co najmniej 40%, korzystnie
co najmniej 45%, jeszcze korzystniej co najmniej 50%,
67
jeszcze korzystnie około 53% zaindukowanych swoistych

i/lub IL-2 wydziela IFN-. W jednym z wykonań, tę
5 proporcję swoistych dla antygenu komórek T CD4+
10 populacje komórek T wydzielające wiele cytokin’). W
jednym wykonaniu, antygenem jest dowolny z ujawnionych
tu antygenów.
15 immunostymulujący według niniejszego wynalazku do
wobec tego antygenu, gdzie co najmniej 10%, korzystnie
20 dla antygenu komórek T CD4+ w populacji swoistych dla
25 CD4+ wydzielających zarówno IFN- jak i TNF-α, ustala
30 wydzielające wiele cytokin’). W jednym wykonaniu,
68

immunostymulujący według niniejszego wynalazku do
5 wobec tego antygenu, gdzie co najmniej 30%, korzystnie
jeszcze korzystnie około 47% swoistych dla antygenu
zaindukowanych komórek T CD8+ to producenci dwóch
cytokin, korzystnie wydzielający zarówno IFN- jak i
10 TNF-α, w populacji swoistych dla antygenu limfocytów T
CD8+ wydzielających IFN-, TNF-α i/lub IL-2. W jednym z
CD8+ wydzielających zarówno IFN-, jak i TNF-α ustala
15 przepływowej. Przykład takiego określania jest
wydzielające wiele cytokin’). W jednym wykonaniu,
20 [0098] Określenie „skuteczna ilość” cząsteczki kwasu
nukleinowego odnosi się do ilości niezbędnej i
wystarczającej do zrealizowania pożądanego efektu
biologicznego. Na przykład, skuteczną ilością kwasu
nukleinowego zawierającego co najmniej jeden
25 niemetylowany CpG do leczenia zaburzenia mogłaby być
ilość niezbędna do wyeliminowania infekcji
drobnoustrojowej lub guza nowotworowego. Skuteczną
ilością do zastosowania jako adiuwant szczepionkowy
mogłaby być ilość przydatna do wzmacniania odpowiedzi
30 immunologicznej osobnika na szczepionkę. „Skuteczną
ilością” do leczenia choroby zakaźnej, zaburzenia
69
związanego z autoantygenem lub zaburzenia związanego z

substancją uzależniającą może być ilość przydatna do
antygenu. Skuteczna ilość dla dowolnego konkretnego
5 zastosowania może się zmieniać w zależności od takich
czynników, jak choroba lub stan podlegający leczeniu,
konkretny podawany immunostymulujący oligonukleotyd
CpG, rozmiary osobnika lub ostrość choroby lub stanu.
Specjalista w tej dziedzinie może doświadczalnie
10 określić skuteczną ilość konkretnego oligonukleotydu
bez konieczności nadmiernego eksperymentowania.
[0099] W aspektach wynalazku, szczepionka może
zawierać ponadto adiuwant. W niektórych wykonaniach,
adiuwant jest agonistą receptora Toll-podobnego (TLR),
15 którym nie jest TLR9. Agonistą TLR, w niektórych
wykonaniach, jest agonista TLR3 (na przykład,
stabilizowany poli I:C), TLR4 (na przykład, pochodna
lipopolisacharydu (LPS), na przykład, MPL lub GLA),
TLR5 (na przykład flagelina), TLR7 (na przykład, małe
20 cząsteczki z rodziny imidazochinoliny) lub TLR8 (na
przykład, małe cząsteczki z rodziny imidazochinoliny).
W niektórych wykonaniach, adiuwantem jest sól glinu, na
przykład wodorotlenek glinu, kompleks immunostymulujący
(ISCOM), emulsja olej-w-wodzie lub woda-w-oleju,
25 liposom lub systemem dostarczania, np. nanocząstka lub
mikrocząstka.
[0100] Termin skuteczna ilość immunostymulującego
oligonukleotydu CpG odnosi się do ilości niezbędnej i
wystarczającej do zrealizowania pożądanego efektu
30 biologicznego. Na przykład, skuteczna ilość
immunostymulującego oligonukleotydu CpG podawanego z
70
antygenem do wywoływania odpowiedzi immunologicznej

swoistej dla antygenu to ilość niezbędna do
zaindukowania odpowiedzi immunologicznej w odpowiedzi
na antygen, po ekspozycji na antygen. W połączeniu z
5 dostarczonymi tu informacjami, poprzez wybór spośród
różnych aktywnych oligonukleotydów immunostymulujących
oraz mających wagę czynników, takich jak moc, względna
biodostępność, masa ciała pacjenta, ciężkość
niepożądanych efektów ubocznych, i korzystnego sposobu
10 podawania można zaplanować skuteczny profilaktyczny lub
terapeutyczny tryb leczenia, który nie powoduje
znacznej toksyczności, a jednocześnie jest skuteczny w
leczeniu konkretnego pacjenta. Skuteczna ilość dla
dowolnego konkretnego zastosowania może się zmieniać w
15 zależności od takich czynników, jak choroba lub stan
podlegający leczeniu, konkretny podawany
immunostymulujący oligonukleotyd CpG, rozmiary osobnika
lub ostrość choroby lub stanu. Specjalista w tej
dziedzinie może doświadczalnie określić skuteczną ilość
20 konkretnego immunostymulującego oligonukleotydu CpG
i/lub antygenu i/lub innego środka terapeutycznego bez
konieczności nadmiernego eksperymentowania w świetle
tego ujawnienia.
[0101] Dawki osobnicze opisanych tu związków do
25 dostarczania miejscowego typowo są w zakresie od około
0,1 g do 50 mg na podanie, które, w zależności od
zastosowania, mogłyby być podawane codziennie, co
tydzień lub co miesiąc i w dowolnym innym odstępie
czasowym. Bardziej typowe dawki miejscowe są w zakresie
30 od około 10 g do 10 mg na podanie, a opcjonalnie od
około 100 g do 1 mg, z 2-4 podaniami w odstępie dni
71
lub tygodni. Bardziej typowo, dawki immunostymulanta są

w zakresie od 1 g do 10 mg na podanie, a najbardziej
typowo od 10 ng do 1 mg, z podawaniem dziennym lub
tygodniowym. Dawki osobnicze opisanych tu związków do
5 podawania pozajelitowego, w celu wywołania odpowiedzi
immunologicznej swoistej dla antygenu, gdzie związki są
dostarczane z antygenem, ale nie z innym środkiem
terapeutycznym, są typowo 5 do 10000 razy wyższe niż
skuteczne dawki miejscowe dla zastosowań adiuwanta
10 szczepionkowego lub immunostymulanta, a bardziej typowo
od 10 do 1000 razy wyższe, a najbardziej typowo od 20
do 100 razy większe. Dawki opisanych tu związków do
podawania pozajelitowego, np. do indukowania wrodzonej
odpowiedzi immunologicznej, do zwiększania ADCC, do
15 indukowania swoistej dla antygenu odpowiedzi
immunologicznej, kiedy immunostymulujące
oligonukleotydy CpG są podawane w skojarzeniu z innymi
środkami terapeutycznymi lub w wyspecjalizowanych
nośnikach do dostarczania, typowo są w zakresie od
20 około 0,1 g do 10 mg na podanie, które, w zależności
od zastosowania, mogą być podawanych codziennie, co
tydzień lub co miesiąc i w dowolnym innym odstępie
czasowym. Bardziej typowo, dawki pozajelitowe dla tych
celów są w zakresie od około 10 g do 5 mg na dawkę, a
25 najbardziej typowo, od około 100 g do 1 mg, z 2-4
podaniami w odstępie dni lub tygodni. W niektórych
wykonaniach, jednakże, dawki pozajelitowe dla tych
celów można stosować w zakresie od 5 do 10000 razy
wyższym niż typowe dawki opisane powyżej.
30 [0102] Dla dowolnego opisanego tu związku
terapeutycznie skuteczna ilość może być wstępnie
72
określona z modeli zwierzęcych. Terapeutycznie

skuteczną dawkę można również określić z danych dla
ludzi dla oligonukleotydów CpG, które były testowane u
ludzi (np. w rozpoczętych testach klinicznych u ludzi)
5 oraz związków, o których wiadomo, że wykazują podobne
aktywności farmakologiczne, takich jak inne adiuwanty,
np. LT i inne antygeny do celów szczepienia. Wyższe
dawki mogą być wymagane do podawania pozajelitowego.
Zastosowana dawka może być dostosowana na podstawie
10 względnej biodostępności i siły podawanego związku.
Dostosowywanie dawki dla uzyskania maksymalnej
skuteczności w oparciu o metody opisane powyżej i inne
sposoby, co jest dobrze znane w tej dziedzinie, mieści
się w zakresie możliwości specjalisty w tej dziedzinie.
15 [0103] Preparaty według wynalazku są podawane w
postaci farmaceutycznie dopuszczalnych roztworów, które
mogą rutynowo zawierać farmaceutycznie dopuszczalne
stężenia soli, środki buforujące, środki konserwujące,
kompatybilne nośniki, adiuwanty i ewentualnie inne
20 składniki terapeutyczne.
[0104] Do stosowania w terapii, skuteczna ilość
immunostymulującego oligonukleotydu CpG może być
podawana pacjentowi dowolnym sposobem, który dostarcza
oligonukleotyd do żądanej powierzchni. Podawanie
25 kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku
może być dokonane dowolnym sposobem znanym specjaliście
w tej dziedzinie. Korzystne drogi podawania obejmują,
ale nie są to tego ograniczone, podawanie pozajelitowe
(na przykład, domięśniowe, podskórne, śródskórne,
30 dożylne, dopęcherzowe lub dootrzewnowe), miejscowe (na
przykład, skórne (przezskórne), śluzówkowe), doustne,
73
donosowe, dopochwowe, doodbytnicze, przezpoliczkowe,

