Universiteit Utrecht

Biomedische Wetenschappen

Moleculen
2019-2020
Blok I-3 tijdslot BC

Blokboek: Eiwitten en Enzymen

1
2
 Hoorcolleges Eiwitten & Enzymen

Het doorlezen, of beter nog, bestuderen van de aangegeven hoofdstukken

voorafgaand aan de hoorcolleges zal het veel gemakkelijker maken om deze te
volgen en vragen te stellen over zaken die (nog) niet duidelijk te zijn.

Colleges 1 en 2
Hoofdstuk 2, 3, 6 en 8.1, 8.3 van Tymoczko, Hoofdstuk 2 blz 51-73, Hoofdstuk 3
blz.109-134, blz141 laatste paragraaf van Alberts
Algemene opbouw Eiwitten, Eiwitstructuur en Katalyse benaderd vanuit de
Thermodynamica

Inhoud: Opbouw en structuur van eiwitketens; Wat bepaalt zowel de vouwing van
eiwitten als het verloop van een chemische reactie? De essentie van een
chemische reactie wordt verklaard mbv de wetten van de thermodynamica. Wat
zijn enzymen en wat doen ze met een chemische reactie? Katalytische principes
van enzymen, toegelicht aan de hand van het protease chymotrypsine
Nuttige links:
Thermodynamica: http://www.chem1.com/acad/webtext/thermeq/
http://ccnmtl.columbia.edu/projects/biology/lecture8/index.htm
Werking serine protease: http://www.bio.cmu.edu/courses/03231/Protease/SerPro.htm
http://telstar.ote.cmu.edu/biology/animation/SerineProtease/SerineProtease_bc.html

Colleges 3 en 4
Hoofdstuk 7.3 en Hoofdstuk 9 van Tymoczko, Hoofdstuk 3 blz. 149-153 van
Alberts.
Allosterische regulatie van enzymen en de biochemie achter zuurstofopslag en
-transport door myoglobine en hemoglobine

Inhoud: Relatie tussen structuur en functie van hemoglobine voor en na binding

aan zuurstof; Hoe kunnen allosterische enzymen ‘informatie uit de cel’ omzetten
in functie?
Nuttige links:
Myo- en Hemoglobine: http://higheredbcs.wiley.com/legacy/college/boyer/0471661791/structure/HbMb/hbmb.htm
http://en.wikipedia.org/wiki/Hemoglobin
http://biochem.web.utah.edu/iwasa/projects/hemoglobin.html

3
4
Colleges 5 en 6
Hoofdstuk 7 en 8.1,8.2 van Tymoczko, Hoofdstuk 3 blz.142-143, 153-159 van
Alberts
Enzymkinetiek / Enzymologie, Regulatie-mechanismen

Inhoud: Michaelis-Menten model van de eigenschappen van enzymen. Werking

van remmers, zowel competitieve, oncompetitieve en niet-competitieve.
Regulatie-strategiën, waaronder fosforylatie.
Nuttige links:
Enzymkinetiek: http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/animations.htm en klik op
"Catalysis"
Remmers: http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/animations.htm en klik op
"Enzyme Inhibition"

Colleges 7 en 8
Hoofdstuk 5 van Tymoczko, Hoofdstuk 8 blz.445-463 van Alberts
Eiwit-technieken: Eiwitzuivering en -detectie

Inhoud: Scheidingstechnieken: elektroforese, kolomchromatografie, centrifugatie.

Gebruik van antilichamen bij eiwitanalyse: immunoprecipitatie, immunoblotting en
ELISA. Bepaling aminozuurvolgorde en driedimensionale structuur van eiwitten:
massa spectrometrie en kristallografie.
Nuttige links:
Kristallografie: http://en.wikipedia.org/wiki/X-ray_crystallography
Massa spectrometrie: http://en.wikipedia.org/wiki/Mass_spectrometry

5
 ZELFSTUDIES
In het college wordt de grote lijn behandeld en in de zelfstudie bekijk je de stof
nog eens (zo mogelijk vanuit een iets andere hoek) en bestudeer je ook
zelfstandig een paar kleinere onderdelen die op college niet of nauwelijks aan de
orde zijn gekomen. Colleges en de daarbij horende zelfstudies vormen één
geïntegreerd geheel. Het uitvoeren van de zelfstudies is een vereiste voor
het vruchtbaar volgen van werkcolleges en practica.

Voor de zelfstudies zal je (gemiddeld) minder dan 2 uur nodig hebben;

zelfstudie 3 neemt meer tijd in beslag. Hier is dan ook tijd voor ingepland in
het onderwijsrooster.

De zelfstudies hebben steeds ongeveer dezelfde structuur:

-"Bestudeer blz … " of "Lees § .. (blz ..)" dan wordt daar steeds bedoeld blz. of §
van “Biochemistry A Short Course” van Tymoczko, Berg & Stryer, 4th
International edition. Het teken § staat voor paragraaf. In sommige gevallen
wordt verwezen naar Molecular Biology of the Cell 6th edition van Alberts c.s.
Vaak wordt min of meer dezelfde stof behandeld in beide boeken. Het kan soms
helpen om te kijken of je iets duidelijker beschreven vindt in het andere boek.
Ook heeft Tymoczko over het algemeen een meer biochemische en Alberts een
meer celbiologisce invalshoek.

-Verwijzingen naar figuren uit Molecular Biology of the Cell van Alberts c.s. zijn
aangegeven met Alberts Fig. ..-..

-Tussendoor staan steeds vragen waarmee je kunt toetsen of je de stof beheerst.

Met behulp van deze vragen en opdrachten word je door de stof geleid en wordt
ook duidelijk gemaakt wat de hoofdzaken zijn.

Alle antwoorden moet je zelf kunnen vinden met behulp van bovengenoemde
boeken of de syllabus. De antwoorden worden dan ook niet beschikbaar gesteld.

-Let op: in de instructies wordt duidelijk onderscheid gemaakt tussen "doorlezen"

en "bestuderen".

-Aan het eind van iedere zelfstudie staan omschrijvingen van de losse
onderdelen van de stof, waarmee je kunt toetsen of je kennis op niveau is.

-Zowel in Tymoczko als Alberts staan oefenvragen (met antwoorden) aan het
einde van de hoofdstukken. Maak hier gebruik van om te kijken hoe goed je de
stof beheerst.
-De opbouw van de zelfstudies verschaft ook duidelijkheid over het verwachte
kennisniveau.
6
7
 Zelfstudie 1
Hoofdstuk 2, 3, 6 en 8.1, 8.3 van Tymoczko, Hoofdstuk 2 blz 51-73, Hoofdstuk 3
blz.109-134, blz141 laatste paragraaf van Alberts. Algemene opbouw Eiwitten,
Eiwitstructuur en Katalyse benaderd vanuit de Thermodynamica

De eerste twee delen van deze zelfstudie vormen een herhaling van een deel
van de stof die in het blok “Cellen” aan de orde is geweest.

Zelfstudie 1A: Algemene opbouw eiwitten: aminozuren en

peptideketens
1.Bestudeer § 3.1 "Proteins are built from a repertoire of 20 amino acids",

2.De 20 aminozuren die als bouwsteen in eiwitten fungeren, hebben de volgende

algemene structuur:
R3
I
H2N - C – C2OOH
1

I
H4

De groepen hebben ‘prioriteit’ gekregen op basis van atoomgetal, waarbij N de

hoogste prioriteit krijgt (1) en H de laagste (4). Prioritering is van belang om de
isovorm van het aminozuur te kunnen bepalen (zie hieronder). Het C- atoom
heet zo omdat het de eerste groep naast de carboxylgroep is.

De hierboven gegeven formule is voor alle 20 aminozuren die in eiwitten

voorkomen gelijk, afgezien van de R-groep. De R-groep, de zijketen, is voor alle
20 aminozuren verschillend. Indien b.v. de R-groep een CH3-groep is, hebben
we te maken met het aminozuur alanine (= 2-aminopropaanzuur).

Bij alle aminozuren, behalve glycine waarbij R=H, is Catoom asymmetrisch.

Van alle aminozuren (behalve dus glycine) kennen we dus twee vormen, die
worden aangeduid als D en L. D en L slaan op de z.g. absolute configuratie en
vormen elkaars spiegelbeeld. Zie Tymoczko Fig. 3.1.
De L-aminozuren hebben een draairichting van hoge naar lage prioriteit (NH3 >
COOH > R) tegen de klok in (zie figuur hieronder).

8
Als je van NH2 via
COOH naar R draait
om het C atoom
draai je -bij de L-
isomeer linksom en
 pl aat j e l i nks de L
en recht s de D
i someer. Bron:
Wiki pedi a (),
unknown source.

In natuurlijke eiwitten op aarde worden (op een paar exotische uitzonderingen in

enkele bacteriën na) alleen L-optische isomeren van aminozuren aangetroffen.

3.Bestudeer § 3.2. Aminozuren kunnen op de volgende manier overzichtelijk

ingedeeld worden:

Aminozuren met hydrofobe zijketens.

De aminozuren van deze groep bezitten een hydrofobe of apolaire zijketen. Deze
zijketens steken in het eiwit meestal naar binnen, aangezien ze een zeer geringe
affiniteit tot water hebben. Tot deze groep behoren de aminozuren: glycine,
alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline en fenylalanine.
(Tymoczko Fig. 3.3)

Aminozuren met zijketens die bij neutrale pH een polair karakter hebben.
Tot deze groep behoren aminozuren met een zijketen die bij neutrale pH geen
formele lading draagt, maar wel een polair karakter heeft. Bij een covalente,
homopolaire binding vindt de binding tussen 2 atomen plaats middels een
gemeenschappelijk elektronenpaar, dat normaliter gelijk gedeeld is tussen de
bindingspartners (b.v. H:H voor een molecuul H 2). De elementen zuurstof,
stikstof en zwavel zijn sterk elektronegatieve elementen die de twee
bindingselektronen sterk naar zich toe trekken, vooral als de bindingspartner een
lichte kern als waterstof is. De polaire, (bij fysiologische pH overwegend) niet
geladen aminozuren zijn: serine, cysteïne, asparagine, glutamine, threonine en
tyrosine, die stikstof, zuurstof of zwavel in de zijketen hebben. N.B. Serine,
threonine en tyrosine bevatten in de zijketen een –OH groep die gefosforyleerd
kan worden. Zie Tymoczko Fig. 3.4

Aminozuren met zijketens die bij neutrale pH positief geladen zijn.

Voorbeelden: lysine, arginine en histidine (gedeeltelijk). Zie Tymoczko Fig. 3.5,
3.6.

Aminozuren met zijketens die bij neutrale pH negatief geladen zijn.

Voorbeelden: asparaginezuur en glutaminezuur. Deze bevatten een
carboxylgroep in de zijketen die bij neutrale pH gedissociëerd is (respectievelijk
aspartaat en glutamaat). Zie Tymoczko Fig. 3.7

De laatste drie groepen samen noemt men de aminozuren met hydrofiele

zijketens. Om dit te begrijpen moeten we eerst enige achtergrondinformatie over
de eigenschappen van water hebben. Water heeft, vergeleken met de meeste
andere vloeistoffen, een relatief hoog kookpunt en een grote
verdampingswarmte. Dit is te verklaren door sterke aantrekkingskrachten tussen
watermoleculen onderling. Dit komt door het sterk polaire karakter van een
watermolecuul. Ieder watermolecuul kan in principe vier andere watermoleculen
binden (zie Tymoczko fig. 2.1 op blz. 19). Deze binding vindt plaats d.m.v.

9
waterstofbruggen. De binding via een waterstofbrug is ongeveer 20 maal
zwakker dan die van een covalente binding.
De waterdipolen oriënteren zich ook rond de lading van de hydrofiele zijketens.
In de meeste gevallen vinden we de hydrofiele zijketens ook aan de buitenzijde
van de meeste eiwitmoleculen die opgelost zijn in een waterig milieu (zoals
bijvoorbeeld het cytoplasma).

Net zo goed als je met 26 letters in een alfabet een oneindig aantal verschillende
boeken kunt schrijven, kun je met 20 aminozuren een zeer grote
verscheidenheid aan eiwitten samenstellen. Je zou alleen al 20x20x20=
203=8000 verschillende tripeptiden kunnen maken.

Vraag 1.
Proline heeft een bijzondere structuur vergeleken met de andere aminozuren.
Wat is het verschil, en wat zijn de gevolgen daarvan voor de structuur van
eiwitten?

Vraag 2.
GABA (gamma-aminoboterzuur, een neurotransmitter) en 3-alanine (onderdeel
van vitamine B) hebben ook een amino-groep en een carboxylgroep. Wat is het
verschil met de aminozuren waaruit eiwitten zijn opgebouwd?
+
H3N - CH2 - CH2 - CH2 - COO- +
H3N- CH2 - CH2 - COO-
GABA 3- Alanine

4.Bestudeer § 4.1 "Primary structure: Amino acids are linked by peptide bonds to
form polypeptide chains", blz. 50-54.

Vraag 3.
Wat is het verschil tussen cysteïne en cystine?

Vraag 4.
In insuline zitten twee soorten disulfide-bruggen (zie Fig.4.5). Wat is het verschil?

5.Bestudeer in § 4.1 het stukje "Proteins have unique amino acid sequences that
are specified by genes" blz. 51-52

Vraag 5.
Wat kan de primaire structuur van een eiwit ons leren?

Vraag 6.
Geef een definitie van de peptidebinding, de hoofdketen, de zijketens, disulfide
bindingen in polypeptiden.

Vraag 7.

10
Hoe "groot" zijn eiwitten eigenlijk? (Geef de grenzen van de molecuulgewichten
aan voor eiwitten zoals die in de natuur voorkomen)

Vraag 8.
Noem ten minste 3 manieren waarop de cel ná de synthese de polypeptide-keten
kan veranderen.

Na dit deel van deze zelfstudie dien je:

- de algemene structuur van een aminozuur te kunnen tekenen, en de volgende
karakteristieken die
alle aminozuren gemeen hebben te kunnen aangeven: de functionele groepen,
de zijketens en
de ion-vormen,
- de hydrofiele en hydrofobe eigenschappen van aminozuren te kunnen verklaren
met behulp van
hun structuur,
- te kunnen verklaren hoe de lading van aminozuren afhangt van de pH,
- een peptidebinding te kunnen tekenen,
- te kunnen uitleggen welke rol disulfide bruggen spelen bij het tot stand komen
van de driedimensionale structuur van eiwitten.

N.B.
De exacte structuurformules van de 20 aminozuren worden niet op het
tentamen gevraagd. Je moet de structuurformules wel herkennen. Ook dien
je te weten tot welke categorie de verschillende aminozuren behoren en
behoor je te weten welke functionele groep in de zijketen van de
verschillende aminozuren zit en wat dat betekent voor bijv. de lading.
b.v. threonine: zijketen bevat OH-groep
glutamine: zijketen bevat amide-groep
aspartaat: zijketen bevat COOH-groep
phenylalanine: zijketen bevat aromatische groep.

Zelfstudie 1B: Algemene opbouw eiwitten: hogere orde

structuren van peptideketens
Hier zullen de verschillende organisatieniveaus van de bouw van eiwitten
omschreven worden. Bovendien komt er aan de orde welke krachten betrokken
zijn bij het tot stand komen en het stabiliseren van elk van die structuren.

6.Lees aandachtig Hoofdstuk 4 blz.49-52

Vraag 9.

11
Wat is het belang van de 3D-structuur van een eiwit?

7.Lees aandachtig §4.1 het stukje “Polypeptide chains are flexible yet
conformationally restricted” op blz.52-54

8.Alvorens in te gaan op de verschillende eiwitstructuren is het zinvol na te gaan

welke krachten betrokken zijn bij het tot standkomen en handhaven van de
eiwitstructuur in z'n geheel. Lees daarom aandachtig § 2.3 en 2.4 “weak
interactions are important biochemical properties" blz.20-26

Vraag 10.
Vergelijk de waterstofbrug in de -helix van eiwitten met die van de dubbele helix
van DNA. Maak duidelijk wat de rol van waterstofbruggen is in het stabiliseren
van deze twee structuren.

9. Lees aandachtig de §4.2 “Secundary structure: Polypeptide chains can fold

into regular structures" blz. 54-57.

Vraag 11.
Wat is de vorm en het patroon van de waterstofbruggen in de -helix en -
(pleated)-sheet ?

10.Bestudeer het stukje "Polypeptide chains can change direction by making

reverse turns and loops.” Blz 57.

11.Lees § 4.3 "Tertiairy structure: Water-soluble proteins fold into compact

structures" blz.60-62.

Vraag 12.
Welke interactie tussen zijketens van aminozuren stabiliseert de 3D-structuur
van eiwitten?

Vraag 13.
Beschrijf de primaire, secundaire, tertiaire en quaternaire structuur van eiwitten.

12.De tertiaire structuur van een eiwit is niet toevallig en is even specifiek voor
een eiwit als de aminozuurvolgorde. Sterker nog: de aminozuurvolgorde bepaalt
de tertiaire structuur. Elk eiwit kent slechts één optimale natuurlijke opvouwing:
de natieve structuur. In de natieve structuur heeft het eiwit een conformatie met
de laagst mogelijke energie-toestand. Dit is onder andere uitgelegd in § 4.5 "The
amino acid sequence of a protein determines its three dimensional structure" het
stukje “Proteins fold by the progressive stabilization…etc”
De sterke neiging van hydrofobe zijketens van bepaalde aminozuren om zich van
water af te keren is de drijvende kracht achter het opvouwen van oplosbare
eiwitten. De polypeptideketen vouwt daarom spontaan zodanig op dat hydrofobe

12
zijketens naar binnen afgeschermd worden van water en de polaire en geladen
zijketens op het oppervlak terecht komen.

Vraag 13.
Hierboven is uitgelegd dat in de natieve structuur het eiwit een conformatie heeft
met de laagst mogelijke energie-toestand. Maar het veranderen van een
aminozuur in de sequentie, bijvoorbeeld als gevolg van een DNA mutatie, zou
het eiwit nog meer kunnen stabiliseren en in een nog lagere energie-toestand
kunnen brengen. Waarom zorgt evolutie (mutatie en selectie) er niet voor dat de
eiwitten in ons lichaam niet altijd een conformatie krijgen met een nog lagere
energie-toestand?

Een gekookt eitje is een voorbeeld van gedenatureerde eiwitten. Denaturatie van
eiwit is niet altijd irreversibel. Om enig inzicht te krijgen in het fenomeen van
denaturatie lees je § 4.5 "The amino acid sequence of a protein determines its
three dimensional structure" . blz. 63-64.
(Dit is ook uitgebreid aan de orde geweest bij het practicum ‘Eigenschappen van
eiwitten” in het blok “Cellen”)

Na dit deel van de Zelfstudie dien je:

- de verschillende organisatieniveaus van de bouw van eiwitten te kunnen
beschrijven,
- te weten waaruit de primaire structuur van een eiwit bestaat,
- uit te kunnen leggen op welke manier een -helix, een β-pleated sheet en een
β-turn tot stand
komen en welke krachten daarbij een rol spelen,
- te kunnen beschrijven welke interacties betrokken zijn bij de tertiaire structuur
van een eiwit,
- te weten wat de quaternaire structuur van een eiwit is en hoe die tot stand
komt,
- het onderscheid aan te kunnen geven tussen een natief en een gedenatureerd
eiwit

Zelfstudie 1C: Thermodynamica

Hiervoor hebben we gekeken naar welke eiwitstructuren er zoal voor komen. De
laatste stukjes van zelfstudie 1B gingen we er al een beetje op in: waarom
nemen die eiwitten die structuur aan? De principes hierachter zijn dezelfde als
die achter waarom sommige reacties wel verlopen en andere niet. We gaan ons
verdiepen in enkele fundamentele principes van de thermodynamica die
essentieel zijn om te begrijpen of een reactie al dan niet kan verlopen of een
aminozuurketen wel of niet in een helix vouwt. Met deze kennis kunnen we ook
begrijpen hoe enzymen precies werken. Een gedeelte van de nu volgende stof

13
heb je al op de middelbare school gehad. Haal dat er desgewenst even bij.
Verder heeft de fysische chemie de basis aangedragen voor dit onderdeel.

13. Bestudeer Alberts blz. 51-54 en Tymoczko blz. 22 en 23

14. Bestudeer §6.3 "Free energy is a useful thermodynamic function for

understanding enzymes" blz. 108-111 Tymoczko en van Alberts blz. 60-63

Vraag 14.
Hoe luiden de eerste en de tweede wet van de thermodynamica?
Definieer de begrippen entropie (S), enthalpie (H) en vrije energie (G) van een
systeem.
Welke mathematische relatie bestaat er tussen deze grootheden?

Vraag 15.
Wat is de ∆G van een spontaan verlopende reactie?

Vraag 16. Wat zegt de ∆G over de snelheid van een reactie?

Vraag 17.
Welke invloed heeft de weg waarlangs tot het eindproduct gekomen wordt op de
∆G?

Vraag 18.
Wat is het verschil tussen ∆G, ∆G0 en ∆G0'?

Vraag 19.
Hoe kan een reactie die normaal niet spontaan verloopt toch gefaciliteerd
worden?

15. Het is belangrijk te benadrukken dat enzymen reacties niet veroorzaken

maar ze alleen maar versnellen (negatieve katalyse komt niet voor). Het
versnellend vermogen is echter zo groot dat het lijkt alsof enzymen reacties
kunnen veroorzaken. Naar aanleiding van het voorgaande rijzen nu de volgende
vragen:

Vraag 20.
Hoe komt het dat reacties die
blijkbaar mogelijk zijn toch zo
traag verlopen?
Het antwoord op die vraag kun je
halen uit Fig. 6.3 in combinatie
met de figuur hiernaast.

Vraag 21.

14
Hoe kunnen enzymen dergelijke reacties versnellen? Bestudeer ter
beantwoording van deze vraag Fig. 6.3 en de bijbehorende tekst in §6.4
"Enzymes facilitate the formation of the transition state" blz. 111-112.

16. Bestudeer blz. 111 "Enzymes alter the reaction rate but not the reaction
equilibrium".

17. Bestudeer de inleiding van hoofdstuk 6 en §6.1 "Enzymes are powerful and
highly specific catalysts” blz. 105-107

18. Bestudeer "Formation of an enzyme-substrate complex is the first step in

enzymatic catalysis" blz. 112.

19.Bestudeer blz. 112-113 "Active sites of enzymes have some common

features".

Vraag 22.
Het aminozuur op positie 102 in de primaire structuur van een bacteriëel enzym
is valine en het corresponderende codon in de mRNA sequentie van dat enzym
is GUU. Een mutatie die dit codon verandert in GCU heeft géén effect op de
activiteit van het enzym maar een andere mutatie die het codon verandert in
GAU levert een eiwit op zonder enige biologische activiteit. Hoe leg je deze
waarneming uit?

Na dit deel de Zelfstudie 2 dien je:

- te weten wat de betekenis van de ∆G van een reactie is en van de ∆G 0' en hun
onderlinge relatie,
- te kunnen bepalen wanneer een reactie spontaan verloopt en in welke richting
dat zal zijn,
- te kunnen beschrijven hoe thermodynamisch ongunstige reacties in de cel toch
kunnen verlopen,
- aan te kunnen geven welke kenmerken enzymen bezitten,
- te weten wat het actieve centrum van een enzym is,
- de interacties van enzymen met hun substraten te kunnen aangeven,
- uit te kunnen leggen welk effect een enzym heeft op de energie van de
geactiveerde toestand
van een reactie,

Zelfstudie 1D: Catalytic Strategies

In deze Zelfstudie gaan we nader in op het mechanisme van de katalyse van de
enzymen chymotrypsine en lysozym. Bestudering van de driedimensionale
structuur van deze eiwitten en het gebruiken van substraat analoga, die aan de

15
actieve plaats van het enzym binden maar niet worden omgezet, zijn belangrijke
hulpmiddelen geweest bij de opheldering van dit mechanisme.

20.Lees de inleiding van Tymoczko Hoofdstuk 8 en §8.1 blz. 143-144. Zie ook
Alberts Fig. 3-52

21. Bestudeer § 8.2-8.3 blz. 149-154 t/m “Chymotrypsin action proceeds in two
steps linked by a covalently bound intermediate”

Vraag 23.
Welke conclusies kun je trekken uit het feit, dat slechts één van de 28 serine
residuën, Ser 195, met diisopropylfosfofluoridaat reageert en dat dit leidt tot
inactief enzym?

Vraag 24.
Welke bindingen hydrolyseert chymotrypsine?

Vraag 25.
Welk experiment toonde aan, dat de katalyse door chymotrypsine een twee-
staps reactie is? Beschrijf deze twee stappen.

22. Bestudeer blz. 154-156 “Serine is part of a catalytic triad that includes
histidine and aspartic acid”.

Vraag 26.
Hoe wordt de buitengewone reactiviteit van Ser195 uit de driedimensionale
structuur van chymotrypsine verklaard?

Vraag 27.
Beschrijf de acylering- en de deacyleringsreactie tijdens de hydrolyse van een
peptide-binding door chymotrypsine, hoe wordt de “tetrahedral transitionstate”
gestabiliseerd?

23. bestudeer van Alberts Hoofdstuk 3 “Lysozyme illustrates how an enzyme

works”, blz. 144-146. Bekijk eventueel ook de bij Fig 3-50 behorende online
animatie.

Vraag 28.
Beschrijf de stappen in het katalytische mechanisme van lysozym, en hoe en
welke aminozuren in de active site hier een rol bij spelen.

Vraag 29.
Wat hebben de reacties gekatalyseerd door chymotrypsine en lysozym gemeen?

Vraag 30.

16
Een onderzoeker doet experimenten waarbij lysozym en chymotrypsine hun
substraten omzetten in aanwezigheid van een stabiele isotoop van water: H 218O.
Zijn na de reactie de enzymen gelabeld met de zware isotoop? Zo ja, op welk
aminozuur?

Vraag 31.
De onderzoeker doet vervolgens experimenten waarbij lysozym en
chymotrypsine hun substraten omzetten in aanwezigheid van een andere
stabiele isotoop van water: 2H2O (Ook wel D2O genoemd). Zijn na de reactie de
enzymen gelabeld met de zware isotoop? Zo ja, op welk aminozuur?