śródoczne lub podjęzykowe.
[0105] Oligonukleotydy immunostymulujące, bądź same,
bądź w skojarzeniu z innymi środkami terapeutycznymi,
5 mogą być podawane dowolną opisaną tu drogą. W
niektórych korzystnych wykonaniach, podawanie jest
lokalne. Podawanie lokalne może obejmować stosowanie
miejscowe na powierzchni błon śluzowych, np. skóry,
takie jak te jamy ustnej i narządów płciowych.
10 [0106] Oligonukleotydy immunostymulujące, gdy jest
pożądane dostarczanie ich ogólnoustrojowo, mogą być
sporządzane do podawania pozajelitowego poprzez
wstrzyknięcie, np. przez wstrzykniecie dużej porcji lub
ciągły wlew. Preparaty do wstrzykiwania mogą być
15 prezentowane w postaci dawki jednostkowej, np. w
ampułkach lub w pojemnikach wielodawkowych, z dodatkiem
środka konserwującego. Kompozycje mogą przyjmować takie
postacie jak zawiesiny, roztwory lub emulsje w
nośnikach olejowych lub wodnych i mogą zawierać środki
20 do sporządzania kompozycji, takie jak środki
zawieszające, stabilizujące i/lub rozpraszające.
[0107] Preparaty farmaceutyczne do podawania
pozajelitowego obejmują wodne roztwory oligonukleotydów
immunostymulujących w postaci rozpuszczalnej w wodzie.
25 Dodatkowo, można sporządzić zawiesiny oligonukleotydów
immunostymulujących jako odpowiednie zawiesiny oleiste
do wstrzykiwania. Odpowiednie lipofilowe
rozpuszczalniki lub nośniki obejmują oleje tłuszczowe,
takie jak olej sezamowy, lub syntetyczne estry kwasów
30 tłuszczowych, takie jak oleinian etylowy lub
triglicerydy, albo liposomy. Wodne zawiesiny do
74
wstrzykiwania mogą zawierać substancje, które

zwiększają lepkość zawiesiny, takie jak
karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol lub dekstran.
Ewentualnie, zawiesina może również zawierać
5 odpowiednie stabilizatory lub środki, które zwiększają
rozpuszczalność oligonukleotydów immunostymulujących, w
celu umożliwienia przygotowania roztworów wysoko
stężonych.
[0108] Oligonukleotydy immunostymulujące, gdy jest
10 pożądane dostarczanie ich ogólnoustrojowo, mogą być
sporządzane do podawania pozajelitowego poprzez
wstrzyknięcie, np. przez wstrzykniecie dużej porcji lub
ciągły wlew. Preparaty do wstrzykiwania mogą być
prezentowane w postaci dawki jednostkowej, np. w
15 ampułkach lub w pojemnikach wielodawkowych, z dodatkiem
środka konserwującego. Kompozycje mogą przyjmować takie
postacie jak zawiesiny, roztwory lub emulsje w
nośnikach olejowych lub wodnych i mogą zawierać środki
do sporządzania kompozycji, takie jak środki
20 zawieszające, stabilizujące i/lub rozpraszające.
[0109] Można rozcieńczać lub zwiększać objętość środka
terapeutycznego materiałem obojętnym. Te
rozpuszczalniki mogą obejmować węglowodany, zwłaszcza
mannitol, a-laktozę, bezwodną laktozę, celulozę,
25 sacharozę, modyfikowane dekstrany i/lub skrobię. Pewne
sole nieorganiczne mogą być także używane jako
wypełniacze, w tym trifosforan wapniowy, węglan
magnezowy i/lub chlorek sodowy. Niektórymi dostępnymi
na rynku rozcieńczalnikami są Fast-Flo, Emdex, STA-Rx
30 1500, Emcompress i Avicell.
75
[0110] Aby ułatwić rozpuszczanie środka

terapeutycznego w środowisku wodnym można dodać środek
powierzchniowo czynny jako środek zwilżający. Środki
powierzchniowo czynne mogą obejmować detergenty
5 anionowe, takie jak laurylosiarczan sodowy,
dioktylosulfobursztynian sodowy i/lub dioktylosulfonian
sodowy. Można zastosować detergenty kationowe i mogą
one obejmować chlorek benzalkoniowy lub chlorek
benzetomiowy. Lista potencjalnych niejonowych środków
10 powierzchniowo czynnych, które mogą być włączone do
preparatu jako środki powierzchniowo czynne to
lauromakrogol 400, stearynian polioksylu 40,
polioksyetylenowy uwodorniony olej rycynowy 10, 50
i/lub 60, monostearynian glicerolu, polisorbat 40, 60,
15 65 i/lub 80, ester kwasu tłuszczowego i sacharozy,
metyloceluloza i karboksymetyloceluloza. Te środki
powierzchniowo czynne mogą być obecne w kompozycji
oligonukleotydów immunostymulujących bądź pojedynczo,
bądź jako mieszanina w różnych proporcjach.
20 [0111] Preparaty farmaceutyczne do podawania
pozajelitowego obejmują wodne roztwory oligonukleotydów
immunostymulujących w postaci rozpuszczalnej w wodzie.
Dodatkowo, zawiesiny oligonukleotydów
immunostymulujących mogą być sporządzane jako
25 odpowiednie oleiste zawiesiny do wstrzykiwania.
Odpowiednie lipofilowe rozpuszczalniki lub nośniki
obejmują oleje tłuszczowe, takie jak olej sezamowy, lub
syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, takie jak
oleinian etylowy lub triglicerydy, albo liposomy. Wodne
30 zawiesiny do wstrzykiwania mogą zawierać substancje,
które zwiększają lepkość zawiesiny, takie jak
76
karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol lub dekstran.

Ewentualnie, zawiesina może również zawierać
odpowiednie stabilizatory lub środki, które zwiększają
rozpuszczalność immunostymulujących oligonukleotydów, w
5 celu umożliwienia przygotowania roztworów wysoko
stężonych.
[0112] Alternatywnie, oligonukleotydy
immunostymulujące mogą być w postaci proszku, do re
konstytucji przy zastosowaniu odpowiedniego nośnika,
10 np. jałowej, wolnej od pirogenów wody, przed użyciem.
[0113] Do podawania doustnego, związki (tj.
immunostymulujące oligonukleotydy CpG, antygeny i inne
środki terapeutyczne) mogą być łatwo sporządzane
poprzez łączenie oligonukleotydów immunostymulujących z
15 farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami dobrze znanymi
w tej dziedzinie. Takie nośniki umożliwiają
sporządzanie oligonukleotydów immunostymulujących
według wynalazku w postaci tabletek, pigułek, drażetek,
kapsułek, płynów, żeli, syropów, rzadkiej zawiesiny,
20 zawiesiny i tym podobnych, do przyjmowania doustnego
przez osobnika, który ma być leczony. Preparaty
farmaceutyczne do stosowania doustnego można otrzymać w
postaci stałej zaróbki, ewentualnie mieląc otrzymaną w
rezultacie mieszaninę i poddając obróbce mieszaninę
25 granulek, po dodaniu odpowiednich środków pomocniczych,
jeśli to pożądane, aby uzyskać rdzenie tabletek lub
drażetek. Odpowiednimi substancjami pomocniczymi są,
konkretnie, wypełniacze, takie jak cukry, w tym
laktoza, sacharoza, mannitol lub sorbitol; preparaty
30 celulozy, takie jak, na przykład, skrobia kukurydziana,
skrobia pszenna, skrobia ryżowa, skrobia ziemniaczana,
77
żelatyna, guma tragakantowa, metyloceluloza,

hydroksypropylometyloceluloza, karboksymetyloceluloza
sodowa i/lub poliwinylopirolidon (PVP). Jeśli jest to
pożądane, można dodać środki rozpraszające, na przykład
5 usieciowany poliwinylopirolidon, agar albo kwas
alginowy lub jego sól, taką jak alginian sodowy.
Ewentualnie, można sporządzić preparaty doustne w soli
fizjologicznej lub buforach, tj. EDTA, do neutralizacji
kwaśnych warunków wewnętrznych lub mogą być podawane
10 bez jakichkolwiek nośników.
[0114] Rozważa się także doustne postacie dawek
powyższych środków lub preparatów. Środki lub preparaty
mogą być modyfikowane chemicznie, tak, że dostarczanie
doustne pochodnej jest skuteczne. Generalnie, brane pod
15 uwagę modyfikacje chemiczne to przyłączenie
przynajmniej jednego ugrupowania do czynnika lub samej
kompozycji, gdzie to ugrupowanie umożliwia (a)
hamowanie proteolizy; oraz (b) pobieranie do krwi z
żołądka lub jelit. Pożądane jest również zwiększenie
20 ogólnej stabilności czynnika lub kompozycji i
zwiększenie czasu krążenia w organizmie. Przykłady
takich ugrupowań obejmują: glikol polietylenowy,
kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego,
karboksymetylocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy,
25 poliwinylopirolidon i poliprolinę. Abuchowski and
Davis, 1981, „Soluble Polymer-Enzyme Adducts” W:
Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, red., Wiley-
Interscience, New York, N.Y., str. 367-383; Newmark, i
wsp., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Innymi
30 polimerami, które mogą być stosowane, są poli-1,3-
dioksolan oraz poli-1,3,6-tioksokan. Korzystne do
78
zastosowania farmaceutycznego, jak wskazano powyżej, są

ugrupowania glikolu polietylenowego.
[0115] Bierze się również pod uwagę donosowe
dostarczanie kompozycji farmaceutycznej według
5 niniejszego wynalazku. Dostarczanie donosowe umożliwia
przejście kompozycji farmaceutycznej według niniejszego
wynalazku do krwioobiegu bezpośrednio po podaniu
produktu leczniczego do nosa, bez konieczności
osadzania produktu w płucach. Preparaty do podawania
10 donosowego obejmują te z dekstranem lub
cyklodekstranem.
[0116] Do podawania donosowego, przydatnym urządzeniem
jest mała, twarda butelka, do której jest dołączony
rozpylacz odmierzanych dawek. W jednym wykonaniu,
15 odmierzona dawka jest dostarczana poprzez umieszczenie
roztworu kompozycji farmaceutycznej według niniejszego
wynalazku w komorze o określonej objętości, która to
komora ma otwór o wymiarze stosownym do rozpylania
preparatu aerozolowego, tworząc aerozol, gdy płyn w
20 komorze jest sprężany. Aby podać kompozycję
farmaceutyczną według niniejszego wynalazku, komora
jest ściskana. W konkretnym przykładzie wykonania,
komora ma system tłoka. Takie urządzenia są dostępne
handlowo.
25 [0117] Alternatywnie, można zastosować plastykową,
butelkę do ściskania z otworem lub ujściem o wymiarach
stosownych do rozpylania preparatu aerozolowego,
tworząc aerozol, gdy butelka jest ściskana. Ujście
znajduje się zwykle na górze butelki, a góra jest
30 generalnie stożkowa, aby częściowo zmieścić w kanałach
nosowych w celu wydajnego podawania aerozolu.
79
Korzystnie, inhalator do nosa dostarcza odmierzoną

ilość preparatu aerozolowego do podawania odmierzonej
dawki leku.
[0118] Do podawania przezpoliczkowego, kompozycje mogą
5 przybrać postać tabletek lub pastylek do ssania
sporządzanych w konwencjonalny sposób.
[0119] Związki można również sporządzać w kompozycjach
doodbytniczych lub dopochwowych, takich jak czopki lub
wlewy retencyjne, np. zawierające typowe podłoża do
10 czopków, takie jak masło kakaowe lub inne glicerydy.
[0120] Oprócz kompozycji opisanych uprzednio, związki
mogą być również sporządzane jako preparaty typu depot.
Takie długo działające kompozycje można sporządzać przy
zastosowaniu odpowiednich materiałów polimerowych lub
15 hydrofobowych (na przykład jako emulsja w dopuszczalnym
oleju) lub żywic jonowymiennych lub jako trudno
rozpuszczalne pochodne, na przykład jako trudno
rozpuszczalna sól.
[0121] Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać
20 odpowiednie nośniki albo zaróbki stałe lub w fazie
żelowej. Przykłady takich nośników lub zaróbek
obejmują, ale bez ograniczania się do tego, węglan
wapniowy, fosforan wapniowy, różne cukry, skrobie,
pochodne celulozy, żelatynę i polimery, takie jak
25 glikole polietylenowe.
[0122] Odpowiednimi postaciami płynnymi lub stałymi
preparatów farmaceutycznych są, na przykład, roztwory
wodne lub w soli fizjologicznej do inhalacji, zamknięte
w mikrokapsułkach, ześlimakowane (ang. encochleated),
30 opłaszczone na mikroskopowych cząsteczkach złota,
znajdujące się w liposomach, rozpylane, jako aerozol,
80
tabletka do wszczepienia w skórę albo suszone na ostrym

przedmiocie do zadrapania skóry. Kompozycje
farmaceutyczne obejmują również granulaty, proszki,
tabletki, tabletki powlekane, (mikro)kapsułki, czopki,
5 syropy, emulsje, zawiesiny, kremy, krople lub preparaty
o przedłużonym uwalnianiu substancji czynnych, w
których stosowane są zaróbki i dodatki i/lub substancje
pomocnicze do kompozycji, takie jak środki
rozpraszające, środki wiążące, środki powlekające,
10 środki spęczniające, lubrykanty, środki smakowe, środki
słodzące lub rozpuszczalniki, jak opisano powyżej.
Kompozycje farmaceutyczne są odpowiednie do stosowania
w różnych systemach dostarczania leków. Dla krótkiego
przeglądu sposobów dostarczania leków, patrz Langer,
15 Science 249:1527-1533, 1990.
[0123] Immunostymulujące oligonukleotydy CpG i
ewentualnie inne terapeutyki i/lub antygeny mogą być
podawane per se (czyste) lub w postaci farmaceutycznie
dopuszczalnej soli. W przypadku stosowania w medycynie,
20 sole powinny być farmaceutycznie dopuszczalne, ale
farmaceutycznie niedopuszczalne sole mogą być dogodnie
stosowane do wytwarzania farmaceutycznie dopuszczalnych
soli. Takie sole obejmują, ale nie są do nich
ograniczone, te uzyskane z następujących kwasów:
25 chlorowodorowego, bromowodorowego, siarkowego,
azotowego, fosforowego, maleinowego, octowego,
salicylowego, p-tolueno-sulfonowego, winowego,
cytrynowego, metanosulfonowego, mrówkowego, malonowego,
bursztynowego, naftaleno-2-sulfonowego oraz
30 benzenosulfonowego. Takie sole można również otrzymać
jako sole metali alkalicznych lub metali ziem
81
alkalicznych, takie jak sole sodowe, potasowe lub

wapniowe grupy kwasu karboksylowego.
[0124] Odpowiednie środki buforujące obejmują kwas
octowy i sól (1-2% wag./obj.); kwas cytrynowy i sól (1-
5 3% wag./obj.); kwas borowy i sól (0,5-2,5% wag./obj.);
oraz kwas fosforowy i sól (0,8-2% wag./ obj.).
Odpowiednie substancje konserwujące obejmują chlorek
benzalkoniowy (0,003-0,03% wag./obj.); chlorobutanol
(0,3-0,9% wag./obj.); parabeny (0,01-0,25% wag./obj.) i
10 timerosal (0,004-0,02% wag./obj.).
[0125] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku
zawierają skuteczną ilość immunostymulującego
oligonukleotydu CpG i ewentualnie antygeny i/lub inne
środki terapeutyczne, ewentualnie zawarte w nośniku
15 dopuszczalnym farmaceutycznie. Termin „dopuszczalny
farmaceutycznie nośnik” oznacza jeden lub więcej
kompatybilnych stałych lub płynnych wypełniaczy,
rozcieńczalników lub substancji do zamykania w
kapsułki, które nadają się do podawania człowiekowi lub
20 innemu zwierzęciu kręgowemu. Termin „nośnik” oznacza
składnik organiczny lub nieorganiczny, naturalny lub
syntetyczny, z którym połączony jest składnik czynny w
celu ułatwienia stosowania. Składniki kompozycji
farmaceutycznych można również zmieszać ze związkami
25 według niniejszego wynalazku, i ze sobą, w taki sposób,
że nie ma oddziaływania, które mogłyby w istotny sposób
niekorzystnie wpłynąć na pożądaną skuteczność
farmaceutyczną.
[0126] Niniejszy wynalazek jest dodatkowo zilustrowany
30 przez następujące Przykłady, które w żaden sposób nie
powinny być traktowane jako dalsze ograniczenie. Cała
82
zawartość wszystkich odnośników (obejmujących

pośmiennictwo, wydane patenty, opublikowane zgłoszenia
patentowe i równoległe zgłoszenia patentowe),
przytoczone w tym zgłoszeniu są tu wyraźnie włączone w
5 całości jako odniesienie.
PRZYKŁADY
Przykład 1:
10
[0127] Immunostymulujący oligonukleotyd CPG 24555
porównywano z oligonukleotydami CPG 10103 i CPG 7909
pod kątem ich zdolności do zwiększania swoistych dla
antygenu odpowiedzi immunologicznych u myszy po
15 immunizacji domięśniowej (IM, ang. intramuscularly)
przy zastosowaniu antygenu powierzchniowego wirusa
zapalenia wątroby typu B (HBsAg) lub owoalbuminy (OVA)
jako antygenów modelowych.
20 Metody i Materiały
[0128] Wszystkie ODN sporządzono z liofilizowanego

oligodeoksynukleotydu (ODN). Pokrótce, ODN rozpuszczono
w wolnym od endotoksyn buforze Tris-EDTA o pH 8,0
25 (OmniPur®; EM Science, Gibbstown, NJ) i rozcieńczono w
jałowej, wolnej od endotoksyn soli fizjologicznej
buforowanej fosforanem (PBS, ang. Phosphate Buffered
Saline), pH 7,2 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)
w warunkach aseptycznych, aby zapobiec zarówno
30 zanieczyszczeniom drobnoustrojami, jak i endotoksynami.
83
Roztwory przechowywano do czasu użycia w temperaturze

4°C.
[0129] Samice myszy typu dzikiego BALB/c i C57BL/6
nabyto w Charles River Canada (Quebec, Kanada). Myszy z
5 brakiem TLR9 w tle C57 były hodowane w Taconic Farms i
przeniesione do zwierzętarni w Coley Pharmaceutical
Group Canada. Myszy były trzymane w klatkach z mikro-
izolatorem w zwierzętarni w Coley Pharmaceutical Group
Canada. Wszystkie badania zostały przeprowadzone za
10 zgodą Komitetu opieki nad zwierzętami Coley Canada
zgodnie z zaleceniami Stowarzyszenia na rzecz oceny i
akredytacji opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi
pielęgnacji (Association for assessment and
accreditation of laboratory animal care, (AAALAC
15 International)) oraz Canadian Council on Animal Care.
Zwierzęta miały masę w przybliżeniu 18-20 g na początku
badania.
Immunizacja myszy
20
Antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B
(HBsAg)
[0130] Myszy BALB/c (n=10/grupę) immunizowano

25 domięśniowo (IM) w lewy mięsień piszczelowy przedni
przy użyciu 1 g HBsAg; podtyp ad (Cliniqa, 4076),
samego lub łącznie z 10 g CPG 24555, CPG 10103 i CPG
7909, w całkowitej objętości 50 l. Po 2 tygodniach po
pierwszym wstrzyknięciu, zwierzętom pobierano krew
30 przez żyłę podżuchwową stosując heparynę jako
antykoagulant i podawano dawkę przypominającą stosując
84
taki sam preparat szczepionki co używany do pierwszej

immunizacji. W 2 tygodnie po dawce przypominającej
zwierzęta skrwawiano przez nakłucie serca, stosując
heparynę jako antykoagulant, poddawano eutanazji
5 poprzez przemieszczenie kręgów szyjnych i pobierano
aseptycznie śledziony do stosowania w teście
immunologicznym do wykrywania aktywności CTL swoistych
dla antygenu, wydzielania IFN- (nadsącza z hodowli)
oraz komórek T CD4 vs CD8 wydzielających wiele cytokin
10 (IFN-, TNF-α i IL-2). Osocze z każdego punktu
czasowego pobierania krwi stosowano do wykrywania
swoistej dla antygenu całkowitej IgG oraz izotypów IgG,
IgG1 i IgG2a.
15 Kurza owalbumina (OVA)
[0131] Myszy C57BL/6 typu dzikiego i z brakiem TLR9