Na dit deel van de Zelfstudie dien je:

- aan te kunnen geven hoe het actieve centrum van lysozym bijdraagt aan de
reactie.
- te weten hoe de bepalende aminozuurzijketens samenwerken bij de hydrolyse
van de glycosidische binding,
- het twee-staps reactiemechanisme van chymotrypsine te kunnen beschrijven
en het experimentele bewijs hiervoor te kennen/begrijpen
- het actieve centrum van chymotrypsine te kunnen beschrijven en de bijzondere
reactiviteit van Ser 195 te kunnen verklaren,
- de verschillende stappen van de katalyse reactie van chymotrypsine te kennen,

17
 Zelfstudie 2

De stof uit Hoorcollege 3&4 en zelfstudie 2 komt uitgebreid terug in een e-

Module die je kunt vinden via de Blackboard-pagina van dit blok. Je kunt
deze e-Module op elk gewenst moment thuis maken om te kijken hoe goed
je de stof beheerst. De docent kan zien of je de e-Module gemaakt hebt en
hoe goed je dit gedaan hebt (cijfer telt niet mee). Na elke vraag is er een
uitleg bij het juiste antwoord. Je kunt de module zo vaak maken als je wilt,
bijvoorbeeld om nog eens te oefenen voor het tentamen. Gebruik Google
Chrome als browser. Als je nog vragen hebt, kun je altijd contact opnemen
met de docent van dit onderdeel (dr. Dansen).

Zelfstudie 2A: myoglobine en hemoglobine

Hoofdstuk 4.3, 7.3 en Hoofdstuk 9 van Tymoczko, Hoofdstuk 3 blz. 149-153 van
Alberts.

Zuurstof is een essentiële component bij de verbranding van ons voedsel en voor
de productie van chemische energie in de vorm van ATP. De structuur en functie
van de zuurstof-transporterende moleculen hemoglobine en myoglobine worden
nu bekeken. We zullen zien op welke wijze hemoglobine efficiënt O 2 opneemt in
de longen, dit afstaat in de weefsels en vervolgens CO 2 bindt en afgeeft in de
longen. Tevens zal aandacht worden besteed aan enkele aangeboren
afwijkingen in de hemoglobine synthese.

13. Lees §4.3 (blz. 60-61) over de structuur van myoglobine.

14.Lees de inleiding van Hoofdstuk 9 en bestudeer §9.1 en 9.2 blz. 161-164.

Vraag 14.
Geef de definitie van een prosthetische groep.

Vraag 15.
Beschrijf de structuur van myoglobine en hemoglobine en vergelijk ze met elkaar.

Vraag 16.
Welk metaalion bevindt zich in het centrum van de heem-groep?

Vraag 17.
Welke atomen bevinden zich in de zes coördinatie-posities van dat metaal-ion in
de aan- en afwezigheid van zuurstof?

18
Vraag 18.
Wat gebeurt er met het centrale metaal-ion bij de binding van zuurstof?

15. Bestudeer §9.3: “Hemoglobin binds oxygen cooperatively” blz. 164-166.

Vraag 19.
Wat gebeurt er bij de overgang van de T- naar de R-vorm van hemoglobine en
waardoor en hoe wordt deze veroorzaakt?

Vraag 20.
Leg het verschil tussen het ”sequentiële” en het “concerted” model bij de werking
van een allosterisch eiwit uit. (zie §7.3 Fig 7-10 blz 130 en Fig 7-13 blz 132)

Vraag 21.
Verloopt de binding van zuurstof aan hemoglobine volgens het “concerted” of
“sequential” model?

16. Bestudeer §9.4 blz. 166-167 “An allosteric regulator determines the oxygen
affinity of Hemoglobin”.

Vraag 22.
Aan welke vorm van hemoglobine bindt 2,3-BPG?

Vraag 23.
Aan welke residuën bindt 2,3-BPG?

Vraag 24.
Wat is het verschil in bindingsaffiniteit van 2,3-BPG aan foetaal en volwassen
hemoglobine? Waardoor wordt dit verschil veroorzaakt?

17. Bestudeer §9.5 “Hydrogen ions and carbon dioxide promote the release of
oxygen” blz. 168-169.

Vraag 25.
Wat wordt verstaan onder het Bohr-effect?

Vraag 26.
Op welke wijze versnelt een lage pH en een hoge CO 2 concentratie
zuurstofafgifte in de spieren?

Vraag 27.
Hoe wordt de door de cellen geproduceerde CO 2 naar de longen vervoerd?

19
Vraag 28.
Noem de verschillen in de wijze van binding van O 2 aan myoglobine en
hemoglobine en de belangrijkste fysiologische gevolgen hiervan.
Na dit deel van de Zelfstudie dien je:
- de ruimtelijke structuur van myoglobine en hemoglobine kunnen beschrijven,
- de coöperatieve binding van O2 aan hemoglobine uit te kunnen leggen aan de
hand van het “sequentiële” en het “concerted” model,
- aan te kunnen geven op welke wijze O2, CO2 en H+ aan het hemoglobine
gebonden zijn, getransporteerd worden en welke structuur veranderingen dit in
het hemoglobine veroorzaakt,
- te weten wat de functionele verschillen zijn tussen myoglobine en hemoglobine,
- de fysiologisch belangrijke rol van 2,3-BPG te kennen bij de afgifte van O 2 in de
spieren,
- de expressie van de hemoglobine genen tijdens de embryonale ontwikkeling te
kennen en op de hoogte te zijn van de affiniteit van foetaal hemoglobine voor O 2.

Zelfstudie 2B: Regulatory Strategies

De stofwisseling in de cel hangt af van de behoefte van de cel en van de
omgeving van de cel, d.w.z. dat de snelheid van de stofwisseling op elk moment
aangepast moet kunnen worden aan de heersende omstandigheden zowel in als
buiten de cel. Dat gebeurt door bepaalde stofwisselingspaden (een opeenvolging
van een reeks enzymen) te versnellen of te vertragen. Niet alle enzymen in die
paden hoeven zich aan te passen maar alleen diegene, die de laagste snelheid
hebben. Voor de activiteitsverandering van dergelijke snelheidsbepalende
enzymen is een aantal verschillende mechanismen bekend. In deze Zelfstudie
komt een aantal van die regelmechanismen aan de orde.

11.Bestudeer §15.6 op blz. 301-303 en van Alberts blz. 149-151.

Vraag 25.
Wat zijn de besproken wijzen van regulatie van de enzym-activiteit?

12. Hemoglobine is geen enzym, omdat er geen reactie plaatsvindt met het
substraat. Maar ook enzymen worden allosterisch gereguleerd. (zie weer §7.3,
blz. 127-132.)

Vraag 26. Waarom kun je een allosterisch gereguleerd enzym een informatie-
sensor noemen?

13. Bestudeer de paragraaf “Regulator Molecules Modulate the T<->R

equilibrium” en Fig 7.12 op blz 131.

20
Vraag 27. Wat zou de biologische relevantie kunnen zijn van het feit dat
aspartate carbamoylase werkt met ATP als allosterische activator en CTP als
allosterische remmer?

Vraag 28.
Wat verstaat men onder “feedback remming“ van een enzym?

14. Andere klassieke voorbeelden van allosterische feedback remming zijn:

De remming van fosfofructokinase door ATP (remming glycolyse blz. 327-328)
en de remming door aminozuren van de sleutelenzymen van hun eigen synthese
route (§31.3, blz. 640-641).

15. Bestudeer figuur 7.9 (Tymoczko), blz. 129.

Vraag 29.
Welke relatie bestaat er tussen reactiesnelheid en substraatconcentratie bij
allostere enzymen en op welke wijze kan het sigmoïdale V0 vs [S] plot van zo
een enzym worden verklaard? Doet zo’n sigmoïdaal verloop je ergens aan
denken?

16. Bestudeer blz. 129-131 “Allosteric enzymes depend on alterations in

quarternary structure” en “Regulator molecules modulate the R-T equilibrium”.

Vraag 30.
Wat is het verschil tussen het concerted en het sequential model voor allostere
regulatie van enzymen?

Vraag 31.
Wat is het verschil tussen een homotropisch en een heterotropisch effect op de
activiteit van een allosterisch enzym?

17. Bestudeer §24.2 t/m “Liver phosphorylase produces glucose for other
tissues” blz. 489-491.

Vraag 32.
Wat is het verschil tussen fosforylase afkomstig uit de spier en de lever?
Waarom is dat verschil biologisch gezien handig?

18. Bestudeer Alberts blz 165-166 “Many proteins are controlled by covalent
modifications…”.

Vraag 33.
Noem 4 verschillende eiwitmodificaties en hun effect op de structuur in termen
van lading en hydrofobiciteit.

Vraag 34.

21
Wat voor effect verwacht je van fosforylering op een Serine in het DNA-
bindingsdomein van een transcriptiefactor?

19. Bestudeer Alberts blz. 154-155.

Vraag 35.
Wat bepaalt de specificiteit van de honderden verschillende kinases en welke
aminozuurresiduën kunnen ze fosforyleren?

20. Bestudeer blz. 249-250 “Cyclic AMP stimulates the phosphorylation of many
target proteins by activating protein kinase A”

Vraag 36.
Waardoor wordt de binding van de katalytische subeenheden aan de regulatoire
subeenheden van PKA veroorzaakt en hoe wordt deze binding verbroken?

21. In de inleiding van deze Zelfstudie heb je geleerd dat regulatie van
enzymactiviteit ook kan optreden door proteolytische activering. Bestudeer dit
proces in §14.2 blz. 272-274.

Vraag 37.
Welke (klassen van) eiwitten worden geactiveerd door proteolytische klieving en
hoe wordt de inactieve voorloper genoemd? Waarom is het een goed idee om
deze enzymen niet in reeds actieve vorm te produceren?

Na dit deel van de Zelfstudie dien je:

- uit te kunnen leggen hoe enzymen fungeren als regelpunten in de stofwisseling,
- aan te kunnen geven via welke mechanismen de activiteit van enzymen kan
worden beïnvloed,
- te kunnen aangeven wat het concerted model voor allostere enzymen inhoudt
en hoe in dat model remmers en activatoren effect sorteren,
- uit te kunnen leggen welke enzymatische reacties zinvol zijn om te beïnvloeden
als een metabool pad in snelheid moet veranderen,
- de T-> R conformatie verandering van allosterische enzymen kunnen
beschrijven en de invloed van substraat en allosterische regulatoren hierop.,
- uit te kunnen leggen op welke wijze cAMP protein kinase A activeert.

22
 Zelfstudie 3
Enzymkinetiek, enzymologie en Regulatie strategieën
Tymoczko hoofdstukken 6 en 7

Enzymologie beschrijft hoe efficiënt enzymen onder bepaalde omstandigheden

werken (kinetiek). Dit is een belangrijk aspect voor het begrijpen van hoe snel
processen in de cel verlopen, maar ook voor het ontwerpen van geneesmiddelen
die op specifieke enzymen aangrijpen: veel geneesmiddelen zijn inderdaad
enzym-remmers. In deze zelfstudie ga je uitgebreid oefenen met de stof en
dat zal dus ook flink meer tijd in beslag nemen dan de eerdere zelfstudie-
opdrachten. Om het werkcollege/COO Enzymkinetiek (WC2) goed te
kunnen volgen dien je zelfstudie 3B in elk geval te hebben voltooid (vragen
ingeleverd via de test op Blackboard), en het is aan te bevelen eerst
zelfstudie 3A te doen.

De werking van enzymen kan worden beïnvloed door remmers, die de

enzymactiviteit verlagen of stoppen, en door activatoren, die de enzymactiviteit
stimuleren. Deze modulatoren zijn vaak gewone producten van het
celmetabolisme die dus een uiterst belangrijke rol vervullen bij het reguleren van
dat metabolisme.

Wat de remmers betreft wordt er onderscheid gemaakt tussen irreversibele en

reversibele remmers. Irreversibele remmers maken een enzym voorgoed
onwerkzaam door bepaalde functionele groepen in het enzym om te zetten. Het
effect van reversibele remmers kan weer ongedaan gemaakt worden. Op grond
van het werkingsmechanisme onderscheiden we 3 soorten reversibele remmers:
competitieve (competitive), niet-competitieve (non-competitive) en
oncompetitieve (uncompetitive) remmers

Zelfstudie 3A

1. Bestudeer van de §7.1 en 7.2 blz. 119-127.

2. Bestudeer blz. 123-126 "KM and Vmax values can be determined by several
means” t/m “kcat/ KM is a measure of catalytic efficiency”.

23
Een belangrijk leerdoel is het begrijpen en kunnen werken met de
Michaelis-Menten vergelijking. Er wordt van je verwacht dat je deze formule
uit je hoofd kent en de afleiding ervan begrijpt. De afleiding van de
Michaelis-Menten vergelijking vind je op blz. 134-135 van Tymoczko.

Er zit wel een foutje in het boek: Formule (19) moet zijn:

k 1 [ E ] [ S ]=(k ¿ ¿−1+ k 2)[ ES]¿

De stappen (24)-(26) blijken voor sommige studenten soms lastig te volgen

en zijn daarom hier op een andere manier weergegeven.

We beginnen bij formule 24.

( [ E ] T −[ ES ] ) [S ]
[ ES ] = ( 24)
KM

[S] binnen de haken halen:

[ ES ] =¿ ¿
vermenigvuldig beide zijden met KM: K M [ ES ]=¿

tel bij beide zijden [ES][S] op: ( K ¿¿ M [ ES ] )+( [ S ][ ES ] )=( [S ] [ E ] T ) ¿

haal [ES] buiten haken: ( K M + [ S ] )[ ES]=([ S] [ E ] T )

deel beide zijden door (KM+[S])

[S ]
[ ES ] =[ E ]T (26)
[S ]+ K M

en ga verder met de afleiding in het boek

Vraag 1.
Welke twee afgeleide betekenissen heeft de K M?

3. Bestudeer blz. 121 "Allosteric enzymes do not conform to Michaelis-Menten

kinetics".

Vraag 2.
In welk opzicht gedragen allostere enzymen zich anders dan enzymen met
Michaelis-Menten kinetiek?