(C57BL/6 TLR9-/-) (n=10/grupę) immunizowano domięśniowo
(IM) w lewy mięsień piszczelowy przedni przy użyciu 20
20 g OVA stopnia VII (Sigma, A7641), samej lub łącznie z
10 g CPG 24555, CPG 10103 i CPG 7909 lub kontrolnym
ODN bez CpG 2137, w całkowitej objętości 50 l.
Zwierzętom podawano dawkę przypominającą stosując taki
sam preparat szczepionki co używany do pierwszej
25 immunizacji 14 i 21 dni po pierwszej immunizacji. W 7.
dniu po ostatniej dawce przypominającej zwierzęta
skrwawiano przez nakłucie serca, stosując heparynę jako
antykoagulant, poddawano eutanazji poprzez
przemieszczenie kręgów szyjnych i pobierano aseptycznie
30 śledziony do stosowania w teście immunologicznym do
wykrywania aktywności CTL swoistych dla antygenu,
85
wydzielania IFN- (nadsącza z hodowli), komórek T CD8+

dodatnich pod względem tetrameru oraz komórek T CD4 vs
CD8 wydzielających wiele cytokin (IFN-, TNF-α i IL-2).
Osocze z każdego punktu czasowego pobierania krwi
5 stosowano do wykrywania swoistej dla antygenu
całkowitej IgG oraz izotypów IgG, IgG1 i IgG2a.
Testy immunologiczne
10 Oznaczanie mian przeciwciał swoistych wobec antygenów
[0132] Przeciwciała (całkowitą IgG, IgG1 i IgG2a/c)

swoiste wobec HBsAg (anty-HB) lub owoalbuminy (anty-
OVA) wykrywano i oznaczano ilościowo w teście ELISA z
15 rozcieńczeniem w punkcie końcowym, który przeprowadzono
w trzech powtórzeniach na próbkach od poszczególnych
zwierząt. Miana w punkcie końcowym zdefiniowano jako
największe rozcieńczenie osocza, które dawało wartości
absorbancji (OD 450 nm) dwa razy większe niż w osoczu
20 bez immunizacji, z wartością odcięcia 0,05. Zostały one
podane jako średnie miana geometryczne dla grupy (GMT,
ang. geometric mean titer) ± SEM.
Ocena odpowiedzi CTL

25
[0133] Śledziony pobrane w tygodniu 1. (dla OVA) lub
tygodniu 2. (dla HBsAg) po ostatniej immunizacji użyto
do oznaczenia swoistych dla antygenu odpowiedzi
cytotoksycznych limfocytów T (CTL, ang. cytotoxic T
30 lymphocyte). Śledziony homogenizowano do zawiesiny
pojedynczych komórek w pożywce do hodowli tkankowej
86
RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT), uzupełnionej 10%

płodową surowicą bydlęcą (Hyclone, Logan, UT),
roztworem penicylina-streptomycyna (końcowe stężenie,
odpowiednio, 1000 U/ml i 1 mg/ml, Invitrogen,
5 Burlington, ON), L-glutaminą (końcowe stężenie 2 mM;
Invitrogen, Burlington, NA) i 5 x 10-5 M β-
merkaptoetanolu (Invitrogen, Burlington, ON). Limfocyty
swoiste dla HBsAg w zawiesinach splenocytów (3 x 106
komórek/ml) stymulowano ponownie przez 5 dni, poprzez
10 inkubację z napromieniowaną linią komórkową myszowatych
(P815/S) z ekspresją HBsAg, a limfocyty swoiste dla OVA
w zawiesinach splenocytów (3 x 106komórek/ml)
stymulowano ponownie przez 5 dni poprzez inkubację z
napromieniowaną linią komórkową myszowatych (EG.7) z
15 ekspresją OVA. Po ponownej stymulacji limfocytów
potencjał do zabijania komórek z ekspresją HBsAg lub
51
OVA oznaczano stosując test uwalniania Cr. Wyniki
przedstawiono jako % swoistej lizy dla różnych
stosunków komórek efektorowych do docelowych (E:T,
20 effector to target).
Ocena swoistego dla antygenu wydzielania IFN- przez

splenocyty
25 [0134] Użyto splenocyty z 1. tygodnia (dla OVA) lub 2.

tygodnia (dla HBsAg) po ostatniej immunizacji, mierząc
wydzielanie IFN- po ponownej stymulacji antygenem. W
skrócie, zawiesiny komórek śledziony przygotowano jak
dokonywano tego w teście CTL i doprowadzono do
30 końcowego stężenia 5 x 106 komórek na ml w pożywce do
hodowli tkankowej RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT)
87
uzupełnionej 2% normalną mysią surowicą (Cedarlane

Laboratories, Ontario, Kanada), roztworem penicylina-
streptomycyna (końcowe stężenie, odpowiednio, 1000 U/ml
i 1 mg/ml, Invitrogen, Burlington, ON), L-glutaminą
5 (końcowe stężenie 2 mM; Invitrogen, Burlington, NA) i 5
x 10-5 M β-merkaptoetanolu (Invitrogen, Burlington, ON)
[Pełna RPMI 1640]. Zawiesinę splenocytów wysiano na 96-
studzienkowe U-denne płytki do hodowli tkankowej (100
l/studzienkę) wraz ze 100 l każdego stymulatora (jak
10 opisano w legendach do odpowiednich figur),
rozcieńczono do odpowiednich stężeń w kompletnej RPMI
1640. Konkanawalinę A (10 g/ml, Sigma) użyto jako
kontrolę dodatnią, a komórki hodowane z samą pożywką
stosowano jako kontrole ujemne. Każdą próbkę
15 splenocytów wysiano w trzech powtórzeniach, a komórki
inkubowano w nawilżanym inkubatorze w 5% CO2 w 37°C
przez 72 h. Nadsącza hodowlane zbierano na koniec
okresu inkubacji i przechowywano w -80°C do czasu
badania. Komercyjnie dostępne zestawy testowe (mysi
20 IFN- OptEIA, BD Pharmingen, Mississauga, ON)
zastosowano zgodnie z instrukcją producenta do
oznaczania stężenia IFN- w nadsączach hodowlanych.
Ocena ilościowa populacji CD8 dodatniej dla tetramerów

25 OVA
[0135] Zawiesiny splenocytów otrzymane jak opisano

powyżej zastosowano również do oceny ilościowej
populacji CD8+ dodatniej dla tetrameru OVA przy
30 zastosowaniu FACS. Splenocyty (2x106) z poszczególnych
śledzion przenoszono do probówek testowych 12x75 mm
88
zawierających 500 μl buforu do barwienia: DPBS

zawierającego 1% płodowej surowicy bydlęcej (HyClone,
Logan, UT) i 0,1% azydku sodu (Sigma). Komórki
odwirowano przy 1200 obrotów na minutę (rpm) przez 5
5 minut i usunięto nasdącz. Receptory Fc blokowano
poprzez inkubację komórek w 4°C przez 10 minut z
przeciwciałem anty-mysi CD16/CD32 (blok Fc) (BD
Pharmingen). Komórki przemyto buforem do barwienia i
barwiono przez 20 minut w 4°C przy użyciu swoistego dla
10 OVA (SIINFEKL) tetrameru klasy 1 (Beckman Coulter).
Następnie komórki znowu płukano buforem do barwienia i
barwiono przez 20 minut w 4°C przy zastosowaniu
przeciwciała anty-mysi CD8a-FITC (BD Pharmingen).
Komórki przepłukano buforem do barwienia, zawieszano
15 ponownie w 500 l buforu do barwienia i analizowano
przy użyciu cytometru przepływowego FC500 (Beckman
Coulter). Komórki T CD8 swoiste dla OVA zidentyfikowano
jako komórki, które były dodatnie zarówno dla CD8a jak
i dla tetrameru. Dane są wyrażone jako % komórek
20 dodatnich dla CD8 i tetrameru.
Ocena ilościowa populacji swoistych dla antygenu

komórek T wydzielających wiele cytokin
25 [0136] Połączone w pule zawiesiny splenocytów dla

każdej grupy stymulowano ponownie w 24-studzienkowych
płytkach do hodowli tkankowej w pożywce RPMI 1640 do
hodowli tkankowej (Hyclone, Logan, UT) uzupełnionej 2%
normalną mysią surowicą (Cedarlane Laboratories,
30 Ontario, Kanada), roztworem penicylina-streptomycyna
(końcowe stężenie, odpowiednio, 1000 U/ml i 1 mg/ml,
89
Invitrogen, Burlington, ON), L-glutaminą (końcowe

stężenie 2 mM; Invitrogen, Burlington, NA) i 5 x 10-5 M
β-merkaptoetanolu (Invitrogen, Burlington, ON).
[0137] Do ponownej stymulacji CD4: 5x106 komórek
5 stymulowano przez noc w końcowej objętości 1 ml,
zawierającej 5 g/ml HBsAg.
[0138] Do ponownej stymulacji CD8: 5x106 komórek
stymulowano przez 5 godzin w końcowej objętości 1 ml,
zawierającej 5 g/ml peptydu HBs peptydu
10 (IPQSLDSWWTSL).
[0139] Pożywkę bez stymulantów zastosowano jako
kontrolę ujemną, natomiast 10 ng/ml PMA (Sigma) i 1
g/ml jonomycyny (Sigma) [dodanych w ciągu ostatnich 4
godzin inkubacji] zastosowano jako kontrole dodatnie.
15 Dodatkowo, w ciągu ostatnich 4 godzin ponownej
stymulacji dodano Brefelden (BD Pharmingen) i monensynę
(BD Pharmingen) do zatrzymania transportu białek.
[0140] Po ponownej stymulacji, komórki przepłukano
buforem do barwienia i receptory Fc blokowano przez
20 inkubację komórek w 4°C przez 10 minut z przeciwciałem
anty-mysi CD16/CD32 (blok Fc) (BD Pharmingen).
Następnie komórki odwirowano i ponownie zawieszono w
buforze do barwienia zawierającym 5 g/ml przeciwciała
anty-mysi CD4-ECD (Invitrogen) albo anty-mysi CD8-ECD
25 (Invitrogen) i inkubowano przez 30 minut w 4°C. Komórki
przemyto buforem do barwienia i ponownie zawieszano w
roztworze BD Perm/Fix (BD Pharmingen) przez 20 minut w
4°C. Komórki płukano ponownie roztworem do płukania BD
Perm Wash solution (BD Pharmingen) i ponownie
30 zawieszono w 1 x roztworze do płukania BD Perm Wash
solution (BD Pharmingen) zawierającym 5 μg/ml każdego,
90
IL-2-FITC (BD Pharmingen), TNF-APC (BD Pharmingen) i

IFN--PeCy7 (BD Pharmingen), i inkubowano przez 20
minut w temperaturze pokojowej, chroniąc od światła.
Komórki płukano roztworem do płukania 1X BD Perm Wash
5 solution (BD Pharmingen) i ponownie zawieszono w
normalnym buforze do barwienia i analizowano przy
użyciu cytometru przepływowego FC500 (Beckman Coulter).
Wyniki
10
Humoralne odpowiedzi immunologiczne
[0141] Wszystkie trzy przetestowane ODN CpG (CPG

24555, 10103 i 7909) znacząco zwiększały miana
15 całkowitej IgG swoistej wobec HBsAg i OVA u myszy typu
dzikiego (p<0,05). Nie było istotnej różnicy między
trzema ODN CpG pod względem ich zdolności do
zwiększania całkowitej IgG swoistej wobec HBsAg i OVA u
myszy (Fig. 1).
20 [0142] Zdolność CPG 24555, CPG 10103 i CPG 7909 do
zwiększania mian przeciwciał u zwierząt z brakiem TLR9
badano przy użyciu OVA. Całkowite miana przeciwciał
wykrywane w 1. tygodniu po szczepieniu przypominającym
dla dowolnego trybu szczepienia były mniejsze niż 100 i
25 żaden z ODN CpG nie był zdolny do znacznego zwiększenia
miana przeciwciał przeciwko OVA w stosunku do tego,
kiedy szczepionkę stosuje się samą lub łącznie z ODN
bez CpG 2137 (dane nie pokazane).
[0143] U myszy rozkład izotypów IgG jest szeroko
30 stosowany jako wskaźnik natury odpowiedzi
immunologicznej, gdzie wysokie poziomy IgG2a lub IgG2c
91
wskazują na odpowiedź immunologiczną przesuniętą w

stronę Th1, natomiast wysokie miana IgG1 wskazują na
odpowiedź immunologiczną przesuniętą w stronę Th2.
Wszystkie trzy CpG ODN pomogły zaindukować silne
5 reakcje immunologiczne przesunięte w stronę Th1, ze
stosunkami IgG2a/IgG1 i IgG2c/IgG1 wynoszącymi  1
(Fig. 1) i ze znacząco zwiększonymi mianami IgG2a/c w
porównaniu do tego, kiedy antygen był stosowany sam
(p<0,05) (Fig. 2).
10
Komórkowe odpowiedzi immunologiczne: odpowiedzi CTL
[0144] Funkcjonalny sposób pomiaru odpowiedzi opartych

na Th1 to pomiar aktywności CTL przeciw komórkom
15 docelowym prezentującym antygen. Jak widać na Fig. 3,
wszystkie badane ODN CpG były zdolne do znaczącego
zwiększania swoistej dla antygenu odpowiedzi CTL
przeciwko OVA u myszy w porównaniu z tym, gdy antygen
był stosowany sam lub łącznie z ODN bez CpG 2137
20 (P<0,05, Fig. 3, panel prawy). Nie było znaczącej
różnicy pomiędzy testowanymi ODN CpG w promowaniu
indukcji CTL swoistych dla OVA z wyjątkiem stosunku E:T
wynoszącego 6,25:1, gdzie obie grupy, dla CPG 24555 i
CPG 7909, wykazały znacznie wyższy poziom CTL swoistych
25 dla OVA niż grupy otrzymujące CPG 10103.
[0145] W przypadku HBsAg, zarówno CPG 24555 jak i CPG
10103, ale nie CPG 7909 były zdolne do indukowania
znacznie wyższych odpowiedzi CTL swoistych dla
antygenu, gdy były stosowane samodzielnie. (P <0,05,
30 Fig. 3, panel lewy). Nie było znaczącej różnicy
pomiędzy CPG 10103 i CPG 24555 w ich zdolności do
92
promowania indukcji odpowiedzi CTL swoistej wobec HBsAg

u myszy.
[0146] Zwiększenia odpowiedzi CTL za pośrednictwem ODN
CpG nie obserwowano u myszy z brakiem TLR9 (Fig. 4).
5
Swoiste dla antygenu komórki T CD8
[0147] Swoiste tetramery MHC klasy I H-2Kb-SIINFEKL

stosowano do oceny odpowiedzi komórek T CD8 u myszy
10 immunizowanych OVA. Wszystkie badane ODN CpG zwiększały
poziom swoistych dla antygenu komórek T CD8 w
porównaniu z tym, kiedy OVA była stosowana sama lub
łącznie z kontrolnym ODN bez CpG, 2137 (Fig. 5). CPG
7909 był lepszy niż CPG 24555 i 10103 w promowaniu
15 indukcji komórek T CD8 swoistych dla OVA (P<0,05). Nie
było znaczącej różnicy pomiędzy CPG 24555 i 10103 w ich
zdolności do indukowania komórek T CD8 swoistych dla
OVA (P0,05).
[0148] Zwiększenia poziomu komórek T CD8 swoistych dla
20 OVA za pośrednictwem CPG nie obserwowano u myszy z
brakiem TLR9 (Fig. 5).
Swoiste dla antygenu wydzielanie IFN-
25 [0149] Badano także wytwarzanie interferonu gamma

(IFN-) w odpowiedzi na stymulację antygenem jako miarę
odporności komórkowej poprzez wykrywanie cytokiny w
nadsączu hodowlanym splenocytów stymulowanych ponownie
antygenem użytym do szczepienia, stosując test
30 immunoenzymatyczny. Nadsącza z hodowli splenocytów
zebranych ze zwierząt immunizowanych bądź HBsAg, bądź
93
OVA z użyciem CPG 24555 lub CPG 10103 wykazywały

znacząco wyższe poziomy IFN- w porównaniu z tymi
immunizowanymi samym antygenem. W przypadku stosowania
z HBsAg, CPG 24555 był znacząco lepszy w promowaniu
5 swoistego dla antygenu wydzielania IFN- w porównaniu z
CPG 10103 lub CPG 7909 (Fig. 6; panel lewy). W
przypadku stosowania z OVA, CPG 24555 był równy CPG
10103, ale lepszy niż CPG 7909 w promowaniu swoistego
dla antygenu wydzielania IFN- (Fig. 6, prawy panel).
10 [0150] Zwiększenia swoistego dla antygenu wydzielania
IFN- za pośrednictwem CPG nie obserwowano u myszy z
brakiem TLR9 (Fig. 7).
[0151] Według ostatnich ustaleń, wytwarzanie IFN-
przez komórki T samego nie jest predykcyjne dla
15 zdolności komórek T swoistych dla antygenu do
indukowania ochronnej odpowiedzi immunologicznej.
Dlatego też w tym badaniu ocenialiśmy zdolność
swoistych dla antygenu komórek T CD4 i CD8 do
wytwarzania IL-2, TNF-α i IFN- przy zastosowaniu
20 polichromatycznej cytometrii przepływowej.
[0152] W przypadku zarówno komórek T CD4 jak i CD8
zaobserwowano względnie niski poziom wydzielania IL-2 w
porównaniu z wydzielaniem IFN- i TNF-α (Fig. 8). W
przypadku komórek T CD4, CPG 24555 pomagały zaindukować
25 większy procent komórek T wydzielających dwie cytokiny
w porównaniu do CPG 10103 i 7909 (23% dla CPG 24555,
natomiast 4 i 6%, odpowiednio, dla CPG 10103 i 7909).
Ogólnie rzecz biorąc, zaobserwowano bardzo niski
procent swoistych dla HBsAg komórek T CD4
94
wytwarzających trzy cytokiny (2, 0 i 1%, odpowiednio

dla CPG 24555, 10103 i 7909) (Fig. 8A).
[0153] W przypadku komórek T CD8 zarówno CPG 24555 jak
i CPG 7909 pomagały zaindukować wysoki poziom komórek T
5 wydzielających dwie cytokiny w porównaniu do CPG 10103
(48 i 56%, odpowiednio, dla CPG 24555 i CPG 7909,
natomiast tylko 19% dla CPG 10103). Podobnie do komórek
CD4, obserwowano bardzo niski procent swoistych dla
HBsAg komórek T CD8+ wytwarzających trzy cytokiny (1, 0
10 i 0%, odpowiednio, dla CPG 24555, 10103 i 7909) (Fig.
8B).
Tabela 1: Udział procentowy swoistych dla HBsAg komórek

T CD4+, które są producentami jednej, dwóch lub trzech
15 cytokin wydzielających IFN- i/lub IL-2 i/lub TNF-α
Komórki T CD4 + Ag Ag + CpG Ag + CpG

sam 24555 10103
IFN-* 69% 53% 36%
TN F-α* 41% 65% 62%
IL-2* 15% 9% 6%
IFN-/IL-2 # 7% 2% 0%
IFN-/TNF-α # 10% 22% 2%
#
TNF-α/IL-2 8% 5% 2%
IFN-/IL-2/TNF-α 0% 2% 0%
% producentów jednej 75% 75% 96%

cytokiny
95
Komórki T CD4 + Ag Ag + CpG Ag + CpG

sam 24555 10103
% wytwarzających co najmniej 25% 25% 4%

dwie cytokiny
* wskazuje całkowity udział komórek wytwarzających te

cytokiny, czy są to pojedynczy, podwójni czy potrójni
producenci
#
oznacza całkowity udział komórek wytwarzających te
dwie cytokiny, czy są to podwójni czy potrójni
producenci
Tabela 2 Udział procentowy swoistych dla HBsAg komórek