Vraag 3.
Veronderstel dat in twee weefsels A en B de activiteit van een bepaald enzym
wordt bepaald. De enzymactiviteit, uitgedrukt in het aantal mol substraat dat per

24
gram weefsel in een bepaalde tijd wordt omgezet, is voor weefsel A 5 maal
groter dan voor weefsel B. Wat is de eenvoudigste verklaring voor deze
waarneming?

4. Bestudeer §8.2 "Enzymes can be inhibited by specific molecules" blz. 134-

135.

Vraag 4.
Welke functie vervult remming van enzymactiviteiten door specifieke kleine
moleculen in biologische systemen?

5. Bestudeer blz. 147-148 "Reversible inhibitors are kinetically distinguishable".

Vraag 5.
Hoe kan competitieve remming ongedaan gemaakt worden?

Vraag 6.
Welk effect heeft een niet-competitieve remmer op de K M van een enzym?

6. Bestudeer §7.2 blz. 123 en Alberts blz 142-143 ”KM and Vmax values can be
determined by several means”.

Vraag 7.
Welk voordeel biedt de Lineweaver-Burk grafiek t.o.v. de verzadigingscurve (V 0
vs [S] plot)?

Vraag 8.
Waarom kan de aard van een remmer gemakkelijk worden bepaald door een
Lineweaver-Burk plot?

7. Lees aandachtig blz. 149-150 “Irreversible inhibitors can be used to map the
active site”.

Vraag 9.
Welke aminozuren in de active site van enzymen worden herkend door
respectievelijk diisopropylfosfofluoridaat (DIPF)en
tosylphenylalanylchloromethylketone (TPCK)?

8. Lees blz 114 “Transition-state analogs are potent inhibitors of enzymes”

Vraag 10.
Waar kunnen “transition-state analogs” voor worden gebruikt?

9. Lees blz. 150-152 "Penicillin irreversibly inactivates a key enzyme in bacterial

cell wall synthesis" .

25
Vraag 11.
Leg uit waarom penicilline een soort paard van Troje is en waarom het
beschouwd kan worden als een suicide inhibitor.

10. Veel eiwitten hebben voor hun biologische activiteit een extra, niet uit
aminozuren bestaande, component nodig: een cofactor. Dit is meestal een
metaalion of een (klein) organisch molecuul. Wanneer het organische molecuul
sterk gebonden is aan het eiwit wordt het een prosthetische groep genoemd. Zo
heeft het eiwit hemoglobine als prosthetische groep heme (heem). Zonder heme
kan het eiwit zijn zuurstof-transporterende functie niet vervullen. Ook enzymen
kunnen prosthetische groepen bevatten. FAD is de prosthetische groep van een
groot aantal redox-enzymen.

De cel bevat daarnaast ook hulpstoffen die niet zo sterk aan het enzym
gebonden zijn maar vrij in de cel voorkomen. Zij kunnen daarom met
verschillende enzymen reageren. Dergelijke hulpstoffen worden coënzymen
genoemd. Een belangrijk voorbeeld is NAD+. Dit komt later aan de orde.
Sommige enzymen hebben een metaalion nodig voor optimale activiteit (Mg 2+,
Zn2+, Cu2+, Fe2+, Ca2+, etc.). Zie ook Tymoczko §6.2 blz. 107-108.

Vraag 12.
Wat is het effect van competitieve, niet-competitieve en oncompetitieve remmers
op de kinetische parameters van enzymatische reacties?

Na dit deel van Zelfstudie 3 dien je:

- het verschil te weten tussen irreversibele en reversibele remming,
- aan te kunnen geven wat het werkingsmechanisme is van een irreversibele
remmer,
- competitieve, niet-competitieve en oncompetitieve remmers op grond van hun
werkingsmechanisme te kunnen
onderscheiden,
- te weten welke effecten competitieve, niet-competitieve en oncompetitieve
remmers hebben op de KM en Vmax van een enzym,
- te kunnen aangeven hoe je door meting onderscheid kunt maken tussen de
verschillende soorten enzymremmers,
- de werking van penicilline te kennen.
- uit te kunnen leggen wat de essentie is van de kinetische parameters K M en
Vmax,
- te weten wat men verstaat onder het “turnover number” van een enzym,
- allostere enzymen te kunnen onderscheiden van niet-allostere enzymen op
grond van hun reactiekinetiek.

26
 Zelfstudie 3B: Enzymkinetiek in de praktijk
In Zelfstudie 3B gaan we onderzoeken hoe enzymreacties werken met behulp
van een webtool die enzymreacties kan simuleren. Op deze manier kun je in
korte tijd eenvoudig heel veel experimenten doen die in het laboratorium
misschien wel enkele dagen in beslag zouden nemen. Het is de bedoeling dat je
in deze zelfstudie een begin maakt met deze gesimuleerde proeven, zodat bij het
Werkcollege/COO-2 direct de diepte in gegaan kan worden. Er is tijd
ingeroosterd om deze zelfstudie te maken.

Zorg dat je Vraag 1 t/m 14 gemaakt hebt en op Blackboard hebt ingevuld

voordat je naar het Werkcollege komt (dit wordt gecontroleerd, dus gebruik
je eigen Blackboard inlog-gegevens!). 

Enzymen zijn de essentiële katalysatoren van

biochemische processen die leven mogelijk
maken. Nadat begin vorige eeuw duidelijk werd
dat enzym en substraat een binding aangaan,
formuleerden Leonor Michaelis en Maud
Menten in 1913 een vergelijking die de snelheid
van enzymatische reacties beschrijft. Deze
vergelijking is gebruikt om de efficiëntie van Maud Menten en Leonor Michaelis
enzymen te bestuderen, maar is ook gebruikt
voor het beschrijven
van niet-biochemische processen zoals de snelheid van klaring van ethanol uit
het bloed, of schattingen van de
verscheidenheid van soorten in de natuur.

De Michaelis – Menten vergelijking

beschrijft de relatie tussen de initiële
reactiesnelheid (V0) van een enzymatische
reactie en de substraat (S)-concentratie bij
een gefixeerde hoeveelheid
enzymmoleculen. Het is de vergelijking van
een hyperbool.

[S]
V 0=V max
K M +[ S]

De belangrijkste kinetische parameters voor de enzymatische reactie zijn K M en

Vmax. Deze twee waarden geven een indicatie van de affiniteit van een enzym
voor een gegeven substraat en de snelheid waarmee dit substraat zal worden
omgezet naar product. De waarde van V max is de V0 bij extreem hoge
substraatconcentratie. De KM is een afgeleide van de V max : het is de

27
substraatconcentratie waarbij de V0 half-maximaal is. Een lage KM geeft dus een
hoge affiniteit weer.

Omdat de M&M-vergelijking een hyperbool beschrijft, kunnen V max en KM niet

zomaar worden gemeten maar moeten deze bepaald worden door extrapolatie
(het bepalen van een waarde die buiten een gegeven reeks waarden ligt: V max)
en interpolatie (het bepalen van een waarde die binnen een gegeven reeks
waarden ligt: KM). Dit kan onder andere worden gedaan door de V 0 waarden,
gemeten bij verschillende substraatconcentratie [S], uit te zetten in een grafiek
en er een ‘best-fit’ hyperbool door te trekken. Dit wordt tegenwoordig
betrouwbaar uitgevoerd door computerprogramma’s die een niet-lineaire
regressie toepassen op de gemeten waarden.

Het programma ‘eSolv’ wordt gebruikt om kennis te maken met de

eigenschappen van enzymen. Door deze link
https://www.esolv.nl/page/enzymkinetiek te volgen kom je op de
overzichtspagina van dit programma. Je gaat met dit programma enzymreacties
simuleren en zo de kinetische parameters van en enzym bepalen. Ook zal
duidelijk worden hoe enzymreacties kunnen worden beïnvloed. Je kunt eSolv
ook thuis gebruiken, bij voorkeur met Google Chrome.

Het enzym Cyclooxygenase-2 (COX-2) komt normaal nauwelijks tot expressie,

maar wordt geïnduceerd wanneer er een ontsteking is. PGH2 is een belangrijk
signaalmolecuul dat zorgt voor het op gang brengen van de ontstekingsreactie
van het lichaam zodat de bron van de ontsteking kan worden opgeruimd. De ‘bij-
effecten’ van de ontstekingsreactie (koorts, pijn, etc.) kunnen erg vervelend zijn
en daarom zijn er verschillende remmers van COX-2 op de markt zoals
bijvoorbeeld Aspirine en Ibuprofen. We gaan de kinetiek van de enzymatische
reactie van COX-2 en de invloed van een remmer hierop nader bekijken. Het
begrijpen van de kinetiek van een bepaald enzym is cruciaal voor het
ontwikkelen van specifieke medicijnen die aangrijpen op dat enzym.

COX-2 zet in een tweestaps reactie het vetzuur arachidonzuur (C20H32O2,

(5Z,8Z,11Z,14Z)-5,8,11,14-Icosatetraeenzuur, ook geschreven als C20:4) om
naar Prostaglandine H2 (C20H32O5, (5Z)-7-{(1R,4S,5R,6R)-6-[(1E,3S)-3-
Hydroxy-1-octen-1-yl]-2,3-dioxabicyclo[2.2.1]hept-5-yl}-5-hepteenzuur, ook
geschreven als PGH2) (Figuur 1).

Om de activiteit van COX-2 te meten wordt arachidonzuur gebruikt als substraat.

Zowel arachidonzuur als het product PGH2 zijn vrijwel kleurloos in oplossing en
niet zomaar te meten. De tweede reactie (peroxidase stap) van COX-2 kan wel
indirect gemeten worden door de oxidatie van N,N,N’,N’-tetramethyl-p-
phenylenediamide (TMPD), die in deze assay plaatsvindt als bijproduct van de
peroxidase reactie, in de tijd te volgen (met behulp van een spectrofotometer, zie
ook je practicumhandleiding). Er is heem toegevoegd om de oxidatie van TMPD
te katalyseren. Geoxideerd TMPD heeft een extinctiemaximum bij ~590 nm (zie

28
Figuur 1, extinctie wordt ook absorbantie genoemd). Toename van de extinctie
bij ~590 nm in de tijd is in deze proef is dus een maat voor de omzetting van
arachidonzuur naar PGH2.

Oxidized TMPD
Arachidonzuur (C20:4) 2O2
COX-2
cyclooxygenaseactiviteit

Prostaglandine G2 (PGG2)
TMPD
COX-2 Heem
peroxidaseactiviteit
TMPD2+(Absorbantie Max @~590 nm)

Prostaglandine H2 (PGH2) Aanname: dA590/dT ~d [PGH2]/dT

Figuur 1: de reactie van COX-2 met Arachidonzuur en de gekoppelde oxidatie
van TMPD

Vraag 1: Wat kun je zeggen over de snelheid waar de oxidatie-reactie van TMPD
aan moet voldoen, om als goede indicator voor COX-2 activiteit te kunnen
dienen in deze assay?

Antwoord 1:

Opdracht 1

Open in eSolv Metingen Opdracht 1: Basics

Je ziet nu een simulatie-window waarin de hoeveel substraat (C20:4), de
hoeveelheid product (PGH2) en de reactiesnelheid V (gedefinieerd als
dPGH2/dt) in de tijd weergegeven kunnen worden. Je kunt een
substraatconcentratie invullen en “simulate” klikken om de enzymreactie-
simulatie te starten. In het panel linksboven kun je de verschillende curves aan-
en uitzetten, en bepalen van welke curve de waardes op de verticale as worden
weergegeven (Let op: als voor de verticale as de [C20:4] concentratie gekozen
wordt, dan kloppen de getallen op die as niet ook voor de concentratie [PGH2]!

29
Wissel de as indien nodig). De metingen van de extinctie van geoxideerd TMPD
bij 590 nm zijn al omgezet naar µmol gevormd product.

Vraag 2: Kies een paar substraat-concentraties en kijk naar de vorm van de

curves. Wat valt je op aan het verloop van de snelheidscurve? Kun je dit verloop
verklaren?

Antwoord 2:

Het is in deze computersimulatie erg makkelijk een bepaalde concentratie C20:4

toe te voegen. In het laboratorium is dat minder gemakkelijk, omdat je daarvoor
steeds een verdunning moet maken. Bovendien mag de concentratie van je
andere reagentia niet ook veranderen tussen twee metingen. Bedenk ook dat de
reactie gaat lopen zodra je substraat toevoegt, en je dus niet de hele reeks van
tevoren bij elkaar kunt pipetteren.

Vraag 3: Hoe ga je in het lab te werk om, net als in de simulatie, de COX-2
activiteit bij verschillende concentraties C20:4 te meten?

Antwoord 3:

Zoals al aangegeven is in de simulatie de extinctie van geoxideerd TMPD bij 590

nm al omgezet naar µmol gevormd product.

Vraag 4: Hoe zou je in het laboratorium bepalen hoe de extinctie-waarden van

TMPD bij 590 nm samenhangen met een bepaalde hoeveelheid gevormd
product? In andere woorden: hoe zou je het systeem ijken?

Antwoord 4:

30
 Opdracht 2

De reactiesnelheid van enzymen is onder andere afhankelijk van de pH. Je kunt

het pH-optimum van COX-2 bepalen door de reactiesnelheid te meten bij
verschillende pH. Open hiervoor in eSolv Metingen Opdracht 2: pH. Kies een
C20:4 concentratie lees bij verschillende pH de initiële reactie-snelheid op t=0 af
(V0 ). Let op: omdat de reactiesnelheid niet gelijk maximaal is (omdat er nog
menging moet plaatsvinden) moet je V0 zelf schatten (zie figuur hieronder).