T CD8+, które są producentami jednej, dwóch lub trzech
cytokin wydzielających IFN- i/lub IL-2 i/lub TNF-α
5
Komórki CD8 + T Ag Ag + CpG Ag + CpG
sam 24555 10103
IFN-* 63% 67% 76%
TNF-α* 42% 76% 37%
IL-2* 10% 7% 6%
IFN-/IL-2 # 5% 2% 0%
IFN-/TNF-α # 10% 47% 18%

#
TNF-α/IL-2 2% 2% 1%
IFN-/IL-2/TNF-α 2% 1% 0%
% producentów jednej 87% 51% 81%

cytokiny
96
Komórki CD8 + T Ag Ag + CpG Ag + CpG

sam 24555 10103
% wytwarzających co najmniej 13% 49% 19%

dwie cytokiny
* wskazuje całkowity udział komórek wytwarzających te

cytokiny, czy są to pojedynczy, podwójni czy potrójni
producenci
#
oznacza całkowity udział komórek wytwarząjacych te
dwie cytokiny, czy są to podwójni czy potrójni
producenci
Dyskusja
[0154] Zaprojektowano badania, aby porównać CPG 24555

5 z CPG 10103 i CPG 7909 pod kątem ich zdolności do
zwiększania swoistych dla antygenu odpowiedzi
immunologicznych u myszy, gdy są stosowane z dwoma
modelowymi antygenami: HBsAg i OVA. CPG 24555 i CPG
10103 mają identyczną sekwencję nukleotydową z tym
10 wyjątkiem, że CPG 24555 ma odwrócenie najbardziej
skrajnego po stronie 3' dinukleotydu CG, co prowadzi do
wyeliminowania motywu CpG w CPG 24555. CPG 7909 jest to
ODN CpG klasy B, dla którego udowodniono aktywność
adiuwantową w badaniach klinicznych u ludzi z wieloma
15 antygenami szczepionkowymi.
[0155] Eliminacja motywu 3' CpG w CPG 24555 nie ma
żadnego negatywnego wpływu na jego zdolność do
zwiększania swoistych dla antygenu odpowiedzi
immunologicznych i wykazała równe (odpowiedzi
20 przeciwciałowe i swoistych dla antygenu komórek T CD8,
97
co mierzono poprzez barwienie tetramerem) lub lepsze

(swoiste dla antygenu wydzielanie IFN-) zwiększanie
adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznej w porównaniu
do CPG 10103. Podobnie, CPG 24555 był taki sam jak CPG
5 7909 w zwiększaniu swoistych dla antygenu odpowiedzi
przeciwciałowych, jak również odpowiedzi CTL. CPG 24555
był lepszy niż CPG 7909 w promowaniu swoistego dla
antygenu wydzielania IFN-.
[0156] Zwiększanie adaptacyjnych odpowiedzi
10 immunologicznych dla wszystkich trzech testowanych ODN
CpG było zależne od TLR9, ponieważ nie widać było
zwiększania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej u
myszy z brakiem TLR9.
[0157] Jak pokazano w Tabeli 1, większą proporcję
15 swoistych dla antygenu komórek T CD4+ wytwarzających
IFN- otrzymano dla CPG 24555. Otrzymano również
większą proporcję wielofunkcyjnych, swoistych dla
antygenu komórek T CD4+, wytwarzających co najmniej
dwie cytokiny spośród IFN-, TNF-α i IL-2 (tj. zarówno
20 IFN- jak i TNF-α, zarówno IFN- jak i IL-2 lub zarówno
TNF-α jak i IL-2, albo nawet potrójnych producentów
wydzielających IFN-, TNF-α i IL-2).
[0158] Co się tyczy komórek T CD8+ (Tabela 2),
otrzymano większą proporcję wielofunkcyjnych, swoistych
25 dla antygenu komórek T CD4+, wytwarzających dwie
cytokiny, a w szczególności IFN- i TNF-α, zarówno
IFN- jak i IL-2.
[0159] Razem wziąwszy, wyniki te wskazują, że CPG
24555 jest lepszy niż CPG 10103 do wytwarzania
30 populacji wielofunkcyjnych, swoistych dla antygenu
98
komórek T, gdy jest on stosowany jako adiuwant. Może to

być ważne, ponieważ wielofunkcyjne komórki T,
szczególnie biorąc pod uwagę wytwarzanie chemokin
(takich jak IFN-, TNF-α i IL-2) uważa się za lepsze
5 komórki efektorowe w porównaniu do komórek T, które
wydzielają jedną cytokinę.
Przykład 2:
10 Porównanie CPG 24555 i CPG 10103
Sekwencje nukleotydowe badanych ODN
[0160]
15
CPG ODN 10103
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T'C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3' (NR
ID. SEKW.:2)
20 CPG ODN 24555

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T'C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (NR
ID. SEKW.:1)
ODN bez CpG 22881

25 5' T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*T*G*G*C*T*G*C*T*T*T*T 3' (NR
ID. SEKW.:4)
ODN bez CpG 2137

5' T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T
30 3' (NR ID. SEKW.:5)
99
* Oznacza wiązanie fosforotionianowe (PS)

Podkreślona część sekwencji reprezentuje różnicę między
CPG ODN 10103 i CpG ODN 24555.
Optymalny motyw CpG dla ludzi: GTCGTT
5
Odporność wrodzona w ludzkich PBMC
[0161] Ludzkie PBMC (5x106/ml) inkubowano z różnymi

stężeniami CPG 10103, CPG 24555 lub kontrolnym ODN bez
10 CpG 22881 przez 24 lub 48 h. Nadsącza komórkowe
zbierano i testowano pod kątem wydzielania
cytokin/chemokin przy zastosowaniu komercyjnego zestawu
ELISA (Fig. 9A i Fig. 9B).
15 Odporność wrodzona in vivo u myszy BALB/c
[0162] Myszom BALB/c (n=5/grupę) wstrzyknięto

podskórnie PBS (kontrola-placebo), CPG 24555, CPG 10103
lub kontrolny ODN bez CpG 2137 w dawce na poziomie 100
20 g. Zwierzętom pobierano krew w 3 godziny po
wstrzyknięciu i osocze badano pod kątem IP-10 (Fig.
10A) i IL-12 (Fig. 10B) lub IL-6 (Fig. 10C) przy
zastosowaniu komercyjnego testu ELISA. Przedstawione
wyniki są średnimi dla grupy ± błąd standardowy
25 średniej (NS = nie znaczący).
Odporność humoralna in vivo u myszy BALB/c
[0163] Myszom BALB/c wstrzykiwano domięśniowo HBsAg (1

30 g) z lub bez CPG 2455, CPG 10103 lub kontrolnego ODN
bez CpG 2137 w ilości 10 g. Myszom podawano zastrzyk w
100
dniu 0. i 14. Przedstawione wyniki są mianami swoistej

dla HBsAg całkowitej IgG po 2 tygodniach po szczepieniu
przypominającym mierzone w teście ELISA w punkcie
końcowym (Fig. 11A).
5 [0164] Myszom BALB/c wstrzykiwano domięśniowo OVA (20
g) z lub bez CPG 2455, CPG 10103 lub kontrolnego ODN
dniu 0.,7. i 21. Przedstawione wyniki są mianami
swoistych dla OVA całkowitej IgG po 1 tygodniu po
10 ostatniej dawce przypominającej (Fig. 11B).
[0165] Myszom BALB/c wstrzykiwano domięśniowo HA grypy
typu A z Teksas 1/77, H3N2 (1 g) ± ałun (25 g Al3+) z
lub bez CPG 2455, CPG 10103 lub kontrolnego ODN bez CpG
2137 w ilości 10 g. Przedstawione wyniki są kinetyką
15 dla swoistej dla HA całkowitej IgG w różnych czasach po
immunizacji mierzonej w teście ELISA w punkcie końcowym
(Fig. 11C).
Odpowiedzi komórek T u myszy BALB/c

20
dniu 0. i 14. Przedstawione wyniki to CTL swoiste dla
51
25 HBsAg mierzone poprzez uwolnienie Cr po 2 tygodniach
po dawce przypominającej (Fig. 12A).
[0167] Myszom BALB/c wstrzykiwano domięśniowo OVA (20
30 dniu 0.,7. i 21. Przedstawione wyniki to CTL swoiste
101
51
dla OVA mierzone poprzez uwalnianie Cr w 1 tydzień po
dawce przypominającej (Fig. 12B).
5 bez CpG 2137 w ilości 10 g. Myszom podawano zastrzyk w
dniu 0. i 14. Splenocyty z 2. tygodnia po ostatniej
dawce przypominającej inkubowano z odpowiednim
antygenem przez 72 godzin i nadsącza hodowlane badano
pod kątem IFN- przy zastosowaniu testu ELISA (Fig.
10 13A).
[0169] Myszom BALB/c wstrzykiwano domięśniowo OVA (20
dniu 0.,7. i 21. Splenocyty z 1 tygodnia po ostatniej
15 dawce przypominającej inkubowano z odpowiednim
antygenem przez 72 godzin i nadsącza hodowlane badano
pod kątem IFN- przy zastosowaniu testu ELISA (Fig.
13B).
20 Wyniki i dyskusja
[0170] CPG 10103 i CPG 24555 mają identyczne sekwencje

nukleotydowe z wyjątkiem odwrócenia najbardziej
skrajnego po stronie 3' dinukleotydu CG obecnego w CPG
25 10103 do GC w CPG 24555, co prowadzi w rezultacie do
eliminacji motywu CpG w CPG 24555. Na podstawie
poprzednich doniesień, mając taką samą sekwencję
flankującą, lokalizację i odstęp motywu, zwiększona
liczba motywów CpG powinna prowadzić do zwiększonej
30 immunostymulacji. Na podstawie dotychczasowego stanu
wiedzy spodziewano się, że CPG 24555 będzie mniej
102
immunostymulujący niż CPG 10103 i mniej skuteczny jako

adiuwant szczepionkowy. Jednakże, powyższe wyniki
wskazują, że CPG 24555 ma podobny lub większy potencjał
immunostymulacji i aktywność adiuwantową w porównaniu z
5 CPG 10103.
Przykład 3
Porównanie CPG 10103, CPG 24555 i CPG 7909 jako