Vraag 5: Zoek het pH optimum van COX-2 door de reactie bij verschillende pH te
simuleren. Begin grof en werk dan naar nauwkeuriger pH-waarden toe. Tip:
gebruik voldoende substraat.

Antwoord 5:
Het pH optimum is:

Opdracht 3

Enzymreacties zijn ook temperatuur-afhankelijk. Ga naar eSolv Metingen

Opdracht 3: Temperatuur

31
Vraag 6: Zoek de optimale temperatuur voor de vorming van PGH2 uit C20:4
door COX-2 door de reactie bij verschillende temperaturen te simuleren. Begin
grof en werk dan naar nauwkeuriger waarden toe. Gebruik weer voldoende
substraat!

Antwoord 6:
De optimale temperatuur is:

Vraag 7: Bij welke pH heb je de optimale temperatuur bepaald? Zou dat nog
uitmaken denk je?

Antwoord 7:

Opdracht 4

Voor het gemak gaan we ervan uit dat de op deze manier bepaalde waarden
voor optimale temperatuur en pH de daadwerkelijke waarden goed genoeg
benaderen om met deze waarden verder te werken. We gaan nu de Michaelis-
Menten constante KM en de maximale snelheid V max van de reactie van C20:4
naar PGH2 door COX-2 bepalen. Open hiertoe in eSolv Metingen Opdracht 4:
KM en Vmax

Voor het bepalen van KM en Vmax dient de initiële reactiesnelheid V 0 te worden

uitgezet tegen de substraatconcentratie [S]. Stel de temperatuur en pH in op
de door jouw gevonden optima. Meet V0 bij simulaties met verschillende
[C20:4]. Zorg ervoor dat je waarden kiest over een brede range. Je kunt de
waarden voor V0 invullen in de tabel die telkens een rij langer wordt als je op
Simulate klikt. Vul waarden voor V0 met cijfers achter de komma in met een
punt en niet met een komma, dus 6.5 en niet 6,5! Maak de tabel eerst leeg als
er nog waarden in staan. Met het kruisje kun je een waarde eventueel
verwijderen (haal eventuele lege vakjes weg). Hoe meer concentraties je test,
hoe nauwkeuriger je meting wordt, maar een stuk of 10 goed gekozen
substraatconcentraties is ruim voldoende. Als je klaar bent open je in eSolv
Resultaten Opdracht 4: KM en Vmax. Als je op Simulate klikt krijg je nu een
Michaelis-Menten plot te zien, die bepaald is op basis van je metingen. Je kunt
de schaal van de substraat-as aanpassen door de gewenste schaal aan te
klikken en nog eens op Simulate te klikken. Je metingen zijn ook zichtbaar in de
grafiek, en Vmax en KM die volgen uit jouw metingen worden getoond. Je ziet ook

32
de correlatie-coëfficiënt r, die een maat is voor hoe goed de curve door je
metingen past. Hoe dichter bij 1, hoe beter de curve alle metingen benadert en
hoe waarschijnlijker het is dat de waarden voor K M en Vmax de daadwerkelijke
waarden benaderen. Als de voor jouw meetpunten bepaalde r kleiner is dan
0.995 moet je de meting opnieuw uitvoeren.

Zie je geen waarden voor KM en de Vmax in het resultaten-scherm?

Dan is er waarschijnlijk één of meer van de volgende zaken aan de hand:
-er is een meting met substraat-concentratie en/of V 0 waarde ‘0’ ingevoerd
-er zijn (ondanks de waarschuwing hierboven) komma’s ipv punten gebruikt voor
de decimalen
-er zit een leeg vakje in de reeks metingen.
Corrigeer en probeer opnieuw.

Vraag 8: Wat zijn de KM en de Vmax voor deze reactie? Hoe groot was r bij je
meting?

Antwoord 8:

Vraag 9: KM is gedefiniëerd als de substraat-concentratie waarbij V 0 half-

maximaal is. Leidt af uit de MM vergelijking (zie pagina 1) dat dit mathematisch
klopt.

Antwoord 9:

33
Vraag 10. Kijk naar het verloop van de grafiek. Welke waarden voor V 0 vs [C20:4]
bepalen het meest de waarde voor Vmax? En welke voor KM?

Antwoord 10:

De proef werd uitgevoerd met verschillende concentraties substraat (C20:4), die

vanuit een stock-oplossing werden toegevoegd. Onder andere bij het maken van
de stock-oplossing als bij het pipetteren heb je te maken met een systematische
fout; afwegen, volumina oplosmiddel afmeten en pipetteren zijn nooit exact gelijk
aan de theoretische hoeveelheid. Ook in het schatten van de V 0 zit een
systematische fout.

Vraag 11: Is bij hoge of bij lage [C20:4] de systematische fout in [S] (∂[S]) en V 0
(∂V0) relatief het hoogst? Wat betekent dit in theorie voor de betrouwbaarheid
van de waarden voor Vmax en KM?

Antwoord 11:

34
Als de curve (sterk) afwijkt van je metingen, kun je besluiten zelf de K M en
de Vmax schatten op basis van jouw meetpunten. Kies hiertoe een schaal
voor de substraat-as die tot de hoogste concentratie loopt, omdat je dan
Vmax goed kunt schatten. KM is de substraatconcentratie waarbij V0 half-
maximaal was, en die kun je nu ook schatten uit de grafiek. Pas hiervoor
eventueel weer de schaal aan. Pas dit verderop in het practicum toe waar
nodig.

Ga terug naar eSolv Metingen Opdracht 4: KM en Vmax. Maak de lijst metingen

leeg en voer de metingen voor V0 bij verschillende [C20:4] nogmaals uit, maar bij
verschillende pH (bij de optimale temperatuur die je bepaald hebt in
opdracht 3). Kies eerst een pH die ~2 eenheden onder het pH optimum (pH opt)
ligt en vervolgens een die ~2 eenheden erboven ligt. De waarden voor K M en Vmax
bij pHopt heb je al bepaald in opdracht 4. Je kunt aan het eind van je metingen
weer naar eSolv Resultaten Opdracht 4: KM en Vmax om de nieuwe curve en
berekende waarden voor KM en Vmax te zien. Als de waarden niet veranderd zijn,
ververs de pagina dan. Vul in onderstaande tabel je gevonden waarden in.

pH Vmax KM
pHopt
pHopt - 2
pHopt + 2

Vraag 12: Wat is de invloed van de pH op de waarden voor K M en Vmax? Wat is

hiervoor je verklaring?

Antwoord 12:

Ga weer terug naar eSolv Metingen Opdracht 4: KM en Vmax. Voer de metingen

voor V0 bij verschillende [C20:4] nogmaals uit, maar bij verschillende temperatuur
(en bij de optimale pH die je gevonden hebt bij opdracht 2). Kies eerst een
temperatuur die ~3 Kelvin onder het temperatuuroptimum (T opt) ligt en vervolgens
een die ~3 Kelvin erboven ligt. De waarden voor K M en Vmax bij Topt heb je al
bepaald in opdracht 4. Je kunt aan het eind van je metingen weer naar eSolv
Resultaten Opdracht 4: KM en Vmax om de nieuwe curve en berekende waarden
voor KM en Vmax te zien. Als de waarden niet veranderd zijn, ververs de pagina
dan. Vul in onderstaande tabel je gevonden waarden in.

35
 T Vmax KM
Topt (K)
Topt – 3 (K)
Topt + 3 (K)

Vraag 13: Wat is de invloed van de temperatuur op de waarden voor K M en Vmax?

Wat is hiervoor je verklaring?

Antwoord 13:

Opdracht 5

Nu ga je het effect van de hoeveelheid enzym bekijken. Open hiertoe in eSolv

Metingen Opdracht 5: Enzymconcentratie. Let op: Stel bij iedere meetreeks
de optimale temperatuur en pH in voor de reactie van COX-2. Je kunt nu
behalve voor de concentratie C20:4 ook een concentratie voor het enzym
invullen. De simulaties in de eerdere opdrachten zijn uitgevoerd met 4 microliter
van de enzymoplossing en kun je vast invullen. Hoe veranderen K M en Vmax bij
andere enzymconcentraties? Let op: Gebruik nu in eSolv Resultaten Opdracht
5: Enzymconcentratie om KM en Vmax uit te rekenen.

µl COX-2 Vmax KM
[COX-2] A 4
[COX-2] B
[COX-2] C

Vraag 14: Wat is de invloed van de hoeveelheid enzym op de waarden voor K M

en Vmax? Wat is hiervoor je verklaring?

Antwoord 14:

Vergeet niet de antwoorden op de vragen in te dienen via Blackboard! Bij

Werkcollege 2 gaan we verder met deze stof.

36
 Zelfstudie 4
Exploring proteins
Tymoczko hoofdstuk 5, Alberts hoofdstuk 8 blz. 445-462

Om de structuur en functie van eiwitten te bestuderen is het noodzakelijk eerst

de eiwitten te zuiveren. Veelal zal dit betekenen dat de eiwitten moeten worden
gescheiden van andere cellulaire macromoleculen en tenslotte zal dan een eiwit
in zuivere vorm moeten worden geïsoleerd. In deze Zelfstudie bekijken we welke
methoden ons daarbij in het laboratorium ten dienste staan.

1. Bestudeer de inleiding van Hoofdstuk 5 en §5.1 (blz. 76) “The proteome is the
functional representation of the genome”.

2. Bestudeer § 5.2 “The purification of a protein is the first step in understanding

its function” blz.76-77.

Vraag 1.
Wat verstaan we onder de specifieke activiteit van een eiwit?

Vraag 2.
Beschrijf hoe een celfractionering kan worden uitgevoerd met behulp van een
ultracentrifuge.

3. Bestudeer blz. 78-80 “Proteins can be purified according to solubility,

size,charge and binding affinity”.

Vraag 3.
Wat zijn de besproken kolomchromatografische technieken en wat is het principe
bij deze scheidingsmethoden?

4. Bestudeer blz. 80-84 en Alberts blz. 517 “Proteins can be separated by gel
electrophoresis and displayed”.

Vraag 4.
Wat zijn de principes bij de vier besproken gel-elektroforese technieken?
37
Vraag 5.
Welke rol vervullen SDS en -mercaptoethanol bij SDS-PAGE?

Vraag 6.
Je wilt de eiwitten in oplossing A (18 en 20 kD) en in oplossing B (300 en 320
kD) van elkaar scheiden door middel van SDS-PAGE. Gebruikt U dezelfde gel
voor beide oplossingen?

5. Bestudeer blz. 82-84 “A purification scheme can be quantitatively evaluated”.

6. Bestudeer §5.3 blz. 78-80 t/m “Gradient centrifugation provides an assay for
the estradiol-receptor complex”

Vraag 7.
Wat verstaan we onder de sedimentatie coëfficiënt? Welke 4 parameters
beïnvloeden de sedimentatie snelheid van een deeltje?

Vraag 8.
Beschrijf hoe een celfractionering met behulp van ultracentrifugatie kan worden
uitgevoerd.

Vraag 9.
Beschrijf het principe van ultra-gradient centrifugatie (ook wel "zonal" of "band"
centrifugatie genoemd). Wat bepaalt de positie van een molecuul in de gradient
na centrifugatie?

7. Bestudeer §5.3 “Immunology provides important techniques with which to

investigate proteins” blz. 84-92.

Vraag 10.
Wat verstaan we onder polyclonale en monoclonale antilichamen en hoe worden
ze gemaakt?

Vraag 11.
Beschrijf de immunoprecipitatie, solid-phase immunoassay en Western blotting
techniek en verklaar de gevoeligheid van de ELISA methode.

8. Bestudeer Alberts blz. 539-540

Vraag 12.
Hoe worden antilichamen gebruikt om de lokalisatie van eiwitten in de cel
zichtbaar te maken?

9. Bestudeer §5.4 blz 92-94.

38
Vraag 13.
Welke stappen worden achtereenvolgend uitgevoerd bij de bepaling van de
aminozuurvolgorde van een eiwit? Op welke manier kan het eiwit in specifieke
brokstukken worden gesplitst? Wat zijn, schematisch, de verschillende stappen
van de Edman degradatie?

10. Bestudeer “Mass-spectrometry can be used to determine a protein’s mass

identity and sequence” blz. 94-96 en Alberts blz. 455-457 “Mass spectrometry
provides a highly sensitive method for identifying unknown proteins”.

Vraag 14.
Wat wordt in een MALDI-TOF massaspectrum gemeten? Wat is een “peptide
mass fingerprint”?

11. Lees Alberts blz 460-463. “Protein structure can be determined using x-ray
diffraction” en “NMR can be used to determine protein structure in solution”

Vraag 15.
Wat zijn de voordelen en beperkingen van de twee technieken?

Vraag16.
Wat is het belangrijkste verschil tussen een eiwit structuur bepaald met
kristallografie en NMR?

Na deze Zelfstudie dien je:

- aan te kunnen geven welke scheidingsmethodieken voor eiwitten in het
laboratorium worden gebruikt,
- de fysisch-chemische principes van de scheidingsmethoden te kunnen
beschrijven,
- de verschillende gelelektroforese technieken te kunnen beschrijven,
- aan te kunnen geven hoe de aminozuurvolgorde van een eiwit wordt bepaald,
- enkele voorbeelden van het gebruik van antilichamen bij de detectie van
specifieke eiwitten te kunnen geven,
- te weten welke technieken gebruikt worden voor de opheldering van de
driedimensionale structuur van eiwitten,
-een zuiveringsstrategie te kunnen verzinnen voor zuivere eiwitten uit een
mengsel of cel-extract.