10 adiuwantu szczepionkowego dla antygenu hemaglutyniny
grypy (HA) u myszy BALB/c
Materiały i metody
15 [0171] Samice myszy BALB/c (10/gp) immunizowano

poprzez domięśniowe (IM) wstrzyknięcie w lewy mięsień
piszczelowy przedni (TA, tibialis anterior)
hemaglutyniny (HA) grypy A z Teksas 1/77, H3N2 (1 g) ±
CpG lub kontrolnego ODN (10 mg) ± ałun (25 mg Al3+), w
20 całkowitej objętości 50 l. Myszom pobierano krew w
różnych odstępach czasu po immunizacji do oceny
odpowiedzi przeciwciał swoistych wobec HA. Połowę
zwierząt na grupę poddano eutanazji w 6 tyg. po
immunizacji, aby ocenić odpowiedzi immunologiczne, w
25 których pośredniczą komórki (CTL, swoiste dla HA
wydzielanie IFN- i analiza poprzez cytometrię
przepływową wydzielania cytokiny przez komórki T).
30
103
Tabela 3
Stężenie
Źródło, nr Stężenie
Odczynnik roztworu
partii końcowe
podstawowego
Antygen grypy Microbix

0,02
A (Teksas 1/77 Biosystems Inc. 1,0 mg/ml
mg/ml
H3N2) 13037A8
Ałun (Al3+)
0,5
Alhydrogel Cedarlane 85339 10,4 mg/ml
mg/ml
„85” 2%
CPG 7909 Coley, partia 37,15 mg/ml 0,2

ACZ-031-016-M mg/ml
CPG 24555 AVECIA, partia 17,75 0,2

(znany również # ASD-A0218-157 mg/ml
jako CPG [oznaczona jako
10103_GC4) CPG 10103]
CPG 10103 Dow Chemical, 24,51 mg/ml 0,2

partia # mg/ml
MM021230
Kontrolny ODN Coley, partia # 22,18 mg/ml 0,2

2137 008 mg/ml
PBS Sigma (P4244) N/A N/A

partia #
096K6064
5
104
Wyniki i dyskusja
Przeciwciała anty-HA w 6 tygodni po immunizacji
5 [0172] W 6 tygodni po immunizacji, mierzono ilość

przeciwciał anty-HA. CPG 24555 był lepszy niż CPG 10103
i CPG 7909 w zwiększaniu poziomu IgG swoistej wobec HA
(Fig. 14).
10 Miana dla hamowania hemaglutynacji (HIA) w 4 tygodnie

po immunizacji
[0173] Funkcjonalność przeciwciał badano stosując test

hamowania hemaglutynacji (HIA). Przy stosowaniu jako
15 adiuwant samodzielnie, CPG 24555 był lepszy niż CPG
10103 (p=0,009) i równy CPG 7909 (p=0,1) w zwiększaniu
mian HIA (Fig. 15). Wszystkie 3 badane ODN CpG były
równe w zwiększaniu mian HIA, gdy były stosowane
łącznie z ałunem.
20
Swoiste dla HA wydzielanie IFN-
[0174] Zmierzono stężenie wydzielanego IFN-. CPG

24555, gdy był stosowany samodzielnie jako adiuwant,
25 był lepszy niż CPG 10103 w zwiększaniu swoistego dla HA
wydzielania IFN- (marker odporności za pośrednictwem
komórek) (Fig. 16). Przy stosowaniu łącznie z ałunem,
CPG 24555 był lepszy niż CPG 10103 i CPG 7909 w
zwiększaniu swoistego dla HA wydzielania IFN- (Fig.
30 16).
105
Przykład 4
Porównanie CPG 24555 i CPG 7909 jako adiuwanta

szczepionkowego dla antygenu powierzchniowego wirusa
5 zapalenia wątroby typu B (HBsAg) u makaków jawajskich
Materiały i metody
[0175] Makaki jawajskie (3-5 lat; 2,5 do 5,5 kg,

10 n=5/gp, z wyjątkiem n=4 w grupie HBsAg + IMX)
immunizowano domięśniowo (wstrzyknięcie 0,6 ml IM w
prawy mięsień czterogłowy) przy zastosowaniu:
1) Engerix-B (dawka pediatryczna, 10 mg HBsAg)

15 2) Engerix-B + CPG 7909 (0,5 mg)
3) Engerix-B + CPG 24555 (0,5 mg)
[0176] Zwierzęta otrzymywały 3 immunizacje; w tygodniu

0 (pierwsze), 4 (przypominające 1) i 8 (przypominające
20 2). Zwierzętom pobierano krew przed pierwszą dawką, 4
tygodnie po pierwszej dawce (tydzień 4), 2 tygodnie po-
dawce przypominającej 1 (tydzień 6), 4 tygodnie po
dawce przypominającej 1 (tydzień 8) i 2 tygodnie po
dawce przypominającej 2 (tydzień 10).
25
Swoiste dla HBsAg testy immunologiczne wykonywano w
następujący sposób:
[0177]
30
1) Miana i zachłanność przeciwciał
106
2) Wewnątrzkomórkowe wydzielanie cytokin (IL-2,

IFN-, TNF-α)
3) Wielofunkcyjne komórki T
4) Test ELISPOT: IL2, TNF-α, IFN-, perforyna
5
Wyniki i dyskusja
Odpowiedzi humoralne
10 [0178] Możliwość wcześniejszej ekspozycji zwierząt w

tym badaniu na wirusa zapalenia wątroby typu B była
widoczna przez wysoki poziom miana przeciwciał
swoistych wobec HBsAg wykrytych przed szczepieniem.
Ponadto, jedno zwierzę w dostawie miało dodatni wynik
15 badań serologicznych dla HBV, co sugeruje możliwą
ekspozycję na HBV. Jednakże, wszystkie zwierzęta użyte
w tym badaniu miały ujemny wynik testu na obecność
wirusa HBV przy zastosowaniu reakcji PCR. Następowało
zwiększenie miana przeciwciał anty-HBsAg wraz z każdą
20 dawka przypominającą. Dodanie CpG do Engerix-B
zwiększało miana przeciwciał swoistych wobec HBsAg w
porównaniu do tego, kiedy Engerix-B był stosowany sam
(Fig. 17). Ponadto, dodanie CpG zwiększało zachłanność
przeciwciał w porównaniu do tego, kiedy Engerix-B był
25 stosowany sam (Fig. 18). CPG 24555 był równy CPG 7909 w
zwiększaniu zarówno miana, jak i zachłanności
przeciwciał.
30
107
Odpowiedzi komórek T: Wewnątrzkomórkowe wydzielanie

cytokin przez komórki T CD4
[0179] Dodanie CpG do Engerix-B prowadziło do

5 zwiększania częstości wydzielania za pośrednictwem
komórek T CD4 IFN- i TNF-α, ale nie IL-2 (Fig. 19A, B
i C). Ogólnie, CPG 24555 był równy lub lepszy niż CPG
7909 do indukcji cytokin za pośrednictwem CD4.
10 Odpowiedzi komórek T: Wielofunkcyjne komórki T CD4;

Analiza ilościowa
[0180] Liczbę komórek wydzielających jedną, dwie lub

trzy cytokiny zmierzono w tygodniu 10. (2 tygodnie po
15 dawce przypominającej 2). CPG 24555 był równy CPG 7909
w indukowaniu swoistych dla Engerix-B komórek T CD4
wydzielających jedną cytokinę. Ogólnie rzecz biorąc,
wykrywano stosunkowo niski poziom komórek T CD4
wytwarzających trzy cytokiny. Jednak CPG 24555
20 indukował wyższy poziom komórek T CD4 wytwarzających
trzy cytokiny niż CPG 7909 lub tylko Engerix-B (Fig.
20A). Ponadto, zwierzęta immunizowane Engerix-B + CPG
24555 miały wyższą proporcję komórek T wytwarzających
trzy cytokiny w porównaniu do zwierząt immunizowanych
25 samym Engerix-B lub Engerix-B + CPG 7909 (Fig. 20B).
Odpowiedzi komórek T: Wielofunkcyjne komórki T CD4;

Analiza jakościowa
30 [0181] Mierzono liczbę komórek wydzielających IL-2,

IFN- i TNFa lub kombinacje tych cytokin. CPG 24555
108
była równy lub lepszy niż CPG 7909 do indukcji

wielofunkcyjnych komórek T (Fig. 21A i Fig. 21B).
Odpowiedzi komórek T: Wielofunkcyjne komórki T CD4

5
[0182] Proporcję komórek T CD4 wytwarzających trzy
cytokiny mierzono w 2 tygodnie po dawce przypominającej
2. Obserwowano wyższą proporcję komórek T CD4
wytwarzających trzy cytokiny dla CPG 24555 niż dla CPG
10 7909.
Wnioski
[0183] Na podstawie danych, eliminacja motywu 3’ CpG w