39
Werkcollege 1: Katalyse

In dit werkcollege zullen aan de hand van drie thema’s de biochemische

ingrediënten voor het mogelijk maken van katalyse door eiwitenzymen worden
behandeld. De drie thema’s zijn:
A. Eiwitstructuur en de actieve site.
B. Enzym-substraat interacties en principes van katalyse
C. Katalyse van een chemische reactie.

Lysozym

Menig principe van katalyse door eiwitenzymen is opgehelderd aan de hand van
studies aan lysozym. Dit eiwit werd ontdekt in 1922 door Alexander Flemming,
de ontdekker van penicilline. Bij mensen komt lysozym voor in lichamelijke
uitscheidingen zoals tranen, speeksel, en slijm. Het verhaal gaat dat Flemming
per ongeluk wat neusvocht op een plaat met bacteriën liet vallen en zag dat de
bacteriën gelyseerd werden. Inmiddels is bekend dat lysozym een belangrijk
onderdeel vormt van ons aangeboren immuunsysteem. Het enzym zorgt voor
lysis van de celwand van Gram-positieve bacteriën (bv Bacillus, Streptococcus).
Dit is ook de reden dat bacteriofagen (virussen die bacteriën infecteren) een
lysozym-achtig eiwit hebben.

Lysozym is in veel opzichten belangrijk geweest voor de levenswetenschappen:

het is het eerste enzym waarvan de kristalstructuur is bepaald en het eerste eiwit
waarvan de volledige primaire aminozuursequentie is achterhaald.

Figuur A. De tertiaire
structuur van lysozym,
weergegeven in
secundaire structuur
vormen. De zijketens
die in ‘ball & stick’
vorm zijn
weergegeven zijn
onderdeel van de
actieve site van
lysozym, en hun
positie in de primaire
structuur is
aangegeven in het
onderstaande
schema.

40
 ONDERDEEL A: Eiwitstructuur en de actieve site
De primaire structuur van lysozym bestaat uit 129 aminozuren. Deze zijn, door
middel van het vormen van -helices en -sheets die zijn verbonden via loops,
gevouwen tot een tertiaire structuur. Zie ook figuur A.

Vraag 1. -helices worden gevormd door waterstofbruggen volgens een vaste

regel. Teken alle waterstofbruggen die nodig zijn voor het vormen van een -
helix in het onderstaande korte peptide.

De 20 aminozuren hebben ieder een eigen mate van waarschijnlijkheid dat ze

meedoen in het vormen van een -helix. In de onderstaande tabel zijn ze
gerangschikt op deze waarschijnlijkheid (van hoog naar laag).

Positie Aminozuur 1-letter code G (kcal/mol)

1 0.00
2 Arginine R 0.21
3 Leucine L 0.21
4 0.24
5 Lysine K 0.26
6 Glutamine Q 0.39
7 Glutaminezuur E 0.40
8 Isoleucine I 0.41
9 Tryptofaan W 0.49
10 Serine S 0.5
11 Tyrosine Y 0.53
12 Fenylalanine F 0.54
13 Histidine H 0.61
14 0.61
15 Asparagine N 0.65
16 Threonine T 0.66
17 Cysteïne C 0.68
18 Asparaginezuur D 0.69
19 Glycine (!)* G 1.00

41
 20 3.16
De gegeven G waarden zijn ten opzichte van het aminozuur in positie 1. *) Glycine neemt een
uitzonderlijke plek in: hoewel het geen zijketen heeft, tolereren -helices glycine over het
algemeen niet omdat het een te flexibel aminozuur is.

In Bijlage A aan het eind van dit werkcollege staan de chemische structuren van
alle 20 aminozuren weergegeven.

Vraag 2. Vul met behulp van Bijlage A de ontbrekende posities van de tabel in
met de vier overgebleven aminozuren (alanine, proline, methionine, en valine),
en leg uit waarom je ze die positie geeft.

Vraag 3. Leg uit wat ‘G’ betekent en leg uit waarom de waarschijnlijkheid van
deelname van een residue aan -helix vorming daalt naarmate de G groter
wordt.

De ‘regel’ voor het vormen van -sheets is dat elke aminegroep en carboxygroep
in de hoofdketen van een peptide een waterstofbruginteractie aangaat met een
carboxygroep en aminegroep in een ander deel van de hoofdketen. Een verschil
met de waterstofbruggen van -helices is dat er voor -sheets geen regel is voor
welke aminozuren met elkaar waterstofbruggen vormen.

Vraag 4. Hoeveel -sheets heeft lysozym en welk type -sheets zijn het?

42
Voor het vormen van een tertiaire structuur worden interacties gemaakt tussen
loops, -sheets en -helices. Deze worden tot stand gebracht o.a. middels
waterstofbruggen, zoutbruggen, vanderwaalskrachten en covalente bindingen.
Een voorbeeld van deze laatste is de zwavelbrug, een verbinding tussen de
zijketens van twee cysteïne residuen.

Vraag 5. De actieve vorm van lysozym doet zijn werk in een oxiderende,
extracellulaire omgeving. Verwacht je dat de tertiaire structuur van lysozym
zwavelbruggen bevat? Leg uit.

De secundaire structuren van lysozym rangschikken zich op zo’n manier dat

aminozuren die in de primaire structuur relatief ver van elkaar liggen in de
tertiaire structuur dicht bij elkaar komen om zodoende een actieve site te vormen.

De primaire structuur van de C-isovorm van lysozym van Gallus gallus (de
kippensoort rode kamhoen) is hieronder weergegeven (merk op dat de sequentie
niet begint met methionine: actief lysozym is een proteolytisch fragment van een
pro-enzym).

Gg-LYSC primaire structuur:

1- KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQA

TNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDI

TASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL-129

De dikke, onderstreepte aminozuren zijn de zes aminozuren die in ‘ball & stick’
vorm zijn weergegeven in figuur A op de eerste pagina van dit werkcollege. Zij
vormen tezamen de actieve site van lysozym.

43
Vraag 6. Welke van deze zes aminozuren kunnen direct betrokken zijn bij
katalyse? Leg uit.

Vraag 7. Wat zou de rol van de overige dikke, onderstreepte residuen (in de
hierboven weergegeven primaire sequentie) kunnen zijn?

ONDERDEEL B: Enzym-substraat interacties en principes van

katalyse
Lysozym behoort tot de familie van de glycosidases, een onderdeel van de grote
familie van hydrolases. De hydrolase reactie is als volgt:

A – B + H2O → A – OH + B – H (reactie A)

Lysozym hydrolyseert de -(1-4)-glycoside binding tussen

N-acetylmuraminezuursuiker (NAM) en N-acetylglucosaminesuiker (NAG). Deze
glycosidase reactie is als volgt:

NAG-NAM-NAG-NAM-NAG-NAM + H2O --> NAG-NAM-NAG-NAM + NAG-NAM

(reactie B)

44
Enzymen kunnen (een combinatie van) drie soorten strategieën gebruiken bij het
uitvoeren van hun functie als katalysator: i) het bij elkaar brengen van
reactanten; ii) het veranderen van de lading van het substraat; en iii) een
conformatieverandering van het substraat. Lysozym werkt volgens dit laatste
principe. Zie figuur B.

Figuur B. NAG-NAM keten verandert van conformatie nadat het is gebonden in

de actieve site van lysozym.

Zoals je wellicht is opgevallen, verandert niet alleen het substraat van vorm na
binding aan enzym, maar ook de actieve site van het enzym verandert na binding
met substraat.

Vraag 8. Met welke Engelstalige term wordt deze vorm van substraatbinding,
waarbij zowel substraat als enzym van vorm veranderen na binding, ook wel
aangeduid?

De vervorming van de NAG-NAM keten na binding aan de actieve site van

lysozym kost relatief veel energie omdat deze vorm van de keten een
energetisch ongunstige conformatie is.

45
Vraag 9. Waar komt de energie vandaan die ervoor zorgt dat de NAG-NAM
keten vervormt? Tip: denk ook aan de rol van de dikke, onderstreepte residuen in
de LYSC sequentie die niet direct bij katalyse zijn betrokken.

De energetisch ongunstige vervorming van de NAG-NAM keten is nodig om de

-(1-4)-glycoside binding te verbreken. Deze conformatie wordt ook wel de
overgangstoestand van het substraat genoemd, en het blijkt dat de meeste
enzymen een voorkeur hebben voor binding van een substraat in de
overgangstoestand.

Vraag 10. Kijk nog eens naar reactie B op de voorgaande blz. Aangezien
enzymen alleen spontane reacties kunnen katalyseren, zal deze reactie ook
verlopen zonder lysozym. Hoe verklaar je dan dat bacteriën toch NAM-NAG
ketens gebruiken voor de opbouw van hun celwand?

De energetische staat van het NAG-NAM-NAG-NAM-NAG-NAM (=(NAG-NAM) 3)

molecuul is uit te drukken in de energie die opgeslagen is in het molecuul en die
beschikbaar is voor (chemisch) ‘werk’. Dit wordt ook wel de Gibbs vrije energie
(G) genoemd. Het (NAG-NAM)3 molecuul in ongebonden toestand heeft een G
waarde, evenals het (NAG-NAM)3 molecuul in enzym-gebonden toestand en
evenals het product ((NAG-NAM)2 + NAM-NAG) nadat katalyse heeft
plaatsgevonden.

46
Vraag 11. In de tabel hieronder staan drie G waarden voor de bovengenoemde
vormen van NAG-NAM moleculen (substraat of product). Welke waarde hoort bij
welke vorm (vrij substraat ((NAG-NAM)3), enzym-gebonden substraat ((NAG-
NAM)3), en product ((NAG-NAM)2 + NAG-NAM))?

Substraat/ Gibbs vrije energie (kcal/mol)

product
150
200
250

Vraag 12. Zet de drie Gibbs waarden uit in onderstaande grafiek, en geef aan
welke waarde hoort bij welke vorm van substraat/product. Teken een curve door
de punten en geef aan wat de ∆G van de reactie is.

Vraag 13. Teken in bovenstaande grafiek ook een curve voor dezelfde reactie
wanneer lysozym afwezig is.

47
Bekijk de volgende gegevens:

Substraat Relatieve snelheid van hydrolyse

(moleculen per seconde)
NAG-NAM 0
NAG-NAM-NAG 1
(NAG-NAM)2 8
(NAG-NAM)2-NAG 4000
(NAG-NAM)3 30000
(NAG-NAM)4 30000

Vraag 14. Wat kun je concluderen over de binding van binding van lysozym aan
substraat, met betrekking tot de lengte van de NAG-NAM keten?

Vraag 15. Als je een oplossing van (NAG-NAM)100 incubeert met lysozym, wat
zal de meerderheid van het product zijn na relatief korte tijd?

48
 ONDERDEEL C. Katalyse van een chemische reactie.
De chemische structuur van NAG-NAM alsmede de twee katalytische residuen in
de actieve site van lysozym zijn weergegeven in figuur C.

Figuur C. Linker schema: NAG-NAM (verschil in R1 vs R2) met weergegeven de

-(1-4)-glycoside binding. Rechter schema: het NAG-NAM molecuul gebonden in
de actieve site van lysozym. De twee katalytisch residuen van lysozym zijn
weergegeven. In werkelijkheid is de ring van het NAG molecuul in het
rechterschema vervormd ten opzichte van die in het linkerschema.
Bij de bespreking van katalyse door chymotrypsine in het hoorcollege zijn drie
eigenschappen van het enzym aangegeven die essentieel zijn voor katalyse: 1)
het reactief maken van serine zodat een nucleofiele aanval op het substraat
mogelijk wordt; 2) de nucleofiele aanval uitvoeren en zorgen dat er een
tetraedrische intermediair (‘tetrahedral intermediate’) wordt gevormd; 3) het
stabiliseren van de tetraedrische intermediair. Bij katalyse door lysozym spelen
soortgelijke principes een rol.

Vraag 16. Welke eigenschappen van de twee getekende aminozuren (Asp-52 en

Glu-35) zijn belangrijk voor het aanvallen van de -(1-4)-glycoside binding?
Waarom?

49
Vraag 17. Teken in het schema II
van figuur D (zie hiernaast) de
ontbrekende atoombindingen die
horen bij het voltooien van de
eerste stap van de reactie,
waarin de -(1-4)-glycoside
binding is verbroken en de
instabiele tussenvorm van het
substraat is gestabiliseerd.
Figuur D. Katalyse van het
verbreken van de
-(1-4)-glycoside binding
in het NAG-NAM molecuul
door lysozym. In zowel
schema II als III zijn enkele
atoombindingen verwijderd.

Na de eerste stap van katalyse

door lysozym zal water een rol in
de reactie gaan spelen.

Vraag 18. Teken in het schema

III van figuur D het eindproduct
van de reactie. Geef duidelijk aan
waar de drie atomen van water
terecht zijn gekomen.

50
BIJLAGE A

51
 COO-1/e-Module
De driedimensionale structuur van myoglobine en
hemoglobine: Allosterische regulatie van affiniteit
voor O2

Je gaat aan de hand van een E-module de structuur-functie relaties van

myoglobine en hemoglobine bekijken. De behandelde stof komt in Tymoczko
(Hoofdstuk 9) aan de orde en is ook op college besproken door dr. T. Dansen.

Je kunt deze e-Module maken via Blackboard om te kijken hoe goed je de

stof beheerst. De docent kan zien of je de e-Module gemaakt hebt en hoe
goed je dit gedaan hebt (cijfer telt niet mee). Na elke vraag is er een uitleg
bij het juiste antwoord. Je kunt de module zo vaak maken als je wilt,
bijvoorbeeld om nog eens te oefenen voor het tentamen. Gebruik Google
Chrome als browser. Als je nog vragen hebt kun je terecht bij de docent.

52
 Werkcollege 2 /COO-2
Enzymkinetiek in de praktijk

In dit Werkcollege/COO-2 gaan we verder waar we gebleven waren na het

maken van Zelfstudie 3B. De docent zal eerst kort de antwoorden van de
zelfstudie doornemen. Je werkt samen met een collega-student op één
laptop.

Opdracht 6

Nu gaan we het effect van een inhibitor op het enzym COX-2 bekijken. Open
hiertoe in eSolv Metingen Opdracht 6: inhibitor 1. Let op: Stel bij iedere
meetreeks de optimale temperatuur en pH in voor de reactie van COX-2. Je
kunt nu behalve voor de concentratie C20:4 ook een concentratie voor inhibitor 1
invullen. Bepaal de KM en Vmax van COX-2 in de aanwezigheid van 0 (die heb je
al), 1, 2, 5,25, 125 en 500 µM inhibitor 1. Let op, in aanwezigheid van inhibitor
noemen we deze waarden K Mapp en Vmaxapp waarbij app staat voor ‘apparent’, wat
‘schijnbaar’ betekent). Je kunt jouw metingen en de hieruit bepaalde waarden
voor KMapp en Vmaxapp vinden in eSolv Resultaten Opdracht 6: inhibitor 1.
Ververs het scherm tussen sets metingen met een bepaalde inhibitor
concentratie.

[Inhibitor 1] (µM) Vmaxapp KMapp

0
1
2
5
25
125
500

53
 Opdracht 7

Nu gaan we het effect van een andere inhibitor op het enzym COX-2 bekijken.
Open hiertoe in eSolv Metingen Opdracht 7: inhibitor 2. Let op: Stel bij iedere
meetreeks de optimale temperatuur en pH in voor de reactie van COX-2. Je
kunt nu behalve voor de concentratie C20:4 ook een concentratie voor inhibitor 1
invullen. Bepaal de KM en Vmax van COX-2 in de aanwezigheid van 0 (die heb je
al), 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 en 5 µM inhibitor 2. Je kunt jouw metingen en de hieruit
bepaalde waarden voor KMapp en Vmaxapp vinden ineSolv Resultaten Opdracht 7:
inhibitor 2. Ververs het scherm tussen sets metingen met een bepaalde inhibitor
concentratie.
[Inhibitor 2] (µM) Vmaxapp KMapp
0
0.1
0.2
0.5
1
2
5

Vraag 15: als je kijkt naar de kinetische parameters van COX-2 in de

aanwezigheid van de twee inhibitors, wat is dan je conclusie over de aard van
deze inhibitors? (competitief of non-competitief).

Antwoord 15

54
De formule voor de Michaelis-Menten vergelijking in aanwezigheid van inhibitors
kun je alsvolgt schrijven:

[ I non−comp ]
( ) [S ]
V 0=V max ∙ 1−
[ I non−comp ] + K inh non−comp
∙

( (
K M ∙ 1+
[ I comp ]
K inhcomp) +[S ] )
[ I non−comp ] concentratie non-competitieve inhibitor
[ I comp ] concentratie competitieve inhibitor
K inh non−comp Inhibitor constante van de non-competitieve inhibitor
K inh comp Inhibitor constante van de competitieve inhibitor

als er geen non-competitieve inhibitor aanwezig is [I non-comp]=0, volgt vanzelf de

formule voor aanwezigheid van alleen een competitieve inhibitor:

[S ]
V 0=V max ∙

( (
K M ∙ 1+
[ I comp ]
K inhcomp ) +[S] )
[ I comp ]
app
waarbij geldt dat K M =K M ∙ 1+ ( K inh comp ) en je de formule kunt schrijven als

[ S]
V 0=V max ∙
( app
K +[S ]
M
)
en als er geen competitieve inhibitor aanwezig is [I comp]=0, volgt vanzelf de
formule voor aanwezigheid van alleen een non-competitieve inhibitor:

[ I non−comp ] [S]
V 0=V max ∙ 1−
( [ I non−comp ] + K inh non−comp )( ∙
K M +[S ] )
[ I non−comp ]
waarbij geldt dat V max =V max ∙ 1−
app
( [ I non−comp ]+ K inhnoncomp ) en je de formule kunt

schrijven als:
[S]
V 0=V app
max ∙
(
K M +[S] )
55
Zoals de KM een maat is voor bij welke concentratie de snelheid van het enzym
half-maximaal is, zo is de inhibitor constante K inh een maat voor bij welke
concentratie de snelheid van het enzym voor de helft is afgenomen, en zegt iets
over hoe sterk de inhibitor de reactie remt. Een kleine K inh betekent dat je weinig
inhibitor nodig hebt om de reactiesnelheid te vertragen. Kijk of je redenering
terugziet in de formules hierboven.

Vraag 16: Bereken uit je metingen voor de competitieve inhibitor (Je hebt in
vraag 16 bepaald welke dat was) de K inh comp. Vergelijk deze waarde met de K M
van COX-2. Wat bindt beter aan COX-2, arachidonzuur of de competitieve
inhibitor?

Antwoord 16:

Opdracht 8
Laten we aannemen dat de competitieve inhibitor die je gebruikt hebt een
vergelijkbare Kinh heeft als de bekende COX-2 remmer Ibuprofen. Met behulp van
de door jou berekende waarde voor de K inh gaan we nu een schatting maken van
wat de dosis Ibuprofen moet zijn om COX-2 in het bloed gedurende 3 uur
tenminste 90% te remmen. We moeten hiervoor een aantal aannames maken
(let op, deze aannames zijn slechts een voorbeeld, kijk voor doseringen op
de verpakking).

-De vrije arachidonzuurconcentratie in het bloed is ongeveer 50 µM

-Ibuprofen wordt volledig opgenomen in het bloed na inname
-de halfwaarde-tijd van Ibuprofen is anderhalf uur
-Een mens heeft ongeveer 5 liter bloed
-de molmassa van Ibuprofen is 206 g/mol

Vraag 17: Hoeveel milligram Ibuprofen moet je slikken om COX-2 in het bloed
gedurende 3 uur tenminste 90% te remmen?

Antwoord 17:

56
57
 Voor wie wil weten hoe eSolv de Michaelis-Menten parameters
uitrekent uit jouw meetwaarden.

Het kan zijn dat in jouw geval de curve die door je punten getrokken is, juist beter
door het punt waar [S]=K M past dan door de punten met een [S] waarbij geldt dat
V0 nadert aan Vmax, en dat lijkt in tegenstelling tot je antwoord bij vraag 8. Dit kan
komen doordat de makers van deze module een wiskundige truc hebben
gebruikt om de curve te fitten door de door jou gemeten punten. Deze
wiskundige truc is ontwikkelt door Lineweaver & Burk in de jaren 30 van de 20e
eeuw, om eenvoudig de K M en de Vmax uit te kunnen rekenen voordat er snelle
computers bestonden die ingewikkelde curves als de MM vergelijking door een
verzameling meetpunten konden fitten. Nu bestaan deze computers wel, maar
binnen deze module was het eenvoudiger om de methode van Lineweaver en
Burk te gebruiken (en zo maak je ook gelijk kennis met de voor- en nadelen van
deze methode). In de volgende vragen gaan we bekijken hoe deze methode
werkt en wat het gebruik van deze methode betekent voor de betrouwbaarheid
van de bepaalde waarden voor KM en Vmax.

Lineweaver & Burk maken gebruik van een zogenaamde ‘dubbel reciproke
omzetting’; in plaats van [S] tegen V 0 wordt 1/[S] uitgezet tegen 1/V 0. Hierdoor
verandert de Michaelis-Menten curve:

[S ]
V 0=V max ∙
K M +[S ]
in:

1 K M +[S] KM [S ] KM 1
= = + = +
V 0 V max ∙ [S] V max ∙[ S] V max ∙[S ] V max ∙ [S] V max

en dat kun je omschrijven naar:

1 1 KM 1
= ∙ +
V 0 [S ] V max V max

Deze formule heeft dus de gedaante van

y=a ∙ x +b

en dat is zoals je weet een rechte lijn met helling a en y-as-afsnede b waarbij in
dit geval dus geldt:
KM 1
a= en b=
Vmax Vmax

58
Een rechte lijn is relatief eenvoudig te fitten
met de zogenaamde kleinste-kwadraten
methode, waarna de waarden voor KM en Vmax
dus bepaald kunnen worden. Ook kun je
deze waarden aflezen als je 1/V 0 uitzet tegen
1/[S] uitzet in een grafiek (zie plaatje). Door
de rechte lijn te extrapoleren kun je -1/KM en
1/Vmax aflezen. Merk op dat deze extrapolatie
zuiver theoretisch is: 1/[S] wordt nooit 0 en
zeker niet kleiner dan 0.

Extra Vraag 1: bewijs met de reciproke variant van de Michaelis-Menten

vergelijking (zie formule hierboven) dat de helling van de rechte lijn overeenkomt
met KM/Vmax, dat de y-as-afsnede overeenkomt met 1/V max en dat de x-as-
afsnede overeenkomt met -1/KM

Extra Antwoord 1:

Zoals hierboven uitgelegd hebben de makers van deze module de Lineweaver-

Burk methode gebruikt om de K M en Vmax uit te rekenen uit de door jou gemeten
waarden voor V0 bij verschillende [S]. De waarden worden door het
computerprogramma omgezet naar 1/V 0 en 1/[S] en er wordt de best mogelijke
rechte lijn doorheen gefit met behulp van de zogenaamde ‘kleinste kwadraten
methode’ waarna KM en Vmax uit de helling en de as-afsnede van die lijn
uitgerekend worden. Ook wordt de correlatie-coëfficiënt r voor de rechte lijn
uitgerekend. Deze waarden worden ingevuld in de MM vergelijking om
vervolgens de MM-curve door jouw punten te berekenen.

59
Extra Vraag 2: Bekijk wat je hebt ingevuld over de betrouwbaarheid van de
berekening van KM en Vmax uit de MM curve bij vraag 8. Hoe zit dat wanneer de
Lineweaver-Burk methode gebruikt wordt? Bekijk ook nogmaals de figuur van de
Lineweaver-Burk plot.

Extra Antwoord 2:

Extra Vraag 3: Denk je dat de correlatie-coefficient van de rechte lijn die gefit
wordt door de Lineweaver-Burk plot van de reciproke van jouw waarden ook
geldt voor de curve die getoond wordt door eSolv?

Extra Antwoord 3:

60
Extra Oefenstof Enzymkinetiek

Gebruik deze extra oefenstof bijvoorbeeld om je voor te bereiden op het

tentamenonderdeel Enzymkinetiek. De uitwerkingen kun je op Blackboard
vinden.

Voor het bestuderen van de verschillende aspecten van de activiteit van een
enzym is het enzym lactaat dehydrogenase (LDH) gebruikt. Dit enzym
katalyseert de reversibele omzetting van pyruvaat in lactaat.
De reactie wordt weergegeven door de volgende vergelijking:

C H3 CH3
 
C=O + NADH + H+  HCOH + NAD+
 
COO- COO-

pyruvaat lactaat

Bij deze zelfstudie wordt een eerder uitgevoerd experiment met dit enzym
gevolgd.

De volgende aspecten van een enzymatische reactie komen achtereenvolgens

aan de orde bij opgave 1:
A: het effect van de tijd op het verloop van de reactie
B. het effect van de enzymconcentratie
C. het effect van de substraatconcentratie
Met behulp van de verzamelde gegevens kan de V max en de KM worden bepaald.
D. het effect van een remmer in de reactie
E. kan het enzym de reactie van pyruvaat naar lactaat én de reactie van lactaat
naar pyruvaat (de reactie in “tegengestelde” richting) katalyseren?

Bij opgave 2 komt aan de orde hoe de Michaelis-Menten vergelijking, een

hyperbool, kan worden omgewerkt tot andere vergelijkingen die een rechte lijn
opleveren en waaruit, dankzij het lineaire verband, redelijk betrouwbaar v max en
Km kunnen worden bepaald.
Met deze alternatieve “plots” kan ook gemakkelijk worden bekeken van welk type
remming sprake is wanneer een remmer wordt toegevoegd aan de bestudeerde
enzymatische reactie.

Lactaatdehydrogenase LDH

Bij veel zoogdieren, en ook bij de mens, zijn er twee verschillende typen iso-
enzym-polypeptideketens voor LDH: de H-vorm, die vooral in het hart tot
expressie komt en de M-vorm, die vooral in skeletspieren en de lever tot
expressie komt.
61
Het functionele LDH-enzym is een tetrameer, dat kan zijn opgebouwd uit alle
mogelijke combinaties van de twee verschillende monomeren: van H 4 tot M4.

Opgave 1
Het beschreven practicum-experiment is uitgevoerd met rattenlever LDH, dat
overwegend uit M4 bestaat. De M4-vorm katalyseert in skeletspieren de reductie
van pyruvaat tot lactaat. Bij deze reactie wordt NAD + gevormd uit NADH. (Het
NAD+ wordt gebruikt bij de oxidatie-reacties in de glycolyse.)
De snelheid van deze reactie kan makkelijk gevolgd worden met behulp van een
spectrofotometer. Dit apparaat meet de aanwezigheid van NADH, dat een
absorptieband heeft bij 340 nm. Bij deze golflengte van 340 nm vertonen NAD +
en de overige aan de reactie deelnemende stoffen nauwelijks absorptie. De
afname van de absorptie bij 340 nm is dus een directe maat voor het verdwijnen
van NADH, en dus ook voor het ontstaan van NAD + en de omzetting van de
hoeveelheid pyruvaat in lactaat.