15 CPG 24555 nie miała żadnego negatywnego wpływu na jego
zdolność do zwiększania swoistych dla antygenu
odpowiedzi immunologicznych i pokazała takie samo lub
lepsze zwiększanie adaptacyjnej odpowiedzi
immunologicznej w porównaniu do CPG 10103 i CPG 7909.
20 Aktywność adiuwantowa CPG 24555 widoczna z wieloma
antygenami u myszy przekładała się również na naczelne
inne niż człowiek, przy czym CPG 24555 wykazywał równą
(odporność humoralna) lub lepszą (wielofunkcyjne,
swoiste dla Ag komórki T) aktywność adiuwantową
25 wzgledem CPG 7909 z antygenem powierzchniowym wirusa
zapalenia wątroby typu B u makaków jawajskich.
109
Lista sekwencji
[0184]
<110> Pfizer Inc.
5 Davis, Heather
Weeratna, Risini
<120> OLIGONUKLEOTYDY IMMUNOSTYMULUJĄCE
<130> PC33856A
<140> Jeszcze nie przypisany
10 <141> 2009-11-04
<150> 61/181,799
<151> 2009-05-28
<150> 61/121,022
<151> 2008-12-09
15 <160> 5
<170> PatentIn wersja 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
20 <213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Oligonukleotyd syntetyczny
<400> 1
25 <210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
30 <223> Oligonukleotyd syntetyczny
<400> 2
<210> 3
<211> 24
110
<212> DNA
<220>
5 <400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
10 <213> Sekwencja sztuczna
<220>
<400> 4
15 <210> 5
<211> 24
<212> DNA
<220>
20 <223> Oligonukleotyd syntetyczny
<400> 5
25
Coley Pharmaceutical Group, Inc.
Pełnomocnik:
111
Zastrzeżenia patentowe
1. Oligonukleotyd immunostymulujący zawierający

sekwencję nukleotydową 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (NR
5 ID. SEKW.: 1).
2. Oligonukleotyd immunostymulujący według

zastrz. 1, który to oligonukleotyd zawiera jedno lub
więcej zmodyfikowanych wiązań.
10
zastrz. 2, który to oligonukleotyd zawiera jedno lub
więcej wiązań fosforotionianowych.
15 4. Oligonukleotyd immunostymulujący według

zastrz. 3, w którym wszystkie wiązania
międzynukleotydowe oligonukleotydu są wiązaniami
fosforotionianowymi.

dowolnego z zastrz. 1 do 4, który to oligonukleotyd
zawiera co najmniej jeden lipofilowy podstawiony analog
nukleotydu i dinukleotyd pirymidyna-puryna.
25 6. Oligonukleotyd immunostymulujący składający

się z sekwencji nukleotydowej 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT
3' (NR ID. SEKW.: 1).
7. Oligonukleotyd immunostymulujący składający

30 się z 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3',
gdzie * oznacza wiązanie fosforotionianowe.
112
8. Szczepionka zawierająca antygen i

oligonukleotyd immunostymulujący według dowolnego z
zastrz. 1 do 7, zawierająca ponadto farmaceutycznie
dopuszczalny nośnik.
5
9. Szczepionka według zastrz. 8, w której
oligonukleotyd immunostymulujący jest w ilości
skutecznej do indukcji odpowiedzi immunologicznej
swoistej dla antygenu.
10
indukowaną odpowiedzią immunologiczną swoistą dla
antygenu jest odpowiedź immunologiczna Th1.
15 11. Szczepionka według dowolnego z zastrz. 8 do

10, w której antygenem jest antygen drobnoustrojowy,
autoantygen lub substancja uzależniająca.

20 antygenem drobnoustrojowym jest antygen bakteryjny,
antygen wirusowy lub antygen pasożytniczy.
25 a) antygen bakteryjny jest związany ze

Staphylococcus aureus, bakterią, która powoduje
próchnicę zębów, lub bakterią, która powoduje choroby
przyzębia;
b) antygen wirusowy jest związany z syncytialnym
30 wirusem oddechowym (RSV), wirusem opryszczki pospolitej
113
1, wirusem opryszczki pospolitej 2, ludzkim wirusem

niedoboru odporności 1 (HIV-1) lub HIV-2, albo
c) antygen pasożytniczy jest związany z
pasożytem, który powoduje malarię.
5
autoantygenem jest antygen nowotworowy, antygen
związany z chorobą Alzheimera, antygen wobec ludzkiego
przeciwciała albo antygen, który ulega ekspresji z
10 ludzkich endogennych elementów retro wirusowych, albo
hapten nikotynowy sprzężony z nośnikiem.
15 a) antygenem nowotworowym jest HER2, MAGE, NY-

ESO, PSA, CEA lub wariantowa forma EGFR;
b) antygenem związanym z chorobą Alzheimera jest
tau lub β-amyloid;
c) antygenem jest IgE; lub
20 d) nośnikiem, z którym jest sprzężony hapten
nikotynowy, jest toksyna błonicy (DT).

antygenem jest peptyd, rekombinowane białko,
25 oczyszczone białko, cały zabity patogen, żywy,
atenuowany wirus lub wektor wirusowy, żywe atenuowane
bakterie lub wektor bakteryjny, polisacharyd, hapten,
albo antygen jest kodowany przez plazmidowy DNA.
30 17. Szczepionka według dowolnego z zastrz. 8 do

16, w której antygen jest sprzężony z nośnikiem.
114

nośnikiem jest toksyna błonicy (DT) lub cząstka
wirusopodobna, przy czym cząstką wirusopodobną jest fag
RNA Q-β, antygen powierzchniowy wirusa zapalenia
5 wątroby typu B (HBsAg) lub antygen rdzeniowy wirusa
zapalenia wątroby typu B (HBcAg).
19. Szczepionka według dowolnego z zastrz. 8 do

18, zawierająca ponadto jeden lub kilka adiuwantów.
10
adiuwantem jest sól glinu, kompleks immunolostymulujący
(ISCOM), emulsja olej-w-wodzie lub woda-w-oleju,
liposom lub system dostarczania.
15
21. Szczepionka według zastrz. 20, w której solą
glinu jest wodorotlenek glinu.
22. Szczepionka według dowolnego z zastrz. 8 do

20 21, w której
a) szczepionka jest sporządzana do podawania

drogą pozajelitową, przy czym droga pozajelitowa jest
domięśniowa, podskórna, śródskórna, dożylna lub
25 dootrzewnowa; albo
b) szczepionka jest sporządzana do podawania
drogą miejscową, przy czym drogą miejscową jest skóra,
droga przezskórna lub powierzchnia śluzówki.
115
23. Szczepionka według zastrz. 22, gdzie droga

śluzówkowa jest doustna, donosowa, dopochwowa,
doodbytnicza, dopoliczkowa lub dooczna.

dowolnego z zastrz. 1 do 7 do zastosowania jako lek.

dowolnego z zastrz. 1 do 7 do zastosowania jako
10 adiuwant w szczepionce.
Coley Pharmaceutical Group, Inc.

Pełnomocnik:
116
117
118
119
10
120
10
121
5
122
123
5
124
125
126
127
128
5
129
5
130
5
131
5
132
5
133
134

Oligonukleotydy Immunostymulujące - Patent

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Oligonukleotydy Immunostymulujące - Patent

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2376107

(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:

(54) Tytuł wynalazku:

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

19.10.2011 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/42

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

30.09.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/09

(73) Uprawniony z patentu:

Coley Pharmaceutical Group, Inc., New York, US

(72) Twórca(y) wynalazku:

HEATHER LYNN DAVIS, Ottawa, CA

17/P34537PL00 EP 2 376 107

[0002] DNA bakteryjny ma działanie immunostymulujące

CpG. Takie ODN CpG mają wysoce immunostymulujące efekty

ku zaskoczeniu, zachowuje swoją aktywność

[0005] W aspektach wynalazku, dostarczony jest

drobnoustrojowy, autoantygen lub substancja

jest hapten nikotynowy, jest toksyna błonicy (DT, ang.

wykonaniach, solą glinu jest wodorotlenek glinu. W

antygenu u osobnika potrzebującego takiego leczenia

retrowirusowych. W dalszych wykonaniach, antygenem

wykonaniach, pochodną LPS jest MPL lub GLA. W innych

dootrzewnowa. W jeszcze innych wykonaniach, szczepionka

Fig. 1: Zwiększenie humoralnej odpowiedzi

całkowitej IgG, IgG1 i IgG2a/c (anty-HBs i anty-OVA).

10 Fig. 2: Natura humoralnej odpowiedzi

Fig. 3: Odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T

Fig. 4: Brak wzmocnienia odpowiedzi CTL, w której

Fig. 5: Swoiste wobec OVA komórki T CD8 u myszy

Fig. 6: Swoiste dla antygenu wydzielanie IFN- u

g OVA (panel po prawej stronie) bez adiuwanta lub

10 Fig. 7: Brak wzmocnienia w swoistym dla antygenu

20 Fig. 8: Swoiste dla antygenu populacje komórek T

Fig. 9: Wrodzona odporność w ludzkich PBMC.

20 Fig. 11: Odporność humoralna in vivo u myszy

przypominającej. Fig. 11C pokazuje kinetykę całkowitej

20 Fig. 13: Odpowiedzi komórek T u myszy BALB/c.

0.; 7. i 21. Splenocyty z 1 tygodnia po ostatniej dawce

Fig. 15: Miana hamowania hemaglutynacji (HIA) w 4

Fig. 16: Swoiste dla HA wydzielanie IFN. Samice

8. Zwierzętom pobierano krew w regularnych odstępach

Fig. 20: Odpowiedzi komórek T: wielofunkcyjne

Fig. 21: Odpowiedzi komórek T: wielofunkcyjne

5 NR ID. SEKW.: 1 - sekwencja nukleotydowa

[0014] Aspekty wynalazku są oparte, w części, na

TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (ODN CPG 24555; NR ID. SEKW.:

wytworzona z użyciem CPG ODN 24555 jako adiuwanta

antygenu pod względem wytwarzania chemokin (takich jak

oligorybonukleotydów (tj. polinukleotyd minus fosforan)

modyfikacje mogą być wybrane spośród: a) zastąpienia

aminouracylu, 5-(C1-C6)-alkilouracylu, 5-(C2-C6)-

5' cytozyna, po której następuje 3' guanozyna i

bromowinylo-uracyl, 4-tio-uracyl, 5-hydroksy-uracyl, 5-

drugorzędowej. Kwasy nukleinowe, które mają długość

automatycznych wykorzystujących reakcje chemiczne bądź

patentowych PCT PCT/US95/01570 (WO 96/02555) i

ugrupowanie tlenowe jest alkilowane. Pokazano również,

ugrupowanie fosforanu tri- lub tetraetylenoglikolowego

przez halogen, alkil, alkoksy, nitro, cyjano i gdzie R1

stabilizowanych immunostymulujących kwasów

[0041] Kwasy nukleinowe zawierają również kwasy

węglowodanowe modyfikacje i zastąpienia w szkielecie,

[0045] Oligonukleotydy według wynalazku mogą być

jak opisano w patencie USA nr 4,469,863, a