Een aantal verschillende experimenten is uitgevoerd. Wat er bij deze

experimenten is gebruikt, hoe de experimenten zijn uitgevoerd en wat de
resultaten waren, is hier weergegeven.

A. Het effect van de tijd

Voor het verloop van een enzym-gekatalyseerde reactie in de tijd wordt

gewoonlijk een curve gevonden zoals hier weergegeven.

62
 Product
0
   15
30
  45

Tijd
 60

Aanvankelijk is het verloop lineair, maar de snelheid van productvorming neemt

met de tijd af. Redenen daarvoor kunnen zijn: de reactie komt in evenwicht, het
substraat raakt op, het product remt de reactie, of één van de componenten,
inclusief het betreffende enzym, wordt geleidelijk afgebroken bij de toegepaste
temperatuur. Bij zeer korte tijden spelen deze effecten nog niet en kan men de
initiële, lineaire snelheid van de reactie meten door het trekken van een raaklijn
aan het eerste deel van de curve van het reactieverloop (zie stippellijn in de
bovenstaande figuur).

Meten van de LDH activiteit

Benodigdheden
0,1 M Tris buffer, pH 7,4
50 mM pyruvaat
5 mM NADH
LDH oplossing
stopwatch
spectrofotometer

Uitvoering
Aan een reageerbuis met 1,9 ml 0,1 M Tris buffer, pH 7,4 en 0,10 ml 5 mM
NADH wordt 0,50 ml LDH oplossing toegevoegd. De absorptie bij 340 nm wordt
bepaald met de spectrofotometer. Vervolgens is 0,50 ml 50 mM pyruvaat
toegevoegd en gedurende 2 minuten om de 15 seconden de absorptie gemeten.
De resultaten van de metingen staan in Tabel 1.

63
Tabel 1

Tijd (sec) A340

0 0.75
15 0.69
30 0.61
45 0.53
60 0.46
75 0.39
90 0.34
105 0.29
120 0.26

Vraag 13.
a. Zet de genoteerde waarden uit in een grafiek. Gebruik hiervoor de
bijgevoegde grafiek A (in grafiekenbijlage aan eind van deze oefenstof) en
zorg dat je de assen goed labelt. Als je handig bent met Excel kun je dat
eventueel ook gebruiken voor het maken van de grafieken.
b. bepaal hieruit de reactiesnelheid A340/min door uit te gaan van de raaklijn
op t = 15 sec.

Vraag 14. Waarom is het van belang de initiële snelheid van de reactie te
bepalen?

B. Het effect van de enzymconcentratie

Een grafiek van de initiële snelheid (V0) van een enzym-gekatalyseerde reactie
tegen de enzymconcentratie zal in de regel een rechte lijn opleveren die door de
oorsprong gaat (zie lijn a).

64
In sommige gevallen gaat dit eenvoudig verband tussen de initiële
reactiesnelheid en de
enzym concentratie niet op. De grafiek kan zowel opwaartse (zie lijn b) als
neerwaartse (zie lijn c) afbuiging vertonen. Opwaartse afbuiging kan bv. het
gevolg zijn van de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid irreversibele
remmer in het mengsel. Hoe meer enzym hoe slechter de remmer de reactie kan
remmen. Hieronder gaan we verder in op de curve met een neerwaartse
afbuiging.

Het effect van de enzymconcentratie is bepaald door een zelfde reeks metingen
te verrichten als bij A, maar nu met 0,1 ml en 0,3 ml enzym oplossing. De
resultaten staan in Tabel 2.

Tabel 2
Tijd (sec) A340 (0,1 ml enzym) A340 (0,3 ml enzym)
0 0.78 0.80
15 0.76 0.75
30 0.74 0.69
45 0.72 0.64
60 0.71 0.58
75 0.69 0.53
90 0.67 0.48
105 0.65 0.44
120 0.64 0.39
A340/min

Vraag 15.

65
De waarden uit tabel 2 zijn uitgezet in grafieken B en C (in grafiekenbijlage aan
eind van deze oefenstof).
a. Bepaal de reactiesnelheid behorende bij de nieuwe enzymconcentraties
b. zet in grafiek D de reactiesnelheid uit tegen de drie enzymconcentraties.
Label de assen op de juiste wijze.
c. De curve in grafiek D lijkt erg op curve ‘c’ op de vorige pagina. Wat kan
een verklaring zijn voor het feit dat de curven geen rechte lijn zijn?

C. Het effect van de substraatconcentratie

Wanneer de initiële snelheid van een enzym-gekatalyseerde reactie uitgezet
wordt tegen de substraatconcentratie wordt een hyperbool verband gevonden.
Dit verband wordt bepaald door de kinetische grootheden V max en KM en is op
college als volgt weergegeven in de Michaelis-Menten snelheidsformule:

[S ]
V 0=V max ∙
K M +[S ]

Bij toenemende substraatconcentratie raakt de gebruikte hoeveelheid enzym op

een gegeven moment verzadigd. Bij hoge substraatconcentratie is de
reactiesnelheid onafhankelijk van de substraatconcentratie (nulde orde reactie)
omdat alle enzymmoleculen zijn verzadigd met substraatmoleculen. Bij lage
substraatconcentraties verandert de reactiesnelheid wél met de
substraatconcentratie.

Aan een reageerbuis met 1,9 ml 0,1 M Tris buffer, pH 7,4 en 0,10 ml 5 mM
NADH is 0,50 ml LDH oplossing en 0,3 ml 0,1 M Tris buffer, pH 7,4 toegevoegd.
De A340 is bepaald. Daarna is 0.2 ml 1,5 mM pyruvaat toegevoegd en gedurende
2 minuten om de 15 seconden weer de A340 bepaald.

Aan een andere buis met 1,9 ml 0,1 M Tris buffer, pH 7,4 en 0,10 ml 5 mM
NADH is 0,50 ml LHD oplossing en 0,1 ml 0,1 M Tris buffer, pH 7,4 toegevoegd.

66
De A340 is bepaald. Daarna is 0.4 ml 1,5 mM pyruvaat toegevoegd en
gedurende 2 minuten om de 15 seconden weer de A 340 bepaald.

De resultaten staan in Tabel 3.

Tabel 3
Tijd (sec) A340 (0,2ml A340 (0,4 ml pyruvaat)
pyruvaat)
0 0.66 0.70
15 0.63 0.65
30 0.59 0.59
45 0.56 0.53
60 0.52 0.47
75 0.49 0.42
90 0.46 0.37
105 0.43 0.32
120 0.41 0.26
A340/min

Vraag 16. De waarden uit tabel 3 zijn uitgezet in grafieken E en F (in

grafiekenbijlage aan eind van deze oefenstof).
a. Bepaal de reactiesnelheid behorende bij de nieuwe
substraatconcentraties.
b. Vergelijk deze twee waarden van A340/min onderling en met die uit
onderdeel A.

Vraag 17. Je hebt nu de reactiesnelheid bepaald bij drie verschillende

substraatconcentraties: bij experiment A één hoge concentratie en experiment C
twee lage concentraties.
a. Reken de substraatconcentraties uit.
b. Zet in grafiek G de reactiesnelheid uit tegen de substraatconcentratie.
Label de assen op de juiste wijze.
c. Wat is de waarde van de KM?

Vraag 18. Na bestudering van de V0 vs [S] grafiek zal het duidelijk zijn dat de
reactiesnelheid alleen maar onafhankelijk is van de substraatconcentratie als we
daarmee tijdens de meting ruim boven de KM blijven zitten.
De vuistregel is dat we bij activiteitsmetingen van enzymen een substraat
concentratie nemen die minstens 5 maal groter is dan de K M.
Ga na of dat bij onderdeel A het geval is geweest als je weet dat de KM van LDH
voor pyruvaat 90 µM is. Wat is de conclusie?

D. Het effect van een remmer in de reactie

In drie reageerbuisjes zitten dezelfde mengsels als die waarvan je de A340 hebt
bepaald in A en in vraag 16 van onderdeel B (grafiek G). Met andere woorden: in

67
alle buisjes zit 0.5 ml LDH, in combinatie met ofwel 0.2 ml, 0.4 ml of 0.5 ml
pyruvaat. In alle buisjes is echter eenzelfde hoeveelheid remmer van LDH
toegevoegd.

De A340/min waarden van deze mengsels zijn bepaald, en staan hieronder in

tabel 4.

Tabel 4
0,2ml pyruvaat 0,4 ml pyruvaat 0,5 ml pyruvaat
A340/min 0.06 0.09 0.28

Vraag 19.
a. Zet de waarden uit in de grafiek G van vraag 17.
b. Wat is het verschil met eerdere curve in de grafiek G uit vraag 17? Wat is
de waarde van de KM ?
c. Welk type remmer zat er in de drie mengsels? Leg uit.

E. Reversibiliteit van enzym-gekatalyseerde reactie

Enzymreacties zijn evenwichtsreacties, d.w.z. dat bij een bepaalde verhouding

van substraten en producten die bij de reactie betrokken zijn, kan er geen netto-
reactie in één van beide richtingen gemeten worden. Deze verhouding drukt men
uit in de evenwichtsconstante. Zodra het evenwicht verstoord wordt, zal de
reactie die het evenwicht herstelt, meetbaar verlopen.
Tot nu toe is steeds gewerkt met pyruvaat en NADH als uitgangsstof, zodat als
maat voor de activiteit van LDH het verdwijnen van NADH gemeten kan worden.
Als men echter gebruik maakt van lactaat en NAD + en meet of de A340 toeneemt,
kan men bepalen of NADH wordt gevormd en een uitspraak doen over de
reversibiliteit van de reactie.

Benodigdheden
0,1 M Tris buffer, pH 8,4
50 mM lactaat
5 mM NAD+
LDH oplossing

Aan een buis met 1,9 ml 0,1M Tris buffer pH 8.4 en 0,1ml 5 mM NAD + is 0,5 ml
LDH toegevoegd. De A340 is bepaald. Vervolgens is 0,5 ml 50 mM lactaat
toegevoegd en gedurende 2 minuten om de 15 seconden de A 340 bepaald.

De resultaten staan in Tabel 5.

Tabel 5

68
 Tijd (sec) A340 (0,5 ml lactaat)
0 0.10
15 0.12
30 0.13
45 0.14
60 0.15
75 0.155
90 0.165
105 0.17
120 0.175
A340/min

Vraag 20. De waarden zijn uitgezet in grafiek H.

a. Bepaal de activiteit van LDH (A340/min), uitgaande van lactaat en NAD+
b. Vergelijk de activiteit van LDH met de eerder verkregen activiteit gemeten
met pyruvaat en NADH. Wat is je conclusie?

Vraag 21.
a. Welke reactie wordt nu door het enzym gekatalyseerd?
b. Wat is het effect van de pH van de Tris buffer (pH 8,4 bij de experimenten
A-C was de pH 7.4) die nu is gebruikt?

Opgave 2.

Inleiding

Zoals beschreven in onderdeel C van opdracht 1, is de Michaelis-Menten

vergelijking de vergelijking van een hyperbool.

Wanneer de snelheid van de reactie wordt uitgezet tegen de

substraatconcentratie kan uit de grafiek de Vmax worden bepaald door
extrapolatie. De KM wordt weer afgeleid uit de Vmax. Dit extrapoleren is niet altijd
betrouwbaar. (Tegenwoordig gaat dat overigens wel vrij goed met
computerprogramma’s).

Om de onbetrouwbaarheid, die inherent is aan het extrapoleren, te omzeilen, is

de Michaelis-Menten vergelijking op verschillende manieren omgewerkt tot een
lineair verband. De dan verkregen “plot” is een rechte lijn die betrouwbaarder
voorspellingen van KM en Vmax mogelijk maakt. Een van die omwerkingen
resulteert in een Lineweaver-Burk plot. Deze wordt direct afgeleid uit de
Michaelis-Menten vergelijking: aan beide kanten wordt de reciproke waarde
genomen.

Vraag 22. Herleid de Michaelis-Menten vergelijking tot de Lineweaver-Burk

vergelijking:

69
Michaelis-Menten:

[S ]
V 0=V max ∙
K M +[S ]

Lineweaver-Burk:

1 K 1 1
= M ∙ +
V 0 V max [ S ] V max

De Lineweaver-Burk vergelijking is de vergelijking van een rechte lijn: y = ax + b,

waarbij a de richtingscoëfficiënt is en b het snijpunt met de y-as (x=0, ofwel
1/[S]=0).

Vraag 23. Wat is het voordeel van een Lineweaver-Burk plot ten opzichte van
Michaelis-Menten plot voor het bepalen van de kinetische parameters van een
reactie?

Hieronder is een Lineweaver-Burk garfiek weergegeven:

Chronische Myeloïde Leukemie ontstaat door chromosomale translocaties die

zorgen voor een fusie tussen twee genen: één die codeert voor BCR en één die
codeert voor het enzym ABL. Het resulterende fusie-eiwit, BCR-ABL, veroorzaakt
leukemie, en patienten met leukemie zijn te genezen door dit enzym te remmen.
Er zijn twee BCR-ABL remmers beschikbaar: Gleevec en GNF-2. Hieronder
staan de Lineweaver-Burk plots van de activiteit van BCR-ABL zonder (zwarte
lijn) en met (rode lijn) remmer.

Gleevec GNF-2

70
Vraag 24. Beredeneer welke van de twee remmers competitief is en welke niet-
competitief.

